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[ES] La lesión medular (LM) es un trastorno neurológico devastador y debilitante que se caracteriza por un grado variable de disfunción motora, sensorial y/o autonómica permanente. El trasplante de células madre neurales (NSC) ofrece una herramienta terapéutica prometedora para el tratamiento de la LM al proporcionar neuroprotección y neuroregeneración. Sin embargo, el entorno generado tras la lesión limita el potencial terapéutico de las terapias celulares al dar lugar a una escasa supervivencia y engraftment de las células y a una diferenciación inadecuada. Además, las terapias celulares han mostrado hasta la fecha una recuperación funcional limitada en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se ha postulado el uso de terapias combinatorias para superar estas limitaciones y potenciar los beneficios terapéuticos de las terapias celulares. En esta tesis doctoral, se han estudiado distintas estrategias de combinación con el trasplante de NSC, como el uso de fármacos y biomateriales, con el objetivo de mejorar y potenciar el efecto de la terapia celular en el rescate de la actividad neuronal, en la modulación del proceso inflamatorio, en la supervivencia del trasplante, así como en su integración y diferenciación en el tejido medular. Así, En el capítulo 1 evaluamos la terapia combinada de células madre neurales humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-NSCs), células madre mesenquimales (MSCs) y un nanoconjugado de curcumina (PA-C) en un modelo de LM subagudo, proporcionando un mayor grado de neuroprotección en comparación con los tratamientos individuales. En el capítulo 2 desarrollamos una estrategia mínimamente invasiva mediante el uso de un scaffold de ácido hialurónico en forma de semi-luna para el transplante de iPSC-NSCs combinado con PA-C. Así, los análisis histológicos demostraron que el tratamiento combinado de iPSC-NSCs y la PA-C presentaban una mayor preservación de fibras neuronales en la zona de la lesión y una reducción de la extensión de la cicatriz fibrótica. Por último, en el capítulo 3 se describe una estrategia terapéutica que se aproxima más a la traslación clínica mediante el trasplante de progenitores neurales fetales humanos (hfNPCs) condicionados previamente con una forma conjugada del inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS). Así, la combinación de las hfNPCs con el PGA-SS-FAS favoreció la migración del transplante en el tejido medular, la preservación de las interneuronas somatosensoriales Lbx1 inhibitorias y las Tlx3 excitatorias, así como la activación neuronal alrededor del epicentro de la lesión. Así pues, en la presente tesis doctoral se estudia y describe el beneficio aportado por tres estrategias combinatorias, que incrementan los efectos neuroprotectores proporcionados por la terapia celular en el tratamiento de lesiones medulares agudas y sub-agudas., [CA] La lesió medul·lar (LM) és un trastorn neurològic devastador i debilitant que es caracteritza per un grau variable de disfunció motora, sensorial i/o autonòmica permanent. El trasplantament de cèl·lules mare neurals (NSC) ofereix una eina terapèutica prometedora per al tractament de la LM proporcionant neuroprotecció i neuroregeneració. Tot i això, l'entorn generat després de la lesió limita el potencial terapèutic de les teràpies cel·lulars donant lloc a una escassa supervivència i engraftment de les cèl·lules i a una diferenciació inadequada. A més, les teràpies cel·lulars han mostrat fins ara una recuperació funcional limitada als assajos clínics. Per tant, s'ha postulat l'ús de teràpies combinatòries per superar aquestes limitacions i potenciar els beneficis terapèutics de les teràpies cel·lulars. En aquesta tesi doctoral, s'han estudiat diferents estratègies de combinació amb el trasplantament de NSC, com ara l'ús de fàrmacs i biomaterials, amb l'objectiu de millorar i potenciar l'efecte de la teràpia cel·lular en el rescat de l'activitat neuronal, en la modulació del procés inflamatori, en la supervivència del trasplantament, així com en la seva integració i diferenciació al teixit medul·lar. Així, Al capítol 1 avaluem la teràpia combinada de cèl·llules mare neurals humanes derivades de cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSC-NSCs), cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) i un nanoconjugat de curcumina (PA-C) en un model de LM subagut, proporcionant un major grau de neuroprotecció en comparació dels tractaments individuals. Al capítol 2 desenvolupem una estratègia mínimament invasiva mitjançant l'ús d'un scaffold d'àcid hialurònic en forma de semilluna per al trasplantament d'iPSC-NSC combinat amb PA-C. Així, els anàlisis histològics mostraren que el tractament combinat d'iPSC-NSCs i la PA-C incrementaba la preservació de fibres neuronals a la zona de la lesió i reduïa l'extensió de la cicatriu fibròtica. Finalment, al capítol 3 es descriu una estratègia terapèutica que s'aproxima més a la translació clínica mitjançant el trasplantament de progenitors neurals fetals humans (hfNPCs) condicionats prèviament amb una forma conjugada de l'inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS. Així, la combinació de les hfNPCs amb el PGA-SS-FAS va afavorir la migració del trasplantament al teixit medul·lar, la preservació de les interneurones somatosensorials Lbx1 inhibitòries i les Tlx3 excitatòries, així com l'activació neuronal al voltant de l'epicentre de la lesió. Així doncs, en aquesta tesi doctoral s'estudia i descriu el benefici aportat per tres estratègies combinatòries, que incrementen els efectes neuroprotectors proporcionats per la teràpia cel·lular en el tractament de lesions medul·lars agudes i sub-agudes., [EN] Spinal cord injury (SCI) is a devastating and debilitating neurological disorder characterized by a variable degree of permanent motor, sensory and/or autonomic dysfunction. Neural stem cell (NSC) transplantation offers a promising therapeutic tool for the treatment of SCI by providing neuroprotection and neuroregeneration. However, the environment generated after injury limits the therapeutic potential of cell therapies by resulting in poor cell survival and engraftment and inadequate differentiation. In addition, cell therapies have shown limited functional recovery in clinical trials to date. Therefore, the use of combinatorial therapies has been postulated to overcome these limitations and enhance the therapeutic benefits of cell therapies. In this doctoral thesis, we have studied different combination strategies with NSC transplantation, such as the use of drugs and biomaterials, with the aim of improving and enhancing the effect of cell therapy in the rescue of neuronal activity, in the modulation of the inflammatory process, in the survival of the transplant, as well as in its integration and differentiation in the medullary tissue. Thus, In Chapter 1 we evaluated the combined therapy of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells (iPSC-NSCs), mesenchymal stem cells (MSCs) and a curcumin nanoconjugate (PA-C) in a subacute LM model, providing a higher degree of neuroprotection compared to single treatments. In Chapter 2, we developed a minimally invasive strategy by using a demilune hyaluronic acid scaffold for combined transplantation of iPSC-NSCs with PA-C. Thus, histological analyses demonstrated that the combined treatment of iPSC-NSCs and PA-C exhibited increased preservation of neuronal fibers in the lesion area and a reduction in the extension of the fibrotic scar. Finally, Chapter 3 describes a therapeutic strategy that more closely approximates clinical translation by transplanting human fetal neural progenitors (hfNPCs) preconditioned with a conjugated form of the Rho/Rock inhibitor fasudil (PGA-SS-FAS). Thus, the combination of hfNPCs with PGA-SS-FAS favored transplant migration within the spinal parenchyma, preservation of endogenous inhibitory Lbx1 and excitatory Tlx3 somatosensory interneurons, as well as endogenous neuronal activation around the lesion epicenter. Thus, this PhD thesis studies and describes the benefit provided by three combinatorial strategies, which increase the neuroprotective effects provided by cell therapy in the treatment of acute and sub-acute spinal cord injury., This research was funded by Fundació Marató TV3 2017/refs.20172230, 20172231 and 20172110; FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación–Agencia Estatal de Investigación “RTI2018- 095872-B-C21/ERDF”, Agencia Valenciana de Innovación (AVI) INNVAL10/19/047 and TERCEL (RD12/0019/0011) funds from the Instituto de Salud Carlos III of Spain; Science by Women program, Women for Africa Foundation to HE and the grants FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-B-C21 and –C22/ERDF]; RISEUP project FetOpen in H2020 Program: H2020-FETOPEN-2018-2019-2020-01 and by Grants RTI2018-095872-B- C21 and PDI2021-1243590B-I00/ERDF funded by MCIN/AEI//10.13039/501100011033 and by ERDF A way of making Europe). This project was also funded by Project 964562 (RISEUP), H2020 FetOpen program

[ES] La nefropatía diabética es una de las complicaciones microvasculares más relevantes en el desarrollo de la diabetes mellitus. Actualmente, esta patología es una de las principales causas que llevan al fallo renal, por lo que profundizar en su estudio para establecer mejores diagnósticos y frenar su progreso, se ha convertido en un objetivo de gran interés para reducir el impacto de esta enfermedad. La hiperglucemia que la caracteriza es capaz de desencadenar efectos adversos en nuestro organismo, afectando principalmente a la actividad del riñón, puesto que puede comprometer la estructura de la barrera de filtración glomerular, que resulta clave en el correcto funcionamiento del glomérulo, siendo los podocitos unos de los componentes más afectados. Uno de los procesos más relevantes en el mantenimiento de la homeostasis y polarización celular de los podocitos es la comunicación intracelular a través del transporte vesicular. Se ha demostrado que las vesículas extracelulares, tales como los exosomas, desempeñan un papel fundamental en diversas enfermedades, siendo su cargo (proteínas, lípidos o microARNs entre otros) objeto de estudio como biomarcadores o dianas terapéuticas. El tráfico vesicular está regulado por algunas proteínas como las Rab GTPasas, de entre las cuales cabe destacar el sistema Rab3A-Rab27A, que ha sido descrito en diversos estudios en los procesos de transporte y exocitosis vesicular. Por todo ello, en este trabajo, se llevó a cabo el silenciamiento génico de ambas Rab mediante ARN de interferencia en podocitos tratados con concentraciones elevadas de glucosa, simulando las condiciones que se producen durante el desarrollo de diabetes. Para el estudio del efecto de esta inhibición, en primer lugar, se caracterizaron los podocitos y los exosomas objeto del posterior estudio. Por otro lado, se estudiaron los cambios ocurridos en el citoesqueleto de actina y la distribución de exosomas marcados con CD63 en el citoplasma de los podocitos mediante microscopía confocal así como el efecto sobre la expresión de los microARNs: miR-26a, miR-21-5p y miR-31-5p. Los resultados muestran que el silenciamiento de ambas Rab y el tratamiento con glucosa afecta a la organización del citoesqueleto y a la distribución de los marcadores exosomales en el citoplasma celular. Además, también se observó una alteración en los niveles de expresión de los microARNs estudiados en estas condiciones. Estos resultados sugieren que el sistema Rab3A-Rab27A, a través de su implicación en el tráfico vesicular, tendría un papel relevante en el daño podocitario ya que su inhibición parece reducir en cierta manera el daño ocasionado por el estrés por glucosa., [EN] Diabetic nephropathy is one of the most relevant microvascular complications of diabetes mellitus. Currently, this pathology is one of the main causes leading to renal failure. Therefore, to improve diagnosis and halt its progress, further research is required to reduce the impact of the disease on human health. Hyperglycaemia is capable of triggering adverse effects in the organism, affecting kidney activity. It can endanger the structure of the glomerular filtration barrier, which is essential for the proper functioning of the glomerulus, where podocytes are one of the most affected components. Homeostasis and cell polarisation in podocytes are important processes that are held by intracellular communication through vesicular transport, in which Rab GTPase proteins are involved. Extracellular vesicles, such as exosomes, are involved in many diseases. Their cargos (proteins, lipids or microRNA among others) are considered potential biomarkers and therapeutic targets. Vesicular traffic is regulated by different types of proteins, such as Rab GTPases. Specifically, the Rab3A-Rab27A system has been described in transport and exocytosis processes in many research studies. Therefore, in this work, gene silencing effect of both Rabs by interference RNA in podocytes treated with high glucose concentrations was studied. To understand the effect of this inhibition, firstly podocytes and exosomes were characterised. Moreover, changes in the actin cytoskeleton and the distribution of CD63-labelled exosomes in the podocyte cytoplasm were studied by confocal microscopy, as well as the effect on the expression of microRNAs: miR-26a, miR-21-5p and miR-31-5p. The results show that the organization of the cytoskeleton and the distribution of exosomal markers in the cell cytoplasm were affected by silencing of both Rab and glucose treatment. In addition, altered expression levels of the microRNAs studied under these conditions were also observed. These results suggest that the Rab3A-Rab27A system, as it participates in vesicular trafficking, may have a relevant role in podocyte damage. The inhibition of the system seems to reduce the damage caused by glucose stress.

[ES] La corteza cerebral es responsable de muchas funciones cognitivas superiores. Alteraciones en los circuitos corticales llevan al desarrollo de condiciones neuropatológicas, siendo la lesión cerebral la primera causa mundial de discapacidad. Tras un daño cerebral, se produce una primera fase aguda de pérdida neuronal, seguida de una cascada inflamatoria y citotóxica. A continuación, se desarrolla un período de regeneración axonal y reorganización cortical que se alarga durante varias semanas. Aunque esta ventana de neuroplasticidad está actualmente en estudio, aún no se han trasladado a clínica tratamientos efectivos para la recuperación neuronal. Una causa de ello podría ser la ausencia de modelos de daño cerebral adecuados para su estudio, puesto que son a menudo diversos y generan una zona lesionada de gran tamaño. El objetivo principal de este TFG es desarrollar y caracterizar un nuevo modelo in vivo de lesión cortical en ratón. Para el estudio de la reorganización cortical tras daño, se inyecta en la corteza motora contralateral un vector viral adenoasociado que expresa GFP, pudiendo así trazar las proyecciones corticales a través del cuerpo calloso. Una vez expresado, se provoca un daño mecánico en la corteza motora derecha, generando un fenotipo motor que es evaluado mediante diversas pruebas de comportamiento. Finalmente, se sacrifica a los animales y los correspondientes cerebros se someten a procedimientos histológicos. Se desarrolla una inmunohistoquímica en flotación que permite el marcaje múltiple. Se usan diferentes anticuerpos para evaluar la integridad tisular, la inflamación y la respuesta celular (células de parvalbúmina y redes perineurales). El modelo propuesto permite una resolución tanto celular como subcelular. La lesión generada es lo suficientemente pequeña para estudiar la respuesta celular, la reorganización cortical y la regeneración axonal. Pero, también es lo suficientemente grande para generar un fenotipo motor detectable. El multiplexeado permite reducir el número de animales de experimentación al poder analizarse diferentes marcadores en las mismas muestras. En general, este novedoso modelo permitiría entender mejor la plasticidad y el comportamiento celular tras daño cerebral., [EN] The cerebral cortex is responsible for many higher cognitive functions. Alterations in cortical circuits elicit several neuropathologic conditions, being brain injury the first cause of adult disability worldwide. After brain injury, a sudden acute phase of neuronal loss and an inflammatory and excitotoxic cascade takes place. This phase is followed by a longer period of axonal regeneration and cortical rewiring which lasts several weeks. Although this neuroplasticity window is currently in research, no effective treatments for recovery have been translated into clinic yet. This could be due to the lack of suitable brain injury models, which are diverse and often generate a vast lesioned area. The main objective of this TFG is to develop and characterize a new in vivo model to produce a controlled cortical injury in mice. To study cortical rewiring upon injury, an adenoassociated viral vector expressing GFP is injected in the contralateral motor cortex to trace the cortical projections through the corpus callosum. Once expressed, a mechanical injury is performed in the right motor cortex, leading to a functional motor outcome that is evaluated with a battery of behavioral tests. Lastly, animals are sacrificed, and brains are collected for histological evaluation. On floating sections, a multiplexed approach is carried out using different antibodies to evaluate tissue integrity, inflammation, and cellular response (parvalbumin cells and perineuronal nets). The proposed model allows volumetric, cellular, and subcellular resolution within the same samples. The generated lesion is small enough to study cell response, cortical rewiring, and axonal regeneration. But it is also big enough to generate a detectable motor impairment phenotype. Multiplexing allows reducing the number of animals required for research by analyzing different markers at the same time. In general, this ground-breaking experimental approach could offer a possibility to understand better plasticity and cell behavior upon brain injury.

[ES] La familia de proteínas BCL2 (B-cell lymphoma 2) regula la permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOM) durante el proceso de muerte celular por apoptosis. Las proteínas BCL2 constituyen una familia de 25 miembros y se caracterizan por la presencia de dominios de homología BCL2 (dominios BH) y un dominio transmembrana (TMD) carboxilo-terminal, presente en la mayoría de sus miembros. De acuerdo con su papel en el proceso de muerte y el número de dominios BH se clasifican en tres grupos: las proteínas antiapoptóticas (BCL2, BCLxL, MCL1, etc.); las proteínas "sensoras" proapoptóticas BH3 only (BAD, BID, BIM, PUMA, NOXA, etc.); y las "ejecutoras" proapoptóticas (BAX, BAK y BOK). Entre ellas forman una compleja red de interacciones, citosólicas y en membrana, que regula el destino celular. Estas interacciones se dan tanto entre dominios BH como entre TMDs. En los procesos tumorales, los equilibrios de interacción entre estas proteínas se ven alterados, desencadenando la evasión de la muerte celular. Actualmente, existen fármacos "miméticos del dominio BH3" que liberan las proteínas proapotóticas BAX/BAK induciendo la muerte celular. Sin embargo, presentan limitaciones para su uso como mutaciones en el dominio de unión. Es por ello por lo que las interacciones entre los TMDs ofrecen nuevas dianas para el desarrollo de fármacos antitumorales. En concreto, cabe destacar la interacción de los TMD de MCL1 y BOK. Se ha visto que MCL1 está sobrexpresado en numerosos tumores. El inhibidor especifico de MCL1, solo o en combinación con otras terapias, ha dado buenos resultados en ensayos preclínicos en modelos de cáncer de mama. El grupo ha realizado un primer cribado de moléculas inhibidoras de la interacción MCL1-BOK (MBoINs). Se busca favorecer la liberación de la proteína proapopotótica BOK desencadenando así la muerte de las células tumorales. En este punto del proyecto, el grupo se dispone a caracterizar en profundidad dos de las drogas identificadas en el cribado. El objetivo del presente TFG es caracterizar la actividad proapoptótica de estas dos nuevas moléculas. Por un lado, se estudia la especificidad de estas moléculas en la interacción proteica empleando un sistema de fluorescencia de complementación bimolecular (BIFc). El grupo dispone de plásmidos que expresan el TMD de cada proteína BCL2 de interés fusionado con el amino-terminal o carboxi-terminal de la proteína fluorescente Venus. Cuando estas construcciones se expresan en células y dos TMDs interaccionan, se reconstituye la proteína Venus registrándose fluorescencia, permitiendo detectar alteraciones en la señal fluorescente en presencia de moléculas que interfieran en la interacción. Por otro lado, se realizan ensayos de dosis respuesta en distintas líneas celulares de cáncer de mama para determinar la eficacia y la concentración a la cual las moléculas son capaces de inducir un 50% de muerte (IC50). Finalmente, se realizan experimentos de silenciamiento para demostrar la especificidad de las moléculas por su diana. Los datos obtenidos en este estudio permitirán disponer del perfil de eficacia de cada una de las moléculas para su evaluación en posteriores ensayos in vivo., [EN] The BCL2 (B-cell lymphoma 2) protein family controls the outer mitochondrial membrane (OMM) permeabilization during the cell death process by apoptosis. BCL2 proteins constitute a family of 25 members characterized by the BCL2 homology (BH) domains and a carboxyl-terminal transmembrane domain (TMD), present in almost all members. According to their function in the cell death process and the number of BH domains, these proteins are classified into three groups: the antiapoptotic proteins (BCL2, BCLxL, MCL1,etc.); the proapoptotic BH3-only ¿sensor¿ proteins (BAD, BID, BIM, PUMA, NOXA, etc.); and the proapoptotic ¿executor¿ proteins (BAX, BAK y BOK). These members form a complex network of interactions, both in cytosol and lipidic membrane that regulate cell fate. The interactions are between BH domains but also between TMDs. In tumour process, the alteration of the BCL2 proteins interactions contribute to the development of evasion mechanisms of cell death. In this context, several ¿BH3 mimetic¿ drugs have been developed. They bind antiapoptotic members and release proapoptotic proteins BAX/BAK inducing cell death. Despite the relevance of these drugs, there are several limitations to their use like mutations in the drug binding domain. Thus, TMDs interactions may become novel targets for the development of antitumoral drugs. Among described TMDs interactions, MCL1 and BOK interaction should be underlined. Overexpression of MCL1 has been identified in several tumours. The specific inhibitor of MCL1 has shown good results, alone or in combination with other therapies, in breast cancer models. The group performed a first high throughput screening searching for molecules able to disrupt MCL1-BOK interaction (MBoINs). The aim is to release the proapoptotic BOK protein from the interaction enhancing tumour cell death. At this moment, the group is characterizing in depth two positive drugs. The objective of this work is to characterize the proapoptotic activity of these molecules. First, bimolecular fluorescence complementation (BiFc) assays will be carried out to study the specificity of the compounds in other TMD protein interactions. The group have prepared plasmids to express the TMD BCL2 protein fused to the amino or carboxyl terminal of Venus fluorescence protein. These constructs will be cotransfected in HCT116 cell line. Once TMDs interact, Venus protein is reconstituted and fluorescence can be detected. Molecules able to disrupt the TMD protein interaction cause alterations in the fluorescence signal. Next, dose-response assays will be performed to determine drug efficacy and calculate the concentration capable to induce the 50% of death (IC50). A panel of breast cancer lines will be evaluated. Finally, silencing assays will be performed to demonstrate the target specificity. The obtained data will help to determine the efficacy profile of each of the tested molecules for their subsequent evaluation for in vivo assays.

[ES] La lesión medular (LM) se refiere a cualquier daño en la médula espinal dando lugar a discapacidad motora, sensorial y autonómica y teniendo consecuencias devastadoras para la persona afectada tanto a nivel de salud como en la dimensión social. A pesar de las numerosas investigaciones con resultados prometedores de las últimas décadas, todavía no existe una terapia efectiva que permita una recuperación funcional considerable de los pacientes con lesión medular que haya sido trasladada a la clínica. Las estrategias en investigación actuales se centran en promover la neuroprotección y neuroregeneración pudiendo ambas conseguirse mediante el trasplante de progenitores neurales (NPCs). No obstante, a pesar de los resultados esperanzadores obtenidos hasta el momento, la terapia celular también puede limitar la recuperación funcional tras el trasplante, principalmente debido a la pobre supervivencia celular y su fracaso en la integración del circuito de la médula espinal del paciente. Asimismo, nuevos enfoques dirigidos a la manipulación de las células a trasplantar están ganando importancia en el contexto de la terapia celular. La optogenética representa un abordaje innovador combinando métodos ópticos y genéticos. A través de la expresión ectópica de proteínas fotosensibles, esta técnica permite un preciso control temporal y espacial de poblaciones celulares específicas sometidas a fotoestimulación. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la estimulación optogenética in vivo de NPCs trasplantadas tras la lesión medular. Para explorar el impacto terapéutico de este enfoque empleamos la canalrodopsina-2 (ChR2), un canal de cationes cuya apertura está mediada por luz, que fue expresada ectópicamente en células progenitoras neurales las cuales fueron trasplantadas en un modelo de lesión medular subaguda in vivo en rata mediante hemisección a nivel de la vértebra T8. La activación optogenética in vivo fue llevada a cabo usando un dispositivo medular de Neurolux que presentaba unido un ¿-LED azul. Las ratas recibieron 1h de estimulación diaria durante un total de 4 semanas a 20 Hz con periodos de 5ms de encendido y 45 ms de apagado. Con el objetivo de evaluar los efectos neuroprotectores de la estimulación optogenética en la lesión medular, se analizó la supervivencia y la identidad celular y el fenotipo de las ChR2-NPCs trasplantadas, así como, la preservación y activación de neuronas propias tras la lesión medular en animales estimulados mediante optogenética y en animales no estimulados. De igual forma, también se analizó la variación del tamaño del área de la lesión. Los resultados obtenidos muestran un efecto positivo de la estimulación optogenética in vivo sobre la diferenciación de las NPCs trasplantadas a neuronas y la disminución del área de la lesión. Asimismo, aunque los valores carecen de significancia estadística, también se observa una mayor activación de las células del injerto, así como una supervivencia incrementada., [EN] Spinal cord injury (SCI) refers to any damage on the spinal cord leading to motor, sensory and autonomic impairment, having devastating consequences for the affected person at self-health and social dimensions. Despite many research efforts with promising outcomes in the last decades, still no effective therapy that allows considerable functional recovery of SCI patients has been translated to the clinic. Current therapeutic strategies under research are focused in promoting neuroprotection and neuroregeneration, and both can be achieved by neural progenitor cells (NPCs) transplantation. Despite the promising results reported, cell therapy also can limit functional recovery after transplant, mainly to the poor cell survival after transplantation and their lack of integration into spinal cord host circuitry. New approaches directed at manipulating cell transplants are gaining attention in the context of cell therapy. Optogenetics represents an innovative approach combining optical and genetic methods. Through the ectopic expression of photosensitive proteins, this technique allows for a precise temporal and spatial control of specific cell populations upon photostimulation. The aim of this work was to study the effect of in vivo optogenetic stimulation of transplanted NPCs following SCI. To explore the therapeutic impact of this approach, we employed channelrhodopsin-2 (ChR2), a light-gated cation channel, that was ectopically expressed in neural progenitor cells which were transplanted in an in vivo subacute rat model of SCI by hemisection at the level of the T8 vertebra. In vivo optogenetic activation was carried out using Neurolux spinal cord device which has tethered a blue µ-LED. Rats received 1h of stimulation every day for a total of 4 weeks at 20 Hz with 5 ms on and 45 ms off. In order to evaluate the neuroprotective effects of optogenetic stimulation in SCI, we analysed cell survival, cell identity and phenotype of transplanted ChR2- NPCs, as well as, the preservation and activation of host neurons following SCI in optogenetic stimulated and non-stimulated animals. Similarly, the variation in the size of the lesion area was also analysed. The results obtained show a positive effect of optogenetic stimulation on the differentiation of the NPCs transplanted to neurons and the reduction of the area of the lesion. Likewise, although the values lack statistical significance, a greater activation of the graft cells is also observed, as well as increased survival.

[ES] La placenta es un órgano vital y transitorio, esencial para permitir el intercambio de nutrientes y oxígeno entre la madre y el feto durante la gestación. Una placentación anormal se asocia a complicaciones durante el embarazo como la preeclampsia, la restricción del crecimiento fetal (FGR) y, en el peor de los casos, el aborto. A pesar de las diferencias morfológicas, las placentas de ratones y de humanos comparten el mismo tipo de placentación hemocorial, en la que las células del trofoblasto (el bloque celular que construye la placenta) entran en contacto directo con la sangre materna. El uso del modelo de ratón para estudiar el desarrollo placentario ha desvelado gran parte de los mecanismos moleculares que regulan la placentación, debido a su homogeneidad genética, su fácil manipulación genómica y su discreta organización estructural. La placenta del ratón está compuesta por tres capas principales: 1) La región más externa corresponde a la decidua de origen materno. 2) La capa intermedia se conoce como la zona endocrina de unión, compuesta por células del espongiotrofoblasto, varios subtipos de células gigantes trofoblásticas (TGCs) y células glucogénicas. 3) Por último, la capa más interna se conoce como laberinto, donde se produce el intercambio de nutrientes, gases y residuos. Esta capa está formada por dos capas adyacentes de células sincitiotrofoblásticas (SynT-I y SynT-II) que surgen de la fusión de células trofoblásticas individuales. La proteína "Phosphatidylinositol Glycan Anchor Biosynthesis Class L" (PIGL) es un componente esencial de la vía biosintética del glicosilfosfatidilinositol (GPI) que culmina en la generación del glicolípido GPI, el cual ancla muchas proteínas a la superficie celular. Anteriormente, se ha observado que los embriones de ratón KO para Pigl mueren a los 9.5 días de desarrollo embrionario (E9.5), siendo esta una etapa asociada a fallos en la placenta. En este estudio, investigamos la función molecular del gen Pigl en la regulación de la placentación temprana del ratón. Para ello, hemos generado células madre trofoblásticas (mTSCs) KO de ratón para Pigl, utilizando la tecnología CRISPR-Cas9, para examinar la capacidad de autorrenovación y diferenciación trofoblástica. A continuación, hemos realizado experimentos de diferenciación a lo largo del tiempo para descubrir que los genes relacionados con el proceso de sincitialización laberíntica eran los más afectados en ausencia de Pigl. Además, el análisis histológico de las placentas control a E9.5 en comparación con las placentas KO para Pigl, reveló no sólo una ausencia de invaginaciones de vasos sanguíneos fetales, sino también una estructura indiferenciada en el corion de los mutantes Pigl-/-. Además, los análisis de inmunotinción para CDH1, LAMININA, MCT1 y MCT4, mostraron una morfología ramificada subdesarrollada en el área del laberinto para las placentas KO, en comparación con sus homólogas control. En conjunto, nuestros datos indican que PIGL desempeña un papel esencial en la regulación de la formación temprana del laberinto. Hasta donde sabemos, la función específica de Pigl durante la placentación todavía no había sido estudiada, lo que supone un importante avance en la comprensión de los mecanismos moleculares que controlan el desarrollo placentario, y de cómo éstos afectan directamente al feto., [EN] The placenta is a transient and vital organ, essential for allowing the exchange of nutrients and oxygen between the mother and the fetus during gestation. Abnormal placentation is associated with pregnancy complications, such as preeclampsia, fetal growth restriction (FGR) and at worst, miscarriage. Despite differences in morphology, mouse and human placentae share the same type of haemochorial placentation, in which trophoblast cells (the building cell block of the placenta) are directly in contact with maternal blood. The use of the mouse model to study placental development has provided a tremendous insight into the molecular mechanisms regulating placentation, due to its genetic homogeneity, easy genomic manipulation, and discrete structural organization. The mouse placenta is composed by three main layers: 1) The outermost region corresponds to the maternally derived decidua. 2) The middle layer is known as the junctional endocrine zone, composed by spongiotrophoblast cells, several trophoblast giant cells (TGCs) subtypes and glycogen cells. 3) And finally, the innermost layer is known as the labyrinth, where the exchange of nutrients, gases and waste takes place. This layer consists of two adjacent syncytiotrophoblast cell layers (SynT-I and SynT-II) arising from the fusion of individual trophoblast cells. ¿Phosphatidylinositol Glycan Anchor Biosynthesis Class L¿ (PIGL) protein is an essential component of the glycosylphosphatidylinositol (GPI) biosynthetic pathway that culminates in the generation of the GPI glycolipid, which anchors many proteins to the cell surface. Previously, it has been reported that Pigl KO mouse embryos die at day 9.5 of embryonic development (E.9.5), which is a time window associated with placental failure. In this study, we investigate the molecular function of Pigl gene in regulating early mouse placentation. For this purpose, we generated Pigl KO mouse trophoblast stem cells (mTSCs) by using CRISPR-Cas9 technology to examine self-renewal and trophoblast differentiation capacity. Then, we performed time-course differentiation experiments to found out that the genes related to the labyrinthine syncytialization process were the most affected ones in the absence of Pigl. Moreover, the histological analysis of E9.5 wild type (WT) placentas compared to Pigl KO placentas revealed not only an absence of fetal blood vessels invaginations, but also an undifferentiated chorion structure in the Pigl-/- mutants. In addition, CDH1, LAMININ, MCT1, MCT4 immunostaining analysis showed an underdeveloped branching morphology in the labyrinth area for the Pigl KO placentas compared to control counterparts. Altogether, our data indicates that PIGL plays an essential role in the regulation of early labyrinth formation. To the best of our knowledge, the specific Pigl function during placentation had not yet been studied, and this is an important advance in understanding the molecular mechanisms of placental development and how these directly affect the fetus.

[ES] La obesidad es la gran epidemia de este siglo, afectando a un número ascendente de individuos globalmente. El tejido adiposo es el encargado de almacenar grasa principalmente en forma de triacilglicéridos, y cuando esta se acumula en exceso en el organismo da lugar a la obesidad. Además de almacenar la grasa, el tejido adiposo, es capaz de hidrolizar los TAG dando lugar a ácidos grasos libres y glicerol mediante un proceso enzimático denominado lipolisis. Esta movilización de grasa resulta fundamental en el proceso de pérdida de peso. Varios estudios han demostrado que existen ritmos circadianos en el tejido adiposo, incluyendo la lipasa sensible a hormonas, una de las principales enzimas encargadas de la lipolisis. La desalineación de nuestro horario de ingesta con los ciclos de luz-oscuridad que sincronizan el reloj central puede causar cronodisrupción, que se asocia con la obesidad. Para determinar si la lipolisis presenta un ritmo circadiano y si la alineación del periodo de ingesta con el periodo de luz consigue aumentar la actividad lipolítica, comparando una dieta TRF con una ingesta continuada (control), se determinó la cantidad de glicerol liberado al medio de cultivo cada 4 horas durante 24 horas en explantes de tejido adiposo subcutáneo humano. La lipolisis mostró un patrón rítmico en la lipolisis en las condiciones control, AM y PM. El tratamiento fasting mostró un grado de lipolisis significativamente superior al resto de condiciones. El tratamiento TRF con una ventana de ingesta por la mañana (AM) dio lugar a un aumento del grado de lipolisis en el tejido adiposo con respecto al control. Esto resalta la importancia del ayuno para movilizar los lípidos almacenados en el tejido adiposo y, además, demuestra que la hora de la ingesta es un factor que influye en los procesos metabólicos, siendo más favorable la ingesta por la mañana., [EN] Obesity is considered to be the greatest epidemic of the 21st century. It affects a rising number of people globally. One of the functions of adipose tissue is fat storage, mainly as triglycerides. Excess of fat accumulation is key for obesity development. Apart from storing lipids, adipose tissue is capable of breaking down triglycerides into free fatty acids and glycerol through an enzymatic process called lipolysis. Mobilization of body fat is essential for weight loss. Previous studies showed circadian rhythms in adipose tissue. Hormone sensitive lipase, one of the main enzymes in lipolysis exhibited a circadian rhythm. Misalignment between meal timing and light-dark cycles, that entrain the central circadian clock, can cause chronodisruption, which is associated with obesity. To determine the presence of a circadian rhythm in lipolytic activity and if alignment of food intake and the light period can enhance lipolysis, by comparing a time restricted eating treatment with continuous eating; the glycerol released into the culture media was measured every 4 hours throughout 24 hours in human subcutaneous adipose tissue explants. Lipolysis displayed a rhythmic pattern in control, AM and PM conditions. Fasting treatment showed significantly higher lipolytic activity than the other conditions. TRE condition with food intake in the morning (AM) had significantly higher lipolytic activity compared to the control. These results highlight importance of fasting to mobilize lipids stored in adipose tissue and, moreover, demonstrates that meal timing is affecting metabolic processes. Therefore, early food intake is more favorable than continuous eating.

[ES] En el presente trabajo se abordará la estructura y función de los circuitos neuronales que participan en los procesos de formación de la memoria, y como estos se ven alterados en modelos animales en enfermedades del neurodesarrollo. Específicamente, se evaluará los déficits en el rendimiento cognitivo en un modelo murino de trastorno del neurodesarrollo (donde el gen Erbb4 se encuentra deleccionado) mediante estudios de una tarea conductual en roedores denominada ¿condicionamiento contextual del miedo¿. Además, estudiaremos las base neurobiológica de los trastornos conductuales mediante el marcaje y trazado de circuitos neuronales que consiste en la combinación de genética de roedores, imagen de fluorescencia y análisis neuroanatómico . De esta forma, se obtuvieron imágenes de dos áreas del cerebro del ratón - hipocampo y corteza prefrontal - tanto en animales control como en mutantes en condiciones con diferentes niveles de rendimiento cognitivo. Nuestros hallazgos nos permitirán entender qué circuitos neuronales están alterados en áreas específicas del cerebro en modelos animales deficientes en Erbb4 que recapitulan alteraciones cognitivas similares a las encontradas en enfermedades como la esquizofrenia, [EN] In this proyect, we will study the structure and function of neural circuits involved in the different memory formation process; and how they are altered in neurodevelopmental disease animal models. Specifically, we will evaluate cognitive performance déficits in neurodevelopment disease murine model (with the gen Erbb4 knocked out) through the behaviour anaylisis commonly call “contextual fear conditioning). Furthermore, we will study the neurological basis of the behavioural disorders through labeling of neural circuits, which implies a combination of mices´ genetics, fluorescence imaging and neuroanatomical analysis. This way, images from differents regions of the mices´brains – hipoccampus and prefrontal cortex – were obtained, both in control and mutants for Erbb4, in conditions with differents levels of cognitive performance. Our findings will allow us to understand what neural circuits are altered in specific brain areas, in animal models with a deficiency in Erbb4, which engage similar cognitive disruptions to the ones found in diseases as schizophrenia.

[ES] El adenocarcinoma de páncreas es uno de los cánceres con peor pronóstico ya que la gran mayoría de casos se presentan en estadios avanzados, por lo que la esperanza de vida en el momento del diagnóstico no llega a los cinco meses y apenas el 7% de los pacientes sobreviven a los cinco años. Esta escasa supervivencia se atribuye principalmente a la ausencia de métodos de cribado eficaces, al diagnóstico tardío debido a síntomas inespecíficos, a la falta de biomarcadores sensibles o específicos para el diagnóstico precoz y a la propensión a la diseminación metastásica temprana. Recientemente, el DNA circulante tumoral (ctDNA) se ha descrito como un prometedor biomarcador sanguíneo de obtención no invasiva para el tratamiento del cáncer, porque refleja la composición genética y epigenética del tumor del que procede. Este trabajo se ha centrado en el estudio molecular del ctDNA aislado de biopsias líquidas en 10 pacientes con cáncer de páncreas en distintos estadios de la enfermedad diagnosticados y tratados en el Hospital Clínico de Valencia. De esta forma, se han caracterizado los perfiles de mutación específicos de cada tumor y se ha medido la variación en su detección en respuesta a quimioterapia. Además, se estableció un modelo de organoides a partir de una biopsia de tejido tumoral para realizar estudios preclínicos ex vivo. El uso de tejido primario en cultivos 3D para la generación de organoides permite recrear el componente epitelial del tumor de manera paciente-específica, de forma que posibilita evaluar la idoneidad de los diferentes tratamientos de forma individualizada. Este trabajo ha consistido en la evaluación de la utilidad de la biopsia líquida, como herramienta para la monitorización de la enfermedad y la toma de decisiones terapéuticas; y el uso de organoides, como modelo preclínico para establecer la sensibilidad y resistencia a fármacos dirigidos, contribuyendo al desarrollo de una medicina de precisión en adenocarcinoma de páncreas., [EN] Pancreatic adenocarcinoma is one of the cancers with the worst prognosis since the vast majority of cases present in advanced stages, so that life expectancy at the time of diagnosis is less than five months and only 7% of patients survive to five years. This poor survival is mainly attributed to the absence of effective screening methods, late diagnosis due to non-specific symptoms, the lack of sensitive or specific biomarkers for early diagnosis and the propensity for early metastatic spread. Recently, circulating tumor DNA (ctDNA) has been described as a promising blood biomarker for non-invasive collection for cancer treatment, because it reflects the genetic and epigenetic composition of the tumor from which it originates. This work has focused on the molecular study of ctDNA isolated from liquid biopsies in 10 patients with pancreatic cancer at different stages of the disease diagnosed and treated at the Hospital Clínico de Valencia. In this way, tumor-specific mutation profiles have been characterized and the variation in their detection in response to chemotherapy has been measured. In addition, an organoid model was established from a biopsy of tumor tissue to perform ex vivo preclinical studies. The use of primary tissue in 3D cultures for the generation of organoids allows recreating the epithelial component of the tumor in a patient-specific manner, thus making it possible to evaluate the suitability of different treatments on an individualized basis. This work has consisted in the evaluation of the usefulness of liquid biopsy as a tool for disease monitoring and therapeutic decision making; and the use of organoids as a preclinical model to establish sensitivity and resistance to targeted drugs, contributing to the development of precision medicine in pancreatic adenocarcinoma.

[ES] La diabetes mellitus tipo 2 (DMT2), consecuencia de desequilibrios entre la secreción y la sensibilidad a la insulina, ha sido identificada como uno de los factores de riesgo en el desarrollo de la fibrosis hepática, hígado graso no alcohólico, esteatosis no alcohólica y sus complicaciones asociadas. Cuando la insulina o el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) se unen a sus receptores, estos se fosforilan y reclutan proteínas como el sustrato del receptor de la insulina 2 (IRS2), que acopla estos receptores con las vías de señalización intracelular. La DMT2, la obesidad y la enfermedad del hígado graso asociada a la disfunción metabólica están estrechamente relacionadas con la resistencia a la insulina, que constituye un factor de riesgo para el desarrollo de fibrosis hepática. La fibrosis es una respuesta de reparación resultante de la aparición de lesiones repetidas en el hígado en la que, si estas persisten de forma crónica, el parénquima funcional es reemplazado por una acumulación excesiva de matriz extracelular (MEC). Las células estrelladas hepáticas (HSCs) son células residentes que se encuentran en un estado quiescente en el hígado sano. Tras sufrir una lesión, estas se activan transdiferenciándose a miofibroblastos proliferativos y contráctiles, que constituyen la principal fuente de MEC. Durante este proceso de activación de las HSCs la autofagia juega un papel fundamental. Se ha observado que las HSC participan en la resolución de la fibrosis sufriendo senescencia, apoptosis, o adquiriendo un fenotipo inactivo. También juegan un papel en la reparación epitelial secretando factores paracrinos como el factor de crecimiento de fibroblastos 7 (FGF7). Resultados previos del grupo han mostrado que IRS2 es necesario para promover la expresión de FGF7, sin embargo, no se conoce en detalle el papel que desempeña la señalización a través de insulina/IRS2 en la reversión de las HSC y la expresión de FGF7. Por ello, se estudió el efecto de la señalización de insulina mediante el análisis de la expresión génica de cultivos de la línea celular LX2, derivada de HSC, en medio con distinta concentración de suero y en presencia o ausencia del inhibidor de la autofagia 3-metiladenina (3MA), así como mediante inmunocitoquímica. Los resultados de la expresión génica y de la inmunotinción mostraron que la privación de suero promovió la inactivación de las HSCs y se halló una sinergia entre la baja concentración de suero y el tratamiento con 3MA en la expresión de FGF7, y de otros genes como HSPA1B, asociado a la inactivación de las HSCs, o interleukina 6 (IL-6), que podría estar favoreciendo la expresión de FGF7, como se ha descrito en fibroblastos., [EN] Type 2 diabetes mellitus (T2DM), a consequence of imbalances between insulin secretion and insulin sensitivity, has been identified as one of the risk factors in the development of liver fibrosis, non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic steatosis, and their associated complications. When insulin or insulin-like growth factor (IGF-1) bind to their receptors, these become phosphorylated and recruit proteins such as insulin receptor substrate 2 (IRS2), which couples the receptors to intracellular signalling pathways. T2DM, obesity and fatty liver disease associated with metabolic dysfunction are closely related to insulin resistance, which is a risk factor for the development of liver fibrosis. Fibrosis is a repair response resulting from repeated liver injury in which, if chronically persistent, functional parenchyma is replaced by excessive accumulation of extracellular matrix (ECM). Hepatic stellate cells (HSCs) are resident cells that are in a quiescent state in the healthy liver. After injury, they are activated by transdifferentiation into proliferative and contractile myofibroblasts, which are the main source of ECM. During this process of HSC activation, autophagy plays a key role. HSCs have been observed to participate in the resolution of fibrosis by undergoing senescence, apoptosis, or acquiring an inactive phenotype. They also play a role in epithelial repair by secreting paracrine factors such as fibroblast growth factor 7 (FGF7). Previous results from the group have shown that IRS2 is required to promote FGF7 expression, however, the role of insulin/IRS2 signalling in HSC reversal and FGF7 expression is not known in detail. Therefore, the effect of insulin signalling was studied by analysing gene expression of HSC-derived LX2 cell line cultures in medium with different serum concentration and in the presence or absence of the autophagy inhibitor 3- methyladenine (3MA), as well as by immunocytochemistry. Gene expression and immunostaining results showed that serum deprivation promoted HSC inactivation and a synergy was found between low serum concentration and 3MA treatment in the expression of FGF7, and of other genes such as HSPA1B, associated with HSC inactivation, or interleukin 6 (IL-6), which could be favouring FGF7 expression, as described in fibroblasts.

[ES] El folato es un cofactor esencial que actúa como aceptor/dador de unidades de un carbono (1C). La serina es el principal donante de unidades de 1C para la biosíntesis de nucleótidos, así como de glicina para la síntesis de glutatión, esencial en el control del estrés oxidativo. De forma complementaria, el ciclo de la metionina/transmetilación, a través de la síntesis de S-adenosil-metionina, es la principal fuente de grupos metilo en la metilación de DNA, RNA y proteínas, con lo que juega un papel esencial en la regulación de la expresión génica, así como en la actividad de múltiples proteínas. El metabolismo del cofactor folato, cuya disponibilidad y estado químico determinan el correcto funcionamiento estas rutas, frecuentemente alteradas en cáncer debido tanto al metabolismo intrínseco de las células presentes, como a la disponibilidad de nutrientes y cofactores. La presencia de concentraciones no fisiológicas de estos metabolitos en los medios comerciales supone una limitación a la información que se puede obtener in vitro. Nuestro objetivo es estudiar la influencia de las condiciones de cultivo en la proliferación, el metabolismo de serina-folato-1C y la sensibilidad a inhibidores de dicha ruta, SHIN2 (inhibidor de la enzima serina-hidroximetiltransferasa) y metotrexato (inhibidor de la dihidrofolato-reductasa), en linfocitos T CD8+ efectores de ratón. Para ello comparamos el medio estándar RPMI con el medio HPLM, que contiene concentraciones fisiológicas de aminoácidos y glucosa, y en ambos casos empleando concentraciones normales o fisiológicas de folato (1 mg/L de folato vs 0.1 mg/mL de 5-MeTHF). El estudio del metabolismo se realiza mediante el empleo de trazadores isotópicos estables (U-13C-glucosa, U-13C-serina, U-13C-glicina, 2H1-glucosa) y su análisis mediante metabolómica basada en cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. En comparación con condiciones de cultivo estándar, tanto el medio HPLM como el uso de concentraciones fisiológicas de folatos limitan la proliferación de los linfocitos. El efecto de los folatos se debe a la limitación de las unidades de 1C disponibles mientras que la disponibilidad de serina y glutamina juegan un papel clave en HPLM. En comparación con RPMI, en el medio HPLM se observa una mayor síntesis de novo de serina a partir de glucosa, una relevancia mayor de la importación en las fuentes de glicina y una menor contribución relativa de la ruta de las pentosas fosfato a la síntesis de NADPH. En ambos medios, el uso de folatos fisiológicos limita la actividad SHMT. En relación con los inhibidores, tanto metotrexato como SHIN2 afectan a la ruta de biosíntesis de purinas. Sin embargo, mientras que el metotrexato no provoca variaciones en el perfil de origen de serina y glicina, SHIN2 sí lo hace. En ambos casos la fuente de folatos afecta a los efectos metabólicos de los inhibidores. [EN] Folate is an essential cofactor that acts as an acceptor/donor of one-carbon (1C) units. Serine is the main donor of 1C units for nucleotide biosynthesis, as well as glycine for glutathione synthesis, essential in the control of oxidative stress. Complementarily, the methionine/trans-methylation cycle, through the synthesis of S-adenosyl-methionine, is the main source of methyl groups in the methylation of DNA, RNA and proteins, thus playing an essential role in the regulation of gene expression, as well as in the activity of multiple proteins. The metabolism of the cofactor folate, whose availability and chemical status determine the correct functioning of these pathways, frequently altered in cancer due to both the intrinsic metabolism of the cells present, as well as the availability of nutrients and cofactors. The presence of non-physiological concentrations of these metabolites in commercial media limits the information that can be obtained in vitro. Our aim is to study the influence of culture conditions on proliferation, serine-folate-1C metabolism and sensitivity to inhibitors of this pathway, SHIN2 (serine hydroxymethyltransferase inhibitor) and methotrexate (dihydrofolate reductase inhibitor), in mouse effector CD8+ T lymphocytes. We compared standard RPMI medium with HPLM medium containing physiological concentrations of amino acids and glucose, and in both cases using normal or physiological concentrations of folate (1 mg/L folate vs 0.1 mg/mL 5-MeTHF). Metabolism is studied using stable isotopic tracers (U-13C-glucose, U-13C-serine, U-13C-glycine, 2H1-glucose) and their analysis by metabolomics based on liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry. Compared to standard culture conditions, both HPLM medium and the use of physiological folate concentrations limit lymphocyte proliferation. The effect of folates is due to the limitation of available 1C units while the availability of serine and glutamine play a key role in HPLM. Compared to RPMI, HPLM medium shows a higher de novo synthesis of serine from glucose, a higher relevance of import in glycine sources and a lower relative contribution of the pentose phosphate pathway to NADPH synthesis. In both media, the use of physiological folates limits SHMT activity. With regard to inhibitors, both methotrexate and SHIN2 affect the purine biosynthesis pathway. However, while methotrexate does not cause variations in the serine and glycine origin profile, SHIN2 does. In both cases the source of folates affects the metabolic effects of the inhibitors.

[ES] El uso del bloqueo del punto de control inmunitario (ICB, por sus siglas en inglés) ha revolucionado el tratamiento del cáncer de pulmón, con mejoras dramáticas en los resultados. Un subconjunto de más del 50 % de los pacientes con cáncer de pulmón no escamoso con expresión de PD-L1 ≥50 % no responde al tratamiento, con una clara resistencia de novo (resistencia primaria). Por lo tanto, los esfuerzos para comprender los mecanismos subyacentes que explican este comportamiento son importantes para mejorar los enfoques inmunoterapéuticos para lograr el control a largo plazo de la enfermedad. Las células inmunitarias reclutadas en el microambiente tumoral pueden ejercer funciones críticas en el desarrollo, la progresión y la resistencia al tratamiento del tumor. En particular, los efectos pro o antitumorales del sistema inmunitario en el cáncer están muy poco regulados por el equilibrio entre los diferentes subconjuntos de células T. La diferenciación de los subconjuntos de células T depende de la presencia y el equilibrio de citocinas conocidas (p. ej., IL6, TGF-ß, IL1ß, IFNG, IL10, IL12, IL23 e IL27) y la actividad de factores de transcripción seleccionados (p. ej., STAT3, RORC, GATA3, Tbet, FoxP3). Estas poblaciones de células T pueden influir en la respuesta inmunitaria antitumoral y también en la eficacia de terapias basadas en la modulación del sistema inmunitario. Al analizar la plasticidad y la capacidad de diferenciación de las células T CD4+ periféricas, planeamos validar la hipótesis de que el potencial de las células T CD4+ para diferenciarse en una subpoblación más proinflamatoria o reguladora predecirá el resultado de la respuesta a la terapia anti-PD1 en el cáncer. pacientes y descifrar los posibles mecanismos de resistencia primaria en este entorno clínico., [EN] The use of immune checkpoint blockade (ICB) has revolutionised the treatment of lung cancer, with dramatic improvements in outcomes. A subset of more than 50% of non-squamous lung cancer patients with PD-L1 expression ≥50 percent experience no response to therapy, with clear de novo resistance (primary resistance). Therefore, efforts to understand the underlying mechanisms that explain this behaviour are important for improving immunotherapeutic approaches to achieve long-term control of the disease. Immune cells recruited to the tumor microenvironment can exert critical functions in tumor development, progression and treatment resistance. In particular, the pro- or anti-tumoral effects of the immune system in cancer is tiny regulated by the equilibrium between different T cells subsets. The differentiation of T cells subsets is dependent on the presence and the balance of known cytokines (e.g. IL6, TGF-ß, IL1ß,IFNG, IL10, IL12, IL23 and IL27) and the activity of selected transcription factors (e.g. STAT3, RORC, GATA3, Tbet, FoxP3). These T cell populations can influence the anti-tumor immune response and also the efficacy of therapies based on the modulation of the immune system. By analysing the plasticity and the differentiation capacity of peripheral CD4+ T cells we plan to validate the hypothesis that, CD4+ T cell potential to differentiate to a more pro-inflammatory or regulatory subpopulation will predict the outcome of the response to anti-PD1 therapy in cancer patients and decipher possible mechanisms of primary resistance in this clinical setting.

[ES] La colonización bacteriana de nuestro organismo sucede tan pronto como nacemos y su configuración desde este momento y durante las primeras etapas de nuestra vida será condicionante tanto a corto como a largo plazo. La microbiota ejerce un papel determinante en el mantenimiento de la homeostasis metabólica e inmunológica, por lo que cualquier alteración que pueda afectar a su desarrollo puede no sólo implicar desordenes y enfermedades neonatales, sino que puede también afectar negativamente en etapas posteriores como la infancia e incluso la vida adulta del individuo. Dichos desordenes se manifiestan afectando a factores como el crecimiento o la susceptibilidad de sufrir enfermedades metabólicas de origen alimenticio a largo plazo. Dentro de la población microbiana intestinal temprana cabe destacar el papel de bacterias del género Bifidobacterium, predominantes en la microbiota intestinal de lactantes y niños de hasta aproximadamente los 3 años de edad, como principales moduladoras de este microambiente y por lo tanto determinantes en su desarrollo posterior. Uno de los factores claves a la hora de desentrañar la compleja red del microbioma humano es el estudio de las interacciones entre los componentes del mismo y la posible sinergia o antagonismo en el que se encuentran implicadas las diferentes especies de manera individual. El presente estudio tiene como objetivo aportar un conocimiento en detalle respecto al papel de las bifidobacterias en la conformación de las comunidades microbianas del intestino humano en etapas tempranas del desarrollo. Para ello se emplearon dos especies diferentes del género Bifidobacterium cultivadas bajo condiciones nutricionales mínimas, con lactosa como fuente preferencial de carbono y en anaerobiosis. Los sobrenadantes libres de bacterias resultantes de dichos cultivos fueron sujeto de estudio para determinar la dependencia metabólica de especies de la microbiota intestinal humana de los metabolitos generados por especies como Bifidobacterium longum y Bifidobacterium kashiwanoense, seleccionando e identificando taxonómicamente la microbiota fecal humana capaz de crecer en placas de medio enriquecidas con tales metabolitos generados por las especies de Bifidobacterium evaluadas. El estudio de comunidades microbianas generadas in vitro a partir del crecimiento en medio selectivo ha revelado la dependencia metabólica, de metabolitos producidos por bifidobacterias, de ciertas especies microbianas consideradas beneficiosas. De igual manera, se han podido intuir interacciones especie-específica en el contexto de las especies de Bifidobacterium analizadas., [EN] Bacterial colonisation of our organism takes place as soon as we are born and its configuration from this moment and during the first stages of our life will be a determining factor both in the short and long run. The microbiota plays a decisive role in the maintenance of metabolic and immunological homeostasis, therefore any alteration that may affect its development may not only result in neonatal disorders and diseases but may also negatively affect later stages such as childhood and even the individual's adult life. Such disorders manifest themselves by influencing factors such as growth or susceptibility to long-term metabolic diseases of dietary origin. Within the early intestinal microbial population, the role of bacteria of the genus Bifidobacterium, predominant in the intestinal microbiota of infants and children of up to approximately 3 years of age, is noteworthy as the main modulators of this microenvironment and therefore determinant in their subsequent development. One of the key factors in unravelling the complex network of the human microbiome is the study of the interactions between its components and the possible synergy or antagonism in which individual species are involved. The present study aims to provide a detailed understanding of the role of bifidobacteria in shaping the microbial communities of the human gut at early stages of development. For this purpose, two different species of the genus Bifidobacterium cultured under minimal nutritional conditions, with lactose as a preferential carbon source and in anaerobiosis, were used. The bacteria-free supernatants resulting from these cultures were studied to determine the metabolic dependence of species of the human intestinal microbiota on metabolites generated by species such as Bifidobacterium longum and Bifidobacterium kashiwanoense, selecting and taxonomically identifying the human faecal microbiota capable of growing in medium plates enriched with such metabolites generated by the Bifidobacterium species evaluated. The study of microbial communities generated in vitro from growth in selective media has revealed the metabolic dependence of metabolites produced by bifidobacteria on certain microbial species considered beneficial. Likewise, species-specific interactions have been intuited in the context of the Bifidobacterium species analysed.

[ES] El cáncer de ovario (CO) es el cáncer ginecológico más mortal, referido como el ¿asesino silencioso¿ por su habitual diagnóstico tardío debido a la casi total ausencia de síntomas específicos de la enfermedad. Con el fin de tratar esta patología se siguen 3 aproximaciones principales; la cirugía de reducción de la masa tumoral, el tratamiento quimioterápico con platinos y la administración de inhibidores de PARP, siendo esta última opción de las más novedosas. Respecto al tratamiento con platino, uno de los fármacos más utilizados en quimioterapia para CO es el carboplatino. Este es un agente citotóxico que actúa interrumpiendo la replicación del ADN. En cuanto a los inhibidores de PARP, se sabe que estos agentes actúan en base al mecanismo conocido como letalidad sintética que tiene lugar en tumores que presentan mutaciones en los genes BRCA1/2. Entre estos inhibidores, olaparib fue el primero en ser aprobado para su administración mostrando ciertos beneficios para el CO. Pese a que el carboplatino y el olaparib son los fármacos utilizados habitualmente para el tratamiento del CO, uno de los inconvenientes de estos tratamientos a nivel clínico es la adquisición de resistencias. Actualmente, existen ensayos clínicos con un nuevo fármaco llamado trabectedina con resultados prometedores en CO. El objetivo de este trabajo de fin de grado es comprobar si la administración de trabectedina sería efectiva para el tratamiento del CO resistente a carboplatino y/o olaparib. En este estudio se administrará trabectedina tanto a líneas celulares de CO sensibles al carboplatino y al olaparib (PEO1) como a líneas celulares de CO resistentes al olaparib (PEO1R) y resistentes al carboplatino (PEO4) con el fin de comprobar por análisis moleculares y celulares si la administración de este fármaco es igual de efectiva en las células sensibles y resistentes. Con los resultados obtenidos de este estudio, la administración de trabectedina podría plantearse como un posible tratamiento en CO resistente a carboplatino y/o olaparib., [EN] Ovarian cancer (OC) is the deadliest gynaecological cancer, referred to as the "silent killer" because of its usual late diagnosis due to the absence of specific symptoms of the disease. In order to treat this pathology, 3 main approaches are followed: debulking surgery, chemotherapy treatment with platinum and the administration of PARP inhibitors, being the last approach one of the most novel options. Regarding platinum treatment, one of the most widely used drugs in chemotherapy for OC is carboplatin, a cytotoxic agent that acts by interrupting DNA replication. As for PARP inhibitors, these agents are known to act based on the mechanism known as synthetic lethality that happens in tumours with mutations in the BRCA1/2 genes. Among these inhibitors, olaparib was the first one to be approved for administration showing some benefit in OC. Although carboplatin and olaparib are the drugs commonly used for the treatment of OC, one of the drawbacks of these treatments at the clinical level is the acquisition of resistance. Currently, there are clinical trials with a new drug called trabectedin with promising results in OC. The aim of this final degree work is to test whether the administration of trabectedin would be effective for the treatment of OC resistant to carboplatin and/or olaparib. In this study, trabectedin will be administered to both carboplatin- and olaparib-sensitive (PEO1) and olaparib-resistant (PEO1R) and carboplatin-resistant (PEO4) CO cell lines in order to test by molecular and cellular analysis whether the administration of this drug is equally effective in sensitive and resistant cells. With the results obtained from this study, the administration of trabectedin could be considered as a possible treatment in CO resistant to carboplatin and/or olaparib.

[EN] Breast cancer have the highest cancer incidence rate in women worldwide. Within this pathology, different subtypes are divided according to histochemical and molecular classification. Specifically, the triple negative molecular subtype is characterized by a lack of expression of human epidermal growth factor receptor 2 and hormone receptors. This subtype represents around 10-20% of all diagnosed breast cancer. Due to its characteristic phenotype, there are currently no targeted therapies for this subtype. In fact, the standard treatment is chemotherapy, whose event-free survival ratio is only 20% of treated patients. Therefore, it is a need to search for more personalized therapies. In recent years, microRNAs have gained importance in the field of cancer, as it has been demonstrated its role as tumor suppressors in many cancers. MicroRNAs are non-coding RNA fragments capable of binding by sequence complementarity with the 3'UTR region of their target mRNA, thus regulating their expression. In this work the function of the microRNAs-449 family in triple negative breast cancer subtype is studied. The results show that microRNAs-449 expression control the fatty acid biosynthesis pathway through the negative regulation of long-chain acyl-CoA synthetase type 4 (ACSL4). For the first time, a luciferase assay has shown that this is in fact a direct interaction. In addition, in the present study it is demonstrated through in vitro assays that microRNAs-449 gain of function, as well as ACSL4 loss of function, reduces the expression of epithelial-mesenchymal transition markers and with it, the capacity for migration and invasion of tumor cells. Thus, the influence of the microRNAs-449/ACSL4 axis on the aggressiveness of the triple-negative breast cancer is demonstrated. In short, these results suggest the potential of microRNAs-449 as therapeutic targets., [ES] El cáncer de mama tiene la incidencia más alta de cáncer en mujeres a nivel mundial. Dentro de esta patología se diferencian distintos subtipos según la clasificación histoquímica y molecular. En concreto, el subtipo molecular triple negativo se caracteriza por carecer de la expresión del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano y de receptores hormonales. Este subtipo representa alrededor del 10-20% del total de casos de cáncer de mama diagnosticados. Debido a su fenotipo característico, por el momento no existen terapias dirigidas para este subtipo. De hecho, el tratamiento estándar es la quimioterapia, tras la cual solo el 20% de los pacientes logran la supervivencia libre de eventos. Es por ello una necesidad la búsqueda de terapias más personalizadas para el paciente. En los últimos años, los microRNAs han cobrado importancia en el ámbito del cáncer, precisamente se ha demostrado el papel que ejercen como supresores tumorales en muchos cánceres. Se trata de fragmentos de RNA no codificantes capaces de unirse por complementariedad de secuencia con la región 3¿UTR de sus mRNA diana, regulando así su expresión. Es por ello que en este trabajo se estudia la función de la familia de microRNAs-449 en el subtipo de cáncer de mama triple negativo. Los resultados muestran que la expresión de estos microRNAs controlan la ruta de biosíntesis de ácidos grasos a través de la regulación negativa de la acil-CoA sintetasa de cadena larga tipo 4 (ACSL4). Por primera vez, se ha demostrado mediante un ensayo luciferasa que se trata de una interacción directa. Además, en el presente estudio se demuestra mediante ensayos in vitro que la ganancia de función de los microRNAs-449 así como la pérdida de función de ACSL4 reducen la expresión de marcadores moleculares del proceso de transición epitelio-mesénquima, y, con ello, la capacidad de migración e invasión de las células tumorales. Así pues, se evidencia la influencia del eje microRNAs-449/ACSL4 en la agresividad del subtipo triple negativo de cáncer de mama. En definitiva, estos resultados sugieren el potencial de los microRNAs-449 como biomarcadores de pronóstico y como posible diana terapéutica.

[ES] El cáncer de vejiga es el noveno cáncer más común en el mundo, ocupando el puesto 13 con respecto a la mortalidad por cáncer al año. Los métodos de diagnóstico disponibles incluyen tomografía computarizada (TC), resonancia magnética o PET (tomografía por emisión de positrones), que implica una alta radiación para el paciente. Dado que no existen métodos no invasivos para diagnosticar tumores urológicos como el cáncer de vejiga, la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico que permitan monitorizar la enfermedad y predecir la respuesta de la terapia o la resistencia sin intervención invasiva y que además sean económicos y fáciles de detectar es extremadamente necesaria. Las biopsias líquidas tienen el potencial de llenar este vacío, ya que la obtención de muestras es sencilla y mínimamente invasiva. El ADN libre circulante (cfDNA) proviene de células que han muerto, ya sea por apoptosis o por necrosis. En el ambiente tumoral, se produce una mayor proporción de muerte por necrosis que por apoptosis, es decir, se produce principalmente una muerte celular no programada. El resultado de esos diferentes tipos de muerte causa un grado de fragmentación diferente del ADN y el grado de integridad podría representar un biomarcador diagnóstico-pronóstico para diferentes tumores urológicos. En este estudio nos centramos en el cáncer de vejiga, y para ese propósito seleccionamos 83 individuos, 63 pacientes con cáncer vesical en diferentes estadios y 20 controles sanos, pareados por edad y sexo. De cada paciente recolectamos 3 muestras de orina diferentes: antes de la cistectomía, tres meses después y al año después de la cirugía. De los controles recogimos una muestra de orina. En este estudio analizamos la integridad del DNA presente en la orina de los pacientes antes de la cistectomía y lo comparamos con el de los controles sanos. Aislamos el cfDNA de la orina y cuantificamos el nivel de expresión de fragmentos grandes y pequeños de 5 genes, ACTB, BCAS1, STOX1, c-MYC y AR por PCR cuantitativa en tiempo real., [EN] Bladder cancer is the 9th most common cancer in the world, ranking 13th regarding mortality per year. The available diagnostic methods include computed tomography (CT) scan, magnetic resonance imaging (MRI) or positron emission tomography (PET) scan, which involves high radiation radiation for the patient. Given that non-invasive methods to diagnose urologic tumours such as bladder cancer are not available, the search for new, realiable and non- expensive diagnostic biomarkers that allow monitoring the disease and predict response to therapy or resistance without invasive intervention is of paramount importance. Liquid biopsies have the potential to fill this gap, since sampling is easy and minimally invasive. Circulating cell-free DNA (cfDNA) comes from cells that have died, either by apoptosis or by necrosis. In the tumor environment, a greater proportion of cells die by necrosis than by apoptosis thus, a non-programmed cell death mainly occurs. Each type of death causes a different degree of DNA fragmentation and the degree of integrity could represent a diagnostic-prognostic biomarker for different urological tumors. In this study we focused on bladder cancer, and for that purpose we selected 83 individuals, 63 patients with bladder cancer at different stages and 20 healthy controls, matched by age and sex. From each patient we collected 3 different urine samples: before the cystectomy, three months after and one year after the surgery. We collected a urine sample from controls. In this study, we analyzed the integrity of urine DNA of patients before the cystectomy and compared it with that of healthy controls. We isolated the urine cfDNA and quantified the expression level of large and small fragments of 5 genes, ACTB, BCAS1, STOX1, c-MYC and AR by quantitative real-time PCR.

[ES] Los neutrophil extracelular traps (NETs) son redes extracelulares compuestas por DNA, histonas y proteínas de los gránulos, como la mieloperoxidasa, calprotectina y elastasa, que son liberadas por los neutrófilos como respuesta ante un estímulo inflamatorio o ante la presencia de patógenos. Ante una herida, los NETs conforman un mecanismo de defensa para atrapar y eliminar patógenos, aunque también participan en el proceso de la coagulación. Esto es debido a que los NETs proporcionan un andamio que estimula la adhesión y agregación plaquetaria y la formación y deposición de fibrina, aumentando el riesgo trombótico. Asimismo, los NETs son un componente fundamental del trombo in vivo. Cabe destacar, que en estudios en modelos animales se ha evidenciado que la terapia trombolítica goldstandard con activador tisular del plasminógeno no es capaz de lisar completamente el coágulo, por lo que no se consigue restaurar completamente el flujo sanguíneo, si no actúa en combinación con la DNasa I del plasma ya que así se degrada tanto la fibrina como los NETs. En el contexto particular del cáncer, se ha demostrado que las células tumorales liberan estímulos proagregantes, procoagulantes y proinflamatorios que activan la coagulación e inducen un aumento del recuento de neutrófilos. Los neutrófilos inducidos por las células tumorales producen más NETs que aquellos activados por otras vías. Además de incrementar el riesgo trombótico en los pacientes oncológicos, los NETs parecen afectar también a la biología del tumor regulando el crecimiento, angiogénesis e invasión tumoral. El objetivo de este trabajo es verificar el aumento de marcadores de NETs en plasma de pacientes con cáncer vesical, analizar la estabilidad de los NETs y evaluar in vitro nuevas terapias con la finalidad de bloquear su potencial protrombótico en los pacientes oncológicos., [EN] Neutrophil extracellular traps (NETs) are extracellular networks composed of DNA, histones and granule proteins, such as myeloperoxidase, calprotectin and elastase, which are released by neutrophils in response to an inflammatory stimulus or the presence of pathogens. In the presence of a wound, NETs form a defense mechanism to trap and eliminate pathogens, although they also participate in the coagulation process. This is due to the fact that NETs provide a scaffold that stimulates platelet adhesion and aggregation and the formation and deposition of fibrin, increasing the thrombotic risk. Furthermore, NETs are a fundamental component of the thrombus in vivo. It should be noted that studies in animal models have shown that gold-standard thrombolytic therapy with tissue plasminogen activator is not able to lyse the clot fully, so that blood flow is not completely restored. Tissue plasminogen activator has to act in combination with plasma DNase I since it degrades fibrin and NETs. In the particular context of cancer, tumor cells have been shown to release proaggregatory, procoagulant and proinflammatory stimuli that activate coagulation and induce an increase in neutrophil count. Neutrophils induced by tumor cells produce more NETs than those activated by other pathways. In addition to increasing thrombotic risk in cancer patients, NETs also appear to affect tumor biology by regulating tumor growth, angiogenesis and invasion. The aim of this work is to verify the increase of NETs markers in plasma of patients with bladder cancer, to analyze the stability of NETs and to evaluate in vitro new therapies with the purpose of blocking their prothrombotic potential in oncological patients.

[ES] El subtipo triple negativo representa el 10-20% de los casos de cáncer de mama. Como consecuencia de su fenotipo molecular particular y la ausencia de dianas moleculares, la quimioterapia citotóxica es la única posibilidad para el tratamiento para estas pacientes. A pesar de que algunas de ellas responden a la terapia, la mayoría de las mujeres presentan un mal pronóstico debido a la quimioresistencia, lo cual conduce al desarrollo de metástasis y la recaída de la enfermedad. Por esta razón, resulta urgente proporcionar a las pacientes de cáncer de mama triple negativo un tratamiento más personalizado y efectivo. En el presente trabajo, describimos el papel de MBNL1 en la regulación de la respuesta a la doxorrubicina en líneas celulares de cáncer de mama triple negativo. Nuestros resultados revelan que la pérdida de expresión de MBNL1 promueve la resistencia a doxorrubicina, mientras que, por el contrario, su sobreexpresión conduce a una mayor sensibilidad a esta droga mediante dos principales mecanismos: por una parte, la regulación de los transportadores ABC y, por otra, la modulación del eje BIN1/c- MYC/PARP1. Nuestro estudio confirma por primera vez en cáncer que MBNL1 regula la expresión del supresor de tumores, BIN1, el cual se relaciona con la respuesta a doxorrubicina en cáncer de mama triple negativo a través de la modulación de c-MYC y PARP1. Así, demostramos que MBNL1 es capaz de controlar el eje BIN1/c- MYC/PARP1, afectando a la respuesta a doxorrubicina cáncer de mama triple negativo. Además, validamos MBNL1 y BIN1 como biomarcadores de pronóstico en pacientes de cáncer de mama triple negativo., [EN] Triple Negative Breast Cancer represents around 10-20% of breast cancer cases. As a consequence of its particular molecular phenotype and the absence of well-defined molecular targets, cytotoxic chemotherapy remains as the unique possibility of treatment. Even though some patients respond, most of women have a poor prognosis due to chemoresistance, which leads to metastasis development and disease relapse, why it is urgent to provide patients a successful and personalized therapy. Herein, we describe the role of MBNL1 in regulating doxorubicin response in triple negative breast cancer cell lines. Our results demonstrate that loss of MBNL1 promotes doxorubicin resistance whereas, on the contrary, MBNL1 overexpression drives cell sensitivity to this drug through two main mechanisms: on the one hand, the regulation of ABC transporters, and, on the other hand, by modulation of BIN1/c-MYC/PARP1 axis. We confirm for the first time in cancer that MBNL1 regulates the expression of the tumor suppressor, BIN1, which is further related to doxorubicin response in triple negative breast cancer cells by modulating c-MYC and PARP1. Additionally, we demonstrate that MBNL1 controls BIN1/c-MYC/PARP1 axis, thus affecting to doxorubicin response in triple negative breast cancer. Moreover, we also validate MBNL1 and BIN1 as prognosis biomarkers in triple negative breast cancer patients.

[ES] El cáncer es la primera causa de muerte en los países desarrollados, y la segunda a nivel mundial, después de las enfermedades cardiovasculares. Dentro de los diferentes tipos de neoplasias, destaca la relevancia del cáncer de pulmón, al ser la segunda más frecuente en la población general y lo que es más importante, el que presenta una mayor mortalidad. El gen AHR codifica para el aryl hydrocarbon receptor (AhR), un factor de transcripción implicado en la regulación de la expresión génica. Originalmente se pensaba que actuaba principalmente como sensor de xenobióticos y regulador de la expresión de enzimas implicadas en la metabolización de dichos compuestos químicos. Sin embargo, se ha demostrado que AhR también tiene un papel en la regulación de la inmunidad, el mantenimiento de las células madre, los procesos de diferenciación celular y la transición epitelio-mesenquimal, convirtiéndolo en una potencial diana terapéutica. El factor de transcripción AhR se encuentra normalmente en su estado inactivo localizado en el citosol, unido a varias co-chaperonas. Una vez activado por la unión con sus ligandos (exógenos o endógenos), se produce la disociación de las chaperonas y su translocación al núcleo celular, donde forma un dímero con ARNT (AhR nuclear translocator). Este dímero AhR-ARNT se une a los elemento de respuesta a AhR (AHRE) localizados en las regiones promotoras de múltiples genes, causando cambios en su tasa de transcripción. Dada la creciente importancia de este factor en diferentes tipos de cáncer, este proyecto de investigación plantea un metaanálisis exhaustivo de las principales bases de datos de información genómica (TCGA, https://tcgaportal.org y CCLE, https://portals.broadinstitute.org/ccle) y diferentes pipelines bioinformáticos online (CBIOPORTAL, https://www.cbioportal.org; GSEA, https://www.gsea-msigdb.org; etc,) para, por un lado, estudiar y cuantificar las principales alteraciones que afectan al gen AHR en el adenocarcinoma pulmonar (el subtipo histológico más relevante de cáncer de pulmón), y por otro, identificar las firmas transcripcionales que mejor correlacionan con la actividad de AhR, y su asociación con las mutaciones oncogénicas más frecuentes en esta histología, como TP53, KRAS, STK11, KEAP1 y EGFR. La posible relación entre AhR y EGFR será estudiada con mayor profundidad dado su carácter de diana terapéutica para los inhibidores de tirosina quinasa (ITQs) actualmente primera línea de tratamiento para los tumores dirigidos por mutaciones en EGFR, y que la activación de AhR se ha postulado como un posible mecanismo de resistencia a los ITQs. Por último, validaremos la interacción AhR-EGFR mediante western blotting, y ensayos de citotoxicidad y muerte celular in vitro en líneas celulares de adenocarcinoma pulmonar con mutaciones en EGFR (H1975 y HCC4006) y sus equivalentes resistentes a los ITQs (H1975 AZDR y HCC4006 GeR) tratadas con el agonista de AhR 2-(1’Hindole-3’-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester (ITE) y el antagonista 2-methyl-N- [2-methyl-4-(2-methylphenyl)azophenyl]-3-pyrazolecarboxamide (CH223191) en combinación con el ITQ de EGFR osimertinib., [EN] Cancer is the leading cause of death in developed countries and the second leading cause worldwide, after cardiovascular diseases. Lung cancer is the second most frequent type of neoplasms in the global population and, more importantly, the one with the highest mortality. The AHR gene codes for the aryl hydrocarbon receptor (AhR), a transcription factor involved in regulation of gene expression. At first, it was thought to act mainly as a sensor of xenobiotics and regulating expression of enzymes involved in the metabolization of these chemical compounds. However, AhR has also been shown to play a role in the immune system regulation, stem cell maintenance and cell differentiation processes, as well as epithelial-mesenchymal transition (EMT), showing its potential as a possible therapeutic target. The AhR transcription factor is usually found in its inactive state located in the cytosol, bound to several co-chaperones. Once activated by binding to its ligands (exogenous or endogenous), it dissociates from the chaperones and translocates to the cell nucleus, where it dimerizes with ARNT (AhR nuclear translocator). This AhR-ARNT dimer binds to AhR response elements (AHRE) located in promoter regions of multiple genes, causing changes in their transcription. Due to the increasing importance of this factor in different types of cancer, this research project proposes a comprehensive meta-analysis of the main genomic information databases (TCGA, https://tcgaportal.org and CCLE, https://portals.broadinstitute.org/ccle) and different bioinformatics pipelines available online (CBIOPORTAL, https://www.cbioportal.org;GSEA, https://www.gsea-msigdb.org; etc,) to study and quantify the main alterations affecting the AHR gene in lung adenocarcinoma (the most relevant histological subtype of lung cancer), and to identify the transcriptional signatures that best correlate with AhR activity, and their association with the most frequent oncogenic mutations in this histology, such as TP53, KRAS, STK11, KEAP1 and EGFR. The possible relationship between AhR and EGFR will be studied in greater depth given its character as a therapeutic target for tyrosine kinase inhibitors (ITKs), currently the first line of treatment for tumors driven by EGFR mutations. Besides AhR activation has been postulated as a possible mechanism of resistance to ITKs. Finally, we will validate the AhR-EGFR interaction by western blotting, and in vitro cytotoxicity and cell death assays in EGFR-mutated lung adenocarcinoma cell lines (HCC827 and HCC4006) and their resistant form to ITKs (H1975 AZDR y HCC4006 GeR) treated with AhR agonist 2- (1' H-indole-3'-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester (ITE) and antagonist 2-methyl-N-[2-methyl-4-(2-methylphenyl) azophenyl]-3-pyrazolecarboxamide (CH223191) in combination with the EGFR ITK osimertinib.

[ES] El cáncer es la primera causa de muerte en países desarrollados. Se trata de una compleja enfermedad genética causada por un gran abanico de alteraciones y las interacciones entre las mismas. El conocimiento de dichos mecanismos moleculares subyacentes ha conducido al desarrollo de las terapias dirigidas y la inmunoterapia. Sin embargo, las terapias dirigidas solo pueden prescribirse a pacientes con cáncer que alberguen las alteraciones génicas a las que van dirigidas las terapias y no todos los pacientes responden a la inmunoterapia. Por estos motivos, se han descubierto y se están descubriendo biomarcadores genéticos predictivos para seleccionar a potenciales respondedores a las terapias. Además de éstos, los biomarcadores pronósticos son también de gran utilidad para estimar el futuro impacto de la enfermedad en los pacientes. En este contexto, la secuenciación de nueva generación (NGS) se está posicionando como una poderosa herramienta para el análisis múltiple de biomarcadores. En el presente estudio, biopsias fijadas con formalina y embebidas en parafina (FFPE) de 24 pacientes con cáncer de pulmón, mama, endometrio o colorrectalse secuenciaron con un nuevo panel de secuenciación dirigida (Oncomine™ Comprehensive Assay Plus, ThermoFisher) con el fin de validarlo tanto analítica como clínicamente. Tras la secuenciación se revisaron los parámetros de calidad. Para llevar a cabo la validación analítica, se estudiaron la presencia y la calidad de biomarcadores conocidos previamente descritos en las muestras por técnicas validadas. Entre dichos biomarcadores se encontraban variantes de nucleótido único (SNVs), inserciones y deleciones (indels), variantes de número de copias (CNVs), la carga mutacional tumoral (TMB) y la inestabilidad de microsatélites (MSI). El análisis de las variantes se llevó a cabo con los programas de Ion Reporter™ y Torrent™ Suite (ThermoFisher), y los resultados obtenidos se revisaron con la ayuda de bases de datos públicas. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS (IBM). En cuanto a la validación clínica, se llevó a cabo un estudio retrospectivo de los historiales clínicos de los pacientes para determinar si habían seguido tratamiento dirigido o inmunoterapia tras ser diagnosticados con alguno de los biomarcadores mencionados. Seguidamente se analizó el beneficio terapéutico obtenido. Los resultados mostraron una buena calidad de secuenciación y una aceptable capacidad de detección de SNVs, indels y CNVs. Los valores de TMB obtenidos, a su vez, concordaban con los de los resultados validados. Con respecto al MSI, se encontraron algunas discrepancias que sugieren la necesidad de refinar los algoritmos responsables de su cálculo. En cuanto a la validación clínica, varios pacientes que habían sido diagnosticados con alteraciones accionables se beneficiaron de tratamientos dirigidos y una mayor supervivencia libre de progresión (SLP). Además, se detectaron co-mutaciones, mecanismos de resistencia y otras alteraciones interesantes desde el punto de vista clínico. En términos generales, el panel de secuenciación dirigida objeto de estudio mostró su habilidad para la detección simultánea de múltiples biomarcadores relacionados con cáncer, expandiendo así las opciones terapéuticas de los pacientes y potencialmente ayudando en la toma de decisiones del personal médico., [EN] Cancer is the first cause of death in developed countries, being a complex genetic disease caused by a wide range of genetic alterations and their interactions. The knowledge of such underlying genetic mechanisms has led to the development of targeted therapies and immunotherapy. However, targeted therapies can only be prescribed to cancer patients harbouring the targeted gene-traits. For those reasons, predictive genetic biomarkers have been and are being discovered to select potential responders. Additionally, prognostic biomarkers are of great use to assess the future impact of the disease on patients. In this context, Next-Generation Sequencing (NGS) is positioning as a powerful tool for multiple-biomarkers assessment. In the present study, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)-tumor tissue from 24 patients with lung, breast, colorectal or endometrial cancer were sequenced with a new targetedsequencing gene panel (Oncomine™ Comprehensive Assay Plus, ThermoFisher) in order to validate it both clinically and analytically. After sequencing, quality parameters were reviewed. To perform analytical validations, the presence and quality of known biomarkers previously obtained from the same samples by validated techniques were studied. The new targetedsequencing gene panel comprised Single-Nucleotide Variants (SNVs), insertions and deletions (indels), Copy-Number Variations (CNVs), Tumor Mutational Burden (TMB) and Microsatellite Instability (MSI), to obtain a comprehensive landscape of the tumor. Variant analysis was performed with the Torrent™ Suite and Ion Reporter™ Softwares (ThermoFisher) and results were reviewed using public databases. Statistical analyses were performed with the SPSS (IBM) software. Regarding clinical validation, a retrospective study of clinical histories of patients was carried to determine if they had received a targeted or immune-based therapy upon diagnosis of any of the above-mentioned biomarkers. Consequently, the obtained therapeutic benefit was analysed. Results showed a correct sequencing quality and acceptable SNVs, indels and CNVs detection. TMB values were also in concordance with previously validated results. However, some discrepancies arouse that suggested the need for refining algorithms responsible to compute regarding MSI. As for clinical validation, several patients who had been diagnosed with targetable alterations benefited from targeted treatments and increased Progression-Free Survival (PFS). In addition, co-mutations, resistance mechanisms and other interesting alterations from the clinical point of view were detected. Overall, the targeted-sequencing panel of study proved its ability to simultaneously detect multiple cancer-related biomarkers, expanding therapeutic options of cancer patients and potentially aiding in decision-making by clinicians.

[ES] RESUMEN: -INTRODUCCIÓN: La Discinesia Ciliar Primaria (DCP) es una enfermedad rara respiratoria con una prevalencia de 1/20000. Es una condición hereditaria y permanente causada por defectos congénitos en la ultraestructura de los cilios. Se manifiesta causando un funcionamiento deficiente del sistema de aclaramiento mucociliar, generando congestión nasal, tos, otitis o en casos más graves problemas pulmonares como las bronquiectasias. Se trata de una enfermedad con un diagnóstico tardío e infradiagnosticada por lo que actualmente se buscan nuevas técnicas para el estudio de la enfermedad. Es por ello por lo que un cultivo en interfaz Aire-Líquido (ALI) permite generar condiciones más similares a las fisiológicas, utilizándose como modelo para el estudio de la DCP. Sin embargo, las células están sometidas a un equilibrio sustancias oxidantes-sustancias antioxidantes, que puede verse alterado por los cambios en las condiciones del cultivo ALI, generando una situación de estrés oxidativo. -MÉTODOS: Establecimiento de un modelo celular para la investigación de la DCP mediante la técnica de cultivo ALI de células epiteliales nasales obtenidas del cornete nasal medio de un individuo sano. Este cultivo permite la diferenciación celular logrando así el desarrollo de un epitelio pseudoestratificado. En segundo lugar, se llevó a cabo, mediante RT-qPCR, el análisis de la expresión de diversos genes del sistema antioxidante en las diferentes etapas del cultivo ALI. -RESULTADOS: El cultivo se alcanzó con éxito, caracterizado por la presencia de células ciliadas generadoras de movimiento. Asimismo, las células en general en el cultivo, están sometidas a un mayor estrés oxidativo cuando se encuentran totalmente sumergidas, es decir, en la etapa de crecimiento y proliferación. -CONCLUSIÓN: Los resultados obtenidos en este trabajo indican que ha sido posible, la puesta a punto en nuestro laboratorio, del cultivo ALI caracterizado por el desarrollo de células epiteliales nasales, células productoras de mucosidades y células multiciliadas características del epitelio nasal humano. En este contexto, el cultivo ALI destaca por su beneficioso uso en el estudio de enfermedades respiratorias, favoreciendo la diferenciación celular, no adquirida en los cultivos en monocapa., [EN] SUMMARY: -INTRODUCTION: Primary Ciliary Dyskinesia (DCP) is a rare respiratory disease with a prevalence of 1/20000. It is a hereditary and permanent condition caused by congenital defects in the ultrastructure of the cilia. It manifests itself by causing a deficient functioning of the mucociliary clearance system, generating nasal congestion, cough, otitis or in more severe cases pulmonary problems such us bronchiectasis. It is a disease with a late diagnosis and underdiagnosed, so new techniques for the study of the disease are currently being sought. This is why an Air-Liquid Interface (ALI) culture allows the generation of conditions more similar to physiological ones, being used as a model for the study of DCP. However, cells are subjected to an oxidant-antioxidant substance balance, which can be altered by changes in ALI culture conditions, generating oxidative stress. -METHODS: Establishment of a cellular model for the investigation of DCP using ALI culture technique of nasal epithelial cells obtained from the middle nasal concha of a healthy individual. This culture allows cell differentiation, thus achieving the development of a pseudostratified epithelium. Secondly, RT-qPCR was used to analyze the expression of various genes of the antioxidant system in the different stages of the ALI culture. -RESULTS: The culture was successfully achieved, characterized by the presence of motility-generating ciliary cells. Also, cells in general in the culture, are subjected to higher oxidative stress when they are fully submerged, that is in the growth and proliferation stage. -CONCLUSION: The results obtained in this work indicate that it has been possible, to develop in out laboratory, the ALI culture characterized by the development of nasal epithelial cells, mucus-producing cells and multiciliated cells characteristic of the human nasal epithelium. In this context, ALI culture stands out for its beneficial use in the study of respiratory diseases, favoring cell differentiation, not acquired in monolayer cultures.

[ES] La aparición del brote de la enfermedad COVID-19 a finales del año 2019, unida a su rápida capacidad de transmisión provocó que, en cuestión de pocos meses, el mundo se viese sumido en una pandemia cuyo principal causante fue un nuevo coronavirus denominado SARS-CoV-2. Consecuentemente, los esfuerzos de la comunidad científica a nivel global han centrado en la caracterización del virus y de su sintomatología asociada, especialmente a los casos más severos de la enfermedad, y los mecanismos moleculares que los provocan, por lo que el trabajo de clasificar y relacionar toda esta información publicada se convierte en una ardua tarea, pero no por ello deja de ser indispensable. Esta revisión describe, por tanto, las características principales del SARS-CoV-2, centrándose en la disfuncionalidad del interferón de tipo I (IFN I) y su implicación en el desarrollo del Síndrome de Liberación de Citoquinas (CRS), que origina una inflamación a nivel sistémico y, en muchos casos, da lugar al fallecimiento de los pacientes. Además, aspira a recopilar, dentro de una única publicación, toda la información obtenida hasta la fecha asociada a estos dos sucesos fisiológicos dentro del contexto de los casos severos de COVID-19 para poder actuar como nexo de unión en la comprensión de las implicaciones entre ambos. Finalmente, se proponen diversos enfoques en cuanto al posible desarrollo de tratamientos centrados en la prevención y cuidado del CRS y su cuadro clínico asociado., [EN] The appearance of the outbreak of the COVID-19 disease during the last months of 2019, as well as its rapid transmission capacity, caused that, in the span of a few months, the world was plunged into a pandemic whose main cause was a new coronavirus called SARS-CoV-2. Consequently, the scientific community around the world focused its efforts on the characterization of the virus and its associated symptomatology, especially among the most severe cases of the disease, and the molecular mechanisms that cause them. Therefore, the task of classifying and associating all this published information becomes arduous, even if it is still indispensable. This revision describes the principal characteristics of SARS-CoV-2, focusing on the malfunction of type I interferon (IFN I) and its implication in the development of Cytokine Release Syndrome (CRS), which results in inflammation at a systemic level and, in many cases, in the death of patients. Furthermore, it aims to compile, within a single publication, all the information obtained so far associated with these two physiological events within the context of severe cases of COVID-19 in order to act as a nexus in the understanding of the implications among the two of them. Finally, various approaches related to the possible development of treatments focused on the prevention and care of the CRS and its associated clinical profile are proposed.

La biopsia líquida es una pieza clave para la implementación de la Oncología de Precisión. En este video comentaremos el concepto de biopsia líquida, sus ventajas y limitaciones, Este objeto de aprendizaje se encuentra descontextualizado. Su uso está pensado para alumnos de grados relacionados con las ciencias biomédicas

En este objeto de aprendizaje comprenderás la naturaleza de los genes implicados en la transformación maligna de las células.

[ES] Existe un reconocimiento creciente de que el cáncer como enfermedad es el resultado de un fallo sistémico en el cual muchas células, además de aquellas con genomas oncogénicos, determinan la frecuencia de cáncer. Se ha vuelto cada vez más evidente que la estructura, la función y la disfunción de los tejidos están altamente entrelazadas con el microambiente durante el desarrollo del cáncer y que la biología de los tejidos y la fisiología del huésped se subvierten para impulsar la progresión maligna. La interrupción de las interacciones celulares y la arquitectura de los tejidos pueden ser incluso los principales impulsores de la carcinogénesis. Experimentos recientes con modelos de ratones diseñados se han centrado en identificar el tipo y los medios por los cuales las células normales median el desarrollo del cáncer. Aunque el paradigma de salud de la radiación predominante se centra en el daño del ADN inducido por la radiación, que conduce a mutaciones, numerosos estudios en los últimos 50 años han proporcionado evidencia de que incluso la carcinogénesis de la radiación es más compleja de lo que generalmente se aprecia. Con el fin de dilucidar el papel del daño del ADN y las interacciones del microambiente de las células en los tumores, evaluaremos los datos de RNAseq de 145 tumores de cáncer de mama, en dos grupos; 10cGy irradiado y control no irradiado (Sham). También evaluaremos mediante inmunohistoquímica diferentes marcadores pronósticos de cáncer para correlacionar las firmas de expresión génica con los diferentes subtipos de tumores de mama., [EN] There is growing recognition that cancer as a disease results from a systemic failure in which many cells other than those with oncogenic genomes determine the frequency of clinical cancer. It has become increasingly evident that tissue structure, function and dysfunction are highly intertwined with the microenvironment during the development of cancer and that tissue biology and host physiology are subverted to drive malignant progression. Disruption of the cell interactions and tissue architecture can even be primary drivers of carcinogenesis. Recent experiments with engineered mouse models have focused on identifying the type and means by which normal cells mediate the development of cancer. Although the prevailing radiation health paradigm focuses on radiation-induced DNA damage leading to mutations, numerous studies over the last 50 years have provided evidence that even radiation carcinogenesis is more complex than generally appreciated. In order to elucidate the role of DNA damage and tumor cell microenvironment interactions, we will evaluate the RNAseq data of 145 breast cancer tumors, in two groups; irradiated 10cGy and non-irradiated control (Sham). We will also evaluate by immunohistochemistry different cancer prognostic markers in order to correlate gene expression signatures with the different breast tumor subtypes.

[ES] Las enfermedades cardiovasculares se deben a trastornos del corazón y de los vasos sanguíneos. Según la Organización Mundial de la Salud, son la principal causa de muerte a nivel mundial, siendo responsables de 17 millones de muertes cada año aproximadamente. Un tipo de enfermedad cardiovascular son las miocardiopatías, que comprenden cambios estructurales y funcionales del músculo cardiaco causando una disfunción mecánica y/o eléctrica del mismo. Hay varios tipos de miocardiopatías que se clasifican según sus causas, en este caso destacamos la miocardiopatía dilatada que tiene tanto causas genéticas como no genéticas. El 35% de los casos están causados por genes mutados que codifican proteínas sarcómeras, citoesqueléticas o de envoltura nuclear. Hasta el momento se han identificado varios genes que se asocian a la presencia de esta patología de diferentes tipos. Se sabe que diferentes factores ambientales como la presencia de hipertensión o diabetes modifica el riesgo de desarrollar un gran número de problemas cardiacos, incluida la miocardiopatía dilatada. Esta enfermedad se caracteriza por una disfunción sistólica y diastólica, producidas por la dilatación del ventrículo izquierdo, por una disfunción contráctil y por el aumento de las presiones de llenado. Si bien, no hay suficiente información sobre el efecto de los genes asociados con el desarrollo de esta patología y el desarrollo de enfermedades de alto riesgo cardiovascular, como puede ser la hipertensión. En este proyecto se realiza un estudio poblacional general de los marcadores descritos previamente asociados con esta patología, utilizando el método de NGS para identificar los polimorfismos de interés. Analizar la importancia de variantes genéticas previamente asociadas con el desarrollo de esta patología en la regulación de los niveles de presión arterial es importante para poder establecer los mecanismos que puedan tener en común el desarrollo de estas dos enfermedades. Así, genes que pueden afectar al desarrollo del corazón o modificarlo en presencia de determinados factores, podrían afectar al desarrollo del sistema circulatorio y provocar el desarrollo de niveles alterados de presión arterial; conociéndose ya que varios de estos genes modulan los niveles de presión arterial. Además, como los niveles elevados de presión arterial es un factor de riesgo importante, aquellas variantes que también supongan unos mayores niveles de presión arterial podrían tener un efecto mayor sobre la miocardiopatía dilatada. Por otro lado, se lleva a cabo un estudio estadístico para ver las posibles asociaciones con dicha patología y otros parámetros relacionados con el riesgo cardiovascular como el BMI, perímetro de cintura y diabetes tipo 2 entre otros., [EN] Cardiovascular diseases are caused by disorders of the heart and blood vessels. According to the World Health Organisation they are the number 1 cause of death globally, accounting for approximately 17 million deaths each year. One type of cardiovascular diseases are cardiomyopathies which is mainly characterized by structural and functional changes of the heart muscle causing mechanical and/or electrical dysfunction of the heart muscle. There are several types of cardiomyopathies that are classified according to their causes, in this case we focus on dilated cardiomyopathy which has both genetic and non-genetic causes. The 35% of cases are caused by mutated genes encoding sarcomeric, cytoskeletal or nuclear envelope proteins. So far, various genes have been identified that are associated with the presence of this pathology of different types. Environmental factors such as the presence of hypertension or diabetes modify the risk of developing a number of cardiac problems, including dilated cardiomyopathy. This disease is characterised by systolic and diastolic dysfunction, caused by left ventricular dilatation, contractile dysfunction and increased blood pressures. Nowadays, there is little information on the effect of genes associated with the development of this pathology and the development of high-risk cardiovascular diseases, such as hypertension. In this project, a general population study of the previously described markers associated with this pathology is carried out, using the Next Generation Sequencing method to identify the polymorphisms of interest. It is important to analyse the importance of genetic variants previously associated with the development of this pathology in the regulation of blood pressure levels in order to establish the mechanisms that may be common to the development of these two diseases. There are some genes that can affect the development of the heart or modify it in the presence of some factors, could affect the development of the circulatory system and cause the development of altered blood pressure levels; several of these genes are already known to modulate blood pressure levels. Furthermore, as elevated blood pressure levels is an important risk factor, those variants that also result in higher blood pressure levels may have a greater effect on dilated cardiomyopathy. Moreover, a statistical study is carried out to see the possible associations with this pathology and other parameters related to cardiovascular risk such as BMI, waist circumference and type 2 diabetes among others.

[ES] El cáncer de mama triple negativo representa aproximadamente un 15% de los casos de cáncer de mama y se caracteriza por su agresividad y mayor potencial metastásico, por lo que se asocia con un mal pronóstico. Además, la ausencia de dianas terapéuticas hace que la única opción de tratamiento actual sea la quimioterapia. En este proyecto se evaluó el papel de MBNL1 en la regulación de la transición epitelio-mesenquimal y la adquisición de características de célula madre en líneas celulares de cáncer de mama triple negativo. Los resultados obtenidos demuestran que la pérdida función de MBNL1 provoca una disminución en la capacidad de proliferación y en la expresión de CCNE2, mientras que induce un aumento en la capacidad de migración, invasión y formación de colonias, así como una menor expresión de los marcadores de transición epitelio-mesenquimal y de célula madre cancerosa. Además, se validó el potencial pronóstico de MBNL1 en pacientes de cáncer de mama triple negativo. De estos resultados se concluye que MBNL1 tiene un papel sobre la regulación del fenotipo mesenquimal y de célula madre cancerosa en modelos in vitro de cáncer de mama triple negativo y cuenta con un gran potencial pronóstico en pacientes con esta enfermedad., [EN] Triple negative breast cancer represents about 15% of breast cancer cases and this type of breast cancer is characterized by its aggressiveness and higher metastatic potential, therefore it is associated with a poor prognosis. In addition, due to the absence of therapeutic targets, chemotherapy is the only currently available treatment option. In this project we evaluated the role of MBNL1 in the regulation of epithelial-to-mesenchymal transition and the acquisition of stem cell properties in triple-negative breast cancer cell lines. The results demonstrated that loss of MBNL1 function causes a decrease in proliferation and CCNE2 expression, while induces an increased migration, invasion and colony formation capacity, as well as a lower expression of epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem cell markers. In addition, the prognostic value of MBNL1 in triple-negative breast cancer patients was validated. From these results we conclude that MBNL1 plays a role in the regulation of mesenchymal and cancer stem cell phenotype in triple-negative breast cancer in vitro and has a promising prognostic potential in breast cancer patients.

[ES] El cáncer se posiciona como una de las principales causas de muerte a nivel mundial, siendo el cáncer de células renales (CCR) el 8º más frecuente en países desarrollados. A pesar de la mejora en el diagnóstico y manejo, el CCR sigue presentándose como una de las neoplasias urológicas malignas más letales. La falta de biomarcadores no invasivos que representen la heterogeneidad del tumor hace que las líneas de actuación actuales no se utilicen de manera extendida y no sean suficientes para aumentar las tasas de supervivencia. La biopsia líquida y en concreto la orina, es una fuente de biomarcadores de fácil y económica obtención que reúne estas características. En cánceres urológicos, la orina es el biofluido que está en contacto con las células tumorales. En ella, se encuentra el DNA libre circulante (cell-free DNA ¿ cfDNA), que proviene de células no tumorales que mueren principalmente por apoptosis y de células tumorales por necrosis. En la apoptosis se produce una mayor fragmentación del DNA por ser una muerte celular programada, mientras que en el ambiente tumoral la necrosis da lugar a una menor fragmentación. Este diferente grado de fragmentación del DNA da lugar a fragmentos de distintos tamaños que podría emplearse como biomarcador tumoral. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la integridad del cfDNA en orina como biomarcador en CCR. Para ello se empleó una colección de muestras de orina de 57 pacientes con CCR de los tres subtipos principales (38 de células claras, 14 papilares y 5 cromófobos) y 27 controles sanos. De cada paciente se recogieron dos muestras, una previa a la cirugía y otra posterior (entre 1 y 2 años después) mientras que de los controles una única muestra. Tras el aislamiento del cfDNA a partir de orina, se cuantificó mediante PCR cuantitativa en tiempo real el nivel de expresión de un fragmento corto (potencialmente resultante de la apoptosis) y uno largo (potencialmente procedente de la necrosis) de los genes ACTB, AR, BCAS1, MYC y STOX1. Se calculó el ratio de fragmentos largos y cortos como medida de la integridad del DNA y se evaluaron las diferencias entre los grupos clínicos. Algunos de los biomarcadores estudiados mostraron potencial diagnóstico y de clasificación de CCR. La integridad de ACTB y AR y el fragmento corto de MYC y STOX1 podrían servir para diagnosticar CCR de células claras, mientras que para papilar y cromófobo podrían usarse el ratio ACTB y el fragmento corto MYC, respectivamente. Además, se ha observado que, con una probabilidad elevada, el fragmento corto de MYC podría predecir el riesgo de pertenecer a cada uno de los tres subtipos, el ratio ACTB el riesgo de CCR de células claras y papilar, y el ratio AR y el fragmento corto de STOX1 el de células claras. Los biomarcadores estudiados no mostraron utilidad para evaluar el seguimiento de los pacientes con CCR. Una vez confirmados y validados en una cohorte mayor de pacientes, estos biomarcadores podrían tener valor en la práctica clínica del CCR., [EN] Cancer is one of the leading causes of death worldwide, with renal cell carcinoma (RCC) being the 8th most common cancer in developed countries. Despite improved diagnosis and management, RCC remains one of the most lethal urological malignancies. The absence of non-invasive biomarkers that represent the heterogeneity of the tumour results in the current approaches not being widely used and not being sufficient to increase survival rates. Liquid biopsy and specifically urine, is an easy and inexpensive source of biomarkers that fulfils these requirements. In urological cancers, urine is the biofluid that is in contact with tumour cells. It contains cell free DNA (cfDNA), which comes from non-tumour cells that die mainly by apoptosis and from tumour cells that die mainly by necrosis. In apoptosis, greater DNA fragmentation takes place due to programmed cell death, whereas in the tumour environment, necrosis results in less fragmentation. Consequently, the different degree of DNA fragmentation that originates fragments of different sizes might be used as a tumor biomarker. Hence, the aim of this project was to evaluate the integrity of cfDNA in urine as a biomarker for RCC. For this purpose, a collection of urine samples from 57 RCC patients with the three main subtypes (38 clear cell, 14 papillary and 5 chromophobe) and 27 healthy controls were used. Two samples were collected from each patient, one pre-surgery and one post-surgery (between 1-2 years later) and from the controls only one sample. After isolation of cfDNA from urine, the expression level of a short (potentially resulting from apoptosis) and a long (potentially resulting from necrosis) fragment of the ACTB, AR, BCAS1, MYC and STOX1 genes were quantified by real-time quantitative PCR (qPCR). The ratio of long to short fragments was calculated as a measure of DNA integrity and the differences between the clinic groups were evaluated. Some of the biomarkers studied showed diagnostic and classification potential in RCC. ACTB and AR integrity and MYC and STOX1 short fragment could be used to diagnose clear cell RCC, whereas for papillary and chromophobe the ACTB ratio and MYC short fragment could be used, respectively. Furthermore, it has been observed that with high probability the MYC short fragment could predict the risk of belonging to each of the three subtypes, while the ACTB ratio the risk of clear cell and papillary RCC, and the AR ratio and the STOX1 short fragment the clear cell RCC. The biomarkers studied were not useful to evaluate the follow-up of RCC patients. Once confirmed and validated in a larger cohort of patients, these biomarkers could have value in RCC clinical practice.

[ES] La activación del sistema inmunológico se ha asociado con comportamientos depresivos tanto en humanos como en modelos animales. En estudios preclínicos se ha demostrado que las citocinas proinflamatorias desempeñan un papel fundamental en la aparición y persistencia de conductas depresivas inducidas por inflamación. Existen evidencias que demuestran que algunos tipos de receptores del sistema inmune pertenecientes a la familia de receptores innato tipo Toll (TLR) están implicados en la regulación de comportamientos relacionados con el aprendizaje, la depresión, la memoria y la ansiedad. De esta manera, en este estudio evaluamos el papel del receptor TLR9 en un modelo de depresión asociado con una inflamación aguda inducido por lipopolisacárido (LPS), en roedores macho C57BL6/J. Analizamos la conducta depresiva, la ansiedad y el posible deterioro cognitivo asociado con la inflamación y/o conducta depresiva, y cómo esta respuesta es regulada por una estimulación del TLR9 previa a la administración de LPS. Nuestros hallazgos muestran que el pre-acondicionamiento agudo con CpG-ODN1826 en ratones macho C57BL6/J tratados con LPS disminuyó significativamente el tiempo de inmovilidad en la prueba de suspensión de la cola (TST), aumentó el tiempo en la caja clara en la prueba de la caja clara-oscura (LDB) y aumentó el tiempo dedicado a explorar el nuevo objeto en la prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR). Además, con la prueba de campo abierto confirmamos que el efecto antidepresivo no se debía a una estimulación de la actividad motora general y que los ratones no mostraban alteraciones en la actividad motora. De esta manera, la estimulación de TLR9 podría promover efectos neuroprotectores en condiciones patológicas. No obstante, los efectos observados tras el preacondicionamiento agudo con CpG-ODN1826, no mostraron estar acompañados de cambios en el perfil neuroinflamatorio en el hipocampo, por lo que quizás estén producidos por mecanismos diferentes a la neuroinflamación no elucidados actualmente., [EN] Activation of the immune system has been associated with depressive behaviors in both humans and animal models. In preclinical studies, pro-inflammatory cytokines have been shown to play a fundamental role in the onset and persistence of inflammation-induced depressive behaviors. There is evidence showing that some types of immune system receptors belonging to the innate Toll receptor (TLR) family are involved in the regulation of behaviors related to learning, depression, memory and anxiety. In this way, this study evaluates the role of the TLR9 receptor in a model of depression associated with acute inflammation induced by lipopolysaccharide (LPS), in male C57BL6/J rodents. We analyze depressive behavior, anxiety and possible associated cognitive impairment with inflammation and/or depressive behavior, and how this response is regulated by a stimulation of TLR9 prior to the administration of LPS. Our findings showed that acute pre-conditioning with CpG-ODN1826 in male C57BL6/J mice treated with LPS decreased the immobility time in the tail suspension test (TST), increased the time in the clear box in the light-dark box test (LDB) and increased the time spent exploring the new object in the novel object recognition test (NOR). Furthermore, with the open field test we confirmed that the antidepressant effect was not due to a stimulation of general motor activity and that mice did not show alterations in motor activity. In this way, TLR9 stimulation could promote neuroprotective effects in pathological conditions. However, the effects observed after acute pre-conditioning with CpG-ODN1826 were not shown to be accompanied by changes in the neuroinflammatory profile in the hippocampus, so they may be produced by mechanisms other than neuroinflammation that are not currently elucidated.

[ES] Discinesia Ciliar Primaria (DCP) es un trastorno hereditario de carácter autosómico recesivo que se caracteriza por la inmovilidad ciliar. El diagnóstico de la enfermedad es complicado debido a la similitud de síntomas a los de otras enfermedades respiratorias y consiste en la combinación de varias pruebas de alta complejidad. La European Respiratory Society (ERS) y la American Thoracic Society recomienda en su último Task Force guideline on PCD hacer enfoque diagnóstico en la realización de estudios genéticos mediante secuenciación masiva. Con el objetivo de comprobar la utilidad de dicha técnica en el ambiente clínico ha sido realizado un estudio retrospectivo de los datos clínicos y el estudio genético mediante técnicas de la secuenciación de nueva generación en el grupo de 10 pacientes con sospecha DCP. Ha sido identificado cinco variantes candidatas en uno de los 44 genes del panel diseñado, cuatro de los cuales no descritas en la literatura previamente. Considerando resultados genéticos ha sido posible definir el diagnostico en pacientes participantes y ampliar conocimiento sobre causas y curso clínico de la enfermedad., [EN] Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is an inherited autosomal recessive disorder characterized by ciliary immobility. The diagnosis of the disease is complicated due to the similarity of symptoms to those of other respiratory diseases and consists of the combination of different high complexity tests. The European Respiratory Society (ERS) and the American Thoracic Society recommend in their latest Task Force guideline on PCD to make a diagnostic approach in genetic studies using massive sequencing. In order to determine its diagnostic utility, the retrospective study of clinical data and genetic study were performed using the new generation sequencing methods in the group of 10 patients with suspected PCD. Five candidate variants were found in one of the 44 genes from designed gene panel, four of them were not previously described in the literature. Considering genetic results, it was possible to define the diagnosis in participants and extend knowledge about causes and clinical course of the disease.

[ES] El síndrome mielodisplásico (SMD) es un trastorno clonal caracterizado por una hematopoyesis ineficaz y una tendencia a evolucionar a leucemia mieloide aguda (LMA). Los estudios genéticos han permitido la identificación de un conjunto de genes mutados recurrentemente fundamentales para la patogénesis del SMD, que pueden organizarse en un número limitado de procesos celulares, incluido el splicing de ARN, la regulación transcripcional, epigenética, traduccional y la transducción de señales. Esta comprensión detallada del panorama molecular de los SMD, junto con la secuenciación de ADN, ha revolucionado la compresión de la patogénesis de esta enfermedad. Por ello, muchos centros incluyen los análisis de NGS como parte del diagnóstico integrado de rutina de los pacientes con SMD permitiendo detectar y tratar de forma más precisa la enfermedad y tratando de evitar su evolución a una LMA. El presente proyecto pretende validar el panel de NGS Extended Myeloid SolutionTM de SOPHiA GeneticsTM en una serie de pacientes menores de 60 años diagnosticados con SMD del Hospital Universitario y Politécnico de La Fe de Valencia. Para la validación de este panel, se comparará el resultado obtenido con el diagnóstico de estos pacientes con los paneles empleados actualmente en la rutina: el panel de diagnóstico somático (Myeloid SolutionTM de SOPHiA GeneticsTM) y el panel empleado en pacientes menores de 60 años para descartar que la neoplasia hematológica tenga un origen germinal (panel genes Custom de SureSelect)., [EN] Myelodysplastic syndrome (MDS) is clonal disorder characterized by ineffective hematopoiesis and a tendency to evolve into acute myeloid leukemia (AML). Genetic studies have enabled the identification of a set of recurrently mutated genes central to the pathogenesis of MDS, which can be organized into a limited number of cellular processes, including RNA splicing, transcriptional regulation, epigenetic, translational, and signal transduction. This detailed understanding of the molecular landscape of MDS, with the DNA sequencing, has revolutionized our understanding of the pathogenesis of this disease. For this reason, many centres include the NGS analysis as part of the routine integrated diagnosis of patients with MDS, allowing to detect and treat the disease with greater precision and trying to prevent its progression to AML. This project aims to validate the NGS panel Extended Myeloid SolutionTM by SOPHiA GeneticsTM in a series of patients under 60 years of age diagnosed with MDS at the Hospital Universitario y Politécnico de La Fe de Valencia. For the validation of this panel, the results obtained with the diagnoses of these patients will be compared with the panels that are currently used in the routine: the somatic diagnostic panel (Myeloid SolutionTM by SOPHiA GeneticsTM) and the panel used in patients under 60 years old to rule out that the hematologic malignancy is germinal in origin (SureSelect Custom Gene Panel).