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L'arthrose (OA) est l’atteinte la plus répandue chez les animaux de compagnie et se manifeste par l'apparition de douleurs chroniques et d'incapacités fonctionnelles. En l’absence de remède, des composés comme les produits de santé naturels (PSN) ont gagné en popularité. Cette revue systématique, enregistrée sur PROSPERO (CRD42021279368), avait pour objectif d'examiner les preuves d’efficacité analgésique des PSN et de diffuser correctement les conclusions sur leur potentiel thérapeutique. Quatre bases de données bibliographiques ont été consultées pour identifier les études testant leur efficacité sur l'OA canine et féline, naturelle ou induite. Après sélection des résultats de recherche, les données de qualité et d’efficacité ont été extraites à l’aide d’une grille d’évaluation originale basée sur les directives ARRIVE, CONSORT et l’outil d’évaluation CAMARADES. Ces grilles ont été préalablement validées : validation apparente, de contenu (interne / externe) et de construit (reproductibilité, répétabilité, sensibilité). Un consensus de 3 évaluateurs, de niveau d’expertise différent, était obligatoire pour chaque score attribué aux données extraites. La méta-analyse montre des preuves solides d’efficacité des suppléments et des diètes thérapeutiques enrichies d’acides gras en oméga-3 dans le traitement de l’OA, et le cannabidiol présente des preuves prometteuses. Les formulations de sulfate de glucosamine/chondroïtine ne présentent toutefois aucun intérêt et ne doivent plus être recommandées dans la prise en charge thérapeutique de cette maladie articulaire dégénérative des animaux de compagnie. Les résultats obtenus soulignent un manque évident de preuves pour supporter la recommandation d’utilisation de nombreux nutraceutiques et dénotent la nécessité de mettre en place des procédures normalisées de bonne pratique clinique pour de futurs essais., Osteoarthritis (OA) is the most common disease in pets and manifests itself as chronic pain and functional disability. In the absence of a cure, compounds such as natural health products (NHPs) have gained popularity. This systematic review, registered on PROSPERO (CRD42021279368), aimed to examine the evidence for analgesic efficacy of NHPs and to properly disseminate findings on their therapeutic potential. Four bibliographic databases were searched to identify studies testing their efficacy in natural and induced canine and feline osteoarthritis. After selection of the search results, quality and efficacy data were extracted using an original evaluation grid based on the ARRIVE and CONSORT guidelines and the CAMARADES evaluation tool. The grids were previously validated: face, content (internal/external) and construct (reproducibility, repeatability, sensitivity) validation. A consensus of three evaluators, with different levels of expertise, was required for each score assigned to the extracted data. The meta-analysis shows strong evidence of efficacy in OA for omega-3 enriched supplements and therapeutic diets, while cannabidiol shows promising evidence. Glucosamine/chondroitin sulphate formulations are of no value and should no longer be recommended for the therapeutic management of OA in pets. The results highlight a clear lack of evidence to support the recommendation for use of many nutraceuticals and indicate the need for standardised good clinical practice procedures for future trials.

Objectives : 1) Présenter un portrait des douleurs intermittentes et constantes décrites chez les personnes souffrant de l’arthrose du genou à travers la compréhension des caractéristiques des patients et de la douleur, ainsi que la fonction physique associés, 2) identifier les facteurs personnels, physiques, psychologiques, de la douleur et du système nerveux liés aux douleurs intermittente, constante et mixte chez les adultes atteints de l’arthrose du genou. Méthodes : Afin de répondre à notre premier objectif, nous avons effectué un examen de l’ étude de la portée respectant les recommandations de Arksey et O'Malley et élaborées par Levac, Colquhoun et O'Brien avec une stratégie de recherche utilisant multiples bases de données depuis sa création jusqu'en octobre 2018. Notre analyse a été établie à travers des articles qui respectaient nos critères d'inclusion. Pour atteindre notre deuxième objectif, nous avons effectué une étude transversale où 35 variables (questionnaires et tests physiques et psychophysiques) ont été évaluées sur un échantillon de 297 participants atteints d'arthrose du genou. Résultats : Quatre articles ont abordé la douleur intermittente et constante, et ont été inclus dans la lecture finale. Nous avons souligné qu’une performance limitée au niveau des activités de la vie quotidienne, un grade de Kellgren-Lawrence et une prévalence de comorbidité plus élevés peuvent expliqués la douleur constante. La présence d’arthrose du genou symptomatique et de symptômes dépressifs étaient aussi associés à la douleur constante. Des limitations des activités de haut niveau et un temps plus élevé durant la pratique des activités modérés étaient reliés à douleur intermittente. Notre étude transversale inclue 279 participants, 58,6% de femmes, un âge moyen de 63,8 ans (ET = 9,6) ; et un Indice de Masse Corporelle moyen de 31,5 kg /m2 (ET = 8,7). Nous avons observé qu’un âge plus élevé (Odds Ratio (OR) 0,95 ; 95% Intervalle de confiance (IC) 0,90, 1,00), et un niveau de fonctionnement auto-rapportée plus élevé OR 0,94 ; IC 0,91, 0,98 étaient associés à une probabilité plus faible d'avoir des douleurs mixtes qu’intermittentes. Cependant, une intensité de douleur plus élevée OR 1,25 ; IC (1,07, 1,47) était reliée à une probabilité plus élevée d’avoir une douleur mixte qu’intermittente. Les femmes étaient 71% moins susceptibles que les hommes d'avoir une douleur constante qu’intermittente OR 0,29 ; IC (0,11, 0,75). Conclusion : Il est important que les physiothérapeutes et les professionnels de la santé prennent en compte des multiples facteurs associés aux différents profile de douleur lors du traitement des personnes atteints d'arthrose du genou. En effet, la compréhension de ces facteurs pourra aider à la gestion de la douleur et le ralentissement de la progression de la pathologie., Objectives: 1) To present a portrait of intermittent and constant pain in people with knee OA through the comprehension of their associated pain and patient characteristics and their physical function, 2) to identify personal, physical, psychological, pain and nervous system factors related to intermittent, constant and mixed pain patterns (periods of both intermittent and constant pain) in adults with knee OA. Methods: To answer our first objective, we conducted a scoping review with the framework recommended by Arksey and O’Malley and elaborated on by Levac, Colquhoun and O’Brien, based on a search strategy using multiple databases from inception until October 2018. Our analysis was established with articles that respected our inclusion criteria. To achieve our second objective, we conducted a cross-sectional study where 35 variables (questionnaires and physical and psychophysical tests) where evaluated on a sample of 297 participants with knee OA. Results: Four articles reporting content regarding intermittent and constant pain in people with knee OA were included for the final review. The review revealed that there was a limitation in daily activities, a higher Kellgren-Lawrence grade, a higher prevalence of comorbidities, symptomatic knee OA and depressive symptoms in people with constant pain. Reports of limitations on high impact activities and a greater time spent in moderate activities was related to intermittent pain. Our cross-sectional study included 279 participants, 58.6% female, average age of 63.8 years (SD=9.6), and average BMI of 31.5 kg/m2 (SD=8.7). Increased age, Odds Ratio (OR) 0.95 (95% Confidence Interval (CI) 0.90, 1.00) and higher self-reported function OR CI 0.94 (0.91, 0.98) were associated with a lower likelihood of having mixed pain compared to intermittent pain. An increase in pain intensity OR 1.25 CI (1.07, 1.47) was related to a 25% higher likelihood of mixed pain compared to intermittent pain. Women were 71% less likely than men to have constant pain compared to intermittent pain OR 0.29 CI (0.11, 0.75). Conclusion: Multiple factors associated with the different pain patterns in people with knee OA are important for physiotherapists and health practitioners to consider when treating this population. The understanding of these factors may help in pain management and the control of disease progression.

L'arthrose (OA) est la maladie dégénérative la plus fréquente (ou) et la principale cause d'incapacité physique avec un coût socioéconomique important. Les manifestations cliniques de l'arthrose peuvent inclure des douleurs, des raideurs et des mouvements articulaires réduits. Pathologiquement, l'OA se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, une augmentation de l'expression des médiateurs inflammatoires et cataboliques et le remodelage osseux sous-chondral. Il a été démontré que la protéine prostaglandine D2 (PGD2) est synthétisée par différents types cellulaires et possède des propriétés pro et anti-inflammatoires, selon le récepteur activé. Plusieurs stimuli pro-inflammatoires ont été discernés et étudiés, mais par contre, les voies anti-inflammatoires restent toujours un univers inexploré. Le récepteur DP1 de la PGD2, ainsi que l’enzyme de synthèse L-PGDS, jouent des rôles importants dans l'inflammation et le métabolisme du cartilage. Cependant, leurs rôles dans la pathogenèse de l'arthrose (OA) restent inconnus. Nous avons entrepris l’étude (de quoi) d’une part, pour explorer les rôles de la L- PGDS et de DP1 dans le développement d'OA, et d’autre part pour évaluer l'efficacité d'un agoniste sélectif de DP1 et d’un virus d'AAV2 / 5 codant pour L-PGDS dans le traitement de l'OA. En premier, nos travaux par histologie ont démontré que la dégradation du cartilage est plus prononcée chez les souris Knock-out L-PGDS et DP1, comparativement au souris sauvages Wild-Type (WT). Ensuite une augmentation de l’expression des médiateurs cataboliques (ADAMTS5 et MMP-13), chez les souris L-PGDS -/- et DP1 -/- par rapport au WT a été démontré. Après, la stimulation des explants de cartilage des souris L-PGDS -/- et de DP1 -/- avec l’IL-1a, ont montré une dégradation élevée en protéoglycanes. En outre ces souris ont développer aussi des modifications osseuses sous- chondral. Enfin, nos résultats suggèrent qu’à la suite d'injection intrapéritonéale de l’agoniste spécifique de DP1, le BW245C a atténué la gravité de la dégradation du cartilage induite par une déstabilisation du ménisque médiale (DMM) et des modifications osseuses chez les souris WT. Pareillement, l'injection intra-auriculaire d'AAV2 / 5 codant pour L- PGDS a atténué aussi la dégradation du cartilage induite par DMM et l'expression de ADAMTS-5 et MMP-13 chez des souris L-PGDS -/-. En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrentque le récepteur DP1 et l’enzyme L-PGDS au niveau du cartilage articulaire arthrosique joue un rôle très important. . Elle pourrait constituer une voie thérapeutique potentielle dans le traitement de l’OA et aussi dans le traitement d’autres pathologies musculo-squelettiques., Osteoarthritis (OA) is the most common degenerative disease (or) and the leading cause of physical disability with significant socioeconomic costs. Clinical manifestations of osteoarthritis can include pain, stiffness, and reduced joint movement. Pathologically, OA is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, increased expression of inflammatory and catabolic mediators, and subchondral bone remodeling. It has been shown that prostaglandin D2 protein (PGD2) is synthesized by different cell types and has pro and anti-inflammatory properties, depending on the activated receptor. Several pro-inflammatory stimuli have been discerned and studied, but the anti- inflammatory pathways remain an unexplored universe. The DP1 receptor of PGD2, as well as the synthetic enzyme L-PGDS, play important roles in inflammation and cartilage metabolism. However, their roles in the pathogenesis of osteoarthritis (OA) remain unknown. We undertook the study (of what) on the one hand, to explore the roles of L-PGDS and DP1 in the development of OA, and on the other hand to evaluate the efficacy of a selective agonist DP1 and an AAV2 / 5 virus encoding L-PGDS in the treatment of OA. First, our histology work demonstrated that cartilage degradation is more pronounced in L- PGDS Knock-out and DP1 mice compared to Wild-Type (WT) wild-type mice. Then an increase in the expression of catabolic mediators (ADAMTS5 and MMP-13), in L-PGDS - / - mice and DP1 - / - compared to WT was demonstrated. Subsequently, stimulation of cartilage explants with IL-α from L-PGDS - / - and DP1 - / - mice showed high degradation in proteoglycans. In addition, these mice also develop subchondral bone changes. Finally, our results suggest that following intraperitoneal injection of the DP1-specific agonist, BW245C attenuated the severity of cartilage degradation induced by medial meniscus destabilization (DMM) and bone changes in mice. WT. Similarly, the intra-atrial injection of AAV2 / 5 encoding L-PGDS also attenuated DMM-induced cartilage degradation and the expression of ADAMTS-5 and MMP-13 in L-PGDS - / - mice. In conclusion, all our results suggest that the recepteur DP1 and the L-PGDS enzyme in osteorthritis cartilage plays a very important role. It may be a potential therapeutic avenue in the treatment of OA and also in the treatment of other musculoskeletal conditions.

La mise en évidence du caractère actif de la phase de la résolution de l'inflammation a ouvert la porte à de nouveaux paradigmes thérapeutiques pour les maladies inflammatoires. Des paradigmes qui reposent sur l’utilisation de médiateurs actifs ayant le potentiel de promouvoir la résolution de l’inflammation. En d’autres termes, ces médiateurs régulent la réaction inflammatoire, initient la réparation tissulaire et conduisent au retour de l’homéostasie. Parmi ces médiateurs, la résolvine D1 (RvD1) présente des propriétés anti-inflammatoires et prorésolutives remarquables et ce, dans divers fonctions et tissus de l’organisme. Bien que les effets de la RvD1 aient été bien caractérisés par de nombreuses recherches, son rôle potentiel au niveau ostéoarticulaire demeure peu documenté. Dans cette étude, nous approfondissons les connaissances sur l’effet de la RvD1 dans la protection et la préservation de l’intégrité ostéoarticulaire, en étudiant sa capacité à réguler les principaux facteurs impliqués dans la physiopathologie articulaire. Dans un premier temps, nous avons démontré que la RvD1 est bien présente dans l’environnement articulaire et que ses niveaux sont plus élevés dans le liquide synovial des genoux arthrosiques par rapport aux genoux sains. Ces genoux sont obtenus d’un modèle d’arthrose chez le chien réalisé lors d’une étude antérieure. Par la suite, nous avons étudié ses effets sur les composantes cellulaires de l’articulation. Sur les chondrocytes arthrosiques humains, nous avons démontré que la RvD1 inhibe l’expression des médiateurs inflammatoires et cataboliques induits par l'IL-1β, à savoir la COX-2, la PGE2, l’iNOS, le NO et la MMP-13. L’étude des voies de signalisation a ensuite révélé que la RvD1 s’oppose à l'activation de NF-κB / p65, p38 / MAPK et JNK1 / 2, induite par l’IL-1β. En plus de ces remarquables effets, la RvD1 confère une protection contre l’apoptose cellulaire et le stress oxydatif induits par le HNE, tel que démontré par l'inactivation des caspases, l'inhibition de la libération de la LDH, l’augmentation des taux de la Bcl-2 et de l’AKT, ainsi que la stimulation du GSH. À côté des chondrocytes, la RvD1 a montré des effets puissants sur les ostéoclastes. En effet, elle inhibe la différenciation et l'activation des ostéoclastes tel que démontré par l’inhibition de l’expression de TRAP et de la cathepsine K. Elle réduit l’expression de TNF-α, de l’IL-1β, de l’IFN-γ, de la PGE2 et de RANKL, induite par le LPS et augmente celle de l’IL- 10. De plus, elle protège contre la résorption de la matrice d’hydroxyapatite ainsi que l’érosion ii de la matrice osseuse ex vivo, induites par le RANKL et le M-CSF. Enfin, l’étude des propriétés de la RvD1 dans un modèle d’arthrite chez la souris a révélé qu’elle réduit le score clinique, l'inflammation de la patte et la destruction des os et des articulations. De surcroit, elle inhibe les médiateurs inflammatoires et diminue significativement les marqueurs sériques du remodelage osseux et cartilagineux. Nos résultats sont très prometteurs et confirment le potentiel de la RvD1 dans la résolution de l’inflammation et le maintien de l’intégrité articulaires. Ils mettent ainsi en évidence sa pertinence clinique en tant qu’agent actif dans la prise en charge thérapeutique des maladies ostéoarticulaires., The recognition of the proactive character of the resolution phase of inflammation has revealed alternative therapeutic paradigms for inflammatory conditions, based on the use of active mediators capable of promoting the resolution of inflammation. In other words, these mediators regulate the inflammatory response, initiate tissue repair and promote the return to homeostasis. Among them, resolvin D1 (RvD1) has remarkable anti-inflammatory and proresolutive properties. Although the effects of RvD1 have been well studied, its potential role in the osteoarticular tissues remains poorly documented. In this study, we expand our understanding of the potential of RvD1 in protecting and preserving joint integrity by studying its ability to regulate the major factors involved in the articular pathophysiology. First, we demonstrated that RvD1 is produced in the articular environment and that its levels are higher in the synovial fluid of osteoarthritic knees compared to healthy knees. The knees were obtained from an osteoarthritic dog model performed in a previous study. Therefore, we studied RvD1 actions on the cellular components of the joint. In human osteoarthritic chondrocytes, we demonstrated that RvD1 inhibits IL-1β-induced inflammatory and catabolic mediators, namely COX-2, PGE2, iNOS, NO, and MMP-13. This led to the study of signaling pathways, which revealed that RvD1 counter-regulates IL-1β-induced activation of NF-κB / p65, p38 / MAPK and JNK1 / 2. In addition, RvD1 confers a protection against cellular apoptosis and oxidative stress induced by HNE, as revealed by caspases inactivation, LDH inhibition, as well as increased levels of Bcl-2, AKT, and GSH. In addition to chondrocytes, RvD1 showed remarkable effects on osteoclasts. Indeed, it inhibits osteoclast differentiation and activation, as demonstrated by the inhibition of TRAP and cathepsin K expression. Moreover, it reduces LPSinduced TNF-α, IL-1β, IFN-γ, PGE2 as well as RANKL and concurrently increases IL-10 expression. Furthermore, it inhibits RANKL and M-CSF-induced hydroxyapatite matrix degradation and bone matrix erosion, ex vivo. Finally, the study of the properties of RvD1 in a mouse model of arthritis, revealed that it alleviates the clinical score, paw inflammation, as well as bone and joint destruction. Furthermore, it reduces the inflammatory mediators and significantly decreases serum markers of bone and cartilage remodeling. Our results are very promising and confirm the high potential of RvD1 in resolving inflammation and preserving joint integrity. They highlight its clinical relevance as a therapeutic agent for the management of osteoarticular diseases.

La douleur est une expérience complexe impliquant des composantes sensorielles et de perception (émotionnelle, affective, cognitive). Elle est associée au stress, de la souffrance et une dégradation de la qualité de la vie. Les affections douloureuses chroniques telles que l'arthrose et le cancer des os touchent les chats et les chiens. La douleur dans ces conditions implique de nombreux mécanismes affectant les systèmes nerveux périphérique et central, qui génèrent et entretiennent une douleur pathologique. Les tests sensoriels quantitatifs (TSQ) sont des outils pour quantifier la composante sensorielle de la douleur, qui peuvent aussi être utilisés pour éluder les mécanismes de la douleur impliquée. Les travaux initiaux sur les chats et les chiens souffrant d'arthrose ont permis de développer et de valider certaines méthodes de TSQ; cependant, quelques questions sont restées sans réponse chez les chats souffrant de l'arthrose, et cette méthodologie n'a pas été encore explorée chez les chiens atteints d’ostéosarcome. Nos hypothèses de recherche étaient: 1) les chats arthrosiques sont affectés par des modifications neurophysiologiques caractéristiques de la sensibilisation centrale, pouvant être détectées par les TSQ et répondant à l'administration d'analgésiques à action centrale; et 2) l’ostéosarcome provoque une sensibilisation périphérique et centrale avec des mécanismes descendants d’inhibition de la douleur déficients chez le chien. Nos objectifs étaient : 1) chez les chats souffrant d'arthrose, de fournir des évidences sur la thérapie basée sur les mécanismes neurophysiologiques à l'aide de TSQ; et 2) de tester la capacité d'un protocole TSQ à démontrer la sensibilisation périphérique et centrale chez les chiens atteints de cancer des os, y compris un test de modulation de la douleur conditionnée, et de tester l’efficacité d’un protocole d’analgésique palliatif par paliers chez ces patients. En utilisant les TSQ statiques et dynamiques chez les chats arthrosiques, nous avons démontré que les analgésiques à action centrale tels que le tramadol peuvent renverser la sensibilisation centrale mesurée par la sommation temporelle de la douleur. Cet effet n’a pas été observé après l’administration d’analgésique à action périphérique tel que les antiinflammatoires non stéroïdiens comme le meloxicam. Ces résultats 3 soulignent l’importance d’une approche de traitement fondée sur les mécanismes de la douleur chronique. Le protocole TSQ développé pour les chiens a révélé que ceux atteints de cancer des os manifestaient de l'hyperalgésie primaire et secondaire et de l’allodynie dynamique au brossage par rapport aux chiens en bonne santé. Un test de modulation de la douleur conditionnée pouvant être facilement appliqué a été mis au point et a démontré la capacité de différencier les chiens sains des chiens cancéreux. En utilisant cette méthodologie, il s’est avéré que cette dernière population démontrait un système descendant d’inhibition de la douleur déficient. Ces études ont fourni des preuves des similitudes dans le profil sensoriel entre les malades humains et les animaux de compagnie affectés par l'arthrose, ainsi que les ostéosarcomiques. Les TSQ sont utiles dans la recherche vétérinaire sur la douleur et doivent être accompagnés des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et de conception, de conduite et de compte-rendu des études., Pain is a complex experience involving sensory and perceptual components. It causes stress, suffering and decreased quality of life. Chronic painful conditions such as osteoarthritis (OA) and bone cancer affect cats and dogs. Pain in these conditions results from numerous mechanisms affecting the peripheral and central nervous systems which generate and maintain pathological pain in affected individuals. Quantitative sensory testing (QST) are means to quantify the sensory component of pain. In combination with observed analgesic efficacy, they can be used to study mechanisms of pain. Initial work on cats and dogs with OA has helped to develop and validate some QST methods; however, questions remained unanswered in cats with OA, and this methodology was not yet explored in dogs with bone cancer. Our main hypotheses were: 1) osteoarthritic cats are affected by neurophysiological changes characteristic of central sensitization which can be detected by QST and the concomitant administration of centrally-acting analgesics; and 2) bone cancer in dogs causes peripheral and central sensitization with deficient descending modulating mechanisms. Our main objectives were: 1) to provide evidence of mechanism-based therapy in cats with OA using QST; and 2) to test the ability of a QST protocol to provide evidence of peripheral and central sensitization in dogs with bone cancer including the development and validation of a conditioned pain modulation test, and to test the efficacy of a step-wise palliative analgesic protocol in these patients. Using static and dynamic QST in osteoarthritic cats, we demonstrated that centrally-acting analgesics such as tramadol can reverse central sensitization as measured by facilitated temporal summation of pain, while the same is not observed when a peripherally-acting analgesic such as non-steroidal anti-inflammatory drug, meloxicam, is administered. These findings highlight the importance of mechanism-based approach for the treatment of chronic pain. The QST protocol developed for use in dogs revealed that dogs with bone cancer are affected by primary and secondary hyperalgesia and brush allodynia when compared 5 with healthy dogs. A conditioned pain modulation test which can be easily applied into clinical practice was developed and demonstrated ability to differentiate between healthy and cancerous dogs. Using this methodology, the latter population was found to be affected by deficient descending modulating systems. These studies provided evidence of the similarities in sensory profile between people and companion animals affected by OA- and bone cancer-related pain. The use of QST is valuable in veterinary pain research and should be accompanied by the highest standards of animal care and study design, conduct and reporting.

L’arthrose est considérée comme étant la cause la plus prépondérante de douleur articulaire chronique, autant chez l’humain que chez l’animal de compagnie. Alors que la sensibilisation nociceptive y a été associée, les mécanismes pathologiques sous-jacents de cette maladie ne restent que partiellement élucidés. Récemment, l’induction chirurgicale d’arthrose chez le rat a permis de révéler la présence de changements dans l’expression fonctionnelle de la douleur ainsi que des modifications neurophysiologiques quantifiables. De fait, l’implication de mécanismes épigénétiques dans la physiopathologie de l’arthrose a été suggérée. Ce projet avait comme objectif d’améliorer notre compréhension de la douleur arthrosique par la validation d’un panel de méthodes d’évaluation de la douleur dans un modèle d’arthrose induite chirurgicalement chez le rat. En plus des évaluations structurelles et fonctionnelles de la douleur ainsi que des analyses neuropeptidomiques, préalablement validées, une exploration épigénétique analysant par RT-qPCR l’expression différentielle de miARNs spinaux potentiellement liés à l’arthrose a été entreprise. L’intervention chirurgicale a entrainé le développement de dommages structuraux conséquents et a permis de détecter la mise en place de processus de sensibilisation centrale à la douleur. De plus, une augmentation au niveau spinal de l’expression de miR-181b a été mise en évidence, et ce miARN serait notamment associé à la douleur arthrosique, en particulier au niveau du contrôle endogène de douleur. En prenant en compte plusieurs déterminants de la douleur arthrosique, ce projet contribue à l’amélioration de la recherche translationnelle sur la douleur chronique. La pertinence de la neuro-épigénétique dans l’étude de la douleur arthrosique a également été mise en évidence dans cette étude., Osteoarthritis (OA) is considered the most common cause of chronic joint pain in humans, but also in companion animal patients. Nociceptive sensitization has been extensively associated with the disease. However, the pathological mechanisms leading to the development of this degenerative joint disease remain only partially understood. In the past few years, surgical induction of OA in rats allowed us to characterize some modifications in functional pain behaviors and to quantify neurophysiological changes. Hence, it has now been suggested that epigenetic mechanisms could also take part in OA physiopathology. The goal of this project was to validate a panel of different pain evaluation methods in a surgically-induced OA rat model with the objective of a better understanding of OA pain. To achieve this, previously validated structural and functional pain assessments were conducted, as well as neuropeptidomic analysis. To test the contribution of epigenetic modification in OA, differential expression of spinal miRNAs was validated by RT-qPCR. The surgical intervention led to the progression of significant structural damages. Moreover, this model confirmed the central nociceptive sensitization development in the OA rats. Indeed, changes in functional behaviors and in neuropeptidomic expression were identified. These findings were interestingly accompanied by an enhanced expression of miR-181b, a micro-RNA previously linked to endogenous control of pain. Multiple pain determinants were taken into account in this surgically-induced OA model; therefore, this study contributed to the advancement of knowledge in chronic pain translational research. This project highlights the relevance of neuro-epigenetics in OA pain studies.

Objectifs Vérifier si la suppression de la douleur chez les gonarthrosiques a un effet immédiat sur la biomécanique tridimensionnelle de leur genou et de leur cheville lors de la marche sur un tapis roulant instrumenté. Méthodes Neuf participants souffrant d’arthrose fémoro-patellaire douloureuse, avec ou sans atteinte d'arthrose fémoro-tibiale, ont été inclus. L’intensité de la douleur, avant le test, devait être ≥ 3 sur une échelle de 10. L’expérimentation se déroulait avant et 15 min après injection intra-articulaire au genou de 5 cc de Xylocaïne à 1%. La cinématique du genou et de la cheville, ainsi que l’intensité de la douleur ont été mesurées. Résultats Suite à l’injection de Xylocaïne, les neufs participants ont ressenti une réduction de la douleur. Ils ont été classés selon l’importance de la réduction de leur douleur : faible (N=1), modérée (N=4), et substantielle (N=4). Tous les sujets ont eu des changements dans leur biomécanique du genou ou de la cheville, mais de manière différente d’un sujet à l’autre. Le participant de réduction faible a démontré des changements dans le plan sagittal et frontal au genou et dans les trois plans à la cheville. Dans le groupe de réduction modérée au genou, un sujet a démontré des changements dans les trois plans, un autre sujet dans deux plans (frontal et transversal) et deux sujets seulement dans le plan frontal. À la cheville, tous les sujets avaient des changements dans au moins deux plans (frontal et transversal). Un sujet du groupe de réduction substantielle a démontré des changements dans deux plans au genou (frontal et transversal) et les autres sujets avaient des changements dans un seul plan (sagittal, frontal ou transversal). Dans ce groupe, tous les sujets avaient des changements dans au moins deux plans à la cheville. Conclusion La réduction de la douleur a un impact 15 min après injection sur la cinématique 3D du genou et de la cheville lors de la marche. Tous les participants ont démontré des changements cinématiques au moins dans un plan anatomique pour les deux articulations., Objectives To verify whether or not pain suppression in patients who have knee osteoarthritis have an immediate effect on three-dimensional biomechanics of the knee and the ankle while walking on an instrumented treadmill. Methods Nine patients with painful patellofemoral osteoarthritis, with or without femoro-tibial osteoarthritis, who reported pain intensity ≥ 3/10 on a Numeric Rating Scale (NRS) before the test, were included in this study. Biomechanical assessment of the knee/ankle along with a regularly NRS evaluation were conducted before and 15 min after pain relief induced by an intra-articular injection of 5 mL lidocaine (1%). All participants were assessed with the KneeKGTM system. Results All participants exhibited reduction in pain after lidocaine injection. They were grouped according to the magnitude of pain reduction: minimal (N = 1), much improved (N = 4), and substantial reduction (N = 4). Biomechanics changes in the knee or in the ankle were found in all subjects, but in a different plane from one subject to another. The participant who had minimal reduction in pain post injection demonstrated changes in sagittal and frontal planes at the knee, and three-dimensional changes at the ankle. In the much improved group at the knee, one subject demonstrated three-dimensional changes, another subject had changes in two planes (frontal and transverse) and only two subjects had changes in the frontal plane. At the ankle, all subjects had changes in at least two planes (frontal and transverse). One subject in the substantial reduction group demonstrated changes in two planes at the knee (frontal and transverse) and the other subjects had changes in only one plane (sagittal, frontal or transverse). In this group, all subjects had changes in at least two plans at the ankle. Conclusion Reduction in pain has an effect 15 min after injection on three-dimensional kinematics of the knee and ankle during walking. All participants demonstrated kinematic changes at least in one anatomical plane at both joints.

L’arthrose se caractérise, entre autres, par la dégradation du cartilage articulaire et l’inflammation de la synoviale. Ces caractéristiques sont dues à l’augmentation de la synthèse des médiateurs pro-inflammatoires et cataboliques. Les mécanismes moléculaires, qui en sont à l’origine, ne sont pas bien connus. Des études préliminaires ont montré que l’expression des gènes 15-LOXs, ayant un rôle anti-catabolique et anti-inflammatoire, est diminuée dans le cartilage arthrosique. Notre hypothèse est que la méthylation d’ADN des promoteurs proximaux des gènes 15-LOX-1 et 15-LOX-2 inhibe leurs expressions dans le cartilage arthrosique. Notre objectif est de déterminer s’il y a une corrélation entre leur expression et la méthylation de leurs promoteurs. L’expression de ces gènes, dans les cartilages arthrosiques et non arthrosiques, a été évaluée par immunohistochimie et RT-PCR en temps réel. L’effet de la déméthylation par l’AZA-DC, agent déméthylant, sur leur expression a été évalué par RT-PCR. Les taux de méthylation des sites CpG au niveau des promoteurs de la 15-LOX-1(29 sites) et 15-LOX-2 (12 sites), dans les cartilages arthrosiques dégradés ou intacts, ont été évalués par pyroséquençage. Nos résultats confirment une diminution de l’expression des gènes 15-LOXs dans le cartilage arthrosique et une augmentation significative de l’expression des gènes 15-LOXs sous l’effet de l’AZA-DC. Nous avons également montré l’absence des différences de méthylation des sites CpG des promoteurs des gènes 15-LOXs entre les cartilages arthrosiques dégradés et intacts. Les taux de méthylation des sites CpG sont globalement faibles. Ces résultats suggèrent que la répression de l’expression de gènes 15-LOXs, dans le cartilage arthrosique n’est pas due à la méthylation d’ADN, Osteoarthritis is characterized, among other things, by the breakdown of articular cartilage and the inflammation of the synovium. These features are due to increased synthesis of pro-inflammatory and catabolic mediators. The molecular mechanisms underlying these changes are poorly known. Preliminary work indicates that the 15-LOXs genes have an anti-catabolic and anti-inflammatory role and that their expression is decreased in OA cartilage. Our hypothesis is that DNA methylation of the proximal promoters of the 15-LOX-1 and 15-LOX-2 genes inhibits their expression in OA cartilage. Our goal is to determine whether there is a correlation between their expression and the methylation of their promoters. Expression of these genes in both OA and normal cartilage was evaluated by immunohistochemistry and real-time RT-PCR. The effect of 5-AZA, a demethylating agent, on their expression was evaluated by RT-PCR. The methylation levels of their proximal promoters in degraded or intact osteoarthritic cartilage were evaluated by pyrosequencing. Our results showed a decrease in 15-LOX gene expression in OA cartilage. We also observed a significant increase in 15-LOXs gene expression upon treatment with 5-AZA-DC. In addition, we demonstrated that there were no differences in the methylation levels of CpG sites of 15-LOXs gene promoters between degraded and intact osteoarthritic cartilages. Methylation rates of CpG sites are generally low These results suggest that repression of 15-LOXs gene expression in osteoarthritic cartilage is not due to DNA methylation.

L’étiologie exacte de la douleur arthrosique n’est que partiellement comprise et le recours à des modèles animaux est fondamental dans l’investigation physiopathologique du modèle nociceptif et le développement de modalités thérapeutiques, en particulier lors de la création d’un modèle de douleur chronique pathologique. Dans l’investigation de la douleur arthrosique du genou chez le rat, l’utilisation d’un modèle par injection intra-articulaire de mono-iodo-acétate de sodium (MIA) est surreprésentée. Cependant, ce modèle ne représente pas la maladie naturelle chez l’humain puisque l’atteinte est aiguë, induite chimiquement, et temporaire. Nous émettons l’hypothèse que les modèles chirurgicaux possèdent l’avantage d’utiliser des mécanismes mimant la condition naturelle dans l’arthrose post-traumatique. Le modèle de transsection du ligament croisé crânial, de déstabilisation du ménisque médial (par méniscotomie médiale partielle) et leur combinaison ont été évalués lors d’une étude pilote avec l’objectif de comparer les données fonctionnelles et les neuromarqueurs spinaux entre les modèles chirurgicaux et MIA. L’induction chirurgicale a été accompagnée de changements neurophysiologiques quantifiables liés à la douleur pathologique et persistant plus longtemps que le modèle MIA, représentant ainsi plusieurs avantages pouvant être appliqués lors de l’évaluation de modalités thérapeutiques. Les modèles chirurgicaux simples se sont révélés sans intérêt car ils présentent des atteintes fonctionnelles temporaires et sans modification neuroprotéomique., The exact aetiology of osteoarthritic pain is only partially understood and the use of animal models is fundamental in the pathophysiological investigation and the development of therapeutic modalities, particularly the creation of a pathological chronic pain model. In the investigation of OA knee pain in rats, the intra-articular injection of sodium mono-iodo-acetate (MIA) is an overrepresented model. However, this does not represent the natural disease in humans since the disease is acute, chemically induced, and temporary. We hypothesized that surgical models have the advantage of using mechanisms with better resemblance to the natural post-traumatic osteoarthritis. The model of transection of the cranial cruciate ligament, destabilization of the medial meniscus (partial medial meniscotomy) and their combination were evaluated in a pilot study with the objective to compare the pain behaviour and spinal neuromarkers between the surgical and MIA models. Surgical induction was accompanied by measurable neurophysiological changes associated with pathological pain and lasting longer than the MIA model, an advantage that can be applied in the evaluation of therapeutic modalities. Simple surgical models have proved to be without interest as they present temporary functional impairment without neuroproteomics modification.

Les études cliniques et in vitro suggèrent que la sclérose de l’os sous-chondral due aux ostéoblastes (Ob) anormaux est impliquée dans la progression de l’ostéoarthrose (OA). Les Ob OA humains isolés à partir d’os sous-chondral sclérosé montrent un phénotype altéré, un niveau réduit de signalisation Wnt/β-caténine canonique et une minéralisation in vitro réduite. Il existe également deux voies non-canoniques, Wnt/PKC et Wnt/PCP qui ont étés décrites dans la littérature. Cependant, il n’existe aucune étude qui traite de ces deux voies dans les Ob OA. Ces voies sont activées après qu’un ligand Wnt non-canonique tel que Wnt-5a se lie à un récepteur Wnt couplé à des corécepteurs de la voie non-canonique. Ceci enclenche, respectivement pour la voie Wnt/PKC-Ca2+ et Wnt/PCP, la phosphorylation de PKC (p-PKC) et la phosphorylation de JNK (p-JNK) et agit sur les cibles en aval. Nous avons voulu déterminer s’il était possible de constater des altérations dans les voies Wnt non-canoniques dans les Ob OA. Nous avons préparé des cultures primaires d’ostéoblastes sous-chondral humains à partir de plateaux tibiaux de patients OA subissant une arthroplastie totale du genou, ainsi qu’à partir de plateaux tibiaux recueillis à l’autopsie de patients « normaux ». L’expression des gènes impliqués dans les voies Wnt/PKC et Wnt/PCP a été évaluée par RT-qPCR et la production par Western Blot des protéines, ainsi que celle de p-PKC et p-JNK et que l’activité des facteurs NFAT et AP-1 utilisés par ces deux voies. L’activité phosphatase alcaline (ALPase) et la quantité d’ostéocalcine (OC) ont étés évaluées respectivement à l’aide d’hydrolyse de substrat et d’ELISA. Le niveau de minéralisation a été évalué par la coloration au rouge Alizarine. Nos résultats montrent que l’expression et la production de Wnt-5a étaient augmentées dans les Ob OA comparées aux Ob N et LGR5 était significativement plus élevée. De plus, l’expression de LGR5 est directement régulée via la stimulation ou la diminution de Wnt-5a, à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. Par ailleurs, Wnt-5a a stimulé la phosphorylation de JNK et de PKC ainsi que l’activité NFAT et AP-1. Les niveaux de minéralisation ainsi que d’activité ALPase et de sécrétion d’OC ont aussi été affectés par les changements du niveau de Wnt-5a. Ces résultats suggèrent que Wnt-5a, qui est augmentée dans les OA Ob, peut stimuler les voies Wnt non-canoniques et affecter le phénotype et la minéralisation des OA Ob humains., Clinical and in vitro studies suggest that subchondral bone sclerosis due to abnormal osteoblasts (Ob) is involved in the progression and/or onset of osteoarthritis (OA). Human Ob isolated from sclerotic subchondral OA bone tissue show an altered phenotype, a decreased canonical Wnt/ß-catenin signaling pathway (cWnt), and a reduced mineralization in vitro. Besides the cWnt pathway, at least two non-canonical signaling pathways, the Wnt/PKC and Wnt/PCP pathway have been described. These pathways are activated when a non-canonical Wnt ligand like Wnt-5a binds to a Wnt receptor coupled with non-canonical co-receptors. This activates, respectively for Wnt/PKC-Ca2+ and Wnt/PCP, the phosphorylation of PKC (pPKC) and the phosphorylation of JNK (pJNK) and their effect on downstream targets. However, there are no reports of either pathway in OA Ob. Here, we studied if alterations of the non-canonical pathways could be observed in OA Ob. We prepared primary human subchondral Ob using the tibial plateaus of OA patients undergoing total knee arthroplasty, or from tibial plateaus of normal individuals at autopsy. The expression of genes involved in Wnt/PKC and Wnt/PCP was evaluated by RT-qPCR and their protein production by Western blot analysis, in addition to p-PKC and p-PCP and NFAT and AP-1 activity with luciferase. Alkaline phosphatase activity and osteocalcin levels were evaluated respectively by substrate hydrolysis and ELISA respectively, and mineralization levels were evaluated with Alizarin red staining. OA Ob showed an increased alkaline phosphatase activity and osteocalcin release. The expression of Wnt5a was increased in OA Ob compared to normal. The expression of LGR5 was significantly increased in these cells. Moreover, the expression and production of LGR5 is directly modulated via the stimulation or inhibition of Wnt5a. However, Wnt5a did not stimulate the expression of LGR4. Wnt5a increased the phosphorylation of PKC and JNK as well as NFAT and AP-1 activity. Mineralization levels as well as alkaline phosphatase activity and osteocalcin secretion levels were also linked with changes in Wnt-5a levels. These data indicate that Wnt5a, which is increased in OA Ob, can directly stimulate the Wnt/PKC and Wnt/PCP pathways and this can affect the phenotype and mineralization observed in human OA Ob.

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative très répondue touchant les articulations. Elle est caractérisée par la destruction progressive du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale et le remodelage de l’os sous chondral. L’étiologie de cette maladie n’est pas encore bien définie. Plusieurs études ont été menées pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’OA. Les effets protecteurs du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes gamma (PPARγ) dans l'OA sont bien documentés. Il a été démontré que PPARγ possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-cataboliques. Aussi, plusieurs stimuli ont été impliqués dans la régulation de l’expression de PPARγ dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes exacts responsables de cette régulation ainsi que le profil de l’expression de ce récepteur au cours de la progression de l’OA ne sont pas bien connus. Dans la première partie de nos travaux, nous avons essayé d’élucider les mécanismes impliqués dans l’altération de l’expression de PPARγ dans cette maladie. Nos résultats ont confirmé l’implication de l’interleukine-1β (IL-1β), une cytokine pro-inflammatoire, dans la réduction de l’expression de PPARγ au niveau des chondrocytes du cartilage articulaire. Cet effet coïncide avec l'induction de l’expression du facteur de transcription à réponse précoce de type 1 (Egr-1). En plus, la diminution de l'expression de PPARγ a été associée au recrutement d'Egr-1 et la réduction concomitante de la liaison de Sp1 au niveau du promoteur de PPARγ. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons évalué le profil d’expression de ce récepteur dans le cartilage au cours de la progression de cette maladie. Le cochon d’inde avec OA spontanée et le chien avec OA induite par rupture du ligament croisé antérieur (ACLT) deux modèles animaux d’OA ont été utilisés pour suivre l’expression des trois isoformes de PPARs : PPAR alpha (α), PPAR béta (β) et PPAR gamma (γ) ainsi que la prostaglandine D synthase hématopoïétique (H-PGDS) et la prostaglandine D synthase de type lipocaline (L-PGDS) deux enzymes impliquées dans la production de l’agoniste naturel de PPARγ, la 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandine J(2) (15d-PGJ2). Nos résultats ont démontré des changements dans l’expression de PPARγ et la L-PGDS. En revanche, l’expression de PPARα, PPARβ et H-PGDS est restée stable au fil du temps. La diminution de l’expression de PPARγ dans le cartilage articulaire semble contribuer au développement de l’OA dans les deux modèles animaux. En effet, le traitement des chondrocytes par de siRNA dirigé contre PPARγ a favorisé la production des médiateurs arthrosiques tels que l'oxyde nitrique (NO) et la métalloprotéase matricielle de type 13 (MMP-13), confirmant ainsi le rôle anti-arthrosique de ce récepteur. Contrairement à ce dernier, le niveau d'expression de la L-PGDS a augmenté au cours de la progression de cette maladie. La surexpression de la L-PGDS au niveau des chondrocytes humains a été associée à la diminution de la production de ces médiateurs arthrosiques, suggérant son implication dans un processus de tentative de réparation. En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que la modulation du niveau d’expression de PPARγ, de la L-PGDS et d’Egr-1 au niveau du cartilage articulaire pourrait constituer une voie thérapeutique potentielle dans le traitement de l’OA et probablement d’autres formes d'arthrite., Osteoarthritis (OA) is the most common degenerative joint disease. It is characterised by progressive destruction of articular cartilage, synovial inflammation and subchondral bone remodelling. The complete etiology of OA is still not well defined. Several studies have been carried out to elucidate the molecular and cellular mechanisms involved in OA development. The protective effects of Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) in OA have been well documented. It has been demonstrated that PPARγ exhibit anti-inflammatory and anti-catabolic properties. Although many stimuli have been reported to regulate the expression of PPARγ in several cell types. However, little information is available on the exact mechanisms that govern its regulation as well as the expression profile of this recepteur during the course of the disease. In the first part of this work, we tried to elucidate the mechanisms involved in the alteration of PPARγ expression in OA. Our findings confirm that interleukin-1 beta (IL-1β), a proinflammatory cytokine, down regulate the expression of PPARγ in articular chondrocytes. This effect coincided with the induction of early growth response protein-1 (Egr-1) expression. In addition, down regulation of PPARγ expression was associated with Egr-1 recruitment to and concomitant reduction in Sp1 occupancy at PPARγ promoter. In the second part of this work, we evaluated the expression profile of this receptor in cartilage during the progression of OA. Spontaneous Hartley guinea pig model and anterior cruciate ligament transection (ACLT) dog model were used to follow the expression of three isoforms of PPARs: PPAR alpha (α), PPAR beta (β) and PPAR gamma (γ) as well as hematopoietic prostaglandin D synthase (H-PGDS) and lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS) two enzymes involved in the production of the natural agonist PAARγ, 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandin J(2) (15d PGJ2). Our reultats showed changes in the expression of PPARγ and L-PGDS. In contrast, the level of PPARα, PPARβ and H-PGDS was constant over time. The decrease in PPARγ levels in articular chondrocytes suggest that it may be a contributing factor in OA development in both animal models used in this study. Furthermore, siRNA silencing of PPARγ resulted in an enhanced production of osteoarthric mediators such as matrix metalloproteinase-13 (MMP-13) and nitric oxide (NO). Thus, confirming the anti-arthritic role of this receptor. In contrast, unlike the later, there was an increase in the expression level of L-PGDS during disease progression. The overexpression of L-PGDS in human chondrocytes was associated with reduced production of these osteoarthric mediators, suggesting its involvement in repair process. In summary, our data suggest that the modulation of PPARγ, L-PGDS and Egr-1 expression levels in articular cartilage may be a potential therapeutic approach in the treatment of OA and probably other forms of arthritis.

L'arthrose est la maladie musculo-squelettique la plus commune dans le monde. Elle est l'une des principales causes de douleur et d’incapacité chez les adultes, et elle représente un fardeau considérable sur le système de soins de santé. L'arthrose est une maladie de l’articulation entière, impliquant non seulement le cartilage articulaire, mais aussi la synoviale, les ligaments et l’os sous-chondral. L’arthrose est caractérisée par la dégénérescence progressive du cartilage articulaire, la formation d’ostéophytes, le remodelage de l'os sous-chondral, la détérioration des tendons et des ligaments et l'inflammation de la membrane synoviale. Les traitements actuels aident seulement à soulager les symptômes précoces de la maladie, c’est pour cette raison que l'arthrose est caractérisée par une progression presque inévitable vers la phase terminale de la maladie. La pathogénie exacte de l'arthrose est encore inconnue, mais on sait que l'événement clé est la dégradation du cartilage articulaire. Le cartilage articulaire est composé uniquement des chondrocytes; les cellules responsables de la synthèse de la matrice extracellulaire et du maintien de l'homéostasie du cartilage articulaire. Les chondrocytes maintiennent la matrice du cartilage en remplaçant les macromolécules dégradées et en répondant aux lésions du cartilage et aux dégénérescences focales en augmentant l'activité de synthèse locale. Les chondrocytes ont un taux faible de renouvellement, c’est pour cette raison qu’ils utilisent des mécanismes endogènes tels que l'autophagie (un processus de survie cellulaire et d’adaptation) pour enlever les organelles et les macromolécules endommagés et pour maintenir l'homéostasie du cartilage articulaire. i L'autophagie est une voie de dégradation lysosomale qui est essentielle pour la survie, la différenciation, le développement et l’homéostasie. Elle régule la maturation et favorise la survie des chondrocytes matures sous le stress et des conditions hypoxiques. Des études effectuées par nous et d'autres ont montré qu’un dérèglement de l’autophagie est associé à une diminution de la chondroprotection, à l'augmentation de la mort cellulaire et à la dégénérescence du cartilage articulaire. Carames et al ont montré que l'autophagie est constitutivement exprimée dans le cartilage articulaire humain normal. Toutefois, l'expression des inducteurs principaux de l'autophagie est réduite dans le vieux cartilage. Nos études précédentes ont également identifié des principaux gènes de l’autophagie qui sont exprimés à des niveaux plus faibles dans le cartilage humain atteint de l'arthrose. Les mêmes résultats ont été montrés dans le cartilage articulaire provenant des modèles de l’arthrose expérimentaux chez la souris et le chien. Plus précisément, nous avons remarqué que l'expression d’Unc-51 like kinase-1 (ULK1) est faible dans cartilage humain atteint de l'arthrose et des modèles expérimentaux de l’arthrose. ULK1 est la sérine / thréonine protéine kinase et elle est l’inducteur principal de l’autophagie. La perte de l’expression de ULK1 se traduit par un niveau d’autophagie faible. Etant donné qu’une signalisation adéquate de l'autophagie est nécessaire pour maintenir la chondroprotection ainsi que l'homéostasie du cartilage articulaire, nous avons proposé l’hypothèse suivante : une expression adéquate de ULK1 est requise pour l’induction de l’autophagie dans le cartilage articulaire et une perte de cette expression se traduira par une diminution de la chondroprotection, et une augmentation de la mort des chondrocytes ce qui conduit à la dégénérescence du cartilage articulaire. Le rôle exact de ULK1 dans la pathogénie de l'arthrose est inconnue, j’ai alors créé pour la première fois, des souris KO ULK1spécifiquement dans le cartilage en utilisant la technologie Cre-Lox et j’ai ensuite soumis ces souris à la déstabilisation du ménisque médial (DMM), un modèle de l'arthrose de la souris pour élucider le rôle spécifique in vivo de ULK1 dans pathogenèse de l'arthrose. Mes résultats montrent que ULK1 est essentielle pour le maintien de l'homéostasie du cartilage articulaire. Plus précisément, je montre que la perte de ULK1 dans le cartilage articulaire a causé un phénotype de l’arthrose accéléré, associé à la dégénérescence accélérée du cartilage, l’augmentation de la mort cellulaire des chondrocytes, et l’augmentation de l'expression des facteurs cataboliques. En utilisant des chondrocytes provenant des patients atteints de l’arthrose et qui ont été transfectées avec le plasmide d'expression ULK1, je montre qu’ULK1 est capable de réduire l’expression de la protéine mTOR (principal régulateur négatif de l’autophagie) et de diminuer l’expression des facteurs cataboliques comme MMP-13 et ADAMTS-5 et COX-2. Mes résultats jusqu'à présent indiquent que ULK1 est une cible thérapeutique potentielle pour maintenir l'homéostasie du cartilage articulaire., Osteoarthritis (OA) is the most common musculoskeletal disease worldwide. It is one of the leading causes of pain and disability among adults, and represents a considerable burden on the healthcare system. OA is a disease of the entire joint, involving not only the articular cartilage but also the synovium, ligaments and subchondral bone. It is characterized by the progressive degeneration of the articular cartilage, osteophyte formation, remodelling of the subchondral bone, deterioration of tendons and ligaments and various degrees of inflammation of the synovium. While current therapies and management strategies can help alleviate symptoms early in the disease process, OA is characterized by almost inevitable progression towards end-stage disease. The exact pathogenesis of OA is largely unknown but the key event in OA is the degradation of the articular cartilage. The articular cartilage is only composed of chondrocytes; cells responsible for the synthesis of the extracellular matrix (ECM) and maintenance of articular cartilage homeostasis. Chondrocytes maintain the articular cartilage matrix by replacing degraded macromolecules and respond to focal cartilage injury or degeneration by increasing local synthesis activity. Since chondrocytes exhibit low levels of turnover, they rely on endogenous mechanisms such as autophagy (a cell survival and adaptation process) to remove damaged organelles and macromolecules in order to maintain articular cartilage homeostasis. Autophagy is a lysosomal degradation pathway that is essential for survival, differentiation, development and homeostasis. It regulates maturation and promotes survival of terminally differentiated chondrocytes under stress and hypoxic conditions. Studies by us and others have shown that compromised autophagy is associated with decreased chondroprotection, increased cell death and articular cartilage degeneration. Carames et al showed that autophagy is constitutively expressed in normal human articular cartilage. However, expression of key autophagy inducers is reduced in ageing cartilage. Our previous studies have also identified a panel of key autophagy genes that are expressed in low levels in human OA cartilage as well as in the articular cartilage from mouse and dog models of experimental OA. Specifically, we identified that expression of unc-51 like kinase-1 (ULK1) is suppressed in human OA cartilage and experimental OA models. ULK1 is a serine/threonine protein kinase and is the most upstream autophagy inducer. Loss of ULK1 results in disruption of autophagy induction. Since adequate autophagy signaling is required for maintaining chondroprotection as well as articular cartilage homeostasis, we hypothesized that ULK1 is required for autophagy induction in the articular cartilage and loss of it will result in decreased chondroprotection and enhanced chondrocyte death leading to the degeneration of articular cartilage. Since the exact role of ULK1 in pathogenesis of OA is unknown, I created for the first time, an inducible cartilage- specific ULK1 knockout (KO) mice using Cre-Lox technology and subjected these mice to the destabilization of the medial meniscus (DMM) mouse OA model to specifically elucidate the specific in vivo role of ULK1 in OA pathogenesis. My results show that ULK1 is essential for maintaining articular cartilage homeostasis. Specifically I show that loss of ULK1 in the articular cartilage results in an accelerated OA phenotype; which is associated with accelerated cartilage degeneration, enhanced chondrocyte cell death, increased expression of catabolic MMP-13. Using human OA chondrocytes transfected with ULK1 expression plasmid I show that ULK1 is able to reduce the expression of mTOR (major negative regulator of autophagy) and decrease the expression of OA catabolic factors including MMP-13, ADAMTS-5 and COX-2. My results so far suggest that ULK-1 is a potential therapeutic target to maintain articular cartilage homeostasis.

L'arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative, classée comme la forme la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée par la dégénérescence du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale, et le remodelage de l’os sous-chondral. Ces changements structurels et fonctionnels sont dues à de nombreux facteurs. Les cytokines, les prostaglandines (PG), et les espèces réactives de l'oxygène sont les principaux médiateurs impliqués dans la pathophysiologie de l'OA. L'interleukine-1β (IL-1β) est une cytokine pro-inflammatoire majeure qui joue un rôle crucial dans l'OA. L'IL-1β induit l'expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2), la microsomale prostaglandine E synthase-1 (mPGES-1), la synthase inductible de l'oxyde nitrique (iNOS), ainsi que leurs produits la prostaglandine E2 (PGE2) et l'oxyde nitrique (NO). Ce sont des médiateurs essentiels de la réponse inflammatoire au cours de l'OA qui contribuent aux mécanismes des douleurs, de gonflement, et de destruction des tissus articulaires. Les modifications épigénétiques jouent un rôle très important dans la régulation de l’expression de ces gènes pro-inflammatoires. Parmi ces modifications, la méthylation/ déméthylation des histones joue un rôle critique dans la régulation des gènes. La méthylation/ déméthylation des histones est médiée par deux types d'enzymes: les histones méthyltransférases (HMT) et les histones déméthylases (HDM) qui favorisent l’activation et/ou la répression de la transcription. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression des gènes de la COX-2, la mPGES-1, et l’iNOS. L'objectif de cette étude est de déterminer si la méthylation/déméthylation des histones contribute à la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS dans des chondrocytes OA humains induits par l'IL-1β. Nous avons montré que la méthylation de la lysine K4 de l'histone H3 (H3K4) par SET-1A contribue à l’activation des gènes COX-2 et iNOS dans les chondrocytes humains OA induite par l'IL-1β. Nous avons également montré que la lysine K9 de l’histone H3 (H3K9) est déméthylée par LSD1, et que cette déméthylation contribue à l’expression de la mPGES-1 induite par IL-1β dans les chondrocytes humains OA. Nous avons aussi trouvé que les niveaux d'expression des enzymes SET-1A et LSD1 sont élevés au niveau du cartilage OA. Nos résultats montrent, pour la première fois, l'implication de la méthylation/ déméthylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS. Ces données suggèrent que ces mécanismes pourraient être une cible potentielle pour une intervention pharmacologique dans le traitement de la physiopathologie de l'OA., Osteoarthritis (OA) is a disabling disease classified as the most common form of arthritis worldwide. It is characterized by cartilage degeneration, synovium inflammation, and subchondral bone remodeling resulting in a loss of joint function. These structural and functional changes are due to numerous factors. Cytokines, prostaglandins (PG), and reactive oxygen species are the major mediators implicated in the pathophysiology of OA. Interleukin-1 (IL-1) is a major pro-inflammatory cytokine that plays a crucial role in OA. IL-1 induces the expression of Cyclo-oxygenase-2 (COX-2), microsomal prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1), inducible nitric oxide synthase (iNOS), as well as their products prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide (NO). These are critical mediators of the inflammatory response during OA causing pain, swelling, and joint tissue destruction. The activation of these pro-inflammatory genes results from different changes at the level of chromatin known as epigenetic modifications. Epigenetic modifications such as DNA methylation and histone modifications play a crucial role in gene expression. Among these modifications, histone methylation/demethylation is the most critical one. Histone methylation/demethylation is mediated by two types of enzymes: histone methyltransferases (HMT) and histone demethylases (HDM) which can either activate or repress transcription. It is therefore necessary to understand the molecular mechanisms which underlie the regulation of COX-2, mPGES-1, and iNOS expression. The objective of this study is to investigate whether histone methylation/demethylation can modulate COX-2, mPGES-1, and iNOS expression in IL-1 induced OA human chondrocytes. We demonstrated that histone H3 lysine K4 (H3K4) methylation by SET-1A contributes to IL-1-induced COX-2 and iNOS expression in human OA Chondrocytes. We showed also that LSD1-mediated demethylation of histone H3 lysine 9 (H3K9) contributes to IL-1β-induced mPGES-1 expression in human OA chondrocytes. We found that levels of SET-1A and LSD1 expression are elevated in OA cartilage as compared with normal cartilage. Our data demonstrates, for the first time, the implication of histone methylation/demethylation in COX-2, mPGES-1, and iNOS regulation suggesting that these mechanisms could be a potential target for pharmacological intervention in the treatment of the pathophysiology of OA.

INTRODUCTION: Emerging evidence indicates that nitric oxide (NO), which is increased in osteoarthritic (OA) cartilage, plays a role in 4-hydroxynonenal (HNE) generation through peroxynitrite formation. HNE is considered as the most reactive product of lipid peroxidation (LPO). We have previously reported that HNE levels in synovial fluids are more elevated in knees of OA patients compared to healthy individuals. We also demonstrated that HNE induces a panoply of inflammatory and catabolic mediators known for their implication in OA cartilage degradation. The aim of the present study was to investigate the ability of inducible NO synthase (iNOS) inhibitor, L-NIL (L-N6-(L-Iminoethyl)Lysine), to prevent HNE generation through NO inhibition in human OA chondrocytes. METHOD: Cells and cartilage explants were treated with or without either an NO generator (SIN or interleukin 1beta (IL-1β)) or HNE in absence or presence of L-NIL. Protein expression of both iNOS and free-radical-generating NOX subunit p47 (phox) were investigated by western blot. iNOS mRNA detection was measured by real-time RT-PCR. HNE production was analysed by ELISA, Western blot and immunohistochemistry. S-nitrosylated proteins were evaluated by Western Blot. Prostaglandin E2 (PGE2) and metalloproteinase 13 (MMP-13) levels as well as glutathione S-transferase (GST) activity were each assessed with commercial kits. NO release was determined using improved Griess method. Reactive oxygen species (ROS) generation was revealed using fluorescent microscopy with the use of commercial kits. RESULTS: L-NIL prevented IL-1β-induced NO release, iNOS expression at protein and mRNA levels, S-nitrosylated proteins and HNE in a dose dependent manner after 24h of incubation. Interestingly, we revealed that L-NIL abolished IL-1β-induced NOX component p47phox as well as ROS release. The HNE-induced PGE2 release and both cyclooxygenase-2 (COX-2) and MMP-13 expression were significantly reduced by L-NIL addition. Furthermore, L-NIL blocked the IL-1β induced inactivation of GST, an HNE-metabolizing enzyme. Also, L-NIL prevented HNE induced cell death at cytotoxic levels. CONCLUSION: Altogether, our findings support a beneficial effect of L-NIL in OA by preventing LPO process in NO-dependent and/or independent mechanisms., INTRODUCTION: De nouvelles données indiquent que l’oxyde nitrique (NO), que l’on retrouve en quantité accrue au niveau du cartilage de patients atteints d’ostéoarthrose (OA), joue un rôle dans la production de 4-hydrynonénal (HNE) via la formation de péroxynitrite (ONOO-). Le HNE est considéré comme étant un des produits les plus réactifs de la péroxidation lipidique (LPO). Notre laboratoire a rapporté des niveaux de HNE plus élevés que normal dans le liquide synovial provenant de genoux de patients OA comparativement aux sujets normaux. Nous avions aussi démontré que le HNE peut induire la production des médiateurs inflammatoires et cataboliques connus pour leurs implications dans la dégradation du cartilage dans l’OA. Le but de la présente étude est de vérifier si un inhibiteur sélectif pour la NO synthétase inductible (iNOS), soit le L-NIL (L-N6-(L-Iminoethyl)Lysine), peut empêcher la formation du HNE via l’inhibition de la production du NO dans des chondrocytes de patients OA. MÉTHODES: Les cellules ont été traitées soit avec ou sans un générateur du NO (SIN ou interleukine-1beta (IL-1β)) soit avec ou sans du HNE pendant 48 h en présence ou en absence du L-NIL. L’expression protéique de l’iNOS et de la sous-unité de la NADPH oxydase (NOX), la p47 (phox), a été vérifiée par Western blot. La génération du HNE a été révélée par ELISA, Western blot et immunohistochimie. Les niveaux de prostaglandine E2 (PGE2), gluthation-s-transférase (GST) et de la MMP-13 ont été mesurés par des kits commerciaux. La quantité de NO a été évaluée par la méthode de la réaction de Griess. La mesure des niveaux d'espèces réactives d’oxygène (ROS) a été effectuée par fluorescence en utilisant un kit commercial. RÉSULTATS: Le L-NIL inhibe la stimulation de la production de NO, de HNE ainsi que l’expression d’iNOS au niveau protéique et de l’ARNm par IL-1β. Le L-NIL bloque aussi la production de HNE indépendamment de la production de NO. La production des ROS et l’activation de p47 (phox) ont été inhibées par L-NIL. Fait intéressant, le L-NIL empêche la production de la PGE2, de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et de la MMP-13 induite par le HNE. CONCLUSION: les résultats obtenus semblent démontrer l’effet bénéfique du L-NIL dans l’OA via la prévention de la production du HNE de manière dépendante ou indépendant du NO.

La douleur est une expérience multidimensionnelle comportant des aspects sensoriels, émotionnels et cognitifs. Théoriquement, des méthodes de mesures comportementales, physiologiques, neurophysiologiques et sensorielles peuvent quantifier la douleur. Peu d’études ont étudié la validation des mesures utilisées en médecine vétérinaire. La recherche combine les travaux de Maîtrise et de Doctorat, traite en partie de la validité de méthodes. Dans cet objectif, nos travaux de recherche étudiaient la validité de méthodes comportementales, physiologiques et neurophysiologiques usuelles pour la mesure de la douleur en comparant les expressions de douleur (vache et chien) chez des animaux contrôle par comparaison à des animaux sous analgésie préventive ou sous traitement curatif suivant une douleur induite par chirurgie (modèles de douleur viscérale bovine ou orthopédique canine) ou causée par une maladie naturelle (arthrose canine). Une première étude comparait les mesures de la douleur entre les vaches du groupe placebo et celles sous analgésie postopératoire sur une durée de 21 jours suivant l’induction d’une douleur viscérale chronique. Les vaches du groupe placebo ont présenté une plus forte sensibilité à la douleur et une diminution de la noradrénaline et de la transthyrétine mesurées dans le liquide cérébro-spinal, une diminution de l’activité motrice (AM) (moindre que dans les groupes avec analgésie), de l’agitation enregistrée par vidéo-analyse et une augmentation du stress selon la mesure de l’activité électrodermique (AED). Les méthodes d’intérêt identifiées étaient les marqueurs spinaux, la mesure de la sensibilisation, de comportements par vidéo-analyse et de l’AM par bio-télémétrie. En utilisant des méthodes semblables à celles précédemment décrites, deux études expérimentales de douleur orthopédique ont été réalisées afin de comparer les réponses à la douleur entre des chiens traités avec une analgésie préventive (opioïdes et anti-inflammatoires, étude #2) ou un biphosphonate (tiludronate, étude #3) par comparaison à des chiens contrôles. Seules les échelles de douleur étaient différentes entre les études de recherche. Pour l’étude #2, les ii chiens sous analgésie ont présenté de plus faibles scores de douleur mesurés avec l’échelle de douleur nommée 4A-VET et ceci simultanément à une faible réponse de l’AED une heure après la chirurgie de trochléoplastie. La fréquence du comportement spontané de ‘la marche avec plein appui de la patte opérée’ mesurée à l’aide de la vidéo-analyse augmentait chez les chiens sous analgésie préventive 24 heures après la chirurgie. L’étude #3 démontrait surtout l’apparition de sensibilisation centrale (à la fois par l’évaluation sensorielle quantitative et les marqueurs spinaux) chez les chiens contrôle, 56 jours après l’induction d’arthrose chirurgicale. Ainsi, les chiens traités avec le tiludronate ont présenté une différence sur la substance P et la transthyrétine cérébro-spinale, une diminution de la sensibilisation périphérique, plus d’appui de la patte opérée lors de la marche selon la mesure du pic de force verticale (PFV), une augmentation de la fréquence de ‘la marche avec plein appui de la patte opérée’. La sensibilisation centrale était associée à la diminution de PFV, et une augmentation de l’AED et du comportement spontané de ‘la marche avec plein appui de la patte opérée’. Pour l’étude #4, la validité et la sensibilité des méthodes ont été évaluées dans une condition d’arthrose naturelle chez des chiens traités avec une diète enrichie en moule verte, un produit ayant des effets anti-inflammatoires et chondroprotecteurs attendus. Les chiens traités présentaient une diminution des scores de douleur via l’échelle nommée CSOM, une augmentation de PFV et une augmentation de l’AM. Dans l’ensemble, les résultats confirment que la vidéo-analyse évaluait la douleur de façon objective et pour des modèles différents de douleur et les marqueurs spinaux sont prometteurs. Le PFV était spécifique de la douleur orthopédique. La sensibilisation était présente lors de douleur pathologique. L’AED n’est pas valide pour la mesure de la douleur. La baisse d’AM suggèrerait un comportement de douleur. Les études étaient exploratoires pour les échelles de douleur en raison de leur niveau (débutant) de développement et du manque d’informations sur les qualités métrologiques de ces mesures., Pain is a multidimensional experience involving sensitive, emotional and cognitive components. Theoretically, there are multiple methods by which pain can be assessed including sensitive, behavioural, physiological, or neurophysiological measurements. However, little work has been done to validate these measurements in veterinary medicine. The presented research program including both Master and Doctorate works was intended to address partially this paucity of research. For this purpose, our work would validate some behavioural and physiological methods of pain assessment by contrasting pain expressions (cows and dogs) in painful animals (negative control) and animals treated with preventive analgesic or curative treatment following surgery-induced (bovine visceral and canine orthopaedic models) pain or natural occurring disease (osteoarthritis in dog). A pain study was first conducted to compare measurements of placebo treated-cows with postoperative analgesic treated-cows during 21 days following surgical induction of sustained visceral pain. Placebo treated-cows were found to have increased pain sensitization and decreased concentration of cerebrospinal fluid noradrenaline and transthyretin, less motor activity (but higher than in analgesic groups), more restlessness recorded with video-analysis and increased partially stress with measurement of electrodermal activity (EDA). This first study allowed a selection of methods of interest for pain evaluation including spinal biomarkers, measurement of sensitization, behavioural recording with video-analysis and motor activity with biotelemetry. Therefore, two canine pain experiments, with use of similar methods of pain assessment presented above, were performed to compare responses to pain between preventive analgesics treated-dogs (opioids and anti-inflammatory drug, study #2) or a bisphosphonate (tiludronate in study #3) with placebo-treated dogs. Only the pain scales were different among the projects. For project #2, analgesic treated-dogs were found to have lower pain scores measured with the so-called 4A-VET postoperative pain scale while simultaneously exhibiting reduction of EDA response up to 1 hour following trochleoplasty. In addition, the occurrence rate of the spontaneous behaviour ‘Walking with full weight bearing of the operated leg’ recorded with video-analysis, was higher in analgesic treated-dogs when compared with the placebotreated dogs at 24 hours post trochleoplasty. The pain study #3 was then conducted and demonstrated central sensitization (assessed with quantitative sensory testing and spinal biomarkers) in all control dogs at 56 days post induction of the canine osteoarthritis pain model. Nevertheless, tiludronate treated-dogs were found to have different spinal biomarkers (substance P and transthyretin), decreased peripheral sensitization, more peak vertical force (PVF), which is a kinetic gait parameter, and increased occurrence rate of ‘Walking with full weight bearing of the operated leg’. Interestingly, the central sensitization was associated negatively with PVF and positively with both EDA and ‘Walking with full weight bearing of the operated leg’. Finally, a fourth pain study was conducted to examine whether some of the methods performed validity and sensitivity in clinical condition with osteoarthritic dogs. For this purpose, osteoarthritic dogs were treated with a green-lipped mussel enriched-diet, having both anti-inflammatory and chondroprotective expected activities. The treated-dogs were found to have low pain scores measured with the pain scale for owner named CSOM, increased PVF and motor activity. Indeed, CSOM scores were associated with both PVF and motor activity. Taken together, the results suggest that video-analysis would assess pain expression through objective, predictive and unique evaluation whatever the species or the model, whereas spinal biomarkers are promising. The PVF changes were related to orthopaedic pain. Sensitization appeared to be common to the pathological pain pattern. The EDA was not validated for pain assessment in animals. Decreased motor activity is pain suggestive. Psychometric evaluation of the pain scales remained only exploratory at this (early) stage of development and knowledge of the present pain scales.

Les modèles animaux d’arthrose sont utilisés sur le rat depuis des décennies pour évaluer l’efficacité analgésique de nombreux composés. Cependant, la méthodologie utilisée, en particulier les protocoles d’évaluation de la douleur, est très différente d’une étude à une autre, rendant difficile la comparaison entre chaque projet. Afin d'améliorer le transfert des résultats précliniques vers la recherche clinique, ce projet propose d'établir un protocole d'évaluation de la douleur fiable et pertinent, et de le valider à l’aide du modèle d’arthrose expérimental le plus populaire, soit l’injection intra-articulaire de mono-iodoacétate de sodium (MIA). La répétabilité et la fiabilité inter-évaluateur de diverses méthodes d’évaluation de la douleur ont été évaluées, et le protocole d'acclimatation le plus fiable a été déterminé. Ensuite, les méthodes les plus intéressantes ont été testées pour leur sensibilité à détecter les altérations douloureuses induites par l’injection de MIA, ainsi que leur réponse au traitement analgésique, soit une injection intra-articulaire de lidocaïne. Une période d'acclimatation adéquate associée à un protocole d'évaluation combinant des mesures réflexes, des comportements spontanés ainsi que des tests opérants ont témoigné avec succès des changements douloureux liés à l'injection de MIA. Le test opérant fut la méthode la plus sensible pour détecter l'effet analgésique de la lidocaïne. Cette étude a permis d’établir le protocole d’acclimatation et les méthodes de l’évaluation de la douleur les plus fiables et sensibles. Aussi, il a démontré la pertinence du test opérant pour détecter la composante affective de la douleur chez les rongeurs., Animal models of osteoarthritis pain have been used for decades in rats to test the analgesia response of numerous compounds. Study methodology, in particular the pain assessment methods, is quite variable, making the comparison between each project difficult and sometimes simply impossible. In order to improve the translation of new therapies from the preclinical research to the clinical field, this study proposed to establish the reliability and concurrent validity of a panel of pain assessment methods. The concurrent validation was performed in the most popular osteoarthritis rat model, i.e. using the intra-articular injection of monosodium iodoacetate (MIA). The repeatability and inter-observer reliability of various pain assessment methods were evaluated, and the most reliable acclimatization protocol was determined. Then, the most reliable methods were tested comparatively in the rat MIA osteoarthritis model for their sensitivity in detecting painful changes related to the MIA injection. Their responsiveness to treatment, i.e. an intra-articular injection of lidocaine, was also assessed. A complete pain evaluation protocol and reliable acclimatization period, combining reflexive and spontaneous behavior measures as well as operant testing, successfully demonstrated the pain related changes of the MIA injection. Operant testing was the most responsive to the analgesic effect of lidocaine. This study established the most reliable and sensitive methods of pain assessment and optimized acclimatization protocol. Moreover it defined the operant testing as a highly relevant tool to demonstrate the affective component of pain in rodent.

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative, avec une pathogenèse inconnue. Des études récentes suggèrent que l'activation du facteur de transcription du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thérapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPARγ inhibent l'inflammation et réduisent la synthèse des produits de dégradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des études utilisant des agonistes du PPARγ n’élucident pas les effets exacts médiés par ce gène complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacité de régulariser d'autres voies de signalisation indépendantes de PPARγ, ainsi entraînant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacité thérapeutique avec potentiellement moins de problèmes de sécurité, il est donc essentiel d'élucider, in vivo, le rôle exact de PPARγ dans la physiopathologie OA. Mon projet de thèse permettra de déterminer, pour la première fois, le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle du gène PPARγ dans le cartilage. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Pour tester cette hypothèse, j'ai généré deux types de souris avec une délétion au PPARγ, (a) une suppression du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage germinale pour l'étude de l'arthrose liée au développement et à l'âge et (b) la suppression inductible du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les études OA. L’étude précédente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une délétion au gène PPARγ germinales, montre que ces souris présentent des anomalies du développement du cartilage. J'ai également exploré si ces souris qui présentent des défauts précoces du développement ont toutes les modifications phénotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes résultats ont montré que les souris adultes, ayant une délétion au gène PPARγ, ont présenter un phénotype de l'arthrose spontanée associée à une dégradation du cartilage, l’hypocellularité, la fibrose synoviale. Cette étude a montré que PPARγ est un régulateur essentiel pour le cartilage, et c’est le manque (l’absence) de ce dernier qui conduit à un phénotype de l'arthrose spontanée accélérée (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'étude, on n’a pas pu vérifier si ces souris présentaient l’OA spontanée en raison des défauts de développement ou à la suite de la délétion du gène PPARγ. Pour contourner les défauts de développement, j'ai généré des souris ayant une délétion du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage inductible avec le système Col2rTACre. Ces souris ont été soumises à modèle de la chirurgie OA (DMM: déstabilisation du ménisque médial) et les résultats révèlent que les souris PPARγ KO ont une dégradation accélérée du cartilage, une hypocellularité, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un évènement critique qui initie la dégradation de cartilage dans OA. Les études récentes suggèrent que le procès d’autophagie, une forme de survie cellulaire programmée, est altéré pendant l’OA et peut contribuer vers une protection diminuée des cellules, résultant la dégradation du cartilage. J’ai donc exploré le rôle de PPARγ dans la protection des cellules en déterminant l’effet de manque de PPARγ dans le cartilage par l’expression de mTOR (régulateur négatif principal d’autophagie) et les gènes d’autophagie durant OA. Mes résultats ont montré que les souris KO PPARγ présentent également une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l’expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isolés des souris contrôles OA. J'ai suggéré l'hypothèse que PPARγ contrôle la régulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l’expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothèse, j’ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPARγ-KO avec le vecteur d’expression de PPARγ pour déterminer si la restauration de l'expression de PPARγ peut sauver le phénotype des cellules PPARγ-KO OA. J'ai observé que la restauration de l'expression de PPARγ dans les cellules PPARγ-KO en présence du vecteur d'expression PPARγ, a pu considérablement régulariser négativement l'expression de mTOR et mettre en règle positivement l'expression des gènes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagène de type II et l’aggrecan et de baisser de manière significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l’augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phénotype OA accélérée observée dans les souris PPARγ KO in vivo, j'ai généré les souris doubles KO PPARγ- mTOR inductible spécifique du cartilage en utilisant le système Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris à DMM modèle de l'arthrose. Mes résultants démontrent que les souris avec PPARγ- mTOR doubles KO ont été significativement protégés contre les OA DMM induites associées à une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protéoglycanes et la perte de chondro-cellularité par rapport aux souris témoins. Considérant que mTOR est un répresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouvé que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a été significativement plus élevée dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPARγ-mTOR par rapport aux souris témoins. En plus, les études de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les études in vivo utilisant les souris doubles KO PPARγ- mTOR montrent que PPARγ est impliqué dans la régulation de la protéine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces résultats contournent PPARγ et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose., Osteoarthritis (OA) is an age related degenerative joint disease with unknown pathogenesis. Recent studies suggest that the activation of the transcription factor Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) is a therapeutic target for OA. Agonists of PPARγ inhibit inflammation and reduce the synthesis of cartilage degradation products both in vitro and in vivo. However, studies using agonists of PPARγ do not elucidate the exact effects mediated by this complex gene. Indeed, some of these agonists have the ability to regulate, in vivo, various other signaling pathways independent of PPARγ, resulting in serious side effects. It is therefore vital, in order to achieve therapeutic efficacy with potentially less safety concerns, to elucidate the exact in vivo role of PPARγ in OA pathophysiology. Thus, the aim of my PhD project was to determine the specific in vivo role of PPARγ in OA pathophysiology using cartilage-specific PPARγ knockout (KO) mice and subjecting these mice to surgical model of OA. I generated two separate PPARγ KO mice harboring a (a) constitutive cartilage-specific germ-line deletion of PPARγ gene for developmental and age-related OA study and (b) inducible cartilage-specific deletion of PPARγ in adult mouse specifically for OA studies using LoxP Cre system. Previous study in my laboratory using germ-line PPARγ KO mice shows that these mice exhibit cartilage developmental defects. I further explored if these mice which exhibit early developmental defects have any phenotypic changes in the articular cartilage during ageing. My results showed that adult PPARγ KO mice exhibited a spontaneous OA phenotype associated with enhanced cartilage degradation, hypocellularity, synovial fibrosis, and increased expression of catabolic and inflammatory factors. This study showed that PPARγ is a critical regulator of cartilage health, the lack of which leads to an accelerated spontaneous OA phenotype (Vasheghani et al, 2013; American Journal of Pathology). From this aim of the study, I could not ascertain if cartilage-specific germline PPARγ KO mice exhibited spontaneous OA because of developmental defects or as a result of PPARγ deficiency. To bypass the developmental defects, I then generated inducible cartilage-specific PPARγ KO mice using Col2rTACre system and subjected these mice to destabilization of medial meniscus (DMM) model of OA surgery. My results revealed that PPARγ KO mice showed accelerated cartilage degradation, hypo-cellularity, synovial fibrosis and increased expression of catabolic and inflammatory factors during OA. Loss of chondrocyte cellularity within the articular cartilage is one of the critical events that initiate the degradation of the cartilage during OA. Recent studies suggest that the process of autophagy, a form of programmed cell survival, is impaired during OA and may contribute towards decreased chondro-protection resulting in cartilage degradation. Thus, I further explored the role of PPARγ in chondro-protection by determining the effect of PPARγ deficiency in the cartilage on the expression of mTOR (master negative regulator of autophagy) and autophagy genes during OA. My results revealed that PPARγ-deficient chondrocytes exhibit significantly enhanced expression of mTOR and decreased expression of genes that initiate autophagy process compared to chondrocytes extracted from control OA mice. I then hypothesized that PPARγ controls mTOR/autophagy signaling and ultimately the fate of chondrocytes and the expression of catabolic and inflammatory factors in the articular cartilage. To test this, I transfected PPARγ KO OA chondrocytes with PPARγ expression vector to determine if restoration of PPARγ expression can rescue the phenotype of PPARγ KO OA cells. I observed that restoration of PPARγ expression in PPARγ KO cells significantly down-regulated the expression of mTOR and up-regulate the expression of autophagy genes along with significant rescue in the expression of collagen type II and aggrecan and significant down-regulation in the expression of critical catabolic and inflammatory markers. To validate our in vitro finding that enhanced mTOR signalling and resultant decrease in autophagy is responsible for accelerated OA phenotype observed in PPARγ KO mice, I generated inducible cartilage-specific PPARγ-mTOR double KO mice and subjected these mice to DMM model of OA. My results clearly demonstrate that PPARγ-mTOR double KO mice exhibit significant protection against DMM-induced OA associated with significant protection from cartilage destruction, proteoglycan loss and loss of chondro-cellularity compared with control mice. Since mTOR is a major repressor of autophagy, I found that the expression of two critical autophagy markers (ULK1 and LC3B) was significantly elevated in PPARγ-mTOR double KO mice compared to control mice. My in vitro rescue studies using PPARγ expression vector and in vivo studies using PPARγ- mTOR double KO mice clearly show that PPARγ is involved in the regulation of mTOR/autophagy signalling in the articular cartilage. Therefore, deficiency of PPARγ upregulates mTOR signalling resulting in the suppression of autophagy and decreased chondroprotection and increased catabolic activity leading to accelerated severe OA. This study for the first time provides direct evidence on the role of PPARγ in chondroprotection by modulation of mTOR/autophagy signalling in the articular cartilage. These findings outline PPARγ and its downstream signalling by mTOR/autophagy as potential therapeutic targets for the treatment of OA.

Introduction: L’arthrose est une maladie fréquente chez le chien. Même si des traitements palliatifs ont prouvé leur efficacité pour soulager les signes cliniques associés, aucun n’a permis de restaurer la structure des cartilages ou la fonction des patients. De nouvelles modalités de traitement sont proposées mais très peu d’évidences existent quant à leur efficacité. Un problème récurrent pour apporter plus d’évidence est le manque d’outils d’évaluation dûment validés. Objectif: Evaluer l’efficacité d’une diète contenant de la moule verte, ainsi que la validité de différentes méthodes pour évaluer les effets de ce traitement sur la condition arthrosique de chiens de propriétaire. Méthodes: Une étude prospective croisée contrôlée en aveugle a été conduite sur 30 chiens de propriétaires. Leur condition était stable et non traitée. Ils ont reçu une diète contrôle pendant 30 jours puis la diète thérapeutique pendant 60 jours. A J0 (inclusion), J30 (fin de la période contrôle) et J90 (fin du traitement), les concentrations plasmatiques en acides gras ω–3 (EPA et DHA), le pic de force verticale (PVF – critère de référence), un questionnaire multifactoriel standardisé (MFQ), et la conductance électrodermique (EDA) ont été mesurés. Deux fois par semaine, les propriétaires remplissaient un questionnaire sur la fonction spécifique à leur animal (CODI). L’activité locomotrice (actimétrie) a été enregistrée en continu sur 7 chiens. Résultats: Aucun effet secondaire n’a été documenté excepté une augmentation du poids des chiens durant la période traitement. La localisation -thoracique ou pelvienne- du membre étudié et le poids ont interagi avec PVF. Les taux d’EPA et DHA ont augmenté durant la période traitement (p=0.026 et p, Background: Osteoarthritis is a frequent disease in dogs. Even though palliative treatments have been proven efficient in alleviating the associated clinical signs, none restored structure of the cartilage or complete function of the patients. New modalities have been proposed but evidence of their effects is weak. The weakness of the evidence is partially explained by the rare validation of the methods of assessment. Objective: To assess the efficacy of a diet containing green-lipped mussel, as well as technical and concurrent validity of different assessment instruments for measuring the effects of a treatment on the osteoarthritic condition of client-owned dogs. Methods: A prospective blinded controlled crossover study was performed on 30 client-owned dogs, suffering from stable and non-treated osteoarthritis. They received a 30-day control diet, followed by a 60-day experimental therapeutic diet. Punctual methods of assessment included Peak of Vertical Force (PVF – “gold standard”), standardized MultiFactorial Questionnaire (MFQ) and ElectroDermal Activity (EDA), and were assessed at D0 (inclusion), D30 (end of control) and D90 (end of treatment). Twice a week, the owners completed a case-specific functional (CODI) assessment. Motor activity (actimetry) was continuously recorded on seven dogs. Results: No side effects were observed except the dogs gained weight during the second period. The location of the affected limb, thoracic or pelvic, as well as the body weight interfered with PVF. Both EPA and DHA increased during treatment (p=0.026 and p

L'arthrose ou ostéoarthrite (OA) est la plus commune des maladies chroniques associées au vieillissement. La multiplicité des loci et des polymorphismes associés à l'OA suggère l'implication de nombreuses voies de signalisation. La plupart des voies empruntées partagent des points en commun avec le processus d'ossification endochondrale. Dans l'arthrose, la réinitiation de ce processus pourrait être responsable de la dégradation du cartilage et de la présence d'ostéophytes. Un des gènes ayant fait surface autant dans l'OA que dans le développement musculosquelettique est PITX1. Contrairement à ce que son nom l'indique, PITX1 n'est pas seulement exprimé dans la glande pituitaire mais également dans l'os, le cartilage, les muscles et les fibroblastes. Pitx1 joue un rôle clé dans l'identité des membres inférieurs et son inactivation complète chez la souris mène à un phénotype ressemblant aux membres supérieurs. Moins sévère, son inactivation partielle provoque des symptômes apparentés à l'arthrose précoce chez la souris vieillissante. Chez l'humain, une perte d'expression de PITX1 est observée dans le cartilage OA de concert avec une augmentation des protéines EXTL3, REG1 et PARP1. Ces dernières pourraient favoriser la phase initiale de régénération associée à l'arthrose. Pour induire la prolifération des chondrocytes, de bas niveaux de PITX1 sont nécessaires. À l'inverse, de hauts niveaux de PITX1 pourraient prévenir la prolifération et être responsables du statut différencié des chondrocytes articulaires normaux. L'étude des mécanismes de régulation du gène PITX1 a mené à l'identification d'un co-répresseur, nommé prohibitine (PHB1), lié sur une région promotrice distale. PHB1 est normalement retrouvé au niveau des mitochondries mais son accumulation nucléaire semble corréler avec la perte de PITX1 et l'initiation de l'OA. Cette découverte pourrait avoir un impact sur le diagnostic et d'éventuels traitements visant à prévenir l'apparition de l'arthrose., Osteoarthritis (OA) is one of the most common age-related chronic disorders. The multiplicity of loci identified in OA linkage studies and the large number of associated SNPs suggests that many molecular pathways are involved in OA pathogenesis. Most of these pathways share common features with the process of endochondral ossification, normally occuring during embryogenesis. Cartilage degradation and the presence of osteophytes, hallmarks of OA, could be attributable to the reinitiation of this process. One gene that has surfaced both in OA and in musculoskeletal development is PITX1. Contrary to its original moniker, PITX1 is expressed in many tissues beyond the pituitary gland, including bone, cartilage, muscle and fibroblast cells. Pitx1 is considered as a master regulator of hindlimb identity and its complete inactivation in mice leads to a forelimb-like phenotype. Less severe, its partial inactivation results in early OA symptoms in aging mice. In humans, loss of PITX1 expression is observed in OA cartilage concomitantly with the upregulation of EXTL3, REG1 and PARP1. The association between these proteins and tissue regeneration is consistent with the biosynthesis phase initially taking place in OA cartilage. The dose-dependent relationship between PITX1 and cell proliferation supports the view that low PITX1 expression levels are necessary for chondrocytes to proliferate. Conversely, high levels of PITX1 would prevent proliferation and be required to maintain a differentiated state in normal articular chondrocytes. The regulation of PITX1 gene is of particular interest since it could help to better understand its role in osteoarthritis pathogenesis and in the process of endochondral ossification. Search for mechanisms responsible for the downregulation of PITX1 in OA led to the identification of prohibitin (PHB1) bound to its distal promoter region. PHB1 is a mitochondrial marker but its presence in chondrocytes nuclei seems to correlate with the initiation stage of OA. This discovery could impact diagnosis as well as possible treatments for osteoarthritis.

Le cartilage est un tissu conjonctif composé d’une seule sorte de cellule nommée chondrocytes. Ce tissu offre une fondation pour la formation des os. Les os longs se développent par l'ossification endochondral. Ce processus implique la coordination entre la prolifération, la différenciation et l'apoptose des chondrocytes, et résulte au remplacement du cartilage par l'os. Des anomalies au niveau du squelette et des défauts liés à l’âge tels que l’arthrose (OA) apparaissent lorsqu’il y a une perturbation dans l’équilibre du processus de développement. À ce jour, les mécanismes exacts contrôlant la fonction et le comportement des chondrocytes pendant la croissance et le développement du cartilage sont inconnus. Le récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est un facteur de transcription impliqué dans l'homéostasie des lipides. Plus récemment, son implication a aussi été suggérée dans l'homéostasie osseuse. Cependant, le rôle de PPARγ in vivo dans la croissance et le développement du cartilage est inconnu. Donc, pour la première fois, cette étude examine le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la croissance et le développement du cartilage. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle au cartilage du gène PPARγ. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Les analyses des souris ayant une délétion au PPARγ aux stades embryonnaire et adulte démontrent une réduction de la croissance des os longs, une diminution des dépôts de calcium dans l’os, de la densité osseuse et de la vascularisation, un délai dans l’ossification primaire et secondaire, une diminution cellulaire, une perte d’organisation colonnaire et une diminution des zones hypertrophiques, une désorganisation des plaques de croissance et des chondrocytes déformés. De plus, la prolifération et la différenciation des chondrocytes sont anormales. Les chondrocytes et les explants isolés du cartilage mutant démontrent une expression réduite du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF)-A et des éléments de production de la matrice extracellulaire. Une augmentation de l’expression de la métalloprotéinase matricielle (MMP)-13 est aussi observée. Dans les souris âgées ayant une délétion au PPARγ, y est aussi noté des phénotypes qui ressemblent à ceux de l’OA tel que la dégradation du cartilage et l'inflammation de la membrane synoviale, ainsi qu’une augmentation de l’expression de MMP-13 et des néoépitopes générés par les MMPs. Nos résultats démontrent que le PPARγ est nécessaire pour le développement et l’homéostasie du squelette. PPARγ est un régulateur essentiel pour la physiologie du cartilage durant les stades de croissance, de développement et de vieillissement., Cartilage, a connective tissue composed of chondrocytes, provides an intermediate template on which bones are formed. Long bones develop through endochondral ossification, involving coordination between chondrocyte proliferation, differentiation and apoptosis, resulting in bone replacing cartilage. Disturbances in this balance results in skeletal abnormalities, and age-related defects including osteoarthritis (OA). The exact mechanisms that control chondrocyte function and behaviour during growth and development are unknown. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma, a transcription factor involved in lipid homeostasis, has recently been suggested to be involved in bone homeostasis. However, PPARγ’s role in cartilage growth and development in vivo is unknown. Therefore, for the first time, this study examines PPARγ’s specific in vivo role in cartilage growth and development using cartilage-specific PPARγ knockout (KO) mice. Conditional KO mice were generated using LoxP/Cre system. Histomorphometric analyses of embryonic and adult mutant mice demonstrate reduced long bone growth, calcium deposition, bone density, vascularity, and delayed primary and secondary ossification. Mutant growth plates are disorganized with abnormal chondrocyte shape, proliferation and differentiation, reduced cellularity, loss of columnar organization, and shorter hypertrophic zones. Isolated mutant chondrocytes and cartilage explants show decreased vascular endothelial growth factor (VEGF)-A and extracellular matrix (ECM) production product expression, and increased matrix metalloproteinase (MMP)-13 expression. Aged mutant mice exhibit accelerated OA-like phenotypes, and enhanced cartilage degradation, synovial inflammation, MMP-13 and MMP-generated neoepitope expression. Our data demonstrate that PPARγ is required for normal skeletal development and homeostasis, and is a critical regulator of cartilage health and physiology in early growth and development and aging.

La vitamine E (VE) est parfois préconisée pour le traitement de l’arthrose chez le chien, par contre aucune étude n’a documenté cette efficacité. L’objectif de cette étude était de déterminer l’effet d’une forte dose de VE alimentaire sur l’inflammation et la douleur arthrosique chez le chien. Deux groupes de chiens avec arthrose provoquée par section du ligament croisé crânial du membre postérieur droit ; un groupe contrôle (n=8) et un groupe supplémenté avec la VE (n=7), ont été suivis selon un design parallèle, randomisé et en aveugle. La supplémentation a été commencée 1 jour après la chirurgie avec une dose de 400 UI/animal/jour par voie orale pendant 56 jours. Les évaluations objectives (activité électrodermique, EDA) et subjectives (VAS, NRS) de la douleur ont été faites avant la chirurgie J0, à J28 et à J55 après chirurgie. La détermination de la concentration synoviale des marqueurs de l’inflammation (IL-1β, PGE2 et NOx) et l’étude lésionnelle ont été faites après l’euthanasie à J56. Une comparaison unilatérale avec un seuil alpha de 10% a été réalisée. Les concentrations synoviales de PGE2 et de NOx étaient faibles chez le groupe supplémenté en VE par rapport au contrôle (P=0,03 et P, Because of the evidence of some anti-inflammatory and analgesic activities of vitamin E (VE) in human osteoarthritis (OA), this double blind and randomized pilot study used a broad spectrum of clinical and laboratory parameters to investigate whether such beneficial effects could be detected in a canine experimental OA model. Dogs were divided into 2 groups: control group (n = 8) receiving a placebo, and test group (n = 7) receiving orally 400 IU/ animal/ day of VE during 55 days, starting the day after transection surgery of the cranial cruciate ligament. At d56, dogs were euthanized and concentrations of prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide (NO) and interleukin-1β (IL-1β) were measured in synovial fluid samples. Severity of lameness and pain was assessed using a visual analogue scale (VAS), a numerical rating scale (NRS) and electrodermal activity (EDA) at d0, d28 and d55. The size and grade of cartilage macroscopic lesions on femoral condyles and tibial plateaus were evaluated, and the histological severity of cartilage lesions and synovial inflammation was determined. One-side comparison was conducted at an alpha-threshold of 10%. Synovial amounts of NOx and PGE2 were lower in the test group (P < 0.0001 and P = 0.03, respectively). Values of VAS, NRS and EDA showed a consistent trend to be lower in the test group compared to the control, while statistical significance was reached for VAS at d55 and EDA at d28 (adjusted P = 0.07 in both cases). Histological analyses of articular cartilage showed a significant reduction in lesions’ scores in the tested group. For the first time, a study in dog with OA using high dose of VE showed that this supplementation reduces inflammation joint markers and histological expression, as well as tends to improve signs of pain.

La douleur articulaire associée à l’arthrose est un problème clinique majeur, spécialement chez les personnes âgées. L’intensité de la douleur est souvent amplifiée lors de mouvement de l’articulation et principalement lors du soutien de la charge corporelle sur le membre lésé. Malheureusement, les traitements pharmacologiques proposés sont trop souvent associés à des effets secondaires néfastes et à une inefficacité pour le soulagement de la douleur à long terme. Divers modèles murins sont utilisés en laboratoire de recherche pour des études précliniques de molécules aux propriétés analgésiques. Une évaluation comparative de la réponse comportementale douloureuse des animaux d’un modèle d’instabilité articulaire induit par le sectionnement du ligament croisé antérieur accompagné d’une méniscectomie partielle (le modèle ACLT+pMMx) et d’un modèle de dégénérescence articulaire induite par le monoiodoacetate (le modèle MIA) a permis de sélectionner un modèle approprié pour la continuité du projet. Les deux modèles ont démontré des lésions tissulaires, mais le modèle MIA a démontré une réponse douloureuse plus prononcée que le modèle ACLT+pMMx. Par l’analyse de la démarche, le modèle MIA a démontré une boiterie claire dans le patron de la démarche des animaux qui est associée à une lésion unilatérale. Le modèle MIA a donc été choisi pour la suite du projet. La problématique principale dans la recherche sur la douleur associée à l’arthrose est une compréhension incomplète des mécanismes de douleur responsables de l’induction et du maintien de l’état de douleur. Il devient donc nécessaire d’améliorer nos connaissances de ces mécanismes en effectuant une caractérisation plus approfondie des modèles animaux employés pour l’évaluation de stratégies pharmacologiques analgésiantes. Afin de bien comprendre le modèle MIA, une caractérisation des événements moléculaires centraux lors de la progression du processus dégénératif des structures articulaires de ce modèle s’est effectuée aux jours 3, 7, 14, 21 et 28 post injection. Des mécanismes hétérogènes qui modulent l’information nociceptive en fonction de la progression temporelle de la pathologie ont été observés. Les changements du contenu i spinal des neuropeptides sélectionnés (substance P, CGRP, dynorphine A et Big dynorphine) ont débuté sept jours suivant l’injection de MIA. L’observation histologique a démontré que les dommages structuraux les plus importants surviennent entre les jours 14 et 21. C’est entre les jours 7 et 21 que les lésions démontrent le plus de similarités à la pathologie humaine. Cela suggère que lors d’une évaluation préclinique d’un traitement pharmacologique pour pallier la douleur articulaire utilisant le modèle MIA, l’étude doit tenir compte de ces événements afin de maximiser l’évaluation de son efficacité. Puisque les traitements pharmacologiques conventionnels proposés pour le soulagement de la douleur ne font pas l’unanimité en terme d’efficacité, d’effets non désirés et de coûts monétaires parfois onéreux, les molécules de dérivés de plante deviennent une alternative intéressante. L’eugénol, le principal constituant de l’huile de clou de girofle, a été administré oralement pour une période de 28 jours chez des rats ayant reçu l’injection intra-articulaire de MIA afin d’évaluer son efficacité pour le traitement de la douleur articulaire. L’eugénol à une dose de 40 mg/kg s’est révélé efficace pour l’amélioration du patron de la démarche des animaux ainsi que pour la diminution de l’allodynie mécanique secondaire. De plus, les concentrations spinales de neuropeptides pronocicepteurs ont diminué chez les animaux traités. Par une évaluation histopathologique, l’eugénol n’a démontré aucune évidence d’effets toxiques suite à une administration per os quotidienne pour une période prolongée. Ces résultats suggèrent le potentiel thérapeutique complémentaire de la molécule d’eugénol pour le traitement de la douleur articulaire., Pain is the most predominant clinical symptom associated with osteoarthritis (OA), mostly among older people. Joint movement and weight bearing often increase the pain intensity. Unfortunately, the proposed pharmacological treatments are frequently associated with side effects and ineffective for pain alleviation for long time periods. Many murine models are used in laboratories for preclinical studies evaluating analgesic compounds. A comparative evaluation of the behavioral pain responses of animals with a joint instability model induced by the transection of the anterior cruciate ligament followed by a partial menisectomy (the ACLT+pMMx model) and of an articular degenerative model induced by an intra-articular injection of monoiodoacetate (the MIA model) was conducted to select an appropriate model for the continuation of the project. Both models demonstrated articular lésions, however the MIA model demonstrated a clearer behavioral pain response over the ACLT+pMMx model. The gait pattern of the MIA model revealed a clear limping gait similar to that observed with unilateral OA in humans. The MIA model was chosen for the subsequent studies. An unresolved issue in pain OA research is the lack of understanding of the pain mechanisms responsible for the induction and maintenance of the pain. Therefore, there is an urgent clinical need to improve the characterization of animal models to effectively discover novel pain relief pharmacological treatment stratégies for OA patients. A characterization of the spinal pain molecular events during the progression of the joint degenerative process in the MIA model was performed on days 3, 7, 14, 21 and 28 post injection. Heterogeneous nociceptive central molecular events were observed in respect to the time course of the pathology’s progression. Changes in selected spinal neuropeptide content (substance P, CGRP, dynorphin A, Big dynorphin) began 7 days following the MIA injection. Most severe joint structural damage on histology occured between days 14 and 21 post injection. These results suggest that preclinical drug evaluation employing this model should be conducted between 7 and 21 days post injection when the lesions resemble most those of human OA. iii As current pharmacological therapy for the alleviation of joint pain does not achieve the unanimity in respect to efficacy, side effects and cost, plant derivate compounds are now interesting alternatives to improve the situation. Eugenol, the main constituent of clove oil, was evaluated for its efficacy for alleviation of joint pain in rats who previously received an intra-articular injection of mono-iodoacetate to induce the MIA model. Eugenol, administered orally for 28 consecutive days at a dose of 40 mg/kg, improved gait pattern and reduced secondary mechanical allodynia. Furthermore, spinal concentrations of pronociceptive neuropeptides were also decreased in the treated animals. No toxic effects of the compoud were identified on histopathological assessment of the various tissues. These results suggest that eugenol could be a potential therapeutic option for alleviating OA joint pain.

De récents travaux ont mis en évidence une production accrue de Perlecan au stade terminal de l’arthrose ou ostéoarthrite (OA). L’équipe du Dr Moreau a mis en évidence qu’il y a une perte d’expression du facteur de transcription Pitx1 dans l’arthrose et que ce dernier pourrait agir comme un régulateur négatif du gène HSPG2 codant pour le Perlecan. Afin d’étudier la régulation transcriptionnelle de ce gène, des fragments du promoteur proximal ont été clonés en amont du gène rapporteur luciférase et testés en transfections transitoires. Des co-transfections avec des quantités variables de pSI-mPitx1 et avec des constructions comportant des fragments de différentes régions du promoteur mHSPG2 (jusqu’à 3926 pbs en amont de l’ATG) ont démontrées une activité transcriptionnelle et une stimulation de cette activité en présence de Pitx1, avec des résultats variables selon les types cellulaires. Parallèlement, des expériences en qPCR effectuées sur des ostéoblastes dérivés de souris transgéniques surexprimant Pitx1 ont aussi démontré qu’une surexpression de Pitx1 corrèle avec une augmentation de l’expression de p53, une cible connue de Pitx1, et de Perlecan. Le lien qui existe entre Pitx1 et Perlecan est encore très méconnu et la cascade régulatrice impliquant ces deux acteurs n’est pas encore établie. Une meilleure connaissance des mécanismes qui régulent la transcription normale et pathologique du gène HSPG2 permettrait sans aucun doute une avancée dans la compréhension du développement et du rôle possible de Perlecan dans la progression de l’ostéoarthrite., Recent work has shown an increase of Perlecan production associated with the terminal stage of osteoarthritis (OA). Dr Moreau’s team demonstrated a loss of expression of the transcription factor Pitx1 in osteoarthritis suggesting its putative role as a negative regulator of the HSPG2 gene coding for Perlecan. To study the transcriptional regulation of this gene, promoter fragments were cloned upstream of a luciferase reporter gene and tested in transient transfection assays. Co-transfections with variable quantities of pSI-mPitx1 and with constructs made with fragments of different lengths of the mHSPG2 promoter demonstrated a transcriptional activity and enhancement of this activity in presence of Pitx1, with variable results depending on cell types. In addition, expression analysis by qPCR on transgenic mice osteoblasts that overexpress Pitx1 showed that the overexpression of Pitx1 correlates with an augmentation of p53, a known Pitx1 target and Perlecan expression. The link between Pitx1 and Perlecan is still poorly understood and a clear pathway involving those two players is not yet established. A better understanding of mechanisms regulating normal and pathological transcription of the HSPG2 gene encoding for Perlecan would allow a better comprehension of osteoarthritis development and the putative role of Perlecan in its progression.

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative et multifactorielle caractérisée par une destruction de cartilage, une formation d’ostéophytes et une inflammation au niveau de la membrane synoviale. Le 4-hydroxynonénal (HNE), un produit final de la peroxydation lipidique, a été identifié récemment comme un facteur catabolique et un médiateur inflammatoire dans le cartilage arthrosique humain. Notre projet vise à étudier l’effet du HNE sur la régulation de la prostaglandine E2 synthase-1 microsomale (mPGES-1) et de la protéine activante 5-lipoxygénase (FLAP)/5-lipoxygénase (5-LOX) dans les chondrocytes arthrosiques humains. Lorsque les cellules sont traitées une seule fois avec 10 µM HNE, les résultats de Western blot et de PCR en temps réel montrent que l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et de la mPGES-1 augmente de manière significative et atteint respectivement le maximum après 8 et 16 heures d’incubation puis diminue graduellement. Cependant, lorsque les cellules sont traitées plusieurs fois avec 10 µM HNE à 2 heures d’intervalle, l’expression de la COX-2 et de la mPGES-1 augmente en fonction du temps sans subir une baisse après 24 heures d’incubation. Le HNE induit l’activité du promoteur de la mPGES-1 via l’activation du facteur de transcription Egr-1. L’investigation de la 2ème voie du métabolisme de l’acide arachidonique, à savoir 5-LOX/FLAP, montre que le HNE induit l’expression de FLAP après 24 heures de stimulation et celle de 5-LOX seulement après 48 heures. Ceci semble survenir à l’étape de transcription au cours de laquelle HNE induit l’expression de l’ARNm et l’activité du promoteur du gène 5-LOX. Nous avons démontré aussi que le niveau de leukotriène B4 (LTB4) augmente et suit le même profil que celui de la 5-LOX. L’étude des mécanismes moléculaires susceptibles d’être impliqués dans la régulation de la 5-LOX/FLAP par le HNE montre que ce dernier stimule leur expression via l’action de prostaglandine E2 (PGE2) et du facteur de croissance transformant-beta 1 (TGF-β1). En conclusion, notre étude démontre que le HNE induit à court-terme d’incubation la voie de COX-2/mPGES-1 puis par la suite stimule celle de FLAP/5-LOX à long-terme d’incubation dans les chondrocytes arthrosiques humains. Ces résultats suggèrent que la mPGES-1 et 5-LOX/FLAP sont des potentielles cibles thérapeutiques intéressantes pour contrôler la production de PGE2 et LTB4 dans OA., 4-hydroxynonenal (HNE), a lipid peroxidation end-product, is produced abundantly in osteoarthritic (OA) articular tissues. Recently, we reported that HNE-induced cyclooxygenase-2 (COX-2) decreased gradually in human OA chondrocytes after 8 h of incubation. This study aimed to investigate whether COX-2 down-regulation is attributed to HNE depletion and is responsible for the switch from COX-2 to 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP)/5-lipoxygenase (5-LOX). Treatment of chondrocytes with 10 µM HNE induced prostaglandin E2 (PGE2) release as well as COX-2 and microsomal prostaglandin E2 synthase-1 (mPGES-1) expression at the protein and mRNA levels, with a plateau reached at 8-16 h of incubation, followed by a subsequent decline. However, 8 repeated treatments with 10 µM HNE prevented the reduction of COX-2 and mPGES-1 expression. We demonstrated that HNE induced mPGES-1 promoter activity mainly through transcription factor Egr-1 activation. On the other hand, when COX-2 expression decreased, leukotriene B4 (LTB4) level rose after a long period of stimulation (48 and 72 h). At the mRNA level, HNE induced FLAP and 5-LOX expression after 24 and 48 h of stimulation, respectively. The addition of a nonspecific COX-2 inhibitor (naproxen) to cultured chondrocytes revealed that FLAP and 5-LOX regulation by HNE required PGE2 production. Furthermore, our data showed that 10 µM HNE significantly induced transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) production. The addition of anti-TGF-β antibody to culture medium reduced HNE-induced 5-LOX/FLAP expression by 40%, indicating the involvement of a TGF-β1-dependent mechanism. Our data demonstrate that the shunt to the FLAP/5-LOX pathway in HNE-induced human OA chondrocytes is attributed to COX-2 inhibition, probably due to HNE depletion. PGE2 and TGF-β1 are suggested to be involved in this regulation. Further experiments are in progress to determine other molecular mechanisms underlying this switch in OA chondrocytes.

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative à l’étiologie complexe et diverse. Les travaux de ces dernières années ont démontré que l’OA est une pathologie affectant tous les tissus de l’articulation incluant le cartilage, la membrane synoviale et l’os sous-chondral. L’OA se traduit par une déstructuration et une perte de fonctionnalité de l’articulation, et est principalement caractérisée par une perte de cartilage articulaire. L’inflammation de la membrane synoviale joue un rôle déterminant dans la progression de l’OA, toutefois elle serait secondaire à la dégradation du cartilage. De plus, l’os sous-chondral est également le siège de nombreuses transformations lors de l’OA. Il est fortement suggéré que ces changements ne correspondent pas seulement à une conséquence, mais pourraient être une cause du développement de l’OA impliquant une communication entre ce tissu et le cartilage. Il est maintenant bien établi que les voies inflammatoires et cataboliques jouent un rôle crucial dans l’OA. C’est pourquoi, nous avons étudié l’implication d’une nouvelle famille de récepteurs membranaires, les PARs, et plus particulièrement le PAR-2 dans les voies physiopathologiques de l’OA. Notre hypothèse est que l’activation de PAR-2 au cours de l’OA est un phénomène majeur du développement/progression de la maladie faisant du récepteur PAR-2 un candidat privilégié pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement le cartilage mais aussi l’os sous-chondral. Pour cette étude, nous avons travaillé in vitro avec des chondrocytes (Cr) et des ostéoblastes (Ob) OA respectivement du cartilage et de l’os sous-chondral du condyle fémoral humain. Nos résultats ont démontré que PAR-2 était plus exprimé dans les Cr et les Ob OA que dans les cellules normales. Par ailleurs, PAR-2 est régulé positivement par certains facteurs retrouvés au cours de l’OA comme l’IL-1β, le TNF-α et le TGF-β dans les Cr OA, et par l’IL-1β, le TNF-α et la PGE2 dans les Ob OA. De plus, les principaux facteurs cataboliques et inflammatoires, soit la MMP-1, la MMP-13 et la COX-2 sont produits en quantité plus élevée suite à l’activation du récepteur dans le cartilage OA. De même, l’activation de PAR-2 dans les Ob OA conduit à une production accrue de facteurs pro-résorptifs tels que RANKL, l’IL-6, la MMP-1 et la MMP-9, et à l’augmentation de l’activité pro-résorptive de ces cellules. En outre, dans les deux types tissulaires étudiés, l’activation de PAR-2 augmente l’activité de certaines protéines de la famille des MAPKinases comme Erk1/2, p38 et JNK. Finalement, nous avons conclu notre étude en employant un modèle in vivo d’OA induite chez la souris sauvage et déficiente pour le gène PAR-2. Nos résultats ont démontré que l’absence d’expression et de production de PAR-2 influençait le processus inflammatoire et les changements structuraux affectant à la fois le cartilage et l’os sous-chondral, conduisant à un ralentissement du développement de l’OA. Nos travaux de recherche ont donc permis de montrer que le récepteur PAR-2 est un élément majeur du processus OA en agissant sur les voies cataboliques et inflammatoires du cartilage, et sur le remodelage tissulaire de l’os sous-chondral. Mots-clés : Arthrose, chondrocyte, cartilage, ostéoblaste, os sous-chondral, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, résorption osseuse, MAPKinase, catabolisme, inflammation, Osteoarthritis (OA) is a complex degenerative articular disease. Recent studies have shown that OA is a pathology affecting all the tissues of the joint including the cartilage, the synovial membrane and the subchondral bone. OA is regarded as destruction and a loss of functionality of joint, and is mainly characterized by a loss of articular cartilage. The synovial inflammation also plays a key role in the progression of OA; however, it is believed to be secondary to cartilage degradation. In addition, there are also in the subchondral bone numerous changes which occur during the course of the disease. It is strongly suggested that these changes in subchondral bone are not just a consequence but could be a cause of the development of OA, thus involving a cross-talk between this tissue and the cartilage. It is now well established that inflammatory and catabolic pathways play a crucial role during OA. This is why we have engaged the study of the involvement of a new family of membranous receptors, the PARs, and more particularly PAR-2 during the pathophysiological process of OA. Our hypothesis is that PAR-2 activation during OA course is a major phenomenon for the development/progression of the disease, and that PAR-2 seems a suitable candidate for the development of new therapeutic approaches targeting not only the cartilage but also the subchondral bone. Thus, we have performed in vitro studies on OA chondrocyte (Cr) and osteoblasts (Ob) cells issued respectively from human femoral condyle cartilage and subchondral bone. Our results showed that PAR-2 was expressed at a higher level in the OA Cr and Ob compared to normal cells. Moreover, PAR-2 is found to be positively regulated by some factors present during the course of OA, such as IL-1β, TNF-α and TGF-β in the OA Cr, and IL-1β, TNF-α and PGE2 in the OA Ob. In addition, the main catabolic and inflammatory factors including MMP-1, MMP-13 and COX-2 are enhanced following PAR-2 receptor activation in the OA cartilage. Similarly, the activation of PAR-2 in OA Ob lead to an increased production of pro-resorptive factors such as RANKL, IL-6, MMP-1 and MMP-9, and an increased pro-resorptive activity of these cells. In addition, in both tissue types, PAR-2 activation increases the activity of certain protein MAPKinases family such as Erk1/2, p38 and JNK. Finally, we have performed an in vivo study using an OA induced model in wild-type and PAR-2 gene knock-out mice. Our results demonstrated that the absence of PAR-2 expression and production influenced the inflammatory process and structural changes affecting the cartilage and the subchondral bone, leading to a slowing down of OA development. Our research investigation have bring to light that PAR-2 receptor is a key element during OA process by acting on the cartilage catabolic and inflammatory pathways as well as the tissue remodelling of the subchondral bone. Keywords : Osteoarthritis, chondrocyte, cartilage, osteoblast, subchondral bone, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, bone resorption, MAPKinase , catabolism, inflammation

OBJECTIF: Récemment, nous avons démontré que la modification du collagène type II (Col II) par le 4-hydroxynonénal (HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augmentée dans le cartilage arthrosique sans qu’on sache la signification de cette augmentation dans la pathogenèse de l’arthrose. L’objectif de cette étude vise à démontrer que cette modification affecte l’interaction chondrocytes/matrice extracellulaire (MEC) et en conséquence induit des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules. METHODES: Des plaques de culture ont été préalablement cotées avec du Col II puis traitées avec du HNE (0.1-2 mM) excepté le puits contrôle. Les chondrocytes ont été ensuite ensemencés puis incubés pendant 48 heures. La viabilité des cellules est évaluée par le test MTT. Le Western blot est utilisé pour mesurer l’expression des molécules d’adhésion (l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1), de la cyclooxygenase-2 (COX-2), du Col II ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. La RT-PCR en temps réel est utilisée pour mesurer l’expression de l’ARNm de l’ICAM-1, des intégrines α1β1, de la COX-2 et de la métalloprotéinases-13 (MMP-13). La détermination de l’expression de l’ICAM-1 à la surface des cellules est réalisée par cytométrie de flux. Des kits commerciaux ont servi pour mesurer le niveau de la MMP-13, de la prostaglandine E2 (PGE2), de l’activité de la caspase-8 et de la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. RESULTATS: La modification du Col II par 0.2 mM HNE induit significativement l’expression des molécules d’adhésion telles que l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1, de la MMP-13 sans avoir un effet sur la morphologie, la survie et le phénotype cellulaires. Nos résultats montrent aussi une forte augmentation de la phosphorylation de la p38 MAPK, d’ERK1/2 et de NF-κB-p65. Cependant, la modification du Col II par 2 mM HNE affecte la morphologie et la viabilité cellulaires et induit l’activité de la caspase-8. Elle inhibe fortement l’expression des integrines α1β1 et du Col II ainsi que la phosphorylation de l’ERK1/2 et de NF-κB-p65, mais par contre, induit significativement la production de la COX-2 et son produit la PGE2 ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK. Fait intéressant, le prétraitement des complexes HNE/Col II par 0.1 mM de carnosine empêche les changements phénotypiques et fonctionnels des chondrocytes. CONCLUSION : Ces nouveaux résultats suggèrent le rôle important de la modification du Col II par le HNE dans l’arthrose, en affectant le phénotype et le fonctionnement cellulaires des chondrocytes. La carnosine, par sa capacité de neutraliser le HNE, a révélé d’être un agent promoteur dans le traitement de l’arthrose., OBJECTIVE: The regulation of cell phenotype and function by the surrounding environment is deeply altered by the oxidative modifications of extracellular matrix (ECM) components that modify their structural and functional properties. This modification may be one cause involved in cartilage degradation in osteoarthritis (OA). Type II collagen (Col II) was reported to be targeted for 4-hydroxynonenal (HNE) binding, a very reactive product of lipid peroxydation. In the present study, we investigated whether HNE-binding to Col II affects OA chondrocytes phenotype and function and then, we determined the protective role of carnosine treatment in preventing these changes. METHODS: Isolated human OA chondrocytes were seeded in control wells and in HNE/Col II adducts-coated plates and incubated afterwards for 48 hours. Adhesion molecules at protein and mRNA levels were determined by Western blotting, flow cytometry and real-time RT-PCR. Commercial kits were used to evaluate cell death, caspase-8 activity and levels of prostaglandin E2 (PGE2), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), MAPK and NF-κB-p65. Col II, cyclooxygenase-2 (COX-2), MAPK and NF-κB-p65 levels were assessed by Western blotting. RESULTS: After 48 hours of incubation, the modification of Col II by 0.2 mM HNE induced strongly the expression of ICAM-1, integrin α1β1, MMP-13 and slightly COX-2 as well as PGE2 release without affecting cell morphology and viability as well as Col II expression. However, the modification of Col II with 2 mM HNE induced shape changes of cells from typical chondrocyte-like polygon shape to round semi-detached, affecting cells viability and inducing caspase-8 activity. It inhibited the expression of ICAM-1, integrin α1β1 and Col II, but in contrast, induced strongly PGE2 release and COX-2 expression. All these effects were prevented by 0.1 mM carnosine treatment, an HNE trapping drug. Carnosine was added to HNE-modified, Col II-coated plates 1h before cell seeding. Upon examination of different signalling pathways involved in these responses, we found that modified Col II with 2 mM HNE inhibited strongly the phosphorylation of ERK1/2 and NF-κB-p65 but induced strongly p38 MAPK. In contrast, the results indicated that MAPK and NF-κB-p65 were activated when cells were incubated with modified Col II by 0.2 mM HNE. CONCLUSION: The interaction between chondrocytes and collagen-bound HNE modulates different signalling pathways via adhesion molecules regulation and consequently leads to the expression of catabolic and inflammatory factors. Carnosine was shown to be an efficient HNE trapping agent able to counteract these effects.

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie qui touche les articulations principalement chez les personnes âgées. Il devient capital de mieux cerner cette pathologie à cause des coûts économiques qu’elle engendre mais surtout à cause du vieillissement de la population. Cette maladie se caractérise par une dégradation du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, une inflammation de la membrane synoviale ainsi que la présence d’ostéophytes. L’étiologie de cette pathologie est restée nébuleuse car la recherche sur la maladie touchait principalement le cartilage articulaire. Toutefois, le rôle clé de l’os sous-chondral dans l’OA est maintenant reconnu. L’obésité étant un facteur de risque de l’OA, nous avons émis l’hypothèse que la leptine, une adipocytokine clé dans l’obésité, joue un rôle important dans l’OA. En effet, la leptine modifie le phénotype des ostéoblastes (Ob) normaux humain et puisque les Ob OA humains ont un phénotype altéré, notre objectif était de déterminer le rôle potentiel de la leptine dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons préparé des cultures primaires d’Ob issus de la plaque sous-chondral du plateau tibial de patients OA et d’individus normaux (N). L’expression de la leptine et de son récepteur actif (OB-Rb) ont été mesurées par RT-PCR en temps réel, et leur production a été mesurée par ELISA et immunobuvardage (IB). La prolifération des Ob OA a été déterminée par incorporation de BrdU. La phosphorylation de p42/44 MAPK dans les Ob OA a été déterminée par IB. Le phénotype des Ob fut déterminé par la mesure de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) et la sécrétion d’ostéocalcine (OC), en présence ou non de leptine. De plus, les effets des ARNs d’interférences (SiRNA) anti-leptine et anti OB-Rb sur le phénotype des Ob OA furent déterminés via leur impact sur l’activité de l’ALP et sur la sécrétion d’OC. L’effet dose-réponse de la leptine sur les expressions d’OB-Rb, du facteur de croissance TGF-1 ou encore sur sa propre expression furent déterminées par RT-PCR en temps réel. Pour terminer, la signalisation de la leptine a été étudiée en évaluant l’effet dose réponse de celle-ci sur la production des protéines JAK2 et STAT3 phosphorylées par IB. Les résultats obtenus ont montrés que les Ob OA expriment et produisent plus de leptine que les Ob N. Au niveau phénotypique, ces Ob OA possèdent une activité de l’ALP ainsi qu’une sécrétion d’OC plus importante que celles observées chez les Ob N. L’ajout d’anticorps inactivant l’interaction leptine et OB-Rb ou d’inhibiteurs chimiques comme tyrphostin ou piceatannol diminuèrent l’activité de l’ALP ainsi que la sécrétion d’OC dans les Ob OA. Par contre, l’ajout de leptine exogène aux Ob OA augmenta l’activité de l’ALP sans pour autant faire varier la sécrétion d’OC. La leptine à des doses de 1ng/ml à 10mg/ml stimula la prolifération des Ob OA ainsi que la phosphorylation de p42/44 MAPK. La leptine exogène diminua l’expression de TFG-1 tandis qu’elle stimula la phosphorylation de JAK2 et STAT3 ou encore sa propre expression de manière dose-dépendante. Cependant, l’expression d’OB-Rb diminua de manière dose-dépendante. Enfin, le traitement des Ob OA avec des Si leptine ou Si OB-Rb diminua l’activité d’ALP, la sécrétion d’OC, l’expression de la leptine, l’expression d’OB-RB ainsi que l’expression du facteur TGF-1. L’ensemble de ces données démontre que la leptine endogène des Ob OA est sous contrôle des facteurs de croissance et qu’elle contribue à maintenir le phénotype anormal de l’os sous-chondral OA. De plus, ceci suggère que la leptine serait un acteur important dans la régulation du remodelage osseux., Osteoarthritis (OA) is a disease which mainly affects the joints in the elderly. It becomes essential to better understand this disease because of the economic costs it brings, but mainly because of population aging. This disease is characterized by a deterioration of cartilage, bone sclerosis, inflammation of the synovial membrane and the presence of osteophytes. The knowledge of its etiology has remained incomplete because research on this disease focused mainly on the articular cartilage. However, the key role of subchondral bone in OA is now recognized. Obesity is a risk factor for OA, then we hypothesized that leptin, a key adipocytokine in obesity plays an important role in OA. Indeed, leptin alters the phenotype of osteoblasts (Ob) and human Ob has altered phenotype in OA patients, our objective was to determine the potential role of leptin in OA Ob. To do this, we prepared primary cultures of Ob from the sub-chondral plate of the tibial plateaus of OA patients and normal individuals (N). The expression of leptin and its receptor active (OB-Rb) were measured by RT-PCR in real time, and their production was measured by ELISA and western blot (WB). The proliferation of Ob OA was determined by BrdU incorporation. The phosphorylation of p42/44 MAPK was evaluated by WB. The phenotype of Ob was determined by measuring the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the secretion of osteocalcin (OC), in the presence or absence of leptin. Moreover, the effects of small interference RNAs (siRNAs) anti-leptin and anti OB-Rb on the phenotype of OA Ob were determined through their impact on the activity of the ALP and the secretion of OC. The dose-response effect of 1eptin on its own expression or the expressions of OB-Rb, the growth factor TGF-β1 were determined by RT-PCR in real time. Finally, signalisation of leptin in OA Ob was studied by evaluating the dose-response effect of this on the production of JAK2 and STAT3 protein phosphorylated by WB. The results showed that the OA Ob express and produce more leptin than N. Moreover, these Ob OA have an activity of the ALP and a secretion OC higher than those observed in N Ob. The addition of antibodies inactivating interaction leptin and OB-Rb or chemical inhibitors such as tyrphostin or piceatannol diminished the activity of the ALP and the secretion of OC in OA Ob against by the addition of exogenous leptin to Ob OA increased the activity of the ALP without influencing the secretion of OC. Leptin at doses of 1ng/ml to 10mg/mL stimulated the proliferation of OA Ob and the phosphorylation of p42/44 MAPK. Exogenous leptin decreased the expression of TGF-β1 while it stimulated the phosphorylation of JAK2 and STAT3 and expression of its own in dose-dependent manner. However, the expression of OB-Rb decreased in dose-dependent. Finally, the treatment of OA Ob with Si leptin or Si OB-Rb decreased activity of ALP, the secretion of OC, the leptin expression, expression of OB-Rb and the expression of TGF-β1 factor. All these data show that endogenous leptin Ob OA controls the growth factors and contributes to maintaining the abnormal phenotype of the subchondral bone OA. Moreover, this suggests that leptin is an important player in the regulation of bone remodelling

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