Search

Dans le but de développer des monocouches cellulaires endothéliales sur des biopuces plasmoniques comme modèles cellulaires in vitro, nous souhaitons induire un phénotype de couche cellulaire imperméable et fonctionnelle où les cellules génèrent des jonctions avec le substrat et entre elles. Ainsi, nous souhaitons utiliser des techniques de microstructuration afin de contrôler l'adhésion et l'autoassemblage de ces cellules au niveau du substrat métallique. Ces travaux de thèse se basent sur l'hypothèse que l'optimisation de l'autoassemblage et de l'adhésion de cellules individuelles selon des microstructures hexagonales peut induire l'émergence d'un modèle cellulaire endothélial in vitro normalisé et fonctionnel. Dans ces travaux de thèse, nous avons fabriqué un modèle de monocouche cellulaire in vitro constitué de 3 hexagones. Il s'agit d'une première preuve de concept qui confirme que la stratégie de contrôler géométriquement le confinement des cellules puis leur connectivité en optimisant les paramètres d'autoassemblage et d'adhésion, permet d'induire une monocouche cellulaire fonctionnelle comme modèle normalisé endothélial in vitro. Il s'agit d'une première brique pour la fabrication, in fine, d'un tissu endothélial plus complet constitué de plus d'hexagones, pour le développement de biopuces plasmoniques de nouvelle génération pour les diagnostics précoces de conditions pathologiques tel le sepsis., The continued success of drug discovery and diagnosis partly relies on the development and evolution of innovative technologies capable of accurately representing the biological activities associated with pharmacodynamic and pharmacokinetic processes. Among these detection tools, we are interested in surface plasmon resonance imaging (SPRI), which quantifies the biological activity of cellular models grown on adapted plasmonic biochips. In this project, we are proposing the development and validation of next generation plasmonic biochips to generate standardized cell layer models in vitro, in order to label-free quantify, in real time, the integrity of the endothelial barrier. The integrity of the vascular endothelium depends on the cohesion of the endothelial cells that compose the cell monolayer. This cohesion is reinforced by endothelial junctions called adherens junctions between cells, mainly composed of VE-cadherins. Quantifying the integrity of this cell layer is particularly important in the study and diagnosis of pathological conditions associated with inflammatory stress and exposure to bacterial toxins such as in the case of sepsis. Based on the association of these inflammatory conditions with a loss of the integrity of the vascular endothelium, we propose a further application for the development of a biosensor for the early diagnosis of pathological conditions such as sepsis. In order to develop endothelial cell monolayers on plasmonic biochips as cellular models in vitro, we wanted to induce an impermeable and functional cell layer phenotype where cells generate junctions with the substrate and between them. In recent years, in biomedical and tissue engineering studies, micropatterning has been defined as a powerful tool for restoring spatial and structural information lost in vitro and trying to get as close as possible to spatial conditions in vivo. Thus, we aimed to control the adhesion and self-assembly of cells at the level of the metal

Depuis les travaux de Yamanaka, prix Nobel de médecine en 2012, la reprogrammation des cellules somatiques avec les facteurs de transcription génique OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 et c- Myc) a montré que divers types cellulaires peuvent être modifiés pour acquérir les caractéristiques des cellules souches embryonnaires. Actuellement, les cellules souches présentent un intérêt majeur dans le domaine scientifique. En particulier, les cellules souches musculaires jouent un rôle primordial dans le maintien de l'homéostasie et de la régénération du muscle squelettique suite à une blessure. Cependant, avec l'âge, le nombre et la capacité régénérative des cellules souches musculaires diminuent. D'ailleurs, l’étude d’Ocampo et al., 2016 a rapporté que l'induction cyclique d’OSKM dans toutes les cellules du muscle squelettique (y compris les cellules souches musculaires) in vivo améliore les pathologies musculaires liées au vieillissement. Ces résultats suggèrent que ce phénomène pourrait être dû au remodelage épigénétique induit par les facteurs OSKM, ce qui conduit à une reprogrammation de certaines cellules résidentes du muscle âgé, en allant d’un état vers un autre ayant une capacité de régénération plus élevée. En se basant sur cette étude, nous avons hypothétisé que l'induction des facteurs OSKM pourrait stimuler la fonction des cellules souches musculaires dans le muscle squelettique, tout en les amenant vers un état indifférencié primitif de cellules souches capables de proliférer et régénérer le muscle. Ainsi, dans ce projet, nous proposons d’aborder ce nouveau concept tout en utilisant une série de modèles génétiques in vivo pour induire OSKM dans le muscle squelettique et tester si la restauration d’un état indifférencié primitif de cellules souches musculaires pourrait stimuler leur capacité de réparation suite à une blessure. Tout d’abord, nous avons acquis des souris R26-rtTA;tetO-OSKM exprimant OSKM dans tous les tissus, notamment le muscle squelettique. Ces souris s

Les principes de pharmacologie moderne suggèrent qu’en liant un récepteur à 7 domaines transmembranaires (7DTM), différents ligands peuvent activer préférentiellement l’une ou l’autre des voies signalétiques en aval du récepteur à l’étude. Afin d’appuyer ce concept de signalisation biaisée, aussi appelé sélectivité fonctionnelle, nous avons émis l’hypothèse que l’effet différentiel de deux ligands endogènes du récepteur APJ, soit l’apéline-13 et l’ELABELA, puisse découler des changements spatiotemporels de l’interactome protéique de ces complexes récepteur-ligand respectifs. Considérant que le récepteur APJ est exprimé in vivo de façon abondante chez les cellules endothéliales, notre objectif était aussi d’en identifier l’interactome propre à ce contexte cellulaire particulier. Afin de valider cette hypothèse, nous avons couplé le récepteur APJ avec une ascorbate peroxydase mutée (APEX2) pour effectuer un essai de proximité en surexprimant cette protéine chimérique chez des cellules endothéliales cardiaques de souris (MCEC) en culture. Nous avons confirmé, par buvardage à la streptavidine-HRP, l’efficacité de la biotinylation des protéines environnantes générée par le récepteur APJ-APEX2 en conditions basale et activée à l’apéline-13 ou l’ELABELA. La détection des étiquettes incluses de part et d’autre de la construction chimérique nous a permis de vérifier par immunobuvardage l’intégrité de celle-ci ainsi que la localisation cellulaire par microscopie confocale. Les protéines biotinylées ont été purifiées via des billes-streptavidine et détectées par spectrométrie de masse. Nos résultats d’analyse démontrent les partenaires d’interaction communs et distincts du récepteur APJ selon ses deux ligands endogènes indiquant une signalisation propre à chaque ligand. Nous avons également comparé nos résultats avec deux différentes bases de données d’interactions protéine-protéine pour y observer des différences et des similitudes. Nous retrouvons entre autres des protéines, The principles of modern pharmacology suggest that by binding a seven-transmembrane domain (7TM) receptor, different ligands can preferentially activate one or the other of the signaling pathways downstream of the receptor under study. In order to support this concept of biased signaling, also called functional selectivity, we hypothesized that the differential effect of two endogenous APJ receptor ligands, apelin-13 and ELABELA, may result from spatiotemporal changes of the protein interactome of these respective receptor-ligand complexes. Considering that the APJ receptor is abundantly expressed in vivo in endothelial cells, our objective was also to identify the interactome specific to this particular cellular context. In order to validate this hypothesis, we coupled the APJ receptor with a mutated ascorbate peroxidase (APEX2) to perform a proximity assay by overexpressing this chimeric protein in cultured mouse cardiac endothelial cells (MCEC). We have confirmed, by streptavidin-HRP blotting, the efficiency of biotinylation of the surrounding proteins generated by the APJ-APEX2 receptor under basal and activated conditions apelin-13 or ELABELA. The detection of the labels included on both sides of the chimeric construction allowed us to verify by immunoblotting the integrity of the protein as well as its cellular localization by confocal microscopy. The biotinylated proteins were purified via streptavidin beads and detected by mass spectrometry. Our analysis results demonstrate the common and distinct interaction partners of the APJ receptor according to its two endogenous ligands indicating a signaling specific to each ligand. We also compared our results with two different protein-protein interaction databases to find differences and similarities. Among other things, we have found proteins of the same family for vacuolar ATPase and the retromer complex which are proteins known to be involved in cellular signaling of 7TM receptor. In addition, we comp

Le suivi continu des substituts tissulaires en développement est crucial afin de comprendre leur évolution au fil du temps. Par contre, la tâche représente tout un défi quand vient le temps d'évaluer des échantillons de grande taille avec les techniques de microscopie. De plus, les méthodes de caractérisation les plus courantes sont fastidieuses et entraînent le sacrifice des cultures. Le développement d'approches de suivi in situ en temps réel, non invasives et non destructives, adaptées aux échantillons non transparents et de grandes tailles, est essentiel dans le domaine du génie tissulaire. Les techniques d'imagerie médicale peuvent répondre à ces besoins sans perturber ni interrompre les cultures en cours. L'hypoThèse de travail de cette Thèse était de démontrer la possibilité d'établir des méthodes d'imagerie in situ, non invasives, non destructives et en temps réel pour le suivi de la viabilité et du métabolisme de cultures tridimensionnelles (3D) de cellules endothéliales dans un gel de fibrine perfusé. Afin d'y arriver, une chambre de culture à perfusion munie de fibres creuses pour la croissance de cellules endothéliales à l'intérieur d'un gel de fibrine a d'abord été conçue. Ensuite, un bioréacteur pulsatif à perfusion apte à assurer la survie et la croissance de cultures 3D in vitro pour le génie tissulaire a été développé et validé. Dans un second temps, les protocoles d'imagerie par tomographie d'émission par positrons (TEP) n'étant pas adaptés aux systèmes de bioréacteurs, il a fallu en développer et valider un en utilisant un radiotraceur bien connu : le [indice supérieur 18]F-fluorodésoxyglucose ([indice supérieur 18]FDG) qui est un marqueur capable de détecter le métabolisme cellulaire. L'imagerie au [indice supérieur 18]FDG d'un bioréacteur permet d'évaluer la perfusion de la culture, de contrôler sa viabilité ainsi que d'estimer la densité cellulaire et le positionnement des structures tissulaires émergentes. Ainsi, les conditions optimales favor

Toward the objective to create or to replace impaired tissues, it is essential to establish a culture process allowing tissue growth in vitro . The Petri dish culture or the traditional 2D culture has only a limited potential, mainly caused by a poor oxygen mass transfer to feed larger tissue constructs. In this project, an autonomous and complete bioprocess has been built to fullfill these needs. The developed reactor is versatile because many cell culture chamber designs can be connected to it. Two proportional-integral algorithms (PI) can control the dissolved oxygen concentration and the pH. The pressure, the temperature and mass flow rate are recorded in real time. An actuator allows mimicking the cardiac output flow. In this mémoire , it will be demonstrated how the reactor has been optimized to reduce the risk of bioburden. Also, the procedures to develop the control tools of the PI algorithm will be detailed. To characterize the reactor, a RTD study will be presented. To characterize the cell culture chamber, a permeability analysis using fluorescent microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) will be exposed. Finally, two cell culture chamber designs to orient microvessel formation have been tested and these results will be presented.

Toward the objective to create or to replace impaired tissues, it is essential to establish a culture process allowing tissue growth in vitro . The Petri dish culture or the traditional 2D culture has only a limited potential, mainly caused by a poor oxygen mass transfer to feed larger tissue constructs. In this project, an autonomous and complete bioprocess has been built to fullfill these needs. The developed reactor is versatile because many cell culture chamber designs can be connected to it. Two proportional-integral algorithms (PI) can control the dissolved oxygen concentration and the pH. The pressure, the temperature and mass flow rate are recorded in real time. An actuator allows mimicking the cardiac output flow. In this mémoire , it will be demonstrated how the reactor has been optimized to reduce the risk of bioburden. Also, the procedures to develop the control tools of the PI algorithm will be detailed. To characterize the reactor, a RTD study will be presented. To characterize the cell culture chamber, a permeability analysis using fluorescent microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) will be exposed. Finally, two cell culture chamber designs to orient microvessel formation have been tested and these results will be presented.

Les produits de glycation avancée résultent d'une réaction chimique entre les sucres réducteurs, comme le glucose, avec les protéines et ainsi causer la réticulation des tissus exposés. L'hyperglycémie chronique observée dans la pathologie du diabète expose les tissus à des concentrations de glucose beaucoup plus importantes et amplifie la formation de réticulations. Les tissus vasculaires sont la voie de distribution périphérique du glucose et en sont donc directement exposés. La réticulation du système circulatoire serait la cause de complications majeures associées au diabète. Afin de mieux comprendre l'impact de la réticulation sur les vaisseaux sanguins, nous avons effectué des analyses mécaniques de différents éléments structurels composant les tissus vasculaires comme le collagène et les cellules endothéliales. Nous avons, dans un premier temps, étudié les propriétés mécaniques du collagène dans des expériences mécaniques sur des fibres de collagène. La microscopie à force atomique nous a permis d'identifier des déterminants structuraux majeurs dans la compréhension de la mécanique d'élongation des tissus de collagène. Des expériences mécaniques, suite à une réticulation par les produits de glycation avancée, ont révélé que le collagène réticulé perd une grande partie de sa capacité à dissiper la tension appliquée à sa structure. De plus, dans la phase"Toe", représentant le régime de fonctionnement physiologique et associée à une phase de déformation non linéaire, les fibres de collagène requièrent une dépense d'énergie beaucoup plus importante pour leur déformation. Le collagène réticulé par les produits de glycation avancée s'avère effectivement beaucoup plus rigide et cohésif. Ainsi, dans le contexte d'un tissu vasculaire, la réticulation par les produits de glycation avancée pourrait affecter leurs propriétés mécaniques ce qui aurait des impacts directs sur la rigidité et la compliance des vaisseaux sanguins. Parallèlement, nous avons mesuré l'impact de l