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[ES] Saccharomyces cerevisiae es ampliamente utilizada como modelo eucariota debido a su rápido crecimiento y alto grado de conservación con respecto a los mamíferos. El modo de crecimiento vegetativo más común en S. cerevisiae es la reproducción asexual por gemación. Sin embargo, bajo condiciones de estrés por falta de nutrientes, las células diploides son inducidas a sufrir meiosis y esporulación formando cuatro células haploides. Estos eventos están altamente regulados para garantizar la supervivencia celular, siendo los patrones específicos de expresión génica cruciales para la inducción correcta de la meiosis. Uno de los pasos más importantes durante la expresión génica es la síntesis de todos los ARNm realizada por la ARN polimerasa II (RNAPII), complejo multiproteico que forma el núcleo de la maquinaria de transcripción. Además de la RNAPII, se requiere una amplia gama de factores de transcripción y complejos de proteínas para dirigir la RNAPII a los promotores génicos y comenzar la transcripción. Uno de ellos es el complejo de factores asociados a la polimerasa (PAF1c). PAF1c está formado por 5 subunidades y es requerido para la monoubiquitinación de la histona H2B y la metilación de H3K4, dos de las modificaciones epigenéticas más importantes en las histonas. Curiosamente, PAF1c no solo es importante para la transcripción durante el crecimiento vegetativo, sino que mutaciones en algunas subunidades indican que también es importante en la formación de rupturas bicatenarias (DSB) de cromosomas meióticos, un evento importante que ocurre en la profase I. El objetivo de este proyecto es hacer un estudio bibliográfico de las funciones de las proteínas involucradas en la transcripción, que recientemente se ha descubierto que participan en eventos meióticos tempranos, así como algunas modificaciones epigenéticas implicadas en este proceso. Se construye un interactoma in silico entre PAF1c y una proteína implicada en la ubiquitinación de H2B y la metilación de H3K4, Mog1, para establecer algunas conexiones entre la regulación y la meiosis. Por último, el estudio de estas proteínas y complejos en la levadura resulta útil porque los ortólogos humanos se pueden sobreexpresar en algunos tipos de cáncer, como el carcinoma paratiroideo (PC) y otros trastornos del desarrollo., [EN] Saccharomyces cerevisiae is widely used as a eukaryotic model because of its fast growth and high degree of conservation with regard to mammals. The most common mode of vegetative growth in S. cerevisiae is asexual reproduction by budding. However, under high-stress nutrient starvation, diploid cells are induced to undergo meiosis and sporulation forming four haploid cells. These events are highly regulated to ensure cell survival. In these lines, specific patterns of gene expression are crucial to guarantee the correct induction of meiosis. One of the most important steps during gene expression is the synthesis of all mRNAs carried out by the RNA polymerase II (RNAPII), which is a multiprotein complex that forms the core of the transcription machinery. In addition to RNAPII, a wide range of transcription factors and protein complexes are required for targeting RNAPII to upstream gene promoters and begin transcription. One of them is the polymerase associated factor complex (PAF1c). PAF1c is formed by 5 subunits and it is required for the monoubiquitination of histone H2B and the methylation of H3K4, two of the most important epigenetic modifications in histones. Interestingly, PAF1c is not only important for transcription during vegetative growth, but mutations in some subunits indicate it to be also important in the formation of double-stranded breaks (DSBs) of meiotic chromosomes, an important event that occurs in prophase I. The aim of this project is to do a bibliographical study of the moonlighting functions of proteins involved in transcription, which have been recently discovered to participate in early meiotic events as well as some epigenetic modifications implied in this process. An in silico interactome between PAF1c and a protein involved in H2B ubiquitination and H3K4 methylation, Mog1, is constructed to establish some connections between regulation and meiosis. Last, the study of these proteins and complexes in yeast is useful because human orthologs can be found overexpressed in some cancers, like parathyroid carcinome (PC) and other development pathologies.

[EN] Mog1 was first described as a Gsp1-binding protein involved in nuclear protein import both in humans and yeast, being Gsp1 the homologue of the human Ran-GTPase. Later, it was found that human Mog1 also regulates the traffic of Nav1.5, the ¿-subunit of the cardiac sodium channel, that has been associated with Brugada syndrome, a cardiac disease. Recently, it has been discovered that Mog1 regulates mRNA transcription and export to the cytoplasm in Saccharomyces cerevisiae by participating in the establishment of epigenetic marks during transcription, specifically H2B monoubiquitylation on lysine 123 (H2Bub1) and H3 trimethylation on lysine 4 (H3K4me3). These post-translational modifications (PTMs) are correlated with actively transcribed genes, being important for transcription elongation, amongst other functions. In addition, there is a crosstalk between H2Bub1 and H3K4me3 since H2Bub1 has been shown to stimulate H3K4me3. However, the exactly molecular mechanism explaining why these PTMs enhance transcription is not fully understood, although some mechanisms have been proposed in which several proteins and complexes are involved. How Mog1 participate in this process is unknown but it was proposed that it is independent on its role in Gsp1 binding, suggesting the existence of two cellular pools of Mog1 protein. Moreover, it has been shown that two subunits of the COMPASS complex, Shg1 and Sdc1, and histones H2B1, H3 and H4, amongst other proteins, co-precipitate with Mog1-Tap tagged. The interaction between Shg1 and Mog1 has been validated through a genome wide Shg1 two-hybrid screening, finding a region in Mog1 between amino acids residues 114 and 154 as the putative binding domain. Part of this region is located in a long loop connecting two beta sheets where there is a tryptophan residue at position 145 especially exposed. Therefore, it is interesting to study if this loop and, especially, W145 are important for Mog1-Shg1 binding. On the other hand, Mog1 co-immunoprecipitation with histones H2B1, H3 and H4 revealed that Mog1 could participate in the establishment of H2Bub1 and H3K4me3 by directly or indirectly binding histones. Of especial interest is H2B because of H3-K4 trimethylation dependency on H2B-K123 monoubiquitylation. Consequently, it is important to clarify if Mog1 interacts with H2B directly and if so, to determine the interaction domain. Furthermore, it was found in a screening that lysine at position 189 in Mog1 can be ubiquitylated which points Mog1 as a putative substrate for posttranslational modifications. Therefore, the main objective of this study is to gain knowledge about the role of Mog1 in the modulation of histone epigenetic modifications H2Bub1 and H3K4me3 by, on the one hand, analysing the phenotypic effect of several Mog1 mutants and, on the other hand, characterising histone H2B-Mog1 interaction., [ÈS] Mog1 fue descrita por primera vez como una proteína de unión a Gsp1, proteína homóloga a Ran- GTPasa en humanos, que participa en la importación de proteínas al núcleo tanto en levadura como en humanos. Más tarde, se encontró que, en humanos, Mog1 regula el tráfico de Nav1.5, la subunidad α del canal de sodio cardiaco, que ha sido asociada con el síndrome de Brugada, una enfermedad cardiaca. Recientemente, se ha descubierto que Mog1 también regula la transcripción y exportación del ARNm en Saccharomyces cerevisiae mediante la participación en el establecimiento de marcas epigenéticas durante la transcripción. Estas modificaciones postraduccionales (PTMs por sus siglas en inglés) son la monoubiquitinación de H2B en la lisina 123 o H2Bub1 y la trimetilación de la histona H3 en la lisina 4 o H3K4me3 que están relacionadas con genes activamente transcritos y son importantes en la elongación transcripcional, entre otras funciones. Además, existe una intercomunicación entre H2Bub1 y H3K4me3 ya que se ha demostrado que H2Bub1 estimula la trimetilación de H3 en K4. Sin embrago, no se ha caracterizado todavía un mecanismo molecular que explique por qué estas PTMS aumentan la transcripción, aunque varios mecanismos se han propuesto englobando varias proteínas y complejos. Se desconoce cómo Mog1 participa en este proceso, pero se ha propuesto que esta función es independiente a su unión a Gsp1, sugiriendo la existencia de dos pools celulares de Mog1. Además, se ha encontrado que dos subunidades del complejo COMPASS, Shg1 y Sdc1, y las histonas H2B1, H3 y H4, entre otras proteínas, coprecipitan en un ensayo con Mog1 con cola Tap. La interacción entre Mog1 y Shg1 ha sido validada en un ensayo de doble híbrido empleando Shg1 como la proteína bait, en el que además se describió una región en Mog1 entre los aminoácidos 114 y 154 como posible dominio de interacción. Parte de esta secuencia está localizada en una región de bucle que conecta dos láminas beta y que contiene un triptófano en posición 145 con su cadena lateral especialmente expuesta. Por lo tanto, es interesante estudiar si esta región de bucle y, en concreto, W145 son importante para la interacción entre Mog1 y Shg1. Por otra parte, la co-inmunoprecipitación de Mog1 e histonas H2B1, H3 y H4 sugiere que Mog1 podría desempeñar su función en el establecimiento de H2Bub1 y H3K4me3 interaccionando directa o indirectamente con las histonas. H2B es de especial interés por su influencia en la trimetilación de H3 en K4. Por ello, es importante estudiar si Mog1 interacciona con H2B directamente y en tal caso, determinar el dominio de interacción. Además, un estudio ha encontrado que la lisina 189 en Mog1 puede estar ubiquitinada, indicando que Mog1 también puede ser sustrato para las modificaciones postraduccionales. En consecuencia, el objetivo principal del presente estudio es indagar en la implicación de Mog1 en el establecimiento de las marcas epigenéticas H2Bub1 y H3K4me3 mediante el análisis del efecto fenotípico de varias mutaciones en la proteína Mog1, y la caracterización de la interacción entre la histona H2B y Mog1.

El glutatión (GSH) es el antioxidante no enzimático más abundante en las células de mamífero, constituido por un tripéptido glutamato-cisteína-glicina. Gracias al grupo sulfhidrilo de la cisteína, actúa como donador de electrones para reducir enlaces disulfuro entre cisteínas, reaccionar con especies reactivas de oxígeno mediante su grupo tiol oxidándose a glutatión disulfuro (GSSG)- o para convertir el peróxido de hidrógeno en dos moléculas de agua inocua para la célula mediante la acción de la enzima glutatión peroxidasa, entre otros antioxidantes enzimáticos. No obstante, en la actualidad se están estudiando otras funciones relacionadas con el GSH como es el caso de las modificaciones postraduccionales glutationilación de proteínas o su relación con la regulación epigenética, dado que algunas moléculas y metabolitos intermediarios de la síntesis de glutatión lo son a su vez de las rutas de metilación de ADN e histonas. Con la finalidad de analizar la relación entre el nivel de estado redox celular debido a niveles de GSH y la alteración de modificaciones postraduccionales en histonas, se ha optimizado un protocolo para disminuir la concentración de GSH celular mediante tratamiento con diamida en células HeLa, y se ha analizado mediante citometría de flujo, fluorimetría y microscopía de fluorescencia. En algunas patologías de carácter progeroide, caracterizadas por cursar con envejecimiento prematuro y en las que se ha observado alteraciones en la estructura de la cromatina, se ha comprobado que uno de los factores de relevancia es el estrés oxidativo que padecen a nivel celular, además de mostrar niveles disminuidos de GSH. Por esta razón, paralelamente se ha trabajado con líneas de fibroblastos humanos dos controles y un paciente de la patología progeroide síndrome de Werner analizando tanto enzimas antioxidantes, como modificaciones en histonas., Glutathione (GSH) is the most abundant non-enzymatic antioxidant in mammalian cells, constituted by a glutamate-cysteine-glycine tripeptide. Thanks to its sulfhydryl residue, acts as an electron donor to reduce disulfide bonds between cysteines, to react with reactive oxygen species by means of its thiol group, or to convert hydrogen peroxide into two molecules of water -safe for the cell- through the action of the enzyme glutathione peroxidase, among other antioxidant enzymes. However, other functions related to GSH are currently being studied, as is the case of post-translational modifications protein glutathionylation- or its relation to epigenetic regulation, since some molecules and intermediate metabolites in the synthesis of glutathione are also involved in DNA and protein methylation pathways. In order to analyze the relationship between the cellular redox state due to GSH levels and alterations in histone posttranslational modifications, a treatment has been optimized to reduce cellular GSH concentration by treatment with diamide in HeLa cells, and the effect has been analyzed by flow cytometry, fluorimetry, and fluorescence microscopy. In some pathology with progeroid features, characterized by premature ageing and in which alterations in chromatin structure have been observed, it has been shown that one of the relevant factors is the oxidative stress they show at the cellular level, besides having reduced levels of GSH. For this reason, in parallel we have worked with human fibroblast cell lines two controls and a patient with Werner syndrome analyzing antioxidant enzymes and modifications in histones.

[EN] Chromatin packaging is linked with the genome sequence, molecular mechanisms and biological properties of cells. We hypothesize that the histone proteins packaging cold-living eukaryotes (psychrophiles) have enhanced flexibility over mesophiles such as commonly studied animals and fungi, whereas the histones of warm adapted eukaryotes (thermophiles) have enhanced stability compared to mesophiles. In this project we will use synthetic genes to recombinantly express and purify histones with sequence of the Antarctic fish Notothenia coriiceps living below 4ºC and the fungus Chaetomium thermophilum with optimum living temperature of 60ºC. We attempted to assemble these into histone octamers and nucleosomes to enable comparison of their properties with human equivalents., [ES] La compactación de la cromatina está relacionada con la secuencia genómica, los mecanismos moleculares y las propiedades biológicas de las células. Se hipotetiza que el compactamiento de las proteínas histonas de los animales eucariotas adaptados al frio (psicrófilos) han ganado en flexibilidad frente a los mesófilos. En cambio las histonas de los eucariotas adaptados a altas temperaturas (termófilos) como los hongos han ganado en estabilidad en comparación frente a los mesófilos. En este proyecto genes recombinantes serán usados para expresar y purificar las histonas del pez de la Antartida Notothenia coriiceps que vive por debajo de los 4ºC y el hongo Chaetomium thermophilum con una temperatura óptima de desarrollo de 60ºC. Se ensamblaran estas histonas en octámeros y nucleosomas para permitir la comparación de sus propiedades con sus equivalentes humanos.

[ES] En los últimos años se ha descrito la participación de las histonas en procesos extracelulares implicados en la inflamación. Las histonas, liberadas de forma controlada por neutrófilos, participan en la inmovilización y eliminación de patógenos por las células del sistema inmunológico. Además, las propias histonas presentan un efecto citotóxico mediado por mecanismos aún no esclarecidos que facilitan el proceso inflamatorio y la respuesta inmunológica. Además, la presencia de histonas produce efectos nocivos sobre las células del endotelio de los vasos sanguíneos, por lo que las histonas circulantes se han visto implicadas, por ejemplo, en procesos de sepsis. En enfermedades con carácter autoinmune como el lupus sistémico eritomatroso (LSE) se han encontrado autoanticuerpos circulantes con especificidad hacia histonas, nucleosomas y otras proteínas nucleares; sin embargo, hasta la fecha se desconoce qué tipo de modificaciones postraduccionales concretas sufren las histonas implicadas en enfermedad, más allá de una participación de histonas citrulinadas o hiperacetiladas en LSE. En el presente trabajo se analizarán los patrones de modificaciones presentes en histonas obtenidas a partir de tejidos de ratones modelo de LSE, y se testeará el efecto citotóxico específico de histonas sometidas a modificaciones similares sobre células endoteliales humanas., [EN] Participation of histones in extracellular processes related to inflammation has been described in recent years. Through their release in a controlled manner by neutrophils, histones take part in the immobilization and elimination of pathogens by immune cells, being key components in the so-called neutrophil extracellular traps (NETs). Besides, histones themselves show a cytotoxic effect induced by mechanisms not fully understood, that contributes to the inflammatory processes and immune responses. However, the presence of histones yields at the same time noxious effects on the endothelial cells of blood vessels, in such a way that plasma histones have been demonstrated to be involved in pathological processes like sepsis, in which prolonged inflammatory response occurs. Nevertheless, which kind of specific postranslational modifications in histones are implicated in disease remains currently unknown, with the exception of the presence of some citrullinated or hyperacetylated histones in systemic lupus erythematosus, for instance. Postranslational modifications of histones contribute to the modulation of gene expression either by allowing or blocking the access to chromatin for the transcription machinery, being one of the key mechanisms underlying epigenetic regulation and, hence, of great relevance for the study of cellular responses to specific environmental conditions. In the present work, the modification pattern present in histones obtained from human cell extracts will be analyzed, and a purification methodology for histones with specific postranslational modifications will be set, in order to evaluate the differences in the cytotoxic capability of the distinct histone types, and the diverse postranslational modifications they might show, on human endothelial cells.