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[eng] Kv1.3 plays a crucial role in leukocytes, where it regulates activation and proliferation. In these cells, Kv1.3 is coexpressed with modulatory subunit KCNE4. This ancillary peptide acts as a dominant negative regulator of the channel with a dual function. On the one hand, KCNE4 triggers the intracellular retention of Kv1.3 reducing K+ currents. On the other, KCNE4 enhances their C- type inactivation kinetics. Thus, the aim of this thesis was to characterize the molecular mechanisms of Kv1.3/KCNE4 association and modulation in the context of the immune system physiology. To do so, the thesis is structured in three chapters. Chapter I (KCNE4 in the immune system). We confirmed the physiological role of KCNE4 in immune cells like T lymphocytes and dendritic cells (Contribution 1). By manipulating the expression of KCNE4 in these cells, we were the first to describe a relationship between KCNE4 and the leukocyte function. Our results highlight a possible therapeutic role for KCNE4. Chapter II (A protein interaction hub (L69-72) in the C-terminus of KCNE4). We analysed the relationship between Kv1.3, KCNE4 and calmodulin (CaM). We identified a tetraleucine motif in the C-terminus of KCNE4 (L69-72) that determines association to Kv1.3 (Contribution 2). In a nearby position, an ER retention motif (ERRM) triggers intracellular retention of the channel. These results were replicated in a peptide containing just 22 residues of KCNE4, including both clusters. This peptide partially replicated the inhibitory effects of KCNE4 and thus, a potential pharmacological interest. We are also the first to propose a structural model for the Kv1.3/KCNE4 association. On the other hand, L69-72 in KCNE4 also determines CaM binding. The role of Ca2+/CaM is relevant in the context of the immune system physiology, where Kv1.3 potentiates the calcium signalling. Furthermore, we are the first to report dimerization of KCNE4 (Contribution 3), which modulates the traffic of KCNE4. Dimerization was also mediated by the leucine cluster, acting as a protein interaction hub. We propose CaM binding as a mechanism to fine-tune interactions with Kv1.3 and dimerization. Chapter III (Structural relationships of the Kv1.3/KCNE4 complex). We focused on the structural Kv1.3/KCNE4 association. A series of chimaeras between KCNE2 and KCNE4 allowed us to decipher roles for each domain of KCNE4 (Contribution 4). Thus, we confirmed that the C- terminus of KCNE4 mediates association and intracellular retention of Kv1.3. Moreover, for the first time we characterized the molecular determinants of KCNE4-dependent kinetic modulation of Kv1.3. These results were confirmed with Gibbs free energy calculations and the Kv1.3/KCNE4 structural model. Using alanine-scanning mutagenesis, we mapped some residues implicated in this process. Moreover, we found that, similar to other Kv/KCNE associations, Kv1.3/KCNE4 associated in an open stoichiometry with up to four KCNE4 subunits per complex (Contribution 5). The number of KCNE4 peptides in the channelosome was proportional to the effects on activation kinetics and current amplitude. However, the accentuation of Kv1.3 inactivation was independent of stoichiometry. The similarities in stoichiometry and docking to Kv channels suggest a conserved mechanism among KCNE peptides. Finally, because KCNE4 caused structural Kv1.3 changes, we studied the effect of KCNE4 on Kv1.3 pharmacology (Contribution 6). We studied margatoxin and Psora-4, two well-characterized Kv1.3 inhibitors with different binding sites. Our results point out the relevance of considering auxiliary subunits in the development of therapeutic approaches. In conclusion, this thesis deepens the knowledge of the molecular mechanisms of Kv1.3 modulation by KCNE4. We provide a structural insight into Kv channel modulation while considering the physiological context. Our results are of considerably physiological interest due to the multitherapeutic potential of Kv1.3.

[eng] The present Thesis is divided in three chapters: 1. Design and synthesis of new soluble epoxide hydrolase inhibitors (sEHI) The synthesis of new soluble epoxide hydrolase inhibitors based on ureas as the main pharmacophore, a benzohomoadamantane unit and different arylpiperidine groups. The aim was to broaden the spectrum of inhibitors previously developed by the group, taking as starting point the Astellas pharmaceutical product AS2586114. Twelve new urea-based sEHIs were synthesized and evaluated. Two of them were selected for further in vitro studies. The synthesis of new sEHI derived from the substitution of the urea group by and amide group, in order to extend the Markush formula of a patent that the group filled in two years ago and, on the other hand, to improve the solubility of the urea-containing sEHI. Twelve novel amide-based sEHI were synthesized and evaluated. One of them was selected for further in vitro studies demonstrating potent anti-inflammatory properties. 2. Design and synthesis of new anti-influenza virus molecules. The development of new antiviral molecules against the influenza A virus H1/N1 subtype targeting the hemagglutinin of the virus, continuing previous research by our group. This part of the Thesis greatly improved and completed previous SAR studies on this kind of hemagglutinin inhibitors. 3. Design and synthesis of new anti-coronavirus molecules. The development of new antiviral molecules against coronavirus 229E, continuing group’s research in the field carrying out a more complete SAR study. Guanidine-bearing molecules were endowed with a great potency against 229E subtype. The most active compound was selected for further mechanistic studies in order to identify the targeted protein. Unfortunately, the compounds were not active against the SARS-2 coronavirus.

[eng] Nucleoside transporters are essential for nucleotide homeostasis as well as for nucleoside-derived drugs bioavailability. Non-canonical natural nucleosides or “epigenetic nucleosides” are endogenously produced and possess pharmacological properties. Their pharmacological action depends on cytidine deaminase activity, which is a typical mechanism of chemoresistance induction for nucleoside-derived drugs. Thus, epigenetic nucleosides show a potential singular status in terms of cancer therapy approach. However, the interplay between these nucleosides and nucleoside transporters which might facilitate their bioavalability remains unknown. In order to unveil that question both interaction and translocation aspects of epigenetic nucleosides towards nucleoside transporters are addressed within this work. In addition to epigenetic nucleosides, the possible interaction of ruxolitinib with nucleoside transporters is also studied in this work. Ruxolitinib is a Janus kinase inhibitor used for the treatment of negative Philadelphia- chromosome chronic myeloproliferative neoplasms. Since it is well known and perfectly established that several kinase inhibitors are recognized by nucleoside transporters, the same question has been raised for ruxolitinib. Additionally, the molecular structure of ruxolitinib contains a heterocycle which is highly similar to hypoxanthine, a key structural determinant for purine nucleoside recognition by nucleoside transporters. That particularity together with the fact that the main cell target of ruxolitinib are hematopoietic precursors which lack de novo nucleotide synthesis and completely depend on nucleoside salvage pathway make ruxolitinib a good candidate in terms of its interaction with nucleoside transporters. As a result of this work, it is shown that epigenetic nucleosides are recognized by nucleoside transporters being even translocated by them in some cases. To that extent, two associations stand out over the rest: 5hmdC with hCNT1 and 5fdC with hENT1. The critical factor which determines molecular recognition turns out to be the chemical environment provided by the functional group at position 5 of the pyrimidine ring of the nucleoside. Unexpectedly, 5fdC turns out to be recognized and even transported by the purine-preferring transporter hCNT2. As to ruxolitinib, its interaction with hENT1 is elucidated. Due to this interaction, ruxolitinib has the capacity to modulate the pharmacological activity of nucleoside-derived drugs such as gemcitabine by inhibiting hENT1 activity.

[cat] Les proteïnes motores s’encarreguen del transport intracel·lular de cargoes a través de fibres tubulars presents en el citosquelet mitjançant la hidròlisis del trifosfat d'adenosina (ATP) com a força motriu del moviment. Aquestes proteïnes motores amb capacitat de moviment mecànic intern han servit d'inspiració per a la creació de nous sistemes sintètics de transport molecular. Així, en aquesta tesi doctoral s’han dissenyat dispositius fonamentats en la formació de monocapes electroactives per a la complexació i descomplexació de cargoes π-donadors i subseqüent transport al llarg d’una superfície funcionalitzada mitjançant l’aplicació d’estímuls redox. Amb aquesta finalitat, s’han sintetitzat diferents sals de bipiridini (MV-SH·2X, BzV-SH·2X, MV2-SH·4X i MV2·4X (X= Cl o PF6)) què són molècules carregades positivament i π-acceptores, per a la formació de les monocapes electroactives. MV-SH·2X, BzV-SH·2X i MV2-SH·4X es van sintetitzar amb terminacions tiol per tal de tenir un punt d’ancoratge en superfícies d’or, mentre que la MV2·4X es va sintetitzar amb un triple enllaç terminal per a poder ser immobilitzada en qualsevol tipus de superfície mitjançant cicloaddicions 1,3-dipolar amb monocapes terminades en grup azida. Les molècules i partícules que es van dissenyar com els cargoes consisteixen en molècules fluorescents derivades de la sulforodamina (SRPEGNp), nanopartícules d’or (Np-AuNPs) i micropartícules de silici policristal·lí (Np-PolySi μP), en tots els casos amb grups π-donadors. La formació de monocapes autoassemblades electroactives amb les sals de bipiridini (MV-SH·2X, BzV-SH·2X i MV2·4X (X= Cl o PF6)) es van preparar en diferents substrats conductors o semiconductors mitjançant tècniques d’immersió o litografia tova d’impressió per microcontacte. Un cop formades les monocapes electroactives, es va procedir a la formació del complex π-donador/π-acceptor incorporant el cargo π-donador (SRPEGNp i Np-PolySi μP) sobre la superfície mitjançant tècniques d’immersió o litografia tova d’impressió per microcontacte. Així mateix, es va estudiar la posterior descomplexació dels cargoes al aplicar estímuls redox o mecànics. Finalment, es va estudiar la funcionalització de les micropartícules de silici policristal·lí amb les sals de bipiridini MV2·4PF6 i 1·4PF6 per a la formació de complexos π-donador/π-acceptor amb neurotransmissors π-donadors i la seva descomplexació al aplicar estímuls redox. Així doncs, en aquesta tesi s’ha pogut demostrar la funcionalitat de noves monocapes electroactives formades amb sals de bipiridini (MV-SH·2X, BzV-SH·2X i MV2·4X (X= Cl o PF6)) que poden interaccionar supramolecularment amb cargoes π-donadors. Aquesta interacció es trenca un cop la molècula electroactiva es redueix, induint la descomplexació del cargo. La resposta d’aquestes monocapes a estímuls redox i la possibilitat de controlar la descomplexació del cargo, fa que aquest treball obri la porta a la seva utilització com a interruptors moleculars electroquímics pel transport de cargoes al llarg de superfícies funcionalitzades electroactives., [eng] Les proteïnes motores s’encarreguen del transport intracel·lular de cargoes a través de fibres tubulars presents en el citosquelet mitjançant la hidròlisis del trifosfat d'adenosina (ATP) com a força motriu del moviment. Aquestes proteïnes motores amb capacitat de moviment mecànic intern han servit d'inspiració per a la creació de nous sistemes sintètics de transport molecular. Així, en aquesta tesi doctoral s’han dissenyat dispositius fonamentats en la formació de monocapes electroactives per a la complexació i descomplexació de cargoes π-donadors i subseqüent transport al llarg d’una superfície funcionalitzada mitjançant l’aplicació d’estímuls redox. Amb aquesta finalitat, s’han sintetitzat diferents sals de bipiridini (MV-SH·2X, BzV-SH·2X, MV2-SH·4X i MV2·4X (X= Cl o PF6)) què són molècules carregades positivament i π-acceptores, per a la formació de les monocapes electroactives. MV-SH·2X, BzV-SH·2X i MV2-SH·4X es van sintetitzar amb terminacions tiol per tal de tenir un punt d’ancoratge en superfícies d’or, mentre que la MV2·4X es va sintetitzar amb un triple enllaç terminal per a poder ser immobilitzada en qualsevol tipus de superfície mitjançant cicloaddicions 1,3-dipolar amb monocapes terminades en grup azida. Les molècules i partícules que es van dissenyar com els cargoes consisteixen en molècules fluorescents derivades de la sulforodamina (SRPEGNp), nanopartícules d’or (Np-AuNPs) i micropartícules de silici policristal·lí (Np-PolySi μP), en tots els casos amb grups π-donadors. La formació de monocapes autoassemblades electroactives amb les sals de bipiridini (MV-SH·2X, BzV-SH·2X i MV2·4X (X= Cl o PF6)) es van preparar en diferents substrats conductors o semiconductors mitjançant tècniques d’immersió o litografia tova d’impressió per microcontacte. Un cop formades les monocapes electroactives, es va procedir a la formació del complex π-donador/π-acceptor incorporant el cargo π-donador (SRPEGNp i Np-PolySi μP) sobre la superfície mitjançant tècniques d’immersió o litografia tova d’impressió per microcontacte. Així mateix, es va estudiar la posterior descomplexació dels cargoes al aplicar estímuls redox o mecànics. Finalment, es va estudiar la funcionalització de les micropartícules de silici policristal·lí amb les sals de bipiridini MV2·4PF6 i 1·4PF6 per a la formació de complexos π-donador/π-acceptor amb neurotransmissors π-donadors i la seva descomplexació al aplicar estímuls redox. Així doncs, en aquesta tesi s’ha pogut demostrar la funcionalitat de noves monocapes electroactives formades amb sals de bipiridini (MV-SH·2X, BzV-SH·2X i MV2·4X (X= Cl o PF6)) que poden interaccionar supramolecularment amb cargoes π-donadors. Aquesta interacció es trenca un cop la molècula electroactiva es redueix, induint la descomplexació del cargo. La resposta d’aquestes monocapes a estímuls redox i la possibilitat de controlar la descomplexació del cargo, fa que aquest treball obri la porta a la seva utilització com a interruptors moleculars electroquímics pel transport de cargoes al llarg de superfícies funcionalitzades electroactives.

[eng] Pediatric RMS is a developmental tumor that affects patients from birth to late adolescence. RMS tumorigenesis involves the stalk of embryological myogenic processes. Classically, two main subgroups of RMS have been defined based on the histopathological features: Embryonal (ERMS) and Alveolar (ARMS). However, the molecular classification refines the subgrouping into Fusion Positive or Fusion Negative based on the occurrence of FOXO1 oncogenic translocations. The recent genetic and epigenetic landscapes of those subgroups have identified few potential druggable targets. Nowadays, the outcome of children with relapsed/refractory RMS remains very poor. In order to find new opportunities for these patients this thesis focuses on the identification of new therapeutic targets effective for RMS treatment as well as on characterizing biomarkers of response for the new targeted treatment. We initially performed a functional approach starting from IGF1R target therapies to main downstream pathways including PI3K/AKT/mTOR and MEK/ERK that we found active in primary samples as well as in patient derived models. The new IGF1/2 monoclonal antibody m708.5 was found active in a subset of RMS particularly dependent on the IGF/AKT/mTOR pathway. Interestingly, we found that the ATP-competitive pan-AKT inhibitor Ipatasertib was highly active causing tumor regression in a subset of patient derived models. We were able to classify RMS primary models and their parental samples into two subgroups: Ipatasertib- dependent and Ipatasertib non-dependent. Moreover, preclinical pharmacology corroborated the dose-dependent response of RMS to this inhibitor. Most interesting, those tumors particularly sensitive to Ipatasertib were shown to be resistant to the MEK inhibitor Trametinib. Surprisingly, the study of a mechanistically different AKT inhibitor did not recapitulate Ipatasertib efficacy in vivo. We discovered that Ipatasertib sensitivity correlated with high PRKG1 levels. We described for the first time PRKG1 gene expression as RMS specific and predictive of Ipatasertib response in vivo. The genetic signature of PRKG1 depleted RMS cells is enriched in the expression of myogenic genes, positioning for the first time PRKG1 in the landscape of RMS tumorigenesis. The potential of PRKG1 as a prognostic marker was evaluated. Ongoing studies will determine the mechanism of myogenic blocking dependent on PRKG1.

[spa] La enfermedad del hígado graso no alcohólico es una patología sin tratamiento farmacológico específico que posee una alta prevalencia a nivel mundial, cuya etapa inicial se caracteriza por la esteatosis hepática simple. En esta tesis estudiamos dos fármacos candidatos para su tratamiento. El primero, la cafeína (CAF), sugerido por su efecto en la reducción de la infiltración de lípidos en el hígado a través de mecanismos antiinflamatorios, antioxidantes y relacionados con la autofagia y, el segundo, el ácido bempedoico (BemA), aprobado recientemente para el tratamiento de la hipercolesterolemia, que posee efectos en el hígado sobre la síntesis de ácidos grasos. Esta tesis fue dividida en tres estudios: en el estudio 1, caracterizamos un modelo animal de esteatosis hepática inducida por el consumo de una dieta alta en grasas (HFD) suplementada con fructosa líquida al 10% (HFHFr) durante tres meses en ratas hembras Sprague Dawley. A pesar de la mayor ingesta calórica, el peso corporal no varió en ratas HFD o HFHFr, debido a la inducción de termogénesis en el tejido adiposo marrón. La adición de fructosa al HFD incrementó la esteatosis hepática debido a la inhibición del catabolismo de ácidos grasos y la inducción de la DNL a través de ChREBP y SREBP, sin signos de inflamación, estrés del retículo endoplásmico o resistencia a la insulina hepática. Además, en el hígado de las ratas HFHFr, la activación de ChREBP aumentó la expresión de PNPLA3, desencadenando hipertrigliceridemia y aumentando el flujo de ácidos grasos hacia el músculo. Este efecto cambió el principal sustrato energético en el músculo, mostrado por un incremento de la β-oxidación de ácidos grasos en este tejido. En el estudio 2, analizamos el efecto de una dosis moderada de CAF (5 mg/kg), o como parte del extracto de café verde (GCE), en ratas HFHFr. Ni la CAF ni el GCE mejoraron la esteatosis hepática, sin embargo, las ratas tratadas con GCE, mostraron niveles más bajos de triglicéridos hepáticos en comparación con el grupo CAF. Los efectos diferenciales de GCE podrían estar relacionados con reducciones en la (a) fosforilación de mTOR hepático, lo que conduce a niveles más altos de lipina-1 nuclear y limita la expresión de genes lipogénicos; (b) niveles de diacilglicerol y ratio de hexosilceramida/ceramida; y (c) expresión del receptor de lipoproteínas de muy baja densidad. En el estudio 3, tratamos ratas HFHFr con BemA (30 mg/kg/día). El tratamiento mejoró la acumulación de lípidos en el hígado a través de nuevos mecanismos, además de la ya descrita inhibición de ACLY hepática: (a) disminución de DNL a través de la reducción de la expresión de la KHK hepática; b) aumento de la lipólisis por inducción de la expresión de PNPLA3, también responsable de la falta de efecto del fármaco sobre la hipertrigliceridemia; y c) aumento de la β-oxidación de ácidos grasos debido a un efecto agonista de PPARα, también observado sobre PPARγ., [eng] Non-alcoholic fatty liver disease is a highly prevalent condition without specific pharmacological treatment, characterized in the initial stages by hepatic steatosis. In this thesis, we studied two potential candidates for its treatment. The first one, caffeine (CAF), was suggested to reduce the lipid infiltration in the liver through anti-inflammatory, antioxidative and autophagy-related mechanisms. The second, bempedoico acid (BemA), was recently approved for the treatment of hypercholesterolemia, and has effects on hepatic fatty acid synthesis. This thesis was divided into three studies: in study 1, we characterized an animal model of hepatic steatosis induced by the consumption for three months of a high- fat diet (HFD) supplemented with 10% liquid fructose (HFHFr) in female Sprague Dawley rats. Despite the higher caloric intake, the body weight did not change in HFD or HFHFr rats, due to the induction of thermogenesis in the brown adipose tissue. The addition of fructose to the HFD increased hepatic steatosis by the inhibition of fatty acid catabolism and the induction of DNL through ChREBP and SREBP activation, without signs of inflammation, endoplasmic reticulum stress or hepatic insulin resistance. Furthermore, in the liver of the HFHFr rats, ChREBP activation increases PNPLA3 expression, triggering hypertrigliceridemia, and increasing the fatty acid flux to the muscle. This changed the mean energy substrate in the muscle, showed by an increment of the fatty acid β-oxidation in this tissue. In study 2, we analyzed the effect of a low dose of CAF (5 mg/kg), isolated or as part of a green coffee extract (GCE), in HFHFr rats. Neither CAF nor GCE alleviated hepatic steatosis, but GCE-treated rats showed lower hepatic triglyceride levels compared to the CAF group. The differential GCE effects could be related to reductions of hepatic (a) mTOR phosphorylation, leading to higher nuclear lipin-1 levels, and limiting lipogenic gene expression; (b) diacylglycerol levels and hexosylceramide/ceramide ratios; and (c) very-low- density lipoprotein receptor expression. In study 3, we treated HFHFr rats with BemA (30 mg/kg/day). The treatment improved the lipid accumulation in the liver through novel mechanisms besides the already described inhibition of hepatic ACLY: (a) decrease of DNL through the reduction of hepatic KHK expression; b) increase in lipolysis by induction of PNPLA3 expression, also responsible for the lack of effect of the drug on hypertriglyceridemia; and c) increase of fatty acid β-oxidation due to a PPARα agonist effect, also observed on PPARγ.

[eng] Photopharmacology has the main purpose to allow the control of protein activity with light. The most exploited strategy used to achieve this objective is the freely diffusible photopharmacology and it is based in the use of photosensitive ligands. These ligands are small bioactive molecules, which include a part of their structure (i.e. photoswitch) that can experience molecular changes upon illumination with a determined wavelength of light. These ligands can freely diffuse and they can be applied with systems expressing native proteins. Azobenzene is the most common photoswitch used in photopharmacology and it can switch with near UV light from the flat and long trans isomer to a shorter bent cis configuration. The reverse photoisomerization can be achieved either with visible light or thermally with light. Thus, if we include azobenzene in the molecular scaffold of a ligand by means of a replacement of a particular moiety (azologization), we can obtain new azo compounds that will resemble to the original ligand, but their structural shape will dramatically changes upon illumination (photoisomerization). Therefore, the two possible isomers will have distinct binding modes to the target protein and will lead to different protein activities under different light conditions, which is known as photoswitching. Metabotropic Glutamate Receptors (mGluRs) belong to the class C/Glutamate family of G Protein-Coupled Receptors and control many neuronal and glial functions. mGlu receptors are endogenously activated by glutamate, which is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system (CNS), but they can also be activated or inactivated by allosteric modulators. They are usually considered better drug candidates than the orthosteric ligands because usually highly specific for a receptor and able to modulate the activity of a given receptor without blocking endogenous ligand binding. First of all, we designed and synthesized three families of compounds, using an azo-replacement strategy, to obtain photoswitchable allosteric modulators with possible NAM activity in mGlu5 in the cis isomers, while in the trans form they are inactive. This behavior is easily controlled by illuminating with different wavelengths and it is reversible in vitro. All the three families were inactive as NAMs, but some results suggest that the compounds could act as mGlu5 PAMs in trans form. Studies are continuing in this direction (Chapter 1). Next, we carry out the design and synthesis of compounds to improve PAM activity at the mGlu4 receptor and increase selectivity over the other group III mGluRs of at least one azo benzene candidate with a structure similar to Optogluram, the first photoswitchable positive allosteric modulator for the mGlu4 receptor. We obtained Optogluram-2 with good pharmacological potency and improved the photoisomerization properties. Under 380 nm light, the potency of Optogluram-2 is significantly reduced. The change in photoinduced potency observed is greater in Optogluram-2 than in Optogluram. Optogluram-2 has similar potency to Optogluram but is more selective for mGlu4 both on the receptors of the same group III as on the other mGluRs. All this indicates that Optogluram-2 can induce an improved activated/deactivated profile change as well as have an optimal selectivity for more complex assays, such as in vivo assays (Chapter 2). Additionally, we synthesized two series of compounds to find the first photoswitchable compound to selectively enable optical control of the endogenous mGlu1 receptor. Photoglurax-1 arose as a PAM of mGlu1 with micromolar potency in the trans isomer. Under 380nm light, the potency is significantly reduced. Photoglurax-1 turned out to be an equipotent mGlu4 PAM and therefore its general profile is not suitable for in vivo translation as a possible mGlu1 PAM tool compound. However, a dual mGlu1/mGlu4 PAM activity could be intriguing for an antipsychotic agent, since mGlu4 PAM activity can alleviate catalepsy, a major adverse event with standard antipsychotic drug treatment. In contrast, Photoglurax-2 acts as a mGlu1 PAM and does not show any observable allosteric effect on mGlu4 or activity on mGlu5, and therefore Photoglurax-2 represents a potential in vivo photoswitchable PAM mGlu1 tool compound. Reversible monitoring of mGlu1 activity obtained with light can be very advantageous in studying the pharmacological and physiological implications of mGlu1 in many diseases with unprecedented precision (Chapter 3). Finally, we designed and synthesized a family of novel photoswitchable azoheteroarenes as mGlu1 NAMs with an active trans isomer and an inactive cis isomer to reversibly inactivate the function of the mGlu1 receptor. The potencies of the trans configurations of some compounds of the family are in the micromolar range . Unfortunately, after 400 nm illumination the results were inconclusive due to artifacts that could originate from a possible toxicity of cis azo compounds. More experiments should be done with cells that do not express mGlu1 and also changing the light system to corroborate eventual toxicity (Chapter 4). Likewise, we use some of these compounds in their trans form, therefore without applying light, as tools to expand the knowledge about the nature of the intermediate states induced by mGlu receptor agonists in studies of fluorescence conformational dynamics. Analysis of the effect of mGlu1 NAMs on receptor conformational changes is reported in Chapter 4., [spa] Los receptores metabotrópicos de glutamato (mGlu) son GPCRs distribuidos a través del CNS y se consideran dianas farmacológicas para trastornos neurológicos, tales como el dolor neuropático y la enfermedad de Parkison, entre otras. En primar lugar, diseñamos y sintetizamos tres familias de compuestos, utilizando una estrategia de azo- reemplazo, para obtener moduladores alostéricos de GPCR fotoconmutable con posible actividad NAM en mGlu5 en los isomeros cis, mientras que en la disposición trans son inactivos. Este comportamiento se controla fácilmente con iluminación con diferentes longitudes de onda y es reversible in vitro. Ninguna familia resultò activa como NAMs, pero algunos resultados sugieren que los compuestos podrían actuar como PAMs mGlu5 en forma trans. La investigación continúa siguiendo esta dirección (Capítulo 1). Seguidamente, realizamos el diseño y sintesis de compuestos para mejorar la actividad de PAM en el receptor mGlu4 y aumentar la selectividad sobre los otros mGluR del grupo III de al menos un candidato a azobenceno con estructura similar a Optogluram, el primer modulador alostérico positivo fotoconmutable para el receptor mGlu4. Obtuvimos Optogluram-2 con buena potencia farmacologica y mejoramos las propriedades de fotoisomerizacion. Bajo una luz de 380 nm, la potencia de Optogluram-2 se reduce significativamente. El cambio de potencia fotoinducido observado es mayor en Optogluram-2 que en Optogluram.Optogluram-2 tiene potencia parecida a Optogluram pero es màs selectivo para mGlu4 tanto sobre los receptores del mismo grupo III como sobre los demas. Todo esto indica que Optogluram-2 puede inducir un cambio de perfil activado/desactivado mejorado asì como tener una selectividad optimal para ensayos más complejos, como los ensayos in vivo (Capítulo 2). Sintetizamos dos series para encontrar el primer compuesto fotoconmutable para habilitar selectivamente el control óptico del receptor mGlu1 endógeno. Photoglurax-1 surgió como un PAM de mGlu1 con potencia micromolar en el isómero trans. Bajo una luz de 380 nm, la potencia se reduce significativamente. Photoglurax- 1 resultó ser un mGlu4 PAM equipotente y por eso su perfil general no es apropiado para una traducción in vivo como una posible herramienta molecular mGlu1 PAM. Sin embargo, una actividad dual mGlu1/mGlu4 PAM podría ser intrigante para un agente antipsicótico,ya que la actividad mGlu4 PAM puede aliviar la catalepsia, un evento adverso importante con el tratamiento estándar con fármacos antipsicóticos. En cambio, Photoglurax-2 actúa como un PAM mGlu1 y no muestra ningún efecto alostérico observable en mGlu4 ni actividad en mGlu5 y por lo tanto Photoglurax-2 representa una potencial herramienta molecular PAM mGlu1 fotoconmutable in vivo. El control reversible de la actividad de mGlu1 obtenido con luz puede ser muy ventajoso para estudiar las implicaciones farmacológicas y fisiológicas de mGlu1 en muchas enfermedades con una precisión sin precedentes (Capítulo 3). Finalmente, intentamos diseñar y sintetizar una familia de novedosos azoheteroarenos fotoconmutables como NAMs de mGlu1 con un isomero trans activo y un isomero cis inactivo para inactivar reversiblemente la función del receptor mGlu1. Las potencias de las configuraciones trans de algunos compuestos de la familia estan en el rango de micromolaridad. Desafortunadamente, tras una iluminación de 400 nm los resultados fueron no concluyentes debido a artefactos que podrían originarse a partir de una posible toxicidad de los compuestos cis azo. Se deben realizar más experimentos con células que no expresen mGlu1 y cambiando tambien el sistema de luz para comprobar si se trata de toxicidad (Capítulo 4). Asimismo, utilizamos algunos de estos compuestos en su forma trans, por lo tanto sin aplicar luz, como herramientas para ampliar el conocimiento sobre la naturaleza de los estados intermedios inducidos por agonistas de los receptores mGlu en estudios de dinámica conformacional de fluorescencia. El análisis del efecto de los NAMs de mGlu1 sobre los cambios conformacionales del receptor están reportados en el Capítulo 4. En resumen, encontramos como obtener un interruptor molecular entre varias actividades farmacologicas. Ademàs, demostramos que la fotofarmacologia presenta ventajas respecto a la farmacologia convencional, ya que permite ajustar la activacion del receptor con luz.

[eng] This doctoral thesis is focused on disclosing molecular factors that regulate the functional mechanism of key targets in i) metabolic disorders, such as diabetes and obesity, and ii) tuberculosis (TB). These diseases have a high impact on the public health, and TB is one of the diseases that causes highest mortality rates based on the World Health Organization reports. Accordingly, gaining insight on functionally relevant protein structures with key roles in these diseases and understanding their regulatory mechanisms can pave a way to identify novel therapeutic targets. Regarding the metabolic disorders, I have specifically studied the direct activation mechanism of adenosine-monophosphate activated protein kinase (AMPK) by different activators, such as A-769662, SC4 and PF-739, since AMPK plays an important role in cellular energy homeostasis and it is directly related to diabetes type 2 and obesity. These studies were carried out to explore the molecular basis of the selective isoform activation of AMPK, especially focusing on the role played by the two different isoforms of β subunit. The first part of this research was focused on the direct activation by A-769662 compound in α2β1 isoform, and the second part addressed the important issue of isoform selectivity, it being dedicated to examine the structural and dynamical properties of β1- and β2-containing AMPK complexes formed with A-769662, SC4 and PF-739. The results revealed the mechanical sensitivity of the α2β1 complex, in contrast with a larger resilience of the α2β2 species. Moreover, binding of activators to α2β1 promotes the pre-organization of the ATP-binding site, favoring the adoption of activated states of the enzyme. In another part of the research related to AMPK, in collaboration with Prof. Ana Castro from Institute of Medicinal Chemistry and Prof. María S. Fernández-Alonso from Complutense University of Madrid, I studied a novel indolic compound synthesized and experimentally analysed by their group as modulator of endothelial AMPK that acts as a mixed-type inhibitor. It means that this modulator, IND6, may bind the ATP-binding site leading to competitive inhibition of the enzyme but also suggest that IND6 may regulate the AMPK activity through binding to an additional pocket. Regarding TB, I have studied the truncated hemoglobin N (trHbN) of Mycobacterium tuberculosis (Mtb). These studies aimed to disclose innovative therapeutic approaches by identifying the molecular basis of the nitrosative stress resistance of Mtb. Our hypothesis was that a decrease in the nitric oxide (NO) resistance should affect the survival of the bacillus, increasing the efficacy of current therapeutic treatments. Nitric oxide detoxification (NOD) is carried out by trHbN, which converts NO into the harmless nitrate anion, becoming essential for the defense mechanism of Mtb. However, two points prevent the use of this system as therapeutic target. On the one side, trHbN is not druggable and there is the risk that a drug targeting trHbN may also affect other hemoglobins. On the other side, the reductase protein that helps trHbN to restore the ferrous state required to initiate the NOD is still unknown. Our studies have led to the identification of three reductase candidates for NOD activity. We have built the 3D models for the three candidates and performed the protein-protein docking in order to obtain a reductase-trHbN complex. The important role played by one of these candidates, ndh, has been highlighted in several experimental studies. This led us to focus our attention in the trHbN-ndh complex and establish the steps that could help to advance in the definition of new therapeutic strategies for TB., [spa] Esta tesis doctoral se centra en el análisis de los factores moleculares que regulan el mecanismo funcional de dianas clave en: i) trastornos metabólicos, como diabetes y obesidad, y ii) tuberculosis (TB). Estas enfermedades tienen un elevado impacto en la salud pública, y en particular la TB se halla entre las enfermedades con una mayor tasa de mortalidad según los informes de la Organización Mundial de la Salud. Por lo tanto, conocer las estructuras proteicas que tienen una función clave en estas enfermedades y comprender sus mecanismos reguladores puede allanar el camino para identificar nuevos objetivos terapéuticos. Respecto a los trastornos metabólicos, he estudiado el mecanismo de activación directa de la proteína quinasa activada por adenosina-monofosfato (AMPK) por diferentes activadores, como A-769662, SC4 y PF-739, ya que AMPK juega un papel importante en la homeostasis energética celular y está directamente relacionada con diabetes tipo 2 y obesidad. Estos estudios se llevaron a cabo con el objetivo de explorar los factores moleculares que regulan la activación selectiva de isoformas de AMPK, centrándome especialmente en el papel que desempeñan las dos isoformas de la subunidad β. La primera parte de esta investigación se centró en la activación directa por el compuesto A-769662 en la isoforma α2β1, y la segunda parte se dedicó a examinar la base molecular de la selectividad entre isoformas, considerando específicamente las propiedades estructurales y dinámicas de los complejos de AMPK que contienen isoformas β1 y β2 formados con A- 769662, SC4 and PF-739. Los resultados revelaron la sensibilidad mecánica del complejo α2β1, en contraste con una mayor resiliencia de la especie α2β2. Además, la unión de los activadores en la isoforma α2β1 promueve la organización previa del sitio de unión de ATP, favoreciendo la adopción de estados activados de la enzima. Asimismo, en colaboración con la Prof. Ana Castro del Instituto de Química Médica y la Prof. María S. Fernández-Alonso de la Universidad Complutense de Madrid, estudiamos un novedoso compuesto indólico sintetizado y analizado experimentalmente por sus grupos, que actúa como inhibidor de tipo mixto y es capaz de modular el AMPK endotelial. Nuestros cálculos sugieren que este modulador, IND6, puede unirse al sitio de unión de ATP que conduciría a una inhibición competitiva del enzima, pero también apuntan que IND6 puede regular la actividad de AMPK mediante la unión a un bolsillo adicional. En cuanto a TB, he estudiado la hemoglobina truncada N (trHbN) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). El objetivo ha sido obtener un nuevo enfoque terapéutico mediante la identificación de la base molecular de la resistencia al estrés nitrosativo de Mtb. Nuestra hipótesis es que una disminución de la resistencia al óxido nítrico (NO) debería afectar la supervivencia del bacilo, aumentando la eficacia de los tratamientos terapéuticos actuales. La desintoxicación del óxido nítrico (NOD, de sus siglas en inglés) se realiza mediante trHbN, que transforma NO en el inocuo anión nitrato, convirtiéndose en un mecanismo de defensa esencial de Mtb. Sin embargo, dos puntos impiden el uso de este sistema como diana terapéutica. Por un lado, la trHbN no puede ver modificada su acción mediante ningún fármaco ya que carece de bolsillos que permitan enlazar el fármaco, y segundo, porque sería muy difícil intentar modificar únicamente esta hemoglobina en el paciente sin provocar efectos secundarios. Por otro lado, aún se desconoce la proteína reductasa que ayuda a restaurar el estado ferroso de trHbN requerido para iniciar el NOD. Mi objetivo ha sido identificar esta reductasa. Por esta razón, los estudios se han centrado en la identificación de tres posibles candidatos capaces de permitir la actividad NOD de Mtb. Una vez identificados, se han construido modelos 3D para cada uno de ellos y realizado el acoplamiento proteína-proteína para obtener un complejo reductasa-trHbN de partida. Durante esta investigación, varios trabajos experimentales apuntaron la importancia de uno de los candidatos identificados, la reductasa ndh. Este hecho nos permitió centrar nuestra atención en el complejo trHbN-ndh y establecer los pasos que podrían ayudar a avanzar en la definición de una nueva estrategia terapéutica para TB.

[cat] La salut ha estat sempre una de les principals preocupacions de la societat, i més encara amb la situació de pandèmia actual produïda pel virus (SARS-CoV-2) s’és conscient de que portar un estil de vida amb bons hàbits alimentaris influeix directament en la salut, existint nombroses investigacions que així ho demostren. Per tant, l’adquisició de nutrients adequats juga un paper vital en el manteniment de la funció normal del cos i la prevenció de malalties, sobretot aquelles que estan relacionades amb l’envelliment (malalties cardiovasculars, neurodegeneratives, diabetis tipus II, així com diversos tipus de càncer). És per això que la demanda d'aliments funcionals que promouen la salut ha rebut una àmplia atenció, tant entre professionals de la salut com entre el públic en general, emergint així nous conceptes com els nutracèutics. El terme nutracèutic combina dues paraules "nutrient" i "farmacèutic" i va ser introduït per Stephen DeFelice, metge endocrinòleg, l'any 1989. DeFelice defineix el compost nutracèutic com "aquell aliment o part d'un aliment que proporciona un benefici en la salut, incloent-hi la prevenció o el tractament d'una malaltia ". Desafortunadament, la majoria d'aquests compostos solen presentar propietats fisicoquímiques limitants, com ara una baixa biodisponibilitat oral, baixa solubilitat i en alguns casos baixa estabilitat química. El pterostilbé, l'ubiquinol i la vitamina D3 són tres compostos nutracèutics coneguts per les seves importants funcions bioquímiques i nutricionals. Lamentablement no sempre es poden aprofitar completament els seus potencials beneficis ja que presenten una baixa biodisponibilitat oral en el cas del pterostilbé i inestabilitat química com en els casos de l’ubiquinol i la vitamina D3. En la present tesi doctoral es descriu el descobriment, la síntesi i la caracterització de noves formes sòlides cristal·lines, en particular cocristalls amb millora de les propietats fisicoquímiques d'aquests tres compostos nutracèutics. Els cocristalls presenten avantatges respecte als compostos de partida en quant a biodisponibilitat i estabilitat i han demostrat ser alternatives amb potencial aplicabilitat industrial. Per a aquest estudi es van utilitzar diferents tècniques experimentals com ara la mòlta, la suspensió, la cristal·lització i l'evaporació lenta. Dels més de 1.500 experiments de cribatge, s’han obtingut 25 noves formes cristal·lines, entre ells polimorfs i cocristalls dels tres compostos nutracèutics. Les estructures cristal·lines d’11 de les noves formes han estat resoltes i analitzades en detall. En particular, dues d'elles s'han resolt mitjançant mètodes d’espai directe amb dades de difracció de raigs X de pols. A més, s’han utilitzat diverses tècniques computacionals, com ara l'anàlisi de les interaccions intermoleculars, el càlcul de l’energia reticular, la construcció de superfícies de potencial electrostàtic molecular (MEP) i superfícies de Hirshfeld per tal d’aprofundir en el coneixement a nivell cristal·logràfic i supramolecular dels 3 principis actius nutracèutics., [eng] Health has always been one of the main concerns of society, and even more so with the current pandemic situation caused by the virus (SARS-CoV-2). It is well accepted that following a lifestyle with good eating habits directly influences health, as numerous studies prove. Therefore, acquisition of the right nutrients plays a vital role in maintaining normal body function and preventing disease, especially those related to aging (cardiovascular disease, neurodegenerative diseases, type II diabetes, as well as different types of cancer). This is why the demand for functional foods that promote health has received widespread attention, both among health professionals and the general public, thus emerging new concepts such as nutraceuticals. The term nutraceutical, combining two words "nutrient" and "pharmaceutical", was introduced by Stephen DeFelice, an endocrinologist, in 1989. DeFelice defines the nutraceutical compound as "food or part of a food that provides a benefit in the health, including the prevention or treatment of a disease”. Unfortunately, most of these compounds tend to show limiting physicochemical properties, such as low oral bioavailability, low solubility, and in some cases low chemical stability. Pterostilbene, ubiquinol and vitamin D3 are three nutraceutical compounds known for their important biochemical and nutritional functions. Unfortunately, their potential benefits cannot always be fully exploited as they have low oral bioavailability in the case of pterostilbene and chemical unstability in the case of ubiquinol and vitamin D3. The present PhD thesis describes the discovery, synthesis and characterization of new crystalline solid forms, in particular cocrystals with improved physicochemical properties of these three nutraceutical compounds. Cocrystals can show certain advantages over parent compounds in terms of bioavailability and stability and have proven to be alternatives with potential industrial applicability. Different experimental techniques such as grinding, slurry, reaction crystallization and solution crystallization were used for this study. From more than 1,500 screening experiments, 25 new crystalline forms have been discovered, including polymorphs and cocrystals of the three nutraceutical compounds. The crystal structures of 11 out of the new forms have been determined and analyzed in detail. In particular, two of them have been solved by means of direct space methods from powder X-ray diffraction data. In addition, several computational techniques have been used, such as the analysis of intermolecular interactions, the calculation of lattice energies, molecular electrostatic potential surfaces (MEPS), and Hirshfeld surfaces in order to get deeper insight and knowledge at crystallographic and supramolecular level of the 3 active nutraceutical principles., [spa] La salud ha sido siempre una de las principales preocupaciones de la sociedad, y más aún con la situación de pandemia actual producida por el virus (SARS-CoV-2) se es consciente de que llevar un estilo de vida con buenos hábitos alimentarios influye directamente en la salud, existiendo numerosas investigaciones que así lo demuestran. Por lo tanto la adquisición de los nutrientes adecuados juega un papel vital en el mantenimiento de la función normal del cuerpo y la prevención de enfermedades, sobre todo aquellas que están relacionadas con el envejecimiento (enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas, diabetes tipo II, así como varios tipos de cáncer). Es por ello que la demanda de alimentos funcionales que promueven la salud ha recibido una amplia atención, tanto entre profesionales de la salud como entre el público en general, emergiendo así nuevos conceptos como los nutracéuticos. El término nutracéutico combina dos palabras "nutriente" y "farmacéutico" y fue introducido por Stephen DeFelice, médico endocrinólogo, en el año 1989. DeFelice define el compuesto nutracéutico como "aquel alimento o parte de un alimento que proporciona un beneficio en la salud, incluyendo la prevención o el tratamiento de una enfermedad ". Desafortunadamente, la mayoría de estos compuestos suelen presentar propiedades fisicoquímicas limitantes, tales como una baja biodisponibilidad oral, baja solubilidad y en algunos casos baja estabilidad química. El pterostilbeno, el ubiquinol y la vitamina D3 son tres compuestos nutracéuticos conocidos por sus importantes funciones bioquímicas y nutricionales. Lamentablemente no siempre se pueden aprovechar completamente sus potenciales beneficios ya que presentan una baja biodisponibilidad oral en el caso del pterostilbeno e inestabilidad química en el caso del ubiquinol y la vitamina D3. En la presente tesis doctoral se describe el descubrimiento, la síntesis y la caracterización de nuevas formas sólidas cristalinas, en particular cocristales, con mejoras en las propiedades fisicoquímicas de estos tres compuestos nutracéuticos. Los cocristales presentan ventajas respecto a los compuestos de partida en cuanto a biodisponibilidad y estabilidad y han demostrado ser alternativas con potencial aplicabilidad industrial. Para este estudio se utilizaron diferentes técnicas experimentales tales como la molienda, la suspensión, la cristalización y la evaporación lenta. De los más de 1.500 experimentos de cribado, se han obtenido 25 nuevas formas cristalinas, entre ellas polimorfos y cocristales de los tres compuestos nutracéuticos. Las estructuras cristalinas de 11 de las nuevas formas han sido resueltas y analizadas en detalle. En particular, dos de ellas se han resuelto mediante métodos de espacio directo a partir de datos de difracción de rayos X de polvo. Además, se han utilizado diversas técnicas computacionales tales como el análisis de las interacciones intermoleculares, el cálculo de la energía reticular, la construcción de superficies de potencial electrostático molecular (MEP) y superficies de Hirshfeld con el fin de profundizar en el conocimiento a nivel cristalográfico y supramolecular de los 3 principios activos nutracéuticos.

[eng] Photopharmacology is an emerging field that relies on the development of photosensitive compounds to enable precise spatiotemporal control over endogenous proteins. Photochromic ligands· are designed to respond to specific wavelengths of light with a reversible change of structure that enhances or diminishes their activity or affinity towards the desired target. Applications are expected to lead to safer treatments in medicine and to innovative tools to investigate complex signalling networks in biology. Thus, in this thesis we aimed at further expanding the spectrum of protein-protein interactions (PPis) and G protein-coupled receptors (GPCRs), that can be addressed by means of photopharmacology. To do so, we focused on resolving different shortcomings that we identified as critical for the actual performance and widespread application of photochromic compounds. For example, Traffic Light 2 (TL2) is a photoswitchable cell-permeable peptide that can inhibit clathrin-mediated endocytosis (CME) in a light regulated manner. Despite proving effective in mammalian cells, the influence of CME over several other cellular processes limited further applications in this biological system. Thus, we validated its activity in a simpler eukaryotic system, Saccharomyces cerevisiae. Using kymography and spheroplast expressing GFP-tagged Sla-1, a coat-associated endocytic protein, we characterized the effect ofTL2 and light over CME dynamics. Studying homologies between mammalian and yeast endocytic proteins we also proposed a mechanism of action for this peptide. The same strategy used to develop Tls was then applied to design new photoswitchable peptides targeting PPis involved in developmental processes. In particular, we focused on Wnt/β-catenin signalling and synthesised a library of light-regulated peptides to reversibly inhibit or activate this pathway with light. The photophysical behaviour of the peptides was characterized and the initial design was validated in vitro by means of circular dichroism and fluorescent-polarization binding assay. The activity was then verified in mammalian cells using a dual-luciferase reporter gene assay. Finally, using Schmidtea mediterranea planarians we set up a model of tissue regeneration to probe in vivo photoregulation of Wnt/β-catenin signalling. The design of photoswitchable peptides was then broadened from PPIs to signalling peptides that bind to and activate receptors. Orexins are neuroexcitatory peptides that modulate through GPCRs neural circuits involved in regulating sleep and arousal. Analysing reported crystal structures of the orexin receptors and NMR solution structures of the peptide we identified a strategy to develop a photochromic analogue of orexins. The derivative was synthesised by standard solid-phase peptide synthesis inserting a non-natural photoswitchable amino acid into the backbone of the peptide. The photochromic behaviour of the analogue was fully characterised, and its activity was assessed by means of different techniques that allow to monitor transient increases in intracellular calcium. Using circular dichroism and molecular modelling simulations we provide a structural model to explain the difference in activity observed between the trans and cis isomers. Finally, in sight of their possible therapeutic relevance, we rationally designed a small library of photochromic ligands to target the adrenergic system. In particular, we used a non-conventional approach, based on azoheteroarenes, to render photoswitchable a class of a-adrenergic ligands. We named these compounds adrenoswitches and characterised their activity in in vitro and in vivo. Affinity towards α-adrenoceptors was assessed through a radioligand binding assay in pre-frontal cortex membranes obtained post-mortem from human brains. In addition, the potency of the compounds was screened in a model of vascular reactivity using ex vivo rat aortic rings. Finally, the most promising compound of the series was used in proof-of-concept applications to manipulate with light locomotor activity in zebrafish and pupillary responses in mice., [spa] La fotofarmacología es una técnica muy prometedora que permite controlar con luz y de manera reversible Ia actividad de compuestos activos biológicamente. En esta tesis doctoral hemos desarrollado péptidos y ligandos fotoconmutables para regular las interacciones entre proteínas y Ia actividad de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs). En primer Iugar, validamos Ia actividad de TL2, un péptido fotoconmutable que inhibe Ia endocitosis mediada por clatrina, en un modelo simple de célula eucariota, Ia levadura Saccharomyces cerevisiae. Mediante Ia tecnica de "kimografía" en esferoplastos que expresan el marcador fluorescente GFP-Sia1, caracterizamos el efecto de TL2 en este proceso celular y su posible mecanismo de acción. Luego aplicamos Ia estrategia de diseño de TL2 para crear una librería de péptidos que inhiben o activan con luz Ia vía de señalización mediada por Wnt/β-catenina. Tras su caracterización química y fotocrómica, analizamos el efecto de los ciclos de luz sobre las estructuras secundarias de los péptidos y su union a Ia β-catenina. Para evaluar su actividad, empleamos un ensayo de luminiscencia que permite cuantificar Ia expresión génica y ponemos a punto un modelo in vivo de regeneración de tejidos en planarias Schmidtea mediterranea. A continuación, ampliamos las aplicaciones de los péptidos fotoconmutables desde Ia inhibición de las interacciones proteína-proteína descrita anteriormente, a Ia activación de receptores de neuropéptidos como las orexinas. En particular, creamos un análogo fotoconmutable de Ia orexina insertando un aminoácido con un grupo azobenceno en Ia secuencia lineal del péptido. Validamos este nuevo diseño mediante estudios estructurales de dicroísmo circular y modelado molecular, y su actividad mediante Ia medida de señales intracelulares como el calcio. Por ultimo,diseñamos y sintetizamos varios derivados fotoconmutables de ligandos α-adrenergicos insertando azoheteroarenos en sus estructuras. Mediante ensayos de unión evaluamos Ia afinidad de los compuestos hacia los adrenoreceptores de tipo α,y comprobamos su activad en un modelo de reactividad vascular en aorta de rata. Uno de los compuestos permitió manipular Ia motilidad de peces cebra y el tamaño pupilar en ratones, demostrando por primera vez el control de los adrenoreceptores con luz in vivo.

[eng] This research work was aimed at the characterization in vitro, ex vivo and in vivo of nanostructured systems which independently contain a natural flavanone extracted from Eysenhardtia platycarpa and another four flavanones obtained through semi-synthesis of the first flavanone with the objective of providing evidence of their efficaciousness as anti-inflammatory cutaneous agents. Initially the flavanone was isolated from its natural source, and following on from this, the derivatives were obtained through chemical reactions of acetylation, methylation, cyclization and vinyl cyclization. Calculations were made in silico using computational programs like Molinspiration and PASS Online. These gave the theoretical physio-chemical properties of the flavanones and estimated the profile of their probable anti-inflammatory activity. An analytical methodology was used for the quantification of the flavanones with High Performance Liquid Chromatography (HPLC) in samples that crossed human skin in an ex vivo study. The objective was to demonstrate that an analytical method had been selected that did not cause any interference from the biological components due to the tissue with which we worked. The results showed that the method was lineal, exact and precise in the assayed concentrations interval (1.56 - 200 µg/mL). Afterwards, nano-structured formulations were prepared individually: they contained each flavanone at 0.5 % and the excipients were: Labrasol®, Labrafac® lipophile, Propylene glycol and Plurol Oleic®. These formulations were morphologically and physio-chemically characterized. The results obtained revealed that the flavanones formulations (FF) were suitable for topical administration. An in vitro assay was carried out of the liberation of the flavanones from their individual formulation, using a dialysis membrane with a system of Franz type cells to guarantee that the formulation liberated the flavanones and allowed there to be a sufficient quantity of each component susceptible to being permeated in human skin. Immediately afterwards, ex vivo studies were realized using human skin with the objective of evaluating the permeation profile of the flavanones contained in dissolution individually and in the formulations. The study demonstrated that the quantity of flavanone permeated and retained in the skin was different, depending on the flavanone assayed. This was probably due to the different molecular interactions of the functional groups with the tissue components. The flavanones derived were retained in the skin in greater quantity than natural flavanone. Finally, an in vivo assay was carried out on the anti-inflammatory efficaciousness in a model of rat’s auricular edema induced by arachidonic acid. The results demonstrated that the flavanones were capable of reducing the edema (swelling) and the formulation excipients did not influence in the biological activity. The formulations turned out to be more effective than the reference pharmaceutical drug used in this study (sodium diclofenac gel). It was shown that the structural modification of the natural flavanone improved the therapeutic activity in which the derived methylated and cyclized vinyl stood out. These results are in concordance with the results obtained in the evaluation of the cytokines expression (IL-1β, IL-6 y TNF-α) carried out, and moreover allowed the advantage of the use of nano-structured systems in making the flavanones more effective to be shown in comparison with flavanones assayed in dissolution., [spa] El presente trabajo de investigación versa sobre la caracterización in vitro, ex vivo e in vivo de sistemas nanoestructurados que contienen de forma independiente una flavanona natural extraída de Eysenhardtia platycarpa y cuatro flavanonas obtenidas mediante semi-síntesis de la primera, con el objetivo de evidenciar su eficacia como agentes antiinflamatorios cutáneos. Inicialmente se aisló la flavanona de su fuente natural seguida de la obtención de los derivados mediante las reacciones químicas acetilación, metilación, ciclación y vinilo ciclación. Se realizaron cálculos in silico utilizando programas computacionales como Molinspiration y PASS Online para obtener las propiedades fisicoquímicas teóricas de las flavanonas y estimar su probable perfil de actividad antiinflamatoria. Se validó una metodología analítica para la cuantificación de las flavanonas por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) en muestras que atravesaron piel humana en un estudio ex vivo. Lo anterior con el objeto de demostrar una selectividad del método analítico planteado sin que hubiese ninguna interferencia provocada por los componentes biológicos propios del tejido con el que se trabajaría. Los resultados mostraron que el método es lineal, exacto y preciso en el intervalo de concentraciones ensayadas (1.56 - 200 µg/mL). Posteriormente, se prepararon individualmente las formulaciones nanoestructuradas que contenían al 0.5 % cada flavanona y como excipientes: Labrasol®, Labrafac®, Propilenglicol y Plurol Oleico®. Dichas formulaciones fueron caracterizadas morfológica y fisicoquímicamente. Los resultados obtenidos revelaron que las formulaciones de las flavanonas (FF) eran adecuadas para su administración tópica. Se llevó a cabo un ensayo in vitro de liberación de las flavanonas desde su formulación individual, utilizando una membrana de diálisis en sistemas de celdas tipo Franz para garantizar que la formulación libera las flavanonas y permite disponer de cantidad suficiente de cada compuesto susceptible de ser permeado en piel humana. Seguidamente, se realizaron estudios ex vivo utilizando piel humana con el propósito de evaluar el perfil de permeación de las flavanonas contenidas en disolución de forma individual y en las formulaciones. El estudio demostró que la cantidad de flavanona permeada y retenida en la piel fue diferente dependiendo de la flavanona ensayada; probablemente debida a las diferentes interacciones molecular de sus grupos funcionales con los componentes del tejido. Las flavanonas derivadas se retuvieron en mayor cantidad en piel que la flavanona natural. Finalmente, se desarrolló un ensayo in vivo de eficacia antiinflamatoria en un modelo de edema auricular de rata inducido por ácido araquidónico. Los resultados demostraron que las flavanonas fueron capaces de reducir el edema y los excipientes de las formulaciones no influyeron en la actividad biológica. Las formulaciones resultaron ser más efectivas que el fármaco de referencia usado en este estudio (gel de diclofenaco sódico). Se comprobó que la modificación estructural de la flavanona natural mejoró la actividad terapéutica destacando los derivados metilados y vinilo ciclizados. Estos resultados se encuentran en concordancia con los obtenidos de la evaluación de expresión de las citosinas (IL-1β, IL-6 y TNF-α) realizado y además, permitió evidenciar la ventaja del uso de sistemas nanoestructurados para disponer las flavanonas, en comparación con las flavanonas ensayadas en disolución.

[spa] En la industria farmacéutica es común buscar procesos alternativos de producción de fármacos comerciales o a punto de entrar en el mercado. En este trabajo, y en colaboración con Esteve Química S.A., se han buscado rutas sintéticas novedosas para dos fármacos de interés, aprobados en 2017 y 2018 respectivamente. La ruta planteada hacia el primero requería la construcción de un indazol y su acoplamiento con un bromuro de arilo. Se lograron estas transformaciones con rendimientos aceptables, disponiendo así de un anillo aromático unido al indazol y con un grupo funcional (en para) potencialmente transformable en aldehído bencílico. Dicha transformación se consiguió con peryodinano de Dess-Martin. La construcción estereoselectiva del anillo de piperidina presente en la molécula a partir del aldehído no fue posible y se abandonó el proyecto. El segundo es un dipéptido doblemente arilado (con restos piridínicos), y con un enlace amida en el extremo C-terminal. Esto nos permitió dividir la molécula en 5 fragmentos comercialmente disponibles y con la estereoquímica deseada. Aunque se buscaba una ruta convergente, no fue posible porque el ácido piroglutámico arilado epimerizaba en los intentos de unión con el otro aminoácido. Por su parte, la arilación de la clorofenilglicina presentó problemas debido a la poca estabilidad del material de partida y la pérdida total de la estereoquímica en la mayoría de las pruebas. Se ensayaron muchas condiciones hasta dar con unas en las que se obtenía producto por un mecanismo similar a una SNAr asistida por Pd. No obstante, este producto resultó totalmente inerte ante los intentos de condensación con el ácido piroglutámico. En conjunto, los resultados negativos obligaban a replantear el orden de la secuencia, pero no se realizaron más pruebas. Por otro lado, es común la aparición de impurezas durante la producción de fármacos. La detección de una impureza de difícil separación durante uno de los procesos de producción de un fármaco en Esteve Química condujo a la necesidad de sintetizar dicho subproducto. La impureza era supuestamente una tetrahidroisoquinolina bencilada, y se planteó su síntesis a partir de un intermedio avanzado. Tras varios intentos de alquilación y acilación fue evidente la necesidad de proteger previamente el nitrógeno para evitar reacciones secundarias. La bromación de la posición aromática deseada, seguida de una bencilación de tipo Negishi (optimizada posteriormente) permitieron la introducción del grupo bencilo. La desprotección del grupo amino presentó complicaciones, pero se pudo entregar cantidad suficiente del producto. Además, se consolidó la metodología de bencilación descubierta al extenderla a diferentes sustratos. Finalmente, se quiso profundizar en la síntesis de tetrahidroisoquinolinas presentes en productos como el Moexipril ya que se disponía de cierta experiencia en reacciones catalíticas de activación C−H por aminas primarias o iminas que podían conducir a estas estructuras. Se ha realizado un estudio extenso sobre coordinación y metalación de sustratos del tipo piridin-2-ilmetaniminas que actúan como ligandos bidentados, tanto con paladio como con platino. Los resultados demuestran la necesidad de la presencia de dos grupos alquilo en α al nitrógeno para obtener resultados positivos. Con paladio sólo se consiguió metalar una de las iminas ensayadas sin dos metilos en α. Con platino, en cambio, fueron tres. Se comprobó que cambios en el anillo de piridina podían favorecer mucho el proceso de metalación: utilizar picolina o quinolina incrementaba la reactividad de las iminas frente al metal. Los mejores resultados con platino lo sitúan como posible sustituto al paladio en reacciones catalíticas que no funcionaron anteriormente., [eng] This work began with the search for new synthetic approaches to two drugs of interest in collaboration with Esteve Química S.A. The indazol moiety of the first drug was constructed in five steps, and its N2-arylation was performed with several compounds. However, it was not possible to form the chiral piperidine ring, and the project was abandoned. The retrosynthetic analysis of the second drug allowed the division of the molecule into five commercially available building blocks. The two amino acids bore the desired stereochemistry. The N-arylation of the pyroglutamic acid scaffold was achieved without many complications, whereas the N-arylation of the other amino acid required an extensive screening of conditions. Since we could not form the dipeptide and reach the final product, the whole synthetic path needed revision. We decided to move on to the next project, which concerned the synthesis of an impurity found during the industrial synthesis of a different molecule. After protecting the amino group of the tetrahydroisoquinoline moiety, bromination of the desired aromatic position was performed. The benzylation was achieved through a microwave-assisted Negishi reaction, accomplishing the main objective of the chapter. Later, we carried out an optimisation of this process and checked the scope of the conditions by testing several aryl bromides. Previous works in our group led to the construction of tetrahydroisoquinoline rings through C−H activation. However, some structural limitations were found such as the necessity of two alkyl substituents next to the amino directing group. We have performed a study of the coordination and metallation process of imines with palladium and platinum. Using imines containing nitrogenated heterocycles that could act as bidentate ligands, the objective was to enhance the metallation reaction to overcome the structural limitations. Thus, the knowledge acquired could be used in the future to develop a new catalytic process towards the formation of tetrahydroisoquinolines. Besides obtaining four metallacycles without two alkyl groups adjacent to the nitrogen, we found out that picoline and quinoline were more reactive than pyridine.

[spa] Cada año, miles de personas fallecen a causa de enfermedades hepáticas en estado terminal, siendo la falta de injertos hepáticos un problema sin resolver en la práctica clínica. Para tratar de resolver esta grave situación clínica y social, se está explorando la utilización de hígados de criterio extendido como son los donantes procedentes de pacientes fallecidos por asistolia o parada cardiaca. Desafortunadamente, la alta incidencia de disfunción hepática y complicaciones biliares causadas por la interrupción del suministro de sangre durante el tiempo de isquemia caliente de este tipo de donantes tras la declaración del fallecimiento por criterios cardiorrespiratorios dificulta la utilización de los injertos hepáticos para el trasplante. Adicionalmente, la mayoría de los injertos presentan cierto grado de esteatosis, debido a la alta prevalencia de obesidad presente en la población a nivel mundial. Desgraciadamente, la esteatosis hepática es uno de los factores de riesgo más graves ya que afectan negativamente los resultados postoperatorios, exacerbando la lesión inducida por isquemia/reperfusión y afectando negativamente la regeneración hepática. Investigaciones recientes en pacientes con cirrosis y otras enfermedades asociadas con inflamación intestinal, han establecido una implicación de estas patologías con alteraciones en moléculas intestinales como el FGF15/19, así como también se han mostrado resultados prometedores debido al tratamiento con GLP-1 en modelos experimentales en isquemia caliente, evidenciando la importancia de moléculas intestinales en el tratamiento de patologías hepáticas. Es así donde surge la presente tesis doctoral; de la necesidad de evaluar el efecto de la muerte por parada cardiocirculatoria en el donante sobre el eje intestinal-hepático y evaluar su posible implicación sobre la lesión y regeneración en modelos experimentales de trasplante hepático con injertos esteatóticos y no esteatóticos. En este contexto, investigaciones dirigidas a establecer los mecanismos fisiopatológicos implicados en trasplante hepático procedente de donantes con parada cardiaca (los cuales cada vez se utilizan más debido a la falta de injertos hepáticos para trasplantar) es de vital importancia para esclarecer las bases moleculares que agravan los resultados postrasplante y en consecuencia buscar dianas de posible acción terapéutica que al modularlas farmacológicamente permitan mejorar los resultados postoperatorios, la calidad de vida de los pacientes que han sido sometidos a trasplante procedentes de donantes con parada cardiaca, y en última instancia, reducir las listas de espera en el trasplante hepático.

[eng] Maintenance of balanced nucleotide pools is necessary for cellular homeostasis. The nucleotide content of the cell is determined by the uptake of nucleosides by specific transporters, the salvage pathway and de novo synthesis of purine and pyrimidine nucleotides. These pathways are highly regulated at different levels and likely to be controlled by mechanisms allowing some sort of coordination among them. In order to decipher possible functional links within this machinery, in this work we have explored the relationship between nucleoside transporters and other elements of nucleotide metabolism. We have studied the interaction and the possible functional link of the human concentrative nucleoside transporter 3 (CNT3) with ADK (adenosine kinase), SAMHD1 (sterile alpha-motif (SAM) and histidine-aspartate (HD) domain-containing protein 1) and QDPR (quinoid dihydropteridin reductase), all of them somehow related to nucleotide metabolism. Biochemical and functional validation of these interactions has evidenced the interconnection between CNT3 and the machinery implicated in nucleotide metabolism. Furthermore, nucleoside analogues are used in the treatment of cancer but they are often administered as pro-drugs. Their metabolic activation takes profit of different metabolic steps known to be implicated in nucleotide metabolism. Thus, changes in these pathways can be extremely relevant in determining drug activation and action in cancer therapy. Recently, combinations of the nucleoside analog Ara-C (cytarabine) and FMS-like tyrosine kinase (FLT3) inhibitors have been developed as first line treatments of acute myeloid leukemia (AML). We have observed that FLT3 positively correlates with enzymes implicated in Ara-C metabolism such as deoxycytidine kinase (dCK), 5’-nucleotidase cN-II and SAMHD1. We have also demonstrated a link among these elements associated with FLT3 inhibition which supports the possibility of coordinated regulation of different elements of the nucleotide metabolic network by this tyrosine kinase receptor. These observations also suggest that, to avoid chemoresistance, it is important to consider the schedule of administration of Ara-C and FLT3 inhibitors in the treatment of AML. Overall, this study provides novel evidence suggesting the existence of protein networks able to promote coordinate regulation of the machinery implicated in nucleotide metabolism.

ANTECEDENTS DEL TEMA En els últims anys els agents antivirals directes aprovats pel tractament de l’hepatitis C han permès l’accés al tractament a grups de pacients que anteriorment no es tractaven pel risc que comportava l’ús d’esquemes amb interferó, incloent als pacients d’edat avançada. Es desconeix si l’alta prevalença de comorbiditats i la polimedicació dels pacients d’edat avançada poden estar associades a més esdeveniments adversos i a una disminució en l’eficàcia del tractament, ja que els pacients majors de 65 anys no es veuen representats en els assaigs clínics. És conegut que els pacients d’edat avançada acostumen a tenir un risc superior de reaccions adverses a medicaments, entre elles les que presenten efectes anticolinèrgics. Per aquest motiu diversos anticolinèrgics s’han llistat com a medicaments potencialment inadequats en pacients geriàtrics i actualment existeixen diverses escales per mesurar la càrrega anticolinèrgica que mostren diferències en els medicaments que inclouen, la puntuació i la potència anticolinèrgica que atribueixen a cada medicament. HIPÒTESI DE TREBALL Reconèixer la influència de les comorbiditats i la tolerància als possibles esdeveniments adversos dels nous tractaments amb antivirals d’acció directa pot ajudar en l’optimització del tractament de l’hepatitis C en aquests pacients. Els pacients geriàtrics que inicien tractament per l’hepatitis C poden estar rebent altres medicaments amb efectes anticolinèrgics que poden influir en la seguretat del tractament. Un enfocament multidisciplinar amb la presència d’un farmacèutic clínic a l’equip pot ajudar a millorar l’atenció als pacients geriàtrics que inicien tractament per l’hepatitis C. OBJECTIUS Avaluar l’impacte de les comorbiditats i les interaccions farmacològiques en l’eficàcia i la tolerabilitat dels antivirals d’acció directa pel tractament de l’hepatitis C crònica en la població geriàtrica. Determinar la prevalença de càrrega anticolinèrgica, relacionada amb medicació crònica, en pacients d’edat avançada tractats amb antivirals d’acció directa, i els factors de risc associats, així com analitzar les conseqüències en la seguretat dels tractaments. METODOLOGIA Estudi retrospectiu observacional en un hospital universitari de tercer nivell. Mitjançant el programa informàtic utilitzat per a la prescripció i preparació de medicaments es van identificar tots els pacients que havien estat tractats amb antivirals de acció directa associats o no a ribavirina, al centre, des d’abril de 2015 a març del 2016. Es van recollir variables clíniques i demogràfiques, incloent la presència de comorbiditats. També els factors virològics i clínics relacionats amb la infecció pel virus de l’hepatitis C. Les comorbiditats es van analitzar segons els valors de Clinical Risk Group, que classifiquen als pacients segons la presència de malalties cròniques. Es van recollir variables farmacològiques, com el nombre de medicaments concomitants, el tipus de medicament, i es va classificar als pacients segons el grau d’exposició a polifarmàcia (entesa com la presa de cinc o més medicaments), així com es va considerar el risc d’interaccions farmacològiques. La presència de càrrega anticolinèrgica es va valorar amb tres escales validades diferents: l’Anticholinergic Cognitive Burden scale (ACB), l’Anticholinergic Risk Scale (ARS) i l’Anticholinergic Drug Scale (ADS). L’eficàcia dels tractaments es va avaluar segons la resposta viral sostinguda la setmana 12 després de finalitzar el tractament, classificant els pacients en tres grups d’edat (65 a 74, 75 a 79 i ≥80 anys). L’anàlisi en seguretat va incloure dades especificades a la història clínica i les notificacions d’esdeveniments adversos registrades a la mateixa. Els resultats en seguretat es van analitzar d’acord amb la presència o no de medicaments anticolinèrgics, cirrosi, alta comorbiditat i interaccions farmacològiques. RESULTATS Es van identificar 261 pacients, amb una edat promig de 71 anys, sent el 61% dones. La prevalença de cirrosi era alta (74%) i el genotip 1b el predominant (n=232; 89%). Un elevat nombre de pacients (n=126; 48%) havia fracassat a un tractament anterior amb interferó i 22 pacients (8%) havien rebut un trasplantament de fetge prèviament. El 90% dels pacients prenien medicació concomitant. La resposta viral sostinguda global va ser del 96.9%, sense diferències entre les cohorts d’edat. Tampoc es van observar diferències en eficàcia tenint en compte la presència de cirrosi o haver rebut un tractament previ. El 86% dels pacients va presentar algun esdeveniment advers, majoritàriament fatiga i símptomes gastrointestinals o dèrmics. Tots els pacients que van presentar algun esdeveniment advers greu (6.5%) tenien una alta comorbiditat associada. Entre els pacients que prenien almenys un medicament crònic (90%), es va observar una elevada presència de polifarmàcia, amb un 47% d’aquests prenent cinc o més fàrmacs concomitants. Els fàrmacs més observats com a medicació crònica van ser els diürètics i els psicolèptics. Un elevat nombre de pacients presentava risc d’interaccions farmacològiques tot i que aquestes no es van relacionar amb pitjors resultats terapèutics. Pel que fa a la prevalença de càrrega anticolinèrgica, els resultats van ser diferents segons l’escala de mesura utilitzada essent similars les escales ACB i ADS (35.2% i 34.3%) i lleugerament superiors respecte a l’escala ARS (10.6%). Per a totes les escales es va fer palesa la relació entre comorbiditat i presència de medicació amb càrrega anticolinèrgica, posant de manifest que els pacients amb més comorbiditat presenten més risc de rebre tractaments amb efectes anticolinèrgics. En la present tesi les tres escales valorades han mostrat resultats diferents i només l’escala Anticholinergic Risk Scale (ARS) ha mostrat relació significativa entre càrrega anticolinèrgica i esdeveniments adversos. CONCLUSIONS Els antivirals d’acció directa són efectius i ben tolerats en pacients majors de 65 anys. Els pacients geriàtrics que inicien tractament per l’hepatitis C són pacients complexes i amb múltiples comorbiditats que reben altres medicaments, alguns dels quals amb efectes anticolinèrgics, que poden influir en la seguretat del tractament. L’eficàcia dels tractaments no s’ha vist influenciada per l’edat, ni per la presència o absència de cirrosi, així com tampoc per haver rebut anteriorment tractament antiviral. El nombre d’esdeveniments adversos greus augmenta amb la comorbiditat i el nombre de medicaments concomitants associats. No es poden extreure conclusions pel que fa a quina mesura de càrrega anticolinèrgica representa el millor valor pronòstic. Per tal d’oferir un tractament antiviral òptim, la coordinació entre els hepatòlegs i els farmacèutics clínics recolzats en un equip multidisciplinari és necessària.

[eng] Modern medical treatments are largely based on the ability of pharmacological drugs to interact with a molecular target in the human body (e.g., receptors) in order to evoke a physiological response. Such targets are expressed throughout the human body in both healthy and diseased tissues: this hampers a truly selective interaction between drug and target in a disease state, giving rise to undesired effects and limiting the effective dose at the desired site. Light-regulated drugs are small molecules that can be tested, validated, and approved using standard drug development procedures, and can be applied directly to wildtype organisms, including humans. This medical approach is known as photopharmacology and offers various benefits for new pharmacological treatments. A reversible photoisomerisable drug can be controlled with light over the body, dramatically improving its selectivity for a target expressed in a specific location and reducing the side effects to the minimal expression. The clinical pharmacology of the muscarinic cholinergic system has important limitations. The complex roles of muscarinic receptors (mAChRs) need further studies to be completely understood. They belong to the class A of G-protein coupled receptors (GPCRs) and are pharmacologically classified into five subtypes (M1-M5). Muscarinic subtype-selective bioactive compounds can potentially be very effective for therapies against Alzheimer's and Parkinson's disease, asthma, pain, intestinal motility disorders, heart disease, and urinary function disorders. Despite several decades of efforts on identifying novel muscarinic agonists and antagonists, their full therapeutic potential is not yet in our hands. The cause is mainly the lack of subtype selectivity of these drugs. Alternative approaches for achieving such subtype specificity are necessary. The success of this challenge can provide a revolution of the pharmacology against a large variety of diseases and disorders, as well as advancing the current knowledge of the metabotropic role of the ACh. This Ph.D. project aims to rational design and develop light-regulated ligands that can enable the optical modulation of muscarinic receptors and the physiological processes in which they are involved. Iperoxo is a charming ligand for mAChRs. Despite its atypical structure compared to acetylcholine, this drug is one of the most potent muscarinic agonists. However, its pharmacological profile is lacking subtype selectivity. Here, we designed, synthesized, and characterized the pharmacological profile of monovalent, bivalent, and dualsteric photoswitchable derivatives of Iperoxo. We tested their activity on the mAChRs subtypes M1 and M2. Among the others, the light-regulated dualsteric drug named Phthalimide-Azobenzene-Iperoxo (PAI) turned out to be a potent photoswitchable activator of M2 receptors. This compound demonstrates to effectively modulate the cardiac function with light in vivo in different wild type animal models, standing as a potential alternative for classical antiarrhythmic drugs that cannot be manipulated spatiotemporally. Moreover, PAI administration in the central nervous system (isolated cortical slices and in anesthetized living mice) can manipulate brain state transitions with light, a function that bears high therapeutic interest in several neurological disorders. In order to overcome the scattering and low penetration of violet and visible illumination, we effectively demonstrated that PAI can activate M2 receptors using two-photon excitation with near-infrared light, offering new therapeutic opportunities for this photopharmacological tool. Because of their therapeutic relevance, we also developed photoswitchable M1 antagonists. We used the tricyclic M1 antagonist pirenzepine as model compound. We designed the new strategy of “crypto-azologization”, replacing the three-ringed core of pirenzepine with different azobenzene scaffolds. We validated this novel design by inhibiting M1 receptors only upon illumination in vitro and in cardiac atria ex vivo. This “crypto-azologization” strategy has the potential to be used for controlling the action of many other mainstream tricyclic drugs with light., [spa] Los receptores muscarínicos (mAChR) son receptores acoplados a proteína G (GPCRs) de clase A y están clasificados en cinco subtipos (M1-M5) que modulan numerosas respuestas fisiológicas centrales y periféricas. Los medicamentos muscarínicos podrían ser muy efectivos en muchas terapias, como para los trastornos cognitivos y las enfermedades cardíacas, pero su baja selectividad de subtipo y sus efectos secundarios obstaculizan el potencial terapéutico de estos fármacos. La fotofarmacología crea medicamentos que se pueden activar con luz de manera reversible, mejorando su selectividad en un sitio específico del cuerpo y ofreciendo la posibilidad de reducir sus efectos secundarios. Con el fin de introducir alternativas para mejorar la especificidad de los fármacos muscarínicos, hemos desarrollados ligandos fotoconmutables para modular con luz los receptores muscarínicos y los procesos fisiológicos controlados por ellos. Hemos diseñado y creado diferentes derivados fotosensibles de Iperoxo, un agonista muscarínico muy potente. Entre todos, el derivado PAI resultó ser un potente activador de los receptores M2 controlado por luz. Con este compuesto hemos demostrado el fotocontrol de la actividad cardíaca in vivo en diferentes modelos animales, creando una potencial alternativa a los fármacos antiarrítmicos clásicos que no se pueden controlar espaciotemporalmente. La administración de PAI en el sistema nervioso central de ratones vivos anestesiados permite fotomanipular las transiciones entre diferentes actividades oscilatorias neuronales. Esta función que tiene un gran interés terapéutico porque ofrece la posibilidad de controlar varios trastornos neurológicos. PAI se puede activar con la luz infrarroja (840 nm) mediante la excitación de dos fotones, y estas longitudes de onda permiten penetrar profundamente en los tejidos biológicos, minimizando los daños y dando lugar a aplicaciones no invasivas in vivo. Debido a su relevancia terapéutica, también hemos desarrollados derivados fotoconmutables de la pirenzepina, un antagonista tricíclico de los receptores M1. Hemos reemplazado el heterotriciclo del compuesto original con diferentes azobencenos, creando una nueva estrategia para diseñar análogos de fármacos fotoconmutables que hemos denominado "cripto-azologización". Hemos validado este nuevo concepto mediante el fotocontrol de la inhibición de los receptores M1 en las aurículas cardiacas ex vivo. Este método ofrece el potencial de fotocontrolar la acción de muchos fármacos tricíclicos convencionales para realizar estudios funcionales de sus receptores in vivo y para reducir los efectos secundarios de las terapias farmacológicas actuales.

[eng] Rosmarinic acid (RA), an ester of caffeic acid and 3,4-dihydroxyphenyl lactic acid, is widely distributed in the plant kingdom, including Satureja khuzistanica, a threatened Iranian plant species. Interest in RA is growing due to its biological activities, including cognitive-enhancing effects, slowing the development of Alzheimer’s disease, cancer chemoprotection and anti-inflammatory activity. In order to meet the increasing demand for this compound and preserve its natural sources, a new biotechnological platform based on cell suspension cultures of S. khuzistanica was developed. The results show that cell suspensions of this plant species synthesized high amounts of RA, which accumulated mainly inside the cells. In order to improve the system’s biotechnological production, the effect of three elicitors, methyl jasmonate (MeJA), cyclodextrin (CD) and coronatine (COR) were tested. The obtained results demonstrate the effectiveness of MeJA and COR in improving the RA production of the S. khuzistanica cell cultures and also that the time course of growth and RA production can change with the age of the cell line and the number of subcultures. In contrast, the effects of CD were found to be insignificant. In this pipeline, the scale up of the biotechnological system to a benchtop bioreactor demonstrated the adaptability of the S. khuzistanica cell cultures to the scaling-up process and that the elicitors MeJA and COR also effectively improved the production at bioreactor level. Concerning the biological activity of S. khuzistanica, we demonstrated that an enriched RA extract was able to reduce the viability of cancer cell lines, increasing the sub-G0/G1 cell population and the activity of caspase-8 in MCF-7 cells, which suggests that S. khuzistanica extracts can induce apoptosis of MCF-7 cells through activation of the extrinsic pathway. In addition, our findings indicate that other compounds of the extract may act synergistically to potentiate the anticancer activity of RA. Similarly to S. khuzistanica, Ruscus aculeatus is a threatened medicinal plant. Its main bioactive components, the steroid saponins ruscogenin and neoruscogenin, have long been used in the treatment of hemorrhoids and varicose veins, but recently demonstrated activity against some types of cancer have stimulated interest in R. aculeatus extracts. Thus, plant cell biofactories could constitute an alternative to the whole plant as a source of these bioactive compounds. In our work, despite the in vitro recalcitrance of R. aculeatus, after many attempts in which we tested more than 70 different culture media, we developed friable R. aculeatus calli and their derived plant cell suspensions. Their ruscognenin production was compared with that of organized in vitro plantlet and root-rhizome cultures. Root-rhizomes showed a higher capacity for biomass and ruscogenin production than the cell suspensions and the yields were greatly improved by elicitation with COR, as in other plant in vitro cultures. The final total ruscogenin content was higher than 1800 mg g DW-1, after 4 weeks of culture. Although ruscogenins accumulate in plants mainly in the root-rhizome, it was demonstrated that the aerial part could play an important role in their biosynthesis, because production was higher in the whole plant than in the root-rhizome cultures. The most productive biotechnological system, COR-elicited root rhizome cultures, was scaled up to a benchtop bioreactor without losing its capacity for biomass and ruscogenin production., [spa] El ácido rosmarínico (RA) se distribuye ampliamente en el reino vegetal, incluida Satureja khuzistanica, una especie vegetal iraní amenazada. El interés por el RA está incrementando debido a sus actividades biológicas, incluidos los efectos de mejora cognitiva y la desaceleración del desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, quimioprotección del cáncer y su actividad antiinflamatoria. Con el fin de satisfacer su creciente demanda se ha desarrollado una nueva plataforma biotecnológica basada en cultivos de células en suspensión de S. khuzistanica. Los resultados obtenidos muestran que las suspensiones celulares de esta especie vegetal sintetizan altas cantidades de RA. Posteriormente, se probó el efecto de tres elicitores, jasmonato de metilo (MeJA), ciclodextrina (CD) y coronatina (COR) y se demostró la efectividad de MeJA y COR para incrementar la producción de RA. El escalado del sistema a nivel de biorreactor demostró la adaptabilidad de los cultivos celulares de S. khuzistanica a esta escala. Por otro lado, y en relación con la actividad biológica de S. khuzistanica, demostramos que los extractos del cultivo celular reducían la viabilidad, al aumentar la población de células sub-G0/G1 y la actividad de la caspasa-8 en la línea celular cancerígena MCF-7. Ruscus aculeatus también es una planta medicinal amenazada cuyos componentes bioactivos, ruscogenina y neoruscogenina, se utilizan en el tratamiento de hemorroides y varices. En nuestro trabajo, probamos más de 70 medios de cultivo diferentes y obtuvimos callos friables y suspensiones celulares vegetales derivadas de ellos. La producción de ruscogneninas de estos sistemas se comparó con la de cultivos de plántulas y de raíces-rizomas también cultivados in vitro. El sistema raíz-rizoma fue el que consiguió una mayor producción de biomasa y ruscogeninas y los rendimientos mejoraron mediante la elicitación de los cultivos con COR. Aunque las ruscogeninas se acumulan en las plantas principalmente a nivel de rizomas, también se demostró que la parte aérea podría desempeñar un papel importante en su biosíntesis. El sistema biotecnológico más productivo, los cultivos de raíz-rizoma elicitados con COR fue escalado a nivel de biorreactor sin pérdida de su capacidad para producir biomasa y ruscogeninas.

[spa] La hepatectomía parcial bajo isquemia-reperfusión (PH + I/R) es una estrategia que se utiliza comúnmente en la práctica clínica para reducir la hemorragia durante la resección del parénquima hepático. Más del 20% de los pacientes que se someten a una resección hepática presentan algún grado de esteatosis, un factor de riesgo importante en la cirugía de las resecciones hepáticas, ya que se asocia a un mayor índice de complicaciones y mortalidad postoperatoria. A pesar de los avances en los tratamientos farmacológicos, los resultados no han sido concluyentes y pocos son los estudios que se han realizado con modelos que mimeticen a máximo las condiciones clínicas de las resecciones hepáticas, por lo que la lesión por isquemia – reperfusión sigue siendo un problema sin resolver. Teniendo en cuenta tal problemática clínica, la presente tesis plantea posibles terapias farmacológicas con el cortisol y el factor de crecimiento endotelial vascular tipo A (VEGFA) que protejan los hígados frente a la lesión inducida por la isquemia-reperfusión y fallo en la regeneración hepática, utilizando animales de experimentación en presencia o ausencia de esteatosis hepática (ratas de la cepa Zucker y ratas de la cepa Sprague-Dawley alimentadas con una dieta deficiente en colina) sometidas a 70% de hepatectomía parcial bajo isquemia- reperfusión. Los resultados de la presente tesis indicaron la activación solo en hígados no esteatósicos de los mecanismos enzimáticos del metabolismo del cortisol encargados de mantener niveles bajos de cortisol para evitar en consecuencia sus efectos nocivos sobre la lesión y regeneración. En presencia de esteatosis, el cortisol exacerba el daño y el fallo en la regeneración asociado a la cirugía hepática, debido a una descompensación de los mecanismos hepáticos productores de cortisol y las estrategias para reducir sus niveles hepáticos. Estos efectos se asociaron a niveles hepáticos elevados de acetilcolina. La administración de un antagonista del receptor muscarínico M3 (pero no el receptor alfa 7 nicotínico) protegió a los hígados frente a la lesión, mejoró la regeneración del parénquima y la tasa de supervivencia tras la cirugía. Los resultados de la presente tesis también indicaron que el VEGFA reduce la incidencia de complicaciones postoperatorias en hígados no esteatósicos después de la cirugía a través de la activación de la vía VEGFR2-Wnt2, y de forma independiente de Id1. Inesperadamente, la administración de VEGFA redujo notablemente los niveles de VEGFA en hígados esteatósicos, exacerbando el daño y el fallo regenerativo asociado a la cirugía, ya que el VEGFA circulante fue secuestrado por los altos niveles de circulación de sFlt1 liberado por el tejido adiposo. En consecuencia, se requirió la administración concomitante de VEGFA y un anticuerpo anti-sFlt1 para bloquear el sFlt1 y evitar la unión de sFlt1 a VEGFA, aumentado la biodisponibilidad de VEGFA. Este efecto se asoció con altos niveles de VEGFA en hígados esteatósicos y protección frente al daño y fallo en la regeneración a través de la activación de la vía de señalización PI3K/Akt, independientemente de la vía Id1-Wnt2. La presente tesis proporciona por primera vez el papel del cortisol en hígados esteatósicos y no esteatósicos en condiciones de PH bajo oclusión vascular y establece el potencial terapéutico de la vía cortisol-acetilcolina-receptores muscarínicos M3 en la cirugía con hígados esteatósicos y no esteatósicos. Así mismo, establece los diferentes efectos y vías de señalización de VEGFA en la cirugía del hígado que requieren PH bajo oclusión vascular según el tipo de hígado y sugiere el potencial de estrategias terapéuticas basadas en VEGFA junto a un anticuerpo anti-sFlt1 para hígados sometidos a hepatectomía bajo isquemia- reperfusión en presencia de esteatosis., [eng] Partial hepatectomy under ischemia-reperfusion (PH+I/R) is commonly used in clinical practice to reduce bleeding during hepatic resection. More than 20% of patients that undergo liver resection have some degree of steatosis, an important risk factor in liver surgery, associated with more complications and postoperative mortality. The present thesis proposes possible pharmacological therapies with cortisol and VEGFA to protect livers against I/R injury and regenerative failure, using experimental animals with or without hepatic steatosis subjected to 70% PH under I/R. Our results indicated the activation of mechanisms responsible for maintaining low levels of cortisol only in non-steatotic livers to avoid consequently its harmful effects on injury and regeneration. In the presence of steatosis, cortisol exacerbates damage and regenerative failure after surgery, associated with elevated hepatic acetylcholine levels. The administration of an M3 muscarinic receptor antagonist protected livers against injury, improved regeneration and survival rate after surgery. Our results also indicated that VEGFA reduces the incidence of postoperative complications in non-steatotic livers after surgery through the VEGFR2-Wnt2 pathway, independently of Id1. Unexpectedly, administration of VEGFA markedly reduced VEGFA levels in steatotic livers, exacerbating damage and regenerative failure, since circulating VEGFA was sequestered by the high levels of plasmatic sFlt1 released by adipose tissue. Accordingly, administration of VEGFA and an anti-sFlt1 antibody was required to block sFlt1, to prevent this sequestration. This was associated with high VEGFA levels in steatotic livers and protection against damage and regenerative failure through the activation of the PI3K / Akt pathway. This thesis provides, for the first time, the role of cortisol in steatotic and non-steatotic livers under PH+I/R conditions and establishes the therapeutic potential of the cortisol- acetylcholine-M3 muscarinic receptors pathway in liver surgery. Likewise, it establishes the different effects and signalling pathways of VEGFA in liver surgery requiring PH under vascular occlusion according to the type of liver.

[spa] Actualmente, el 80% de los injertos hepático proceden de donantes con muerte cerebral. Sin embargo, la muerte cerebral reduce la tolerancia de los injertos hepáticos a la lesión por isquemia/reperfusión y contrarresta los efectos beneficiosos derivados del precondicionamiento isquémico, la única estrategia quirúrgica que se está aplicando hasta el momento en la práctica clínica aunque con resultados contradictorios. Ante la creciente demanda de órganos y el drástico aumento de la mortalidad de los pacientes en lista de espera, los centros hospitalarios decidieron ampliar los criterios de aceptación de un órgano. Esta es la razón por la que se emplean hígados esteatósicos, aún cuando presentan poca tolerancia a la lesión por isquemia-reperfusión y un mayor riesgo de disfunción o fallo primario del injerto. Se estima que la esteatosis se encuentra presente en más del 30% de los hígados de donantes con muerte cerebral y se considera un factor de riego y de pronóstico en los resultados post-trasplante. Por lo anteriormente expuesto, es evidente la necesidad de desarrollar estrategias protectoras para minimizar los efectos adversos de la muerte cerebral y la lesión por isquemia/reperfusión tanto en hígados esteatósicos como no esteatósicos. En la presente tesis se investigó el papel de la proteína del grupo de alta movilidad Box 1, el efecto del cortisol y sus enzimas implicadas, así como la relevancia de los cambios de los niveles de la hormona del crecimiento y su posible regulación por el factor de crecimiento epidérmico tras la muerte cerebral. La presente tesis proporciona nuevos avances sobre la fisiopatología de la lesión inducida por isquemia/reperfusión en injertos hepáticos esteatósicos y no esteatósicos procedentes de donante con muerte cerebral y contribuye al desarrollo de nuevas estrategias farmacológicas y quirúrgicas novedosas y eficaces para mejorar en última instancia la calidad del injerto hepático y los resultados post-trasplante., [eng] Currently, 80% of grafts are taken from brain-dead (BD) donors. However, BD markedly reduces the tolerance of liver grafts to ischemia/reperfusion (I/R) injury and may counteract the protection conferred by ischemic preconditioning (IP). This is the only surgical strategy that has been applied in clinical liver transplantation (LT), but with controversial results. The shortage of organs has led centers to expand their criteria for the acceptance of steatotic grafts that exhibit poor tolerance to I/R. Some of these include the use of steatotic livers. However, I/R injury is the underlying cause of graft dysfunction in marginal organs. Indeed, the use of steatotic livers for transplantation is associated with an increased risk of primary non-function or dysfunction after surgery. In addition, steatosis is currently estimated to be present in up to 30% of deceased donor livers and is recognized as a key donor variable predicting post-transplant outcome. Thus, further investigations are required for the establishment of protective strategies in steatotic and non-steatotic liver transplantation from BD donors. There are few experimental studies, mainly focused in non-steatotic livers that explain how BD affects liver grafts. In the present study, we examined the role of high-mobility group box 1 (HMGB1), the effects of cortisol and their involved enzymes, as well as the relevance of changes in the levels of growth hormone and epidermal growth factor after brain death. This thesis provides, for the first time, new mechanistic insights into the pathophysiology of BD with may help to reduce its adverse effects in both steatotic and non-steatotic liver grafts and contributes to the development of novel and efficient pharmacological and surgical strategies to ultimately improve liver graft quality.

[eng] Lipophilicity is a key physicochemical descriptor used to understand the biological profile of (bio)organic compounds, xenobiotics and a broad variety of biochemical, pharmacological, and toxicological processes. This property is estimated from the partition coefficient between aqueous and nonaqueous environments for neutral compounds (PN) and corrected for the pH- dependence of ionizable compounds as the distribution coefficient (D). In this context, in this doctoral thesis the Miertus–Scrocco–Tomasi continuum solvation model was used to check the suitability of some reported and proposed formalisms to estimate the distribution coefficient for a set of small acidic and basic compounds. The results indicate that in general the simple pH- dependence model of the ionizable compound in water suffices to predict the partitioning at or around physiological pH. However, at extreme pH values, where ionic species are predominant, more elaborate models provide a better prediction of pH-dependent distribution curves of log D for both acidic and basic compounds as well as for amino acid analogues. New theoretical treatments for the lipophilicity profile of ionizable compounds were proposed to account for the electroneutrality in the phases of the n-octanol/water system. In this context, was used the theory of ion-transfer across the interface between two immiscible electrolyte solutions (ITIES). Experimental research is being carried out to see the scope of those formalisms developed in this thesis. Taking advantage of the successful results in small compounds, a lipophilicity scale adapted to different pH conditions was built for the 20 natural amino. The environment-dependence was introduced from the Dunbrack’s backbone- dependent conformational library using two weighting schemes for the rotamers: solvent-like (SolvL) and protein-like (ProtL) lipophilic schemes. The veracity of our scale was corroborated with successful correlations with other consolidated experimental scales. Characterization of short disordered peptides (retention times in RP-HPLC, log PN and log D7.4 values) was best described using the former approach, and biological properties of peptides with available three-dimensional structure (local context-dependent lipophilicity e.g binding free energies) with the second one. Our theoretical lipophilicity scale was thus characterized by its versatility and adaptability, which confers a unifying character. Future studies will address the application of this methodology to the calculation of lipophilic parameters for no proteogenic amino acids, other conformations of the actual residues (proline cis) and other fragments relevant to proteins. On the other hand, the applicability of the present versatile scale is vast and promising, including for instance the use as scorings for protein- protein docking protocols, among others., [spa] La lipofilicidad es un descriptor fisicoquímico clave utilizado para comprender el perfil biológico de los compuestos (bio)orgánicos, xenobióticos y una amplia variedad de procesos bioquímicos, farmacológicos y toxicológicos. Esta propiedad se estima a partir del coeficiente de reparto entre ambientes acuosos y no acuosos para compuestos neutros (PN) y corregido para la dependencia del pH de los compuestos ionizables como el coeficiente de distribución (D). En este contexto, en esta tesis doctoral se usó el modelo de solvatación continua de Miertus-Scrocco-Tomasi para verificar la idoneidad de algunos formalismos reportados y propuestos para estimar el coeficiente de distribución para un conjunto de pequeños compuestos ácidos y básicos. Los resultados indican que, en general, el modelo simple de dependencia del pH del compuesto ionizable en agua es suficiente para predecir la partición en o alrededor del pH fisiológico. Sin embargo, a valores extremos de pH, donde predominan las especies iónicas, los modelos más elaborados proporcionan una mejor predicción de las curvas de distribución dependientes del pH del log D, tanto para compuestos ácidos como básicos, así como para análogos de aminoácidos. Se propusieron nuevos tratamientos teóricos para el perfil de lipofilicidad de compuestos ionizables para explicar la electroneutralidad en las fases del sistema n-octanol/agua. En este contexto, se utilizó la teoría de la transferencia de iones a través de la interfase entre dos disoluciones de electrólitos inmiscibles (ITIES por sus siglas en inglés). Se están llevando a cabo investigaciones experimentales para ver el alcance de los formalismos desarrollados en esta tesis. Aprovechando los resultados exitosos en pequeños compuestos, se construyó una escala de lipofilicidad adaptada a diferentes condiciones de pH para los 20 aminoácidos naturales. La dependencia del entorno se introdujo a partir de la biblioteca conformacional dependiente del “backbone” de Dunbrack utilizando dos esquemas de ponderación para los rotámeros: el esquema lipofílico tipo solvente (SolvL) y tipo proteíco (ProtL). La veracidad de nuestra escala se corroboró con correlaciones exitosas con otras escalas experimentales ya consolidadas. La caracterización de péptidos cortos desordenados (valores de tiempos de retención en “RP-HPLC”, log PN y log D7.4) fue mejor descrita utilizando el primer esquema, y las propiedades biológicas de los péptidos con estructura tridimensional disponible (lipofilicidad dependiente del contexto local y energías libres de unión) con la segunda. Nuestra escala teórica de lipofilicidad se caracterizó por su versatilidad y adaptabilidad, lo que le confiere un carácter unificador. Los estudios futuros abordarán la aplicación de esta metodología al cálculo de parámetros lipofilicos para aminoácidos no proteogénicos, otras conformaciones de los residuos actuales (prolina cis) y otros fragmentos relevantes para las proteínas. Por otro lado, la aplicabilidad de la escala versátil actual es amplia y prometedora, incluyendo, por ejemplo, el uso como ponderantes para protocolos de acoplamiento de proteína-proteína, entre otros.

[spa] Los trastornos del oído, en especial la sordera, constituyen un tema de vital importancia que ha evolucionado espectacularmente en los últimos años. Se han podido conocer sus causas y, como consecuencia, evitar y tratar sus secuelas. En esta tesis doctoral se exponen las causas de las lesiones de las células del oído interno, se investigan los diferentes mecanismos que permiten prevenir o evitarla y, en su caso, corregir las lesiones irreversibles que produce esta gran discapacidad. Así mismo se recogen los aspectos históricos, farmacológicos y quirúrgicos que se han producido en los últimos años. En la introducción de la tesis se tratan algunos aspectos farmacológicos tales como la ototoxicidad causada por los fármacos o las terapias de la regeneración de las células ciliadas del oído interno mediante factores regeneradores, también llamados factores de crecimiento (GF). Se incluyen además los aspectos quirúrgicos novedoso y exitoso del tratamiento de la sordera profunda mediante el implante coclear y de los diferentes tipos de implantes de oído medio, tales como los de cadena osicular y los de conducción ósea. La segunda parte está dedicada a los resultados de los estudios del autor donde se revisan los aspectos farmacológicos que suponen la administración de los antivirales en el tratamiento de la sordera súbita, así como el uso del implante coclear, el avance más importante en otología de todos los tiempos, que permite adquirir o recuperar la audición de los pacientes sordos profundos, en especial en un colectivo de pacientes sindrómicos, tales como los afectados por el síndrome de la dilatación del acueducto de vestíbulo y en otras anomalías como las del Síndrome cardio-otológico de Jervell and Lange-Nielsen, completando la tesis con la valoración de la integración social de los pacientes sordos profundos, 15 años después de su implantación coclear demostrando su gran eficacia en el desarrollo social, universitario y de integración profesional de estos pacientes con un gran hándicap., [eng] Ear disorders, especially deafness, constitute a vitally important issue that has evolved dramatically in recent years. It has been become possible to know their causes and, as a consequence, avoid and treat their sequels. In this doctoral thesis the causes of internal ear cells lesions are shown, the different mechanisms that prevent them are investigated, and, if appropriate, possible treatment of irreversible lesions related to this great disability is explained. Likewise, the historical, pharmacological and surgical aspects that have occurred in recent years are included. In introduction of the thesis some pharmacological aspects are covered, such as the ototoxicity caused by drugs or regeneration of the ciliated cells of the inner ear through the therapy with regenerative factors, also called growth factors (GF). It also includes the latest and most successful surgical aspects of the treatment of deep deafness through the cochlear implant and the different types of middle ear implants, such as ossicular chain and bone conduction implants. The second part is dedicated to the results the author to complete the pharmacological aspects of the topic, such as the administration of antivirals in the treatment of sudden deafness, as well as the use of the cochlear implant, which is the most important progress in otology of all time. Such progress allows acquiring or recovering the hearing of deep deaf patients, especially in a group of syndromic patients, like those with the syndrome of dilatation of the vestibule or other anomalies such as Jervell and Lange-Nielsen syndrome, to complete this thesis, we include the results of the social integration of profoundly deaf patients 15 years after their cochlear implantation, demonstrating its great effectiveness and social, educational and professional success of these patients despite such a significant disability.

[cat] Els antihistamínics són un conjunt de fàrmacs antagonistes del receptor d’histamina 1 (HRH1) àmpliament emprats per al tractament de l’al·lèrgia. Els darrers anys s’ha investigat la importància de HRH1 en càncer, i s’han descrit efectes antitumorals d’alguns antihistamínics. Al present treball s’ha ampliat aquesta recerca a les neoplàsies hematològiques, amb especial interès en leucèmia mieloide aguda (LMA), una malaltia amb recaigudes freqüents i mal pronòstic, i on existeix la necessitat de tractaments innovadors. Aquí, es descriu l’expressió en superfície de HRH1 en neoplàsies hematològiques, però descartant-ne un efecte clau en la leucemogènesi. Es descriuen, així mateix, els efectes antileucèmics selectius d’ebastina, terfenadina, loratadina i rupatadina al rang micromolar baix, validats en experiments en línies cel·lulars i amb mostres primàries de pacients en experiments ex vivo i in vivo. Aquest grup de fàrmacs, que hem anomenat antihistamínics antineoplàsics (ANHA), mostren efectes sinèrgics amb quimioteràpia convencional i posseeixen capacitat d’eliminar cèl·lules mare leucèmiques de LMA, considerades responsables de les recaigudes, preservant majoritàriament l’hematopoesi normal. El mecanisme pel qual els ANHA exerceixen els seus efectes antileucèmics és independent de HRH1, i es produeix mitjançant acumulació a lisosomes i mitocondris. Aquest tropisme dual inicia un procés de mort cel·lular caracteritzat per un augment de superòxid mitocondrial, una permeabilització de la membrana lisosomal i una activació de caspases. En línia amb aquestes observacions, els ANHA es caracteritzen per ser fàrmacs hidrofòbics amb estructura catiònica i amfifílica, característiques que s’han relacionat prèviament amb l’acumulació a aquests orgànuls. A partir d’aquestes observacions, es proposa l’ús de fàrmacs lisosomo- i mitocondriòtrops com a estratègia terapèutica per a la LMA i la resta de neoplàsies hematològiques, en la qual s’està treballant mitjançant química mèdica., [eng] Antihistamines constitute a drug family comprising antagonists of histamine receptor 1 (HRH1), extensively used for the relief of allergic symptoms. Over the last years, the importance of HRH1 in cancer has been investigated, and antitumoral effects of some antihistamines have been reported. The present work has expanded this research to hematological neoplasias, with special interest in acute myeloid leukemia (AML), a disease characterized by frequent relapse and bad prognosis for which novel treatments are desperately needed. Herein, we report surface expression of HRH1 in hematological neoplasias, while ruling out a key role in leukemogenesis. Likewise, we report selective antileukemic effects induced by ebastine, terfenadine, loratadine and rupatadine at the low micromolar range, as assessed in cell lines and in patient samples in ex vivo and in vivo experiments. This group of drugs, hereafter referred to as antineoplasic antihistamines (ANHA), display synergic effects when combined with conventional chemotherapy and are active against the AML leukemic stem cell compartment, considered responsible for the relapses, while mostly sparing healthy hematopoesis. ANHA-mediated antileukemic effects are HRH1-independent, and rely instead on lysosomal and mitochondrial accumulation. This dual tropism triggers a cell death process characterized by an increase in mitochondrial superoxide species, a lysosomal membrane permeabilization and caspase activation. In line with these findings, ANHAs possess a cationic amphiphilic structure with overall hydrophobicity, features previously related to accumulation in those organelles. Considering these observations, the use of lysosomo- and mitochondriotropic drugs is proposed as a therapeutic strategy in AML and other hematological neoplasias. Drug optimization to reach clinics is being currently pursued by medicinal chemistry.

[eng] The distinctive reactivity of isocyanides has been recognised as an advantageous characteristic for the formation of heterocyclic compounds. In the present manuscript new synthetic possibilities are explored involving the isocyanide group as the key point for the development of new reactions that allow the access to unpublished compounds. In particular, some of them show very promising pharmacological properties. According to the different final products accessed, the pharmacological studies and the resulting publications, this dissertation has been classified into six sections. Synthesis of DNA-interactive pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines (PBDs). In all the synthesis of C2-endo-unsaturated PDBs published so far, the C2-endo double bond is installed either when the pre-PDB synthon is already synthesized or when the tricyclic core is already built. Both approaches involve several synthetic steps that, unfortunately, in the most part of the examples constitute a considerable drawback. In order to avoid the cumbersome installation of the double bond after the formation of the tricyclic core, we investigate a new synthetic strategy that relies on the unprecedented use of enantiopure 3-acyl-5-alcoxycarbonyl-2-pyrrolines, synthesized by our group, as key starting materials. Interestingly, the methylketone appendage at the 3-position and the ester substituent at the 5 position are the most suitable to give access to the PBD compounds through known organic transformations. In this section, objectives, discussion and experimental details to access enantiomerically pure PBDs will be commented. First diastereoselective [3+2]cycloaddition reaction of diethyl isocyanomethylphosphonate and maleimides published in Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 1640-1649. Bicyclic α-iminophosphonates were prepared via the first diastereoselective silver catalyzed [3 + 2] cycloaddition reaction of diethyl isocyanomethylphosphonate and diversely N-substituted maleimides. The reduction of the resulting imine by catalytic hydrogenation led to cyclic α-aminophosphonates, which are α-aminoester surrogates. The relative stereochemistry of the adducts was confirmed by X-ray crystallographic analysis of one of the compounds. The diastereoselectivity of the cycloaddition reaction was rationalised by theoretical studies. Easy Access to (2-imidazolin-4-yl)phosphonates by a microwave assisted multicomponent reaction, published in Tetrahedron, 2015, 71, 2872-2881. An efficient and user-friendly synthetic process involving the combination of multicomponent reaction methodology and microwave heating generates unprecedented (2-imidazolin-4-yl)phosphonates. This strategy presents a silver-catalysed, operationally simple and environmentally friendly transformation without the need of anhydrous atmosphere or additional solvents. Neuroprotective effects of a structurally new family of high affinity imidazoline I2 receptor ligands published in ACS Chem. Neurosci. 2017, 8, 737-742. The imidazoline I2 receptors (I2-IRs) are widely distributed in the brain, and I2-IR ligands may have therapeutic potential as neuroprotective agents. Since structural data for I2-IR remains unknown, the discovery of selective I2-IR ligands devoid of α2-adrenoceptor (α2-AR) affinity is likely to provide valuable tools in defining the pharmacological characterization of these receptors. We report the pharmacological characterization of a new family of (2-imidazolin-4-yl)phosphonates. Radioligand binding studies showed that they displayed a higher affinity for I2-IRs than idazoxan, and high I2/α2 selectivity. In vivo studies in mice showed that acute treatments with two of the compounds significantly increased p-FADD/FADD ratio (an index of cell survival) in the hippocampus when compared with vehicle-treated controls. Additionally, acute and repeated treatments with one compound markedly reduced hippocampal p35 cleavage into neurotoxic p25. The present results indicate a neuroprotective potential of (2-imidazolin-4-yl)phosphonates acting at I2-IRs. Novel compounds as high affinity ligands under revision for protection as a patent and potent transference of technology., [cat] La peculiar reactivitat dels isocianoacetats ha estat reconeguda com una avantatjosa característica en la formació de compostos heterocíclics. En aquest manuscrit es presenten noves possibilitat sintètiques utilitzant isocianoacetats com a punt clau per desenvolupar noves reaccions per accedir a nous compostos amb interès farmacològic. L’accés a aquests nous compostos s’ha realitzat a través de dues reaccions principals; les reaccions de cicloaddició i les reaccions multicomponent. En les reaccions de cicloaddició s’ha descrit la preparació de les pirrolbenzodiazepines (PBD), gràcies a la utilització d’un precursor obtingut a través d’una cicloaddició formal [3+2], sota catàlisis cooperativa d’alcaloides de cincona i sals de plata i amb posterior enriquiment de l’excés enantiomèric per self-disproportonation of enantiomers via sublimació. També s’ha descrit la cicloadició [3+2] entre el isocianometilfosfonat de dietil (PhosMic) i maleimides per donar lloc a α-aminofosfonats bicíclics de manera diastereoselectiva, amb la confirmació de la seva estructura relativa per anàlisi de raig X. Pel que fa a les reaccions multimponent s’ha estudiat la reacció entre PhosMic, amines i cetones per donar lloc a les (2-imidazolin-4-il)fosfonats en condicions respectuoses amb el medi ambient, ja que la reacció presenta una elevada economia del àtom, és eficient i transcorre en unes condicions suaus gracies al us del microones. Finalment, la caracterització farmacològica d’aquest compostos en front dels receptor d’imidazolina del tipus 2 (I2-IRs), receptors àmpliament distribuïts en el cervell i relacionats amb activitat neuroprotectora, ha proporcionat nomes eines per poder estudiar-los.

[eng] Pain is one of the main medical problems that in several cases results into a chronic disease with limited effective treatment, thus the discovery of new drugs to fight against constitutes a big challenge nowadays. Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are widely distributed along the pain neuraxis and modulate pain transmission at different anatomical levels. Hence, subtype-selective mGlu receptors ligands are considered a promising candidate drugs for the treatment of acute, chronic and neuropathic pain. Accordingly, selective negative allosteric modulators (NAMs) of mGlu1 and mGlu5 receptors, and agonists or positive allosteric modulators (PAMs) of mGlu2 or mGlu4 receptors have consistently been shown to display analgesic activity in experimental animal models of chronic pain. However the systemic use may be limited by mechanism-related adverse effects. An effective strategy to overcome this limitation would consist of developing inactive photosensitive mGlu5, mGlu1 and mGlu4 receptors-based drugs, which may thereafter be activated by light administration with spatiotemporal control exclusively in the located area where pain takes place, or even in brain regions critically involved in pain control. Two main optopharmacology approaches were used in this thesis for the photo delivering such as photoswitchable compounds (photoisomerisation) or caged compounds (photolysis). On the one hand, photoswitchable compounds are molecules (normally azobenzenes) that coexist in two possible conformations (trans or cis) being the trans conformation the isomer thermodynamically stable. Moreover, these azo groups are bioisosteres of several groups such as amides, acetylenes or triazole. Interestingly, the addition of an azo group promotes the control of protein function, which had been demonstrated in a previous work with photoswitchable compounds as Alloswitch-1 or Optogluram. Unfortunately, their trans isomer provides the biological activity, meaning the compound is active in the stable disposition and we could just inactivate them upon irradiation. Due this reason, the needs to find a photoswitchable compound active in cis disposition are more interesting in a therapeutic point of view. On the other hand, caged compounds consist in known drugs modifying by a single covalent bond, to mask the biological activity and release them selectively under light irradiation. The main issue presented by these compounds are a losing of control after irradiation. Several photochromic compounds targeting the mentioned mGluRs were designed and synthesized in the present thesis, evaluating these compounds in several fields as photochemistry, pharmacology and even in in-vivo experiments., [cat] El dolor és un dels principals problemes de salut, que en diversos casos es tradueix en una malaltia crònica amb un tractament efectiu limitat, per tant, el descobriment de nous fàrmacs per lluitar-hi, constitueix en molts casos, un gran repte avui dia. Els receptors metabotròpics del glutamat (mGluRs) estan àmpliament distribuïts al llarg del sistema nerviós central i perifèric, i modulen la transmissió del dolor en diferents nivells anatòmics. Els diferents lligands per a la modulació dels diferents subtipus de mGlus, es consideren uns fàrmacs prometedors per al tractament del dolor agut, crònic i neuropàtic. Recentment, s'ha demostrat que els moduladors al·lostèrics negatius (NAM) selectius en mGlu1 o mGlu5, i els agonistes o moduladors al·lostèrics positius (PAM) de mGlu2 o mGlu4 mostren activitat analgèsica en models animals de dolor crònic. No obstant això, l'ús sistèmic pot ser limitat pels efectes adversos. Una estratègia efectiva per superar aquesta limitació consisteix en el desenvolupament de lligands inactius fotosensibles per els receptors mGlu5, mGlu1 i mGlu4, per ser activats després amb l’aplicació de llum amb un control espai-temporal exclusivament en l’àrea on es localitza el dolor o inclòs en regions del cervell involucrats en el control del dolor. Existeixen principalment dos tipus de aproximacions en optofarmacologia, i que han estat utilitzat en la present tesis, els compostos fotocommutables (fotoisomerització) o compostos gàbia (fotòlisis). D’una banda, els compostos fotocommutables són molècules (normalment azobenzens) que coexisteixen en dos conformacions possibles (trans o cis), sent la conformació trans el isòmer termodinàmicament estable. A més, els grups azo són bioisòsters de diferents grups funcionals alguns com amides, acetilens o triazols. Amb l’adició d’aquest grup obtenim un control sobre la funció de la proteïna, demostrat en anteriors treballs realitzats per el grup. Desafortunadament, el isòmer trans d’ambdues molècules era el conformació biològicament activa, significant que el compost era actiu en la seva conformació estable i nomes es podia desactivar mitjançant llum. Per aquesta raó, el descobriment de nous compostos fotocommutables actius en disposició cis són més interessants des de un punt de vista terapèutic. D’altre banda, els compostos gàbia consisteixen en la modificació de compostos actius per un enllaç covalent, que emmascara la seva activitat biològica, alliberant-ne el compost actiu sota irradiació.

[eng] Pharmaceuticals which are used worldwide are designed to facilitate the life for the human society and have an important role in treatment and prevention of disease for both humans and animals. They are ubiquitous in the aquatic environment and are mainly derived from municipal wastewater treatment plants (WWTPs) due to their low removal rate. Therefore, their presence in the environment is directly linked to the human impact. Various biological and abiotic processes in the environment can transform them to transformation products (TPs). In many cases, transformation is already initiated in the human body by a variety of drug-metabolizing enzymes. The metabolites formed through human metabolism present some modifications in their chemical structures that can differ in physicochemical properties to their parent compound. Once they are excreted from the human body, both the unmetabolised parent drug and their metabolites enter WWTPs by means of the sewer system. Since the WWTPs are not designed to remove completely pharmaceutical residues, the fraction not removed after the treatment will eventually end up in the receiving water bodies. Consequently, due to pharmaceutical transformations in the human body, biotransformations in WWTPs and phototransformations in surface water, they can potentially produce a high number of TPs in real world samples which makes their identification a challenge. In this thesis, two different approaches (TPs profiling and suspect screening) based on high resolution mass spectrometry (HRMS) for the detection and identification of TPs of pharmaceuticals were investigated. TPs profiling approach was applied for the identification of phototransformation products of an antiviral zanamivir (ZAN) in batch reactors filled with surface water. On the other hand, suspect screening approach was applied for evaluation of transformation, prioritization and identification of photoTPs of six iodinated contrast media in surface water. Finally, a combination of suspect and TPs profiling approach was applied for the detection of TPs of an anticonvulsant lamotrigine and its main human metabolite lamotrigine N2-glucuronide which were formed as the result of their degradation in both activated sludge and pH dependent hydrolysis. The TPs profiling approach for evaluation of these transformations is illustrated in the example of photodegradation of an antiviral ZAN with identification of its TPs in surface water (Chapter 3.). Here a set of lab- scale experiments was performed in order to determine the susceptibility of ZAN towards photodegradation under simulated and natural sunlight. The identification of the TPs was performed using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (HILIC-HRMS) where four photoTPs were tentatively identified and their proposed structures were rationalized by photolysis mechanisms. Kinetic experiments showed that photodegradation kinetics of ZAN in surface waters would proceed with slow kinetics since upon exposure of aqueous solutions of surface water (20 μg L-1) to simulated sunlight, ZAN was degraded with t1/2 of 3.6 h. Under natural sunlight irradiating surface water, about 30 % of the initial concentration of the antiviral disappeared within 18 days. However, when ZAN and its TPs were retrospectively screened from surface water extracts, neither the parent nor the TPs were detected. The results of this TP profiling used for the identification of TPs of ZAN, although straightforward, suggests that it is not suitable when dealing with a considerably elevated number of TPs formed in batch experiments. However, time and effort needed to be optimised for the structure elucidation of 108 photoTPs of six iodinated contrast media (ICM) (Chapter 3.). Again, the photodegradation study was performed in surface water spiked with the ICMs using a sunlight lab-scale simulator. 108 TPs were generated and each photoTP was characterised by its unique exact mass of the molecular ion and retention time and added to a suspect list. Once the suspect list was generated, the photoTPs were searched in thirteen surface water samples which were extracted using a generic solid- phase extraction method (four cartridges of different chemistries in order to retain ample number of compounds with different chemical properties). Based on their detection frequency (those TPs with the frequency higher than 50 % were deemed important), eleven TPs were prioritized and their structures elucidated by HRMS and NMR (when possible). Out of the eleven prioritised TPs, ten were formed as the result of deiodination (either by deiodination, oxidative deiodination or intramolecular elimination). In the real surface water samples, median concentration of parent compounds was 110 ngL-1 reaching up to 6 µgL-1 for iomeprol while TPs were found at median concentration of 8 ngL-1, reaching up to 0.4 µgL-1 for iomeprol TP651-B. Here detection-based prioritization served as a crucial step to reduce the number of TPs to be identified and thereby reducing costs and time for the subsequent target analysis. This time-effective approach not only guaranties that the degradation products elucidated would be found, but also that they are environmentally relevant. In summary, the proposed screening approach facilitates the evaluation of the degradation of polar compounds at a real scale with a fast detection of TPs without prior availability of the standards. Approach used for detection and identification of TPs of ICM in Chapter 3 was an example of suspect screening where the suspect list of TPs was generated at lab-scale, In Chapter 4, the work started with a suspect screening of lamotrigine (LMG) and related compounds (its human metabolites, synthetic impurities and photoTPs) which were listed from the literature and searched in wastewater and surface water samples. As the result of suspect screening, LMG, three human metabolites and a LMG synthetic impurity (OXO-LMG) were detected in the screened samples. Preliminary results showed significantly higher concentrations of OXO-LMG in wastewater effluent, suggesting its formation in the WWTPs. However, biodegradation reactors amended with mixed liquor at neutral pH showed that LMG is resistant to biodegradation with only about 5 % elimination after 6 days. Since LMG is extensively and predominantly metabolised by phase II metabolism to its N2-glucuronide, this metabolite (LMG-N2-G) was degraded following the same experimental setup. Results showed that this metabolite was the actual source of the TP detected. Additionally, in batch experiments, LMG-N2-G was transformed, following pseudo-first kinetics, to three TPs as a result of i) deconjugation (to LMG), ii) oxidation of the glucuronic acid (to LMG-N2-G-TP430) and iii) amidine hydrolysis in combination with deconjugation (to OXO-LMG). In order to further rationalize the formation of the TP OXO-LMG, the stability of LMG-N2-G and related compounds was studied as a function of pH in the range of 4 – 9. Same as during biodegradation, LMG was stable across the entire pH range tested. However, LMG-N2-G was transformed to three TPs at neutral – basic pH. They were identified as TPs formed after hydrolysis of amidine and guanidine moieties. The third TP detected was an intermediated in the guanidine hydrolysis reaction. Kinetic experiments in wastewater samples at different concentration (20 and 200 nM) and pH (pH 6.5, 7, 8, 8.5 and 9) demonstrated that while the degradation constants were concentration independent, at higher pH, LMG-N2-G degraded at higher rate. The pH-dependent stability experiments of related compounds with different nitrogen N2-substituents on the 1,2,4-triazine ring showed that reaction of amidine and guanidine hydrolysis depends on imine tautomer equilibrium whose formation depends directly on the N2-supsitutent. LMG- N2-G major abiotic TP (amidine hydrolysis TP) was detected in hospital effluent and WWTP influent samples. Having in mind the concentrations of both biotic and abiotic TPs detected, a total mass balance at two- concentration levels batch reactors was closed at 86% and 102%, respectively. In three WWTPs total mass balance of LMG-N2-G ranged from 71-102%. Finally, LMG-N2-G and its TPs were detected in surface water samples with median concentration ranges of 23–186 ngL-1. The work presented in this chapter gives a new insight into the behaviour of glucuronides of pharmaceuticals, suggesting that they might also be sources of yet undiscovered, but environmentally relevant TPs., [cat] Els productes farmacèutics, l'ús dels quals s'estén a nivell mundial, estan dissenyats per millorar la qualitat de vida de la societat i juguen un paper clau en el tractament i la prevenció de malalties, tant en homes com en animals. Aquests compostos químics es troben de forma ubíqua en el medi ambient. Això es deu principalment a les estacions depuradores d'aigua residual (EDARs), les quals no són capaces d'eliminar de manera eficient aquest tipus de compostos, ja que no estan dissenyades amb aquesta finalitat. Per tant, la presència de fàrmacs en el medi ambient està directament relacionada amb l'activitat humana. Un cop al medi ambient, l'estructura d'aquests compostos pot ser modificada per diferents processos biològics i abiòtics, generant-se així els que es coneixen com a productes de transformació (PTs). De fet, la transformació dels fàrmacs pot iniciar-se en alguns casos en el cos humà, després de la seva administració a causa de l'activitat metabòlica dels diferents enzims que posseeix l'home. Els metabòlits formats en aquests processos presenten algunes modificacions en les seves estructures químiques pel que fa al compost original, i, en conseqüència, unes propietats fisicoquímiques diferents. Un cop excretats, tant el fàrmac original no metabolitzat com els seus metabòlits arriben a les EDARs mitjançant la xarxa de sanejament municipal d'aigües residuals. La fracció d'aquests compostos que no s'elimina en els diferents tractaments realitzats en l'EDAR, es descarrega juntament amb l'efluent de la planta als aigües receptores. El gran nombre de transformacions que poden experimentar els fàrmacs en el seu cicle de vida a causa del seu metabolisme en el cos humà, la seva biotransformació per microorganismes i la seva fototransformació per llum solar, pot generar un nombre molt elevat de PTs en el medi ambient, i, per tant, la identificació dels mateixos, necessària per avaluar el destí dels fàrmacs en el medi ambient, és un desafiament. En el desenvolupament d'aquesta tesi es van aplicar dues aproximacions analítiques diferents: a)avaluació de perfils de PTs generats en experiments a escala de laboratori i b) anàlisi qualitativa dirigida suspect screening en mostres reals, tots dues basades en espectrometria de masses d'alta resolució (HRMS) per a la detecció i identificació de PTs de productes farmacèutics. L'aproximació d'avaluació de perfils de PTs en reactors a escala de laboratori es va aplicar per identificar productes de fototransformació (fotoPTs) de l'antiviral zanamivir (ZAN) en aigua superficial. L'aproximació de suspect screening es va aplicar per prioritzar i identificar fotoPTs de sis mitjans de contrast radiològics iodats (ICM) en aigua superficial. Finalment, una combinació de les dues aproximacions es va aplicar per detectar PTs de l’anticonvulsiu lamotrigina (LMG) i del seu principal metabòlit humà, el lamotrigina-N2-glucurònid (LMG- N2-G), resultants de la seva degradació tant en fangs activats com a reaccions d'hidròlisi a diferents valors de pH.

[eng] Antiangiogenic drugs are used clinically for treatment of different types of cancers and in the case of renal cell carcinoma (RCC) are now standard first-line treatments (Rini, 2009). Nevertheless, these agents mainly serve to stabilize the disease but are not able to eliminate all tumor cells and resistance eventually develops concomitant with progression (Kerber and Folkman, 2002). Using different orthoxenograft mouse models of RCC we confirmed that inhibitors of the VEGF pathway have a therapeutic window of effectiveness but unfortunately adaptation and tumor relapse always occur. Several different mechanisms of resistance to antiangiogenics have been already described, many concerning the activation of compensatory signals that produce re-vascularization and tumor re-growth. (Bergers and Hanahan, 2008). In our study we determined that even if resistance is characterized by the up-regulation of the pro-angiogenic enzyme ECGF1 (previous data from the lab); re-vascularization does not occur, the vascular trimming is maintained by the treatment pointing to an alternative mode of adaptation. Using two different approaches, we demonstrated that PD-ECGF1 is responsible of the acquisition of resistance to anti-anigiogenics. In fact, its enzymatic inhibition as second-line treatment post resistance resulted in the arrest and stabilization of tumor growth. PD-ECGF1 inhibition did not increase the anti-vascular effect of DC101, confirming that resistance was vessel independent, but dramatically affected tumor cell proliferation and apoptosis. Considering the numerous proprieties ascribed to its final metabolite 2-deoxy-D-ribose (Ikeda et al., 2006; Bjinsdorp et al., 2008), we evaluated its role, finding that recombinant 2-deoxy-D-ribose nullified the effect of AEAC on 786O- and Ren28 tumor growth rescuing tumor cell proliferation and apoptosis, without promoting re-vascularization. Overall these findings, confirmed also in an in vitro setting, demonstrate that tumor stroma plays a minor role in this model of anti-angiogenics resistance, and that PD-ECGF1 acts mainly intracellularly supporting tumor cell proliferation and protecting from apoptosis by its enzymatic activity and final metabolite 2-deoxy-D-ribose. Using a genetic approach in which PD-ECGF1 protein expression was silence as a second line of treatment post DC101-resistance, mimicking what done pharmacologically, we confirmed and improved the anti-tumoral response described, without perceiving any doxycycline toxic effect. In fact, PD-ECGF1 genetic knock down resulted in a complete arrest of tumor progression enhancing the merely partial stabilization produce by AEAC treatment in 786O- tumor bearing mice. Unfortunately VEGFR-blockers can’t be used in vitro on cancer cells, and to verify this hypothesis we decided to mimic the final effects of anti-angiogenic treatments, finding that under nutrient deprivation conditions cancer cells significantly up-regulate PD-ECGF1 expression, and metabolizing thymidine acquired considerable growth advantages. Finally, the analysis of plasma and tissue samples of ccRCC patients from the Bellvitge Hospital confirm in a clinical set that PD-ECGF1 is exclusively found in pathologic conditions, where if highly expressed correlates with poor prognosis, suggesting that might represent a good therapeutic predictor factor. Moreover, the analysis of tissues biopsies before and after anti-angiogenic treatment revealed that whilst PD-ECGF1 treatment-induce up-regulation was a common feature, the patients that unfortunately didn’t respond showed the sharp difference, confirming PD-ECGF1 as a possible therapeutic target., [spa] Los fármacos antiangiogénicos se usan clínicamente para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer y en el caso del carcinoma de células renales (CCR) representan la primera diana terapéutica (Rini, 2009). Sin embargo, no son capaces de eliminar todas las células tumorales y muchos pacientes desarrollan resistencia al tratamiento y recrecimiento tumoral (Kerber y Folkman, 2002). Mediante el uso de diferentes modelos de ratón hemos confirmado que los inhibidores de la vía VEGF tienen una limitada ventana terapéutica de efectividad, seguida desafortunadamente de adaptación y recaída tumoral que en nuestro estudio esta` caracterizada por la regulación positiva de la enzima PD-ECGF1. Usando dos enfoques diferentes, demostramos que PD-ECGF1 es responsable de la adquisición de resistencia a anti-anigiogénicos. De hecho, su inhibición enzimática como tratamiento de segunda línea después de la resistencia dio como resultado la detención y la estabilización del crecimiento tumoral. La inhibición de PD-ECGF1 no aumentó el efecto antivascular de DC101, pero afectó de manera dramática la proliferación y apoptosis de las células tumorales. Teniendo en cuenta las numerosas propiedades atribuidas a su metabolito final 2-deoxy-D-ribose (Ikeda et al., 2006; Bjinsdorp et al., 2008), evaluamos su papel, encontrando que la 2-deoxy-D-ribose anuló el efecto de la inhibición de PD-ECGF1 rescatando el crecimiento tumoral. Experimentos en vitro demostraron como las células tumorales incrementaban la expresión de PD-ECGF1 en condiciones de falta de nutrientes haciéndonos especular que esta proteína tenga un papel en la adaptación metabolica. Finalmente, el análisis de muestras de plasma y tejido de pacientes con ccRCC del Hospital de Bellvitge confirma en un conjunto clínico que PD-ECGF1 se encuentra exclusivamente en condiciones patológicas, donde se correlaciona con mal pronóstico, sugiriendo que podría representar un buen factor predictor terapéutico.

[eng] In this thesis we have focused on two novel therapeutic strategies that target the crosstalk between the tumor cells and the microenvironment. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) remains an incurable disease where high CD38 expression is associated with poor prognosis and identifies cells that are prone to proliferate. CD38 cooperates in migration, adhesion and invasion through its molecular association with CXCR4, MMP9 and CD49d. The human anti-CD38 monoclonal antibody daratumumab has shown efficient cell killing and a good safety profile in clinical trials in multiple myeloma. In this thesis, we demonstrate that daratumumab also exerts significant cytotoxicity against patient-derived CLL cells, via ADCC and ADCP in vitro and in vivo. Furthermore, daratumumab interferes with CD38 signaling and reduces CLL cell adhesion, migration and homing. Moreover, daratumumab shows therapeutic activity in two mouse models. Thus, daratumumab improves overall survival in a systemic CD38+ MEC2 cell line mouse model and reduces tumor burden in CLL-patient derived xenografts. These results provide scientific rationale for the clinical development of daratumumab in poor prognosis CD38+CLL. Despite unprecedented activity of ibrutinib in mantle cell lymphoma (MCL), acquired or induced resistances appear in association with dismal prognosis. CC-292 (spebrutinib) is a novel, highly specific covalent BTK inhibitor that binds irreversibly to the Cys481 in the BTK active site, with demonstrated preclinical activity in several B-cell malignancies, and initial encouraging results in a phase 1 trial in relapsed/refractory chronic lymphocytic leukemia. We have characterized CC-292 activity in a panel of MCL cell lines (n=5) and primary cases (n=11) with different mutational status of NF-κB pathway genes. CC-292 shows a similar anti-proliferative profile than ibrutinib, conditioned by the existence of activating mutations in alternative NF-κB pathway genes such as TRAF2/3 and BIRC3. Noteworthy, CC-292 blocks B-cell receptor activation, independently of the presence of mutations on TRAF2/3 or BIRC3 genes. However, CC-292 interferes with CXCL12-induced migration mostly in MCL cells without activation of alternative NF-κB pathway. In sensitive cell lines, CC-292 activity was significantly enhanced by co-treatment with the immunomodulatory agent lenalidomide, maintaining its efficacy in co-culture with mesenchymal stromal cells (MSC). For MCL cases bearing mutations in the alternative NF-κB pathway, inhibitors of NIK, a central kinase promoting processing of p100 to p52, engaged cytostatic and cytotoxic responses in MCL cell lines and primary cultures. This effect was maintained in MSC-MCL co-cultures and was further enhanced by CC-292 leading to a complete impairment of NF-κB pathway. These substantial effects of CC-292 on MCL, especially in combination regimens, warrant further investigation in the clinical setting. All in all, the findings of the present thesis support the importance of developing strategies to target the microenvironment and its interaction with neoplastic cells., [spa] En esta tesis nos hemos centrado en dos estrategias terapéuticas novedosas que interfieren en la comunicación entre las células tumorales y el microambiente. Nuestro trabajo con Daratumumab, un anticuerpo monoclonal humano anti-CD38, sugiere que el DARA puede ser un agente terapéutico prometedor para el tratamiento de pacientes de LLC CD38+. DARA ejerce sus efectos principalmente a través de ADCC/ADCP y también a través de la inhibición de la migración y la adhesión de las células tumorales. La inhibición de la migración de las células tumorales a tejidos linfoides puede ser clínicamente relevante, ya que hay una creciente evidencia que indica que las interacciones tumor-microambiente pueden desempeñar un papel importante en la resistencia a los fármacos y contribuir a los fracasos clínicos. DARA también demostró una importante actividad in vivo en modelos inmunocomprometidos de ratón de LLC. Los resultados que hemos obtenido indican que el CC-292 es eficaz en el bloqueo de la señalización del BCR y la migración inducida por la quimiocina CXCL12 de células de LCM. Además, el CC-292 inhibe la activación celular inducida por α-IgM, evaluada por la expresión en membrana de CD69 y CD86, y la secreción de CCL3/CCL4. Se sabe que el bloqueo de la proteína BTK inhibe la vía clásica de NF-κB. Un estudio reciente descubrió que las líneas celulares de LCM resistentes al inhibidor de BTK ibrutinib, presentaban activación de la vía alternativa de NF-κB y que podían ser sensibles a los inhibidores de esta vía, tales como los nuevos inhibidores de NIK. En este sentido, hemos confirmado que el CC-292 inhibe la vía NF-κ B en aquellas líneas celulares sensibles al CC-292 pero no en las resistentes. Con el fin de aumentar el efecto antitumoral del CC-292 en las líneas resistentes, el CC-292 se combinó con dos inhibidores de NIK. Los resultados sugieren que las líneas celulares resistentes al CC-292 son sensibles a estos inhibidores y muestran una potencial sinergia con el CC-292

[spa] Ciclosporina y tacrolimus son la base de la terapia inmunosupresora en el trasplante hepático, ya que son fármacos imprescindibles para la prevención del rechazo del órgano trasplantado. Sin embargo, todavía está pendiente de explicar una gran parte de su variabilidad farmacocinética y farmacodinámica. Existen estudios que ponen de manifiesto una relación entre las características farmacocinéticas y farmacodinámicas de estos fármacos con algunas variantes de genes que codifican para enzimas y proteínas clave relacionadas con su metabolismo y transporte. No obstante, los resultados publicados hasta el momento son controvertidos, cuya inconsistencia general puede estar relacionada con los siguientes factores: variabilidad étnica, pequeño número de pacientes incluidos en los estudios, inespecificidad de los sistemas de medida empleados para la determinación de la concentración de estos fármacos en sangre, variación en el punto del tiempo en el que se obtienen los resultados, e impacto del genotipo del donante. En el presente trabajo se han estudiado las variantes CYP3A4*1B (c.-392A>G), CYP3A4*22 (c.522-191C>T), CYP3A5*3 (c.6986A>G), y c.3435C>T y c.2677G>T del gen ABCB1. Se ha realizado minimizado las posibles variaciones debidas al diseño del estudio con el fin de ayudar a resolver parte de esta variabilidad y obtener resultados consistentes: incluyendo únicamente pacientes de la misma etnia y con un único inmunosupresor en monoterapia durante los tres primeros meses post-trasplante, realizando todas las medidas de la concentración de los fármacos inmunosupresores en sangre con el mismo sistema de medida, considerando el parámetro “ratio concentración dosis” en el estudio, empleando modelos estadísticos que tienen en cuenta la dependencia de los datos de un mismo individuo en el tiempo e incluyendo el genotipo tanto del receptor como del donante. Además se ha investigado el papel potencial de los genotipos, tanto a nivel individual como en combinación (haplotipos). También se ha evaluado la relevancia clínica de los hallazgos obtenidos, y se ha estudiado la influencia de dichas variantes genéticas sobre la eficacia clínica (incidencia de rechazo agudo) y sobre la seguridad (incidencia de aparición de los efectos adversos) en el paciente trasplantado hepático. En nuestra población en estudio, mediante los métodos descritos, se han identificado y/o al menos corroborado algunas observaciones interesantes que merecen estudios más detallados (como la de requerimientos de dosis más altos para los receptores de un injerto portador de la variante *1 del gen CYP3A5). En cuanto a la prevención de acontecimientos adversos, en ciclosporina parece interesante la influencia del alelo CYP3A4*1B en receptores sobre la neurotoxicidad, la combinación del alelo CYP3A4*1B en donantes con el genotipo 3435CC de ABCB1 en receptores sobre la hipertensión arterial. En tacrolimus el alelo CYP3A5*1 en receptores muestra relación con la nefrotoxicidad e hipertensión arterial, el alelo 3435T de ABCB1 en donantes con la diabetes mellitus y los alelos 2677A/T de ABCB1 en donantes con la neurotoxicidad. Podrían llevarse a cabo estudios prospectivos para verificar estos hallazgos, y corroborar la repercusión que tiene el conocimiento del genotipo. En general, se pone de manifiesto la relevancia del genotipo del donante. Aunque éste supone un inconveniente debido a que no puede ser elegido, recomendamos generar un Banco de ADN tanto de los receptores como de los donantes (incluyéndolo en el consentimiento informado) para permitir el acceso fácil y rápido a este tipo de muestras para la realización de futuros estudios farmacogenéticos. Posibles líneas de futuro serían: realizar este tipo de estudios pero midiendo la concentración de estos fármacos en el interior de los linfocitos; así como investigar la función que desempeña ABCB1 en linfocitos, en tejido hepático, tejido renal y en barrera hematoencefálica en relación a ciclosporina y tacrolimus, ya que parece tener un papel clave no sólo a nivel del intestino., [eng] Cyclosporine and tacrolimus are the basis for immunosuppressive therapy in liver transplantation: they are essential drugs for organ transplant rejection prevention. However, a large part of its pharmacokinetic and pharmacodynamic variability still needs to be explained. A number of studies show a relation between the pharmacokinetics and pharmacodynamics of these drugs with some variants of genes encoding key enzymes and proteins related to their metabolism and transport. Nevertheless, the results published so far are controversial. Their general inconsistency may be related to the following factors: ethnic variability, small number of patients included in the studies, lack of specificity measuring systems used for concentration determination of these drugs in blood, variation at the point in time where the results are obtained, and impact of donor genotype. In this work we have studied the following variants: CYP3A4*1B (C-392A>G), CYP3A4*22 (c.522-191C>T), CYP3A5*3 (c.6986A>G), and c.3435C>T and c.2677G>T from ABCB1 gene. We have minimized possible variations due to study design in order to help solve part of this variability and obtain consistent results. We have furthermore investigated the potential role of genotypes, both individually and in combination (haplotypes). Moreover, we have evaluated the clinical relevance of the findings, and we have also studied the influence of these genetic variants on clinical efficacy (incidence of acute rejection) and safety (incidence of occurrence of adverse effects) in the liver transplanted patient. In our study population, by the methods described, we have identified and/or at least confirmed some interesting observations that deserve more detailed studies (such as the requirement of higher doses for recipients of the CYP3A5*1 carriers graft). As regards the prevention of adverse events, in cyclosporine seems interesting the influence of CYP3A4*1B allele in receptors on neurotoxicity, the combination of CYP3A4*1B allele in donors with 3435CC ABCB1 recipients on hypertension. In tacrolimus the CYP3A5*1 allele in recipients shows relation to nephrotoxicity and hypertension, the 3435T ABCB1 allele in donors with diabetes mellitus and 2677A/T alleles of ABCB1 donors with neurotoxicity. Prospective studies could be conducted to verify these findings and corroborate the impact of the genotype knowledge. In general, it shows up the relevance of the donor genotype.

[spa] Los trastornos lisosomales y la aciduria glutárica tipo I son las enfermedades objeto de este estudio. Dichas enfermedades, pertenecen al numeroso grupo de enfermedades metabólicas hereditarias (EMH) y tienen en común la deficiencia de una enzima y la consiguiente acumulación del sustrato que al no poderse metabolizar resulta tóxico para la célula. En general, estas enfermedades presentan afectación neurológica, debutan en los primeros años de vida y son devastadoras, tanto para el paciente como para su entorno familiar. En la actualidad, la mayoría de tratamientos disponibles son paliativos o bien no tienen un efecto significativo sobre la afectación neurológica. En este trabajo nos hemos propuesto desarrollar y aplicar diferentes estrategias terapéuticas, bajo diferentes enfoques moleculares, para poder aportar nuevas herramientas en el tratamiento de estas enfermedades. Para ello se han cribado compuestos de bajo peso molecular capaces de atravesar la barrera hematoencefálica para poder, si procede, tratar la afectación neurológica. Nos hemos centrado en el desarrollo de tres aproximaciones diferentes: el uso de terapias con agentes antioxidantes, el uso de chaperonas farmacológicas y el uso de compuestos activadores de la sobrelectura de codones de terminación prematuros (PTCs). Hemos demostrado que el tratamiento con diferentes antioxidantes (coenzima Qio o un cóctel de tocoferol, ácido lipoico y N-acetilcisteina) es capaz de rescatar ciertos parámetros bioquímicos característicos del síndrome de Sanfilippo en fibroblastos de pacientes con esta enfermedad. Por lo tanto, esta aproximación terapéutica podría mejorar la sintomatología de dichos pacientes. Hemos desarrollado un método de cribado de chaperonas farmacológicas para la aciduria glutárica tipo I, que nos ha permitido identificar un posible hit. Se ha validado su efectividad mediante estudios in vitro y en fibroblastos de pacientes con esta enfermedad y se ha confirmado su eficacia en una de las mutaciones más prevalentes en población española (p.Val400Met). Además, hemos colaborado en la creación y validación de un modelo neuronal derivado de células iPS para la enfermedad de Gaucher tipo II (forma neuronopática) y se ha comprobado la efectividad del tratamiento con chaperonas farmacológicas en este nuevo modelo celular mediante el uso de análogos de Nojirimicina. La obtención de estas células iPS permitirá a la comunidad científica tener acceso a un modelo celular neuronal de la enfermedad de Gaucher. Hemos identificado diferentes líneas celulares de pacientes con distintas enfermedades lisosomales, causadas por mutaciones “nonsense”, que responden al tratamiento con compuestos que inducen la sobrelectura de PTCs. En colaboración con otros grupos, hemos puesto a punto un método de cribado de pequeñas moléculas capaces de promover la sobrelectura de PTCs y hemos probado los diferentes hits resultantes en las diferentes líneas celulares previamente seleccionadas. De los más de 62.000 compuestos cribados, únicamente uno demostró restaurar los parámetros bioquímicos alterados en las enfermedades lisosomales de estudio: Bicalutamide. Este compuesto es un anti-androgénico utilizado para el tratamiento de cáncer de próstata que se ha relacionado recientemente con el mecanismo de autofagia. El estudio molecular de su mecanismo de acción nos ha permitido determinar que la restauración de los parámetros bioquímicos alterados después del tratamiento con Bicalutamide era debida a un incremento del flujo autofágico y de la exocitosis lisosomal, determinado por la activación del factor de transcripción TFEB. Este descubrimiento nos ha conducido a la realización de una patente de uso del compuesto Bicalutamide y sus derivados para el tratamiento de enfermedades lisosomales (WO 2015/097088 A1). En resumen, en este trabajo se han desarrollado diferentes estrategias terapéuticas mediante diferentes enfoques moleculares que conforman una primera aproximación para el tratamiento de la afectación neurológica de distintas EMH. Se han identificado dos nuevos compuestos procedentes de librerías de reposicionamiento que han demostrado restaurar parcialmente los parámetros bioquímicos alterados. Estos compuestos podrían ser útiles para el tratamiento de las enfermedades objeto de este estudio, tanto a nivel sistémico como neurológico. Sin embargo, previamente se deberá validar la eficacia de los compuestos identificados en modelos animales., [eng] Lysosomal storage disorders (LSDs) and glutaric aciduria type I (AG-I) are inherited metabolic disorders that arise from the deficiency of an enzyme and the subsequent accumulation of its substrate which is harmful for the cell. Most of these diseases present neurological involvement and start during the first years of life being devastating for both, patients and relatives. Nowadays, most of the available treatments are palliative or have no significant effect in the neurological involvement. In this study, we have developed and applied different therapeutic strategies in order to provide new tools for the treatment of these diseases, focusing particularly in targeting the neurological involvement: use of antioxidants, pharmacological chaperones (PCs) and readthrough compounds. We have demonstrated that treatment with antioxidants (coenzyme Qio or a cocktail with tocopherol, lipoic acid and N-acetylcystein) is able to restore the biochemical alterations in fibroblasts derived from Sanfilippo patients. Thus, this therapeutical approach could ameliorate Sanfilippo's patient phenotype. We have developed a high throughput screening methodology to identify possible PCs for the AG-I. We have validated hits effectiveness using in vitro and primary AG-I patient's cell models and confirmed the chaperone activity of one compound in the most prevalent missense mutation in the Spanish population. Moreover, we have validated a neuronal cell model for Gaucher disease created using iPS cells and proved the effectiveness of already described PCs in this cell type, providing a new neurological model for Gaucher disease to the scientific community. We have identified different cell lines derived from patients with nonsense mutations affected by different LSDs responsive to a readthrough treatment. These cell lines have allowed us to validate possible hits resulting from a HTS performed in collaboration with other groups. Only one compound, Bicalutamide, was able to restore the biochemical alterations observed in patients' fibroblasts. Bicalutamide is an anti-androgenic drug used for the treatment of prostate cancer that has been recently related to the autophagy mechanism. Studying its molecular role, we have elucidated that Bicalutamide acts through the activation of the transcription factor TFEB which in turn induces the autophagy and exocytosis fluxes, removing the lysosomal pathogenic accumulation. We have patented its use in LSDs (WO 2015/097088 Al). In conclusion we have developed different therapeutic strategies through different molecular approximations for the treatment of both, the systemic and neurological involvement of the studied diseases. The discovery of these new drugs has to be validated in animals' models.

Introducció: El rendiment diagnòstic dels leucòcits marcats amb 99m Tc recau, en bona part, en la qualitat del procediment de marcatge i d’obtenció de les imatges. Els controls habitualment establerts no justifiquen, per si sols, la variabilitat dels resultats obtinguts. Objectiu: Verificar a la pràctica diària, els components de la dosi, el seu marcatge i el seu funcionalisme dins del pacient amb nous controls mitjançant metodologies a l’abast del centre, amb mínima pèrdua de la dosi i sense contravenir les normatives en radioprotecció establertes ni perllongar l’estada del pacient. Metodologia Estudi prospectiu, observacional en 320 pacients (159 dones; edat 63,2 ± 23,1 anys) amb malalties inflamatòries i infeccioses diagnosticats mitjançant els seus leucòcits marcats 99m Tc-HMPAO i que han configurat tres grups amb controls diferents. El primer grup (n=87) per a la determinació de l’hemograma i viabilitat cel·lular amb una nova aplicació de la citometria de flux. El grup II (n=101) per verificar la distribució del 99m Tc entre els components de dosi per separació per gradients i al grup III (n=132) localització de la dosi als ossos, vasos i parts toves per determinar el funcionalisme de la dosi administrada. Els resultats s’han agrupat segons el resultat de la gammagrafia i per seguiment clínic de 2 anys. Resultats No han existit diferències significatives per a la majoria de les variables estudiades. En el Grup I es va evidenciar significació en el rendiment del marcatge (p=0,018), cèl·lules totals (p=0,048) i plaquetes (p=0,035) entre les variables estudiades agrupades segons la taxa de resultats verdaders/falsos. Significatius, també en el tercer grup en la captació dels ossos respecte a les parts toves (p, Introduction: The controversy of the clinical utility of the 99mTc-labeled leucocytes lies in the quality of the procedure performed, given that the usually established controls do not justify all the variables involved by themselves. Objective: Checking in daily practice the components of dose, the 99mTc labeling and its functionalism in the patient with new controls using methodologies to the scope of the centre. All of this with minimal loss of dose, without contravening the regulations on radioprotection and without extending the patient length of stay. Methodology Prospective observational study in 320 patients (159 women; age 63,2 +- 23,1 years) with infectious and inflammatory diseases diagnosed using 99mTc- HMPAO-leukocytes in three different control groups. The first group (n=87) for the determination of the complete blood count and cell viability with a new application of flow cytometry. The group II (n=101) to verify the 99mTc distribution between dose components separated by gradients. And the group III (n=132) for localization of bones dose, vessels and soft tissue in order of determinate the functionalism of the administered dose. The studied variables have been grouped in accordance with the scan result and a clinical follow-up for 2 years. Results: No significant differences were found for most of the studied variables. The first group showed significance in efficiency of the labeling (p = 0,018), in total cells (p = 0,048) and in platelets (p = 0,035) grouping them by clinical criterion. The verification of the labeled erythrocytes was not exact. In the third group it was observed significance on bone capture in relation to soft tissue (p < 0,001) when the variables were grouped by diagnosis. The overall clinical effectiveness was 86,2% with a 76%, 67% and 73% of kappa index for each group, respectively. Conclusions: The established controls allow us to verify the quality of procedure for the majority of variables and identify the causes of the methodological deviation in the optimal obtaining of leukocytes. The method shows a limitation to verify the labeled erythocytes. The bone capture is a good indicator for the functionalism of the administered leukocytes.

For over eighty years, adamantane ring has interested organic chemists for its simplicity and symmetry. The rigid tricyclo[3.3.1.13,7]decane skeleton has provided a unique structural template for evaluating important theoretical concepts in chemistry. The physical and chemical properties of the adamantane nucleus have largely overshadowed the structure’s contribution to the discovery of human therapeutics. Nevertheless its application in medicinal chemistry has become more and more significant in the last decades, where the adamantane ring was identified as a key structural subunit in several synthetic drugs for multiple targets. Adamantane is often considered as providing just the critical lipophilicity readily available as an add-on for known pharmacophoric units. Although its valuable contribution to medicinal sciences, adamantane ring can lead to solubility and stability problems which compromise the pharmacokinetic profile of the potential drug. Hence many research teams have worked out alternatives on adamantyl-based compounds in order to avert these issues, especially by attaching polar groups at key positions. In the last few years, the research group of Dr. Santiago Vázquez from University of Barcelona has developed new polycyclic scaffolds as surrogates of the adamantane group with encouraging results in multiple targets. So far, we have synthesized ring-contracted, ring-expanded and oxa analogues of the drugs amantadine, rimantadine and memantine with anti-influenza, NMDA receptor antagonist and trypanocidal activities, proving the capacity of these polycycles to substitute the adamantane ring. As described previously, the replacement of the adamantane ring with other polycyclic scaffolds can lead to compounds with better pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles. In particular, my Ph.D. research has focused mainly on the substitution of the adamantane moiety in inhibitors of different targets. 1) NMDA receptor antagonists: design, synthesis, pharmacological evaluation and electrophysiological studies of new compounds. 2) 11β-HSD1: design, synthesis, pharmacological evaluation and computational studies of new compounds. 3) Soluble epoxide hydrolase inhibitors: design, synthesis, pharmacological evaluation and in vitro cellular studies of new compounds. From the results of this dissertation, we have confirmed the ability of the new scaffolds to replace the adamantane nucleus with successful outcomes. The work derived from this thesis have been published in peer scientific journals, as well as in two different patent applications., La recerca duta a terme durant la meva tesi doctoral ha estat centrada principalment en la substitució de l’anell d’adamantà en inhibidors de diferents dianes. Fins al moment, durant la present tesi, he sintetitzat estructures policícliques de diferent mida i forma com anàlegs de l’adamantà per la seva substitució en múltiples dianes farmacològiques. Concretament, he preparat famílies de compostos que tenen com a diana el receptor NMDA del glutamat per la malaltia d’Alzheimer, l’enzim 11β-HSD1 pel tractament de la diabetis mellitus tipus 2 i malalties cardiovasculars, i l’enzim sEH pel tractament del síndrome metabòlic i estats de dolor i inflamació. El nostre objectiu és proporcionar nous compostos amb propietats fisicoquímiques millorades, mentre mantenen la seva potència biològica. Amb la seva avaluació en assajos in vitro, hem demostrat la capacitat d’aquest policicles de substituir l’anell d’adamantà. Cal destacar que la meva recerca ha inclòs el disseny, la síntesi i la caracterització completa dels compostos finals, així com l’avaluació farmacològica i els assajos in vitro d’una de les famílies de compostos.

[cat] La malaltia de Gaucher (GD) forma part d'un conjunt de malalties que es coneixen amb el nom de "malalties d'acumulació lisosómica". La GD n'és la més prevalent i en la majoria de casos és causada per mutacions en el gen GBA1, que codifica l'enzim glucocerebrosidasa (GBA1) la qual hidrolitza, principalment, l'esfingolipid glucosilceramida (GlcCer) en glucosa i ceramida. En la GD aquest enzim presenta una activitat deficient i la GlcCer s'acumula en els lisosomes dels macròfags que formen les anomenades "cèl. lules Gaucher". La GD és autosòmica recessiva i compren 3 subtipus clínics, en funció de la presència i el grau de les manifestacions neurològiques: la de tipus 1 (GD1; no neuronopàtica), la de tipus 2 (GD2; neuronopàtica aguda), i la de tipus 3 (GD3; neuronopàtica subaguda). La GD1 es caracteritza per presentar problemes viscerals, hematològics i ossis. La patofisiologia de les manifestacions òssies d'aquesta és poc coneguda però tot apunta a que les cèl. lules de Gaucher, el sistema immunològic i les cèl• lules òssies hi juguen un paper important. De totes les aproximacions terapèutiques pel tractament de la malaltia, cal destacar que la teràpia de substitució enzimàtica (ERT) és la més utilitzada, però en els últims 10 anys la teràpia amb xaperones farmacològiques ha esdevingut una opció atractiva per millorar el plegament i transport d'aquells enzims mutats que ho requereixin. El treball que es presenta en aquesta tesi doctoral ha permès identificar algunes xaperones que presenten una bona capacitat d'augmentar l'activitat enzimàtica d'algunes glucocerebrosidases mutades. A més, s'ha elaborat un model mesenquimal i osteoblàstic de la GD1 en el que s'està avaluant la implicació de la deficient activitat GBA1 en la diferenciació osteoblàstica i, indirectament, en l'activació de la formació dels osteoclasts., [eng] Gaucher disease (GD) is the most prevalent lysosomal storage disorder and in most cases is caused by mutations in the GBA1 gene, which encodes the enzyme glucocerebrosidase (GBA1). This protein mainly hydrolyzes the sphingolipid glucosylceramide (GlcCer) into glucose and ceramide. Gaucher patients have a deficient GBA1 enzyme activity which causes that GlcCer accumulates in lysosomes of macrophages forming the so-called "Gaucher cells". GD is an autosomal recessive disorder and can be classified in three clinical subtypes, depending on the presence and degree of neurological manifestations: type 1 (GD1, no neuronopathic), type 2 (GD2; acute neuronopathic) and type 3 (GD3; subacute neuronopathic). The GD1 is characterized by visceral, haematological and bone manifestations. The pathological mechanisms of bone alterations in GD are still poorly understood. But it seems that Gaucher cells, immunitary system and bone cells play an important role. Of the current therapeutic approaches for treatment of the disease, enzyme replacement therapy (ERT) is the most commonly used. However, in the last 10 years pharmacological chaperones therapy has become an attractive option to improve the folding and transport of some mutated enzymes. The aim of this work has been the identification and characterization of compounds with positive effect on the activity of some mutant glucocerebrosidases to act as chaperones. Also, a model of mesenchymal and osteoblastic GD1 has been generated. In this model is being assessed the involvement of deficient GBA1 activity in the osteoblast differentiation process and, indirectly, in the capacity of osteoclasts formation., [spa] La enfermedad de Gaucher (GD) forma parte de un conjunto de enfermedades que reciben el nombre de "enfermedades de acumulo lisosómico". La GD es la más prevalente y en la mayoría de los casos es debida a mutaciones en el gen GBA1 que codifica la enzima glucocerebrosidasa (GBA1) la cual hidroliza, principalmente el esfingolípido glucosilceramida (GlcCer) en glucosa y ceramida. En la GD ésta enzima presenta una actividad deficiente y la GlcCer se acumula en los lisosomas de los macrófagos formando las células Gaucher. La GD es una patología autosómica recesiva e incluye 3 subtipos clínicos, en función de la presencia y el grado de las manifestaciones neurológicas: tipo 1 (GD1; no neurológica), tipo 2 (GD2; neurológica aguda), y tipo 3 (GD3; neurológica subaguda). La GD1 se caracteriza por presentar problemas viscerales, hematológicos y óseos. La patofisiología de las manifestaciones óseas de la GD1 es poco conocida pero parece ser que las células Gaucher, el sistema inmunológico y las células óseas juegan un papel importante. De todas las aproximaciones terapéuticas para el tratamiento de la GD, la terapia de substitución enzimática (ERT) es la más habitual, pero en los últimos 10 años la terapia con chaperones farmacológicas ha resultado ser una buena opción para mejorar el plegamiento y el transporte de aquellos enzimas mutados que lo requieren. El trabajo que se presenta en ésta tesis doctoral ha permitido identificar algunos productos que presentan una buena capacidad de aumentar la actividad de algunas glucerebrosidasas mutadas y actuar por lo tanto como chaperonas farmacológicas. Además, se ha elaborado un modelo mesenquimal y osteoblástico de la GD1 en el que se está evaluando la implicación de la deficiente actividad de la enzima GBA1 en la diferenciación osteoblástica y, indirectamente, en la activación de la formación de los osteoclastos.

Podeu consultar la Vuitena trobada de professorat de Ciències de la Salut completa a: http://hdl.handle.net/2445/66524, Des de la implantació de Espai Europeu d’Educació Superior i l’adopció per part de les universitats de l’avaluació continuada (AC) com a sistema d’acreditació del aprenentatges, existeix la preocupació tant per part dels estudiants com dels professors, que l’AC, entesa com la suma de proves i/o evidències parcials d’avaluació, ens porta a una disminució de notes en la franja alta de qualificació...

INTRODUCTION: In 1966, Rett syndrome (RTT, OMIM#312750) was for the first time described as a clinical issue by Dr. Andreas Rett, an Austrian pediatrician. He has observed in 22 patients similar unique symptoms. A few years later Hagberg and colleagues described further the syndrome in 35 girls. Rett syndrome is the cause of mental retardation that affects 1 in 10.000 female births, which makes it the second cause of mental retardation in girls. In 1999 Zoghbi lab found out the genetic basis of Rett disease. Mutation in MeCP2 is in 95% cases the reason of classical Rett. MeCP2 is a nuclear protein, expressed widely in different tissues, but is most abundant in neurons of the mature nervous system. A few years earlier Bird and coworkers indentified MeCP2 as a new protein that binds to the methylated CpG dinucleotides. Although the function of the MeCP2 is still unknown, it is considered likely to regulate gene expression, either through the silencing or activation of the specific genes or by more global regulation of transcriptional processes. RTT was the first neurodevelopmental disorder related to epigenetics. AIM OF THE STUDY Hypotesis: The main aim of this thesis is to perform preclinical evaluation of drugs that are known to target pathways which are altered in Rett syndrome. It is also necessary to investigate new mechanisms associated with the development of Rett syndrome, aiming to find new pathways related to Rett phenotype that can be manipulated through the pharmacological approach. Aims: 1. Determine tests that can reflect the difference at the behavioral and molecular levels between the Mecp2 KO and WT littermate mice. 2. Optimize study design protocol for evaluation of in vivo drug treatments. 3. Identify candidate drugs against selected targets in order to improve Rett disease, with the goal to reverse the symptoms, prolong the life span or ameliorate dysfunctions based on inflammation and neural mechanisms. 4. Determine the potential effects of novel therapeutic approaches for newly discovered pathways dysregulated in Rett syndrome. Methods: Animals knockout (KO) to the MeCP2 gene are a well-established murine model that mimics RTT human disease. This model is an excellent tool for the study of the consequences of the loss of MeCP2 in neuronal function. Once we know the dose administered, use two experimental groups of treated and untreated animals. Treatment is initiated when the animals are 4 weeks old and start showing symptoms characteristic of this model: reduced mobility, retraction of the hind legs, tremors, hair frizzing and respiratory abnormalities, difficulty walking, retraction of the rear legs. During the test, the mice will be evaluated according to a set of symptoms resulting from MeCP2 deficiency. Results: Part 1 • We performed a comprehensive panel of experiments investigating the differences between Mecp2 KO and wt littermate mice at the behavioral and molecular levels. This was further extended to evaluate the specific drug treatments efficacy. Part 2 • Combined administration of Levodopa and a Dopa decarboxylase inhibitor in Rett syndrome mouse models was well tolerated, diminished Rett syndrome-associated symptoms and increased lifespan. • The use of L-Dopa + Ddci in the Mecp2 KO mice induced dendritic growth mediated by dopaminergic neurons. • L-Dopa + Ddci-treated group exhibited higher Th and pTh expression and dopamine levels in comparison to the vehicle treated group. Part 3 • The results presented here reveal an important role for the relationship between Mecp2 and GSK3 signaling in Rett syndrome disease • Inhibitor of GSK3, SB216763, improved life span and reduced single and total symptoms scores, as well as motor deficiency in Mecp2 KO mice • Inhibition of GSK3 is a possible line of stimulation of neuronal dendritic growth, supported by elevated levels of D2- receptor after drug administration. • Treatment with SB216763 decreased inflammation and strengthened antioxidant defense in the brain of Mecp2KO mice Part 4 • Treatment with copaxone, a BDNF analogue reflect rather low improvement in Mecp2 KO studied mice, displaying also very variable results between studied animals. • Treatment with dexamethasone, an example of glucocorticoids intervention display rather low improvement – approximately 20% when compared to untreated mice. • Ropirinol treatment confirmed that dopminergic pathway is dysregulated in Rett. Both life span and the phenotype were improved. However, the efficiency was lower compared to L-dopa + Ddci treatment. • Injections of bromperidol, a serotonin modulator, were toxic for Mecp2 KO mice. Even though the selected doses were very low, they caused significant reduction of body weight in the KO treated group. • Previously described positive effect of cysteamine was not reproduced in our laboratory (Roux et al., 2012). • Gabapentin, one of GABA modulators, improved the phenotype, but not life span of Mecp2 KO animals, being more efficient with the low dose. • TDZD8 treatment confirmed previously a described role of GSK3 inhibition in Rett. Both life span and phenotype were improved. However, the efficacy was lower than after SB216763 treatment. • Antioxidants studied in this thesis displayed improvement of 30% in Rett syndrome phenotype and some of them prolonged the life span by 25% when compared to the vehicle group. • Epigenetics drugs evaluated in this thesis, even though some of them were suggested to be relevant for Rett syndrome, did not show any specific improvement. Conclusions: The treatment with L-Dopa + Ddci is promising to overcome the dopaminergic defects observed in the preclinical model of Rett syndrome (Szczesna et al., 2014) The new data indicate selected inhibitor, SB216763, as a being potential drug treatment for Rett disease. The drug can be adressed to have neuroprotection properties via the improvement of synaptic plasticity, reduced oxidant and inflammation damage or partial rescue of mobility dysfunctions (Szczesna et al in preparation)., INTRODUCCIÓN: En 1966, el síndrome de Rett (RTT, OMIM#312750) fue por primera vez descrito como un problema clínico por el pediatra austriaco Andreas Rett. Observó síntomas similares en 22 pacientes. Pocos años después, Hagberg y colaboradores describieron el síndrome en 35 niñas más. El síndrome de Rett causa retraso mental en 1 de cada 10000 niñas, lo que hace que sea la segunda causa de retraso mental en niñas. En 1999 en el laboratorio de Huda Zoghbi descubrieron las bases genéticas de la enfermedad. El 95% de los casos de Rett clásico se produce por mutaciones en MeCP2. MeCP2 es una proteína nuclear, que se expresa en diferentes tejidos, pero es especialmente abundante en neuronas del sistema nervioso maduro. Pocos años antes Bird y colaboradores habían identificado MeCP2 como proteína con capacidad para unirse a dinucleótidos CpG. Aunque la función de MeCP2 todavía no se conoce con exactitud, se considera que probablemente actúa como regulador de la expresión génica, tanto mediante el silenciamiento o activación de genes específicos como actuando de manera más global sobre la transcripción. El síndrome de Rett fue la primera enfermedad del desarrollo neuronal relacionada con la epigenética. OBJETIVOS DEL ESTUDIO Hipótesis: El principal objetivo de esta tesis es realizar la evaluación preclínica de fármacos que actúan sobre las diferentes rutas alteradas en el síndrome de Rett. Es necesario también investigar nuevos mecanismos asociados al desarrollo de la enfermedad, con el fin de descubrir nuevas rutas que puedan estar relacionadas con la patología y que sean susceptibles de ser manipuladas mediante la utilización de fármacos específicos. Objetivos: 1. Determinar qué tests pueden reflejar las diferencias tanto a nivel conductual como molecular entre ratones knockout de MeCP2 y salvajes de la misma camada. 2. Optimización de protocolos de evaluación de tratamientos farmacológicos in vivo. 3. Identificación de fármacos dirigidos a dianas específicas para la mejora del curso de la enfermedad, con la finalidad de revertir la sintomatología, aumentar la supervivencia o mejorar disfunciones relacionadas con mecanismos neuronales o inflamación. 4. Determinar el potencial de las nuevas terapias desarrolladas para las rutas que se descubran alteradas en el síndrome de Rett. Métodos: El knockout de MeCP2 es un modelo murino bien establecido que mimetiza el síndrome de Rett humano. Este es un excelente modelo para el estudio de las consecuencias relacionadas con la pérdida de MeCP2 en las funciones neuronales. Una vez conocida la dosis que se ha de administrar, se utilizaron dos grupos experimetales, el grupo de tratados y no tratados. El tratamiento se inicia cuando los animales tienen 4 semanas y empiezan a mostras síntomas característicos del modelo: movilidad reducida, retracción de las patas traseras, temblores, pelo encrespado y anormalidades respiratorias, dificultas al andar, retracción de las patas delanteras. Durante el test, los ratones serán evaluados según los síntomas derivados de la deficiencia de MeCP2. Resultados: Parte 1 • Hemos realizado una serie de experimentos investigando las diferencias entre ratones MeCP2 KO y sus hermanos de camada salvajes, tanto a nivel de comportamiento como molecular. Posteriormente, se evaluó la eficacia de una serie de tratamientos. Parte 2 • La administración combinada de Levodopa y un inhibidor de la Dopa decarboxylasa en ratones con síndrome de Rett fue bien tolerada por los animales, disminuyendo los síntomas asociados al síndrome y aumentando la supervivencia. • El uso de L-Dopa + Ddci en el los ratones Mecp2 KO indujo el crecimiento dendrítico mediado por neuronas dopaminérgicas. • El grupo tratado con L-Dopa + Ddci muestra exhibió un aumento en los niveles de expression Th y pTh y de los niveles de dopamina en comparación con el grupo tratado con el vehículo. Parte 3 • Los resultados presentados revelan que la relación entre Mecp2 y la ruta de señalización de GSK3 juega un papel importante en el síndrome de Rett. • El inhibidor de GSK3, SB216763, mejoró la supervivencia y redujo la gravedad de los síntomas, así como la deficiencia motora ,de los ratones Mecp2 KO • La inhibición de GSK3 es una posible vía de estimulación del crecimiento de las neuronas dendríticas, avalado por los elevados niveles del receptor D2 encontrados tras la administración de la droga. • El tratamiento con SB216763 disminuyó la inflamación y reforzó las defensas antioxidantes en el cerebro de los ratones Mecp2 KO. Parte 4 • El tratamiento con copaxona, un análogo de BDNF dio lugar a una menor mejora de los ratones Mecp2 KO, mostrando además una gran variabilidad entre los ratones estudiados. • El tratamiento con dexamethasona, un ejemplo de tratamiento con glucocorticoides, mostró una pequeña mejora, aproximadamente un 20% cuando se comparan los ratones tratados con los no tratados. • El tratamiento con Ropirinol confirmó que la vía dopaminérgica está alterada en Rett. Tanto la supervivencia como la sintomatología mejoró tras la administración de la droga. Sin embrago, la eficiencia fue menor a la obtenida con la tratamiento combinado de Dopa + Ddci. • Las inyecciones de bromperidol, un modulador de la serotonina, resultaron ser tóxicas en ratones Mecp2. Incluso aunque las dosis administradas fueran muy bajas, los ratones sufrían pérdida de peso acusado. • Resultados previos describiendo un efecto positive en los ratones Mecp2 tras la administración de cysteamina no pudieron ser reproducidos en nuestro laboratorio (Roux et al., 2012). • Gabapentin, un modulador de GABA, mejoró los síntomas pero no tuvo ningún efecto en la supervivencia de los animales Mecp2. • El tratamiento con TDZD8 confirmó resultados los previos describiendo el efecto positivo de la inhibición de GSK3 en Rett. Se mejoró tanto la supervivencia como la sintomatología. Sin embrago, la eficiencia fue menor a la obtenida con SB216763. • Los antioxidantes estudiados en esta tesis mostraron una mejora del 30% en la sintomatología de Rett, siendo algunos también eficaces en la mejora de la supervivencia. • Las drogas epigenéticas evaluadas en esta tesis no mostraron ninguna mejora significativa en el tratamiento del síndrome de Rett. Conclusiones: El tratamiento con L-Dopa + Ddci es muy prometedor para sobreponer los defectos dopaminérgicos observados en el modelo preclínico del síndrome de Rett utilizado en esta tesis (Szczesna et al., 2014). Los nuevos datos indican que el inhibidor de GSK3, SB216763, es un posible fármaco para el tratamiento del síndrome de Rett. La droga ha mostrado propiedades neuroprotectoras mediante la mejora de la plasticidad sináptica y la reducción del daño oxidativo e inflamación, así como la mejora de las disfunciones motoras (Szczesna et al, artículo en preparación).

[spa] En este proyecto, caracterizamos sistemáticamente nuevas interacciones entre genes causantes y genes asociados a los cánceres de mama y colorrectal, con el objetivo de dar a conocer los mecanismos moleculares implicados en la biología del tumor. En total, presentamos 599 y 622 nuevas interacciones relacionadas con el cáncer de mama y colorrectal, respectivamente. A continuación, contextualizamos las interacciones descubiertas integrándolas con todos los datos de interacción disponibles en la literatura, construyendo el interactoma más completo asociado a cáncer de mama. Por último, ofrecemos validaciones iniciales sobre la alteración de la respuesta al daño del ADN como consecuencia de interacciones específicas, lo que sugiere nuevos roles de RFN20 y FAM84B, entre otros, como potenciadores de los mecanismos de reparación del ADN. En el segundo capítulo de la tesis precedimos nuevas dianas terapéuticas para el cáncer de mama basándonos en su similitud funcional y topológica con dianas de fármacos ya aprobados. A continuación medimos la redundancia y el solapamiento de vías o rutas de señalización con el fin de predecir nuevas combinaciones de fármacos para el cáncer de mama. Por último, realizamos una validación inicial y comprobamos que, por un lado, la inhibición de seis de las ocho dianas produce una disminución de la supervivencia de las células del cáncer de mama. Por otra parte, un 44% de las 23 nuevas combinaciones predichas interactúan de manera sinérgica entre sí. En conclusión, las estrategias presentadas en esta tesis ofrecen una perspectiva global para explorar los mecanismos moleculares que subyacen en enfermedades complejas, más allá del estudio de genes individuales., [eng] Network and systems biology disciplines could revolutionize the study of complex diseases by taking proteins back to their context, considering a much broader perspective of their environment without losing the molecular details. Cancer is an extremely complex disease, as innumerable proteins are involved in its development, thus network and systems biology disciplines could revolutionize its study. The objectives of the current thesis were (1) the systematic characterization of novel interactions between causative and associated breast and colorectal cancer genes to unveil the molecular mechanisms involved in tumor biology and (2) the prediction and initial validation of novel drug targets and drug combinations for breast cancer. We first collected genes related to breast and colorectal cancers onset and development and we selected two groups of genes from our starting pool: (1) driver/causative genes (genes key in breast and colorectal cancers, genes that cause genetic predisposition to the disease or key genes in important cancer pathways), and (2) associated genes (genes related to the disease that do not interact with causative genes and that are poorly studied). Then we performed several high-throughput yeast two-hybrid screenings (a pair-wise and a library screen for each cancer type) to detect novel interactions among these two groups of genes. Overall, we identified 599 non-redundant interactions between 49 drivers and 150 associated proteins in the BC study and 622 novel interactions among 42 drivers and 65 associated proteins for CRC. To contextualize the 599 novel BC-related interactions that our study had revealed, we integrated them with all the interaction data reported in the literature to build a comprehensive interactome associated to BC, obtaining a network of 11,226 interactions among 2,019 proteins. We next studied the structure of this network to detect the presence of potential functional modules, defined as groups of proteins that are densely interconnected and that are functionally homogenous. These modules were merged by similar functions to build subnetworks, so each subnetwork contains all the modules that share a biological function. We next focused our attention in the DNA repair subnetwork and in 15 associated genes that had been never related to this function. To know if these BC candidate genes are indeed regulating DNA repair, we carried out clonogenic assays and foci formation assays. Overall, six genes showed a relationship to cell survival after DNA damage, illustrating the power of our approach to generate novel mechanistic hypothesis. In the second part of the thesis we took into account functional redundancy and pathway crosstalk to predict novel drug targets and drug combinations for breast cancer. We predicted novel putative drug targets that resembled not only the functional but also the topological characteristics of known breast cancer targets. Eight candidate drug targets were experimentally tested by MTT assays and, interestingly, the inhibition of four out of the eight targets tested yielded a clear and consistent effect in the survival of breast cancer cells, while other two were slightly inhibiting the grow of some subtypes of BC cells. Next, we wanted to evaluate the applicability of the crosstalk inhibition metric for inferring novel breast cancer drug combinations. Overall, we predicted hundreds of promising novel drug-drug or novel target-drug combinations that either exceeded the crosstalk inhibition threshold of approved drug combinations or showed a synergistic/additive behavior. We carried out MTT assays to test a selected subset of 10 drug-drug combinations and 13 novel target-drug combinations. Overall, the detailed percentages of the results obtained were (1) 44% of drug combinations were synergistic (DCI50 ≤ 0.85), (2) 39% were of additive nature (0.85 < DCI50 ≤ 1.2) and (3) 17% were antagonistic (DCI50 > 1.2). In conclusion, the strategies presented in this thesis offer a global perspective to explore the molecular mechanisms underlying complex disease beyond individual genes and proteins, and can be easily applied to other cancer types and complex diseases.

Madangamines are a small group of marine alkaloids isolated from sponges of the order Haplosclerida collected by hand using scuba on reefs off Madang, Papua New Guinea. Madangamine A show significant in vitro cytotoxicity against murine leukemia (P388), human lung (A549), brain (U373) and breast (MCF-7). However, no bioactivity data have been reported for madangamines B-E, and further pharmacological research on this alkaloid group has been prevented by the minute amount of alkaloid samples. We present herein the enantioselective synthesis of (+)-madangamine D, which represents the first total synthesis of an alkaloid of the madangamine group. Using a phenylglycinol-derived bicyclic lactam as the starting enantiomeric scaffold we were able to control the stereochemistry of all three contiguous stereogenic centers on the BC ring system, while A ring was formed through a stereocontrolled cascade aminohydroxylation reaction, in which an “in situ generated” amine attacks an epoxide ring. This strategy provides a direct route to the diazatricyclic ABC core common to all madangamines, with the appropriate functionalization to allow the subsequent building of the macrocyclic D and E rings of these alkaloids. The saturated 14-membered D ring of madangamine D, leading to the tetracyclic ABCD system was efficiently constructed using a ring-closing metathesis reaction followed by a catalytic hydrogenation of the resulting double bond. The (Z,Z)-unsaturated 11-membered E ring, required to complete the synthesis of madangamine D was successfully assembled in a straightforward manner using a Z-stereoselective Wittig reaction followed by an intramolecular macrolactamization. Madangamine D showed significant in vitro cytotoxic activity against human colon HT29 (GI50 4.4 µg/mL) and pancreas PSN1 (GI50 7.4 µg/mL) cancer cell lines, but was inactive against lung NSCLC A549 and breast MDA-MB-231 cancer cell lines at the highest assayed concentration (10 µg/mL)., Las esponjas del orden Haplosclerida representan una importante fuente de alcaloides estructuralmente diversos pero biogenéticamente relacionados, siendo las madangaminas uno de los menos estudiados desde el punto de vista sintético. En 1994 fue aislada el primer alcaloide de este grupo, la Madangamina A de la esponja marina Xestospongia ingens1 y unos años más tarde se aislaron cuatro nuevos alcaloides, las madangaminas BE.2 Estructuralmente, las madangamines son alcaloides pentacíclicos y se caracterizan por presentar un núcleo diazatricíclico (anillos ABC) y dos puentes de carbonados. El anillo macrocíclico D es diferente en cada madangamina en tamaño, así como en el grado y la posición de insaturación, mientras que el anillo E es idéntico en todas ellas. En la presente Tesis Doctoral presentamos la síntesis enantioselectiva de ()-madangamine D,3 que ofrece por primera vez una muestra pura de este producto natural y constituye la primera síntesis total de un alcaloide de la grupo de las madangamines. Usando de una lactama bicíclica derivada del fenilglicinol como el scafold enantiomérico de partida, nuestro enfoque consiste en la construcción inicial del núcleo diazatricíclico ABC y la posterior construcción de los anillos macrocíclicos D y E. La lactama de partida 2 es fácilmente accesible por ciclocondensación de oxoester 1 con el (R)-fenilglicinol, en un proceso en donde se instala el primer estereocentro. El intermedio diazatríclico se prepara a partir de una lactama insaturada derivada de 2. En este proceso son claves una reacción de adición conjugada estereoselectiva, el cierre del anillo carbocíclico mediante metátesis, una alquilación estereoselectiva y finalmente cierre del anillo A por aminohidroxilación. La anulación de los anillos macrocíclicos se lleva a cabo mediante una reacción de cierre del anillo por metátesis (anillo D) y una olefinación de Wittig seguida de macrolactamización (anillo E). Los datos de RMN de 1H y 13C de nuestra madangamina sintética fueron coincidentes con los reportados para el producto natural. La madangamina D sintética muestra citotoxicidad in vitro contra las líneas celulares de cáncer HT29 de colon humano y PSN1 páncreas.

[spa] Las esponjas del orden Haplosclerida representan una importante fuente de alcaloides estructuralmente diversos pero biogenéticamente relacionados, siendo las madangaminas uno de los menos estudiados desde el punto de vista sintético. En 1994 fue aislada el primer alcaloide de este grupo, la Madangamina A de la esponja marina Xestospongia ingens1 y unos años más tarde se aislaron cuatro nuevos alcaloides, las madangaminas BE.2 Estructuralmente, las madangamines son alcaloides pentacíclicos y se caracterizan por presentar un núcleo diazatricíclico (anillos ABC) y dos puentes de carbonados. El anillo macrocíclico D es diferente en cada madangamina en tamaño, así como en el grado y la posición de insaturación, mientras que el anillo E es idéntico en todas ellas. En la presente Tesis Doctoral presentamos la síntesis enantioselectiva de ()-madangamine D,3 que ofrece por primera vez una muestra pura de este producto natural y constituye la primera síntesis total de un alcaloide de la grupo de las madangamines. Usando de una lactama bicíclica derivada del fenilglicinol como el scafold enantiomérico de partida, nuestro enfoque consiste en la construcción inicial del núcleo diazatricíclico ABC y la posterior construcción de los anillos macrocíclicos D y E. La lactama de partida 2 es fácilmente accesible por ciclocondensación de oxoester 1 con el (R)-fenilglicinol, en un proceso en donde se instala el primer estereocentro. El intermedio diazatríclico se prepara a partir de una lactama insaturada derivada de 2. En este proceso son claves una reacción de adición conjugada estereoselectiva, el cierre del anillo carbocíclico mediante metátesis, una alquilación estereoselectiva y finalmente cierre del anillo A por aminohidroxilación. La anulación de los anillos macrocíclicos se lleva a cabo mediante una reacción de cierre del anillo por metátesis (anillo D) y una olefinación de Wittig seguida de macrolactamización (anillo E). Los datos de RMN de 1H y 13C de nuestra madangamina sintética fueron coincidentes con los reportados para el producto natural. La madangamina D sintética muestra citotoxicidad in vitro contra las líneas celulares de cáncer HT29 de colon humano y PSN1 páncreas., [eng] Madangamines are a small group of marine alkaloids isolated from sponges of the order Haplosclerida collected by hand using scuba on reefs off Madang, Papua New Guinea. Madangamine A show significant in vitro cytotoxicity against murine leukemia (P388), human lung (A549), brain (U373) and breast (MCF-7). However, no bioactivity data have been reported for madangamines B-E, and further pharmacological research on this alkaloid group has been prevented by the minute amount of alkaloid samples. We present herein the enantioselective synthesis of (+)-madangamine D, which represents the first total synthesis of an alkaloid of the madangamine group. Using a phenylglycinol-derived bicyclic lactam as the starting enantiomeric scaffold we were able to control the stereochemistry of all three contiguous stereogenic centers on the BC ring system, while A ring was formed through a stereocontrolled cascade aminohydroxylation reaction, in which an “in situ generated” amine attacks an epoxide ring. This strategy provides a direct route to the diazatricyclic ABC core common to all madangamines, with the appropriate functionalization to allow the subsequent building of the macrocyclic D and E rings of these alkaloids. The saturated 14-membered D ring of madangamine D, leading to the tetracyclic ABCD system was efficiently constructed using a ring-closing metathesis reaction followed by a catalytic hydrogenation of the resulting double bond. The (Z,Z)-unsaturated 11-membered E ring, required to complete the synthesis of madangamine D was successfully assembled in a straightforward manner using a Z-stereoselective Wittig reaction followed by an intramolecular macrolactamization. Madangamine D showed significant in vitro cytotoxic activity against human colon HT29 (GI50 4.4 µg/mL) and pancreas PSN1 (GI50 7.4 µg/mL) cancer cell lines, but was inactive against lung NSCLC A549 and breast MDA-MB-231 cancer cell lines at the highest assayed concentration (10 µg/mL).

En la present Tesi Doctoral en primer lloc s’ha completat un estudi previ de reaccions aldòliques d’α-hidroxi metil cetones, tant per a grups protectors benzílics com silílics. Així, al Capítol 1 s’ha demostrat que la tria adequada del grup protector de l’α-hidroxi cetona i l’àcid de Lewis permet accedir a aldols 1,4-anti o 1,4-sin amb bons rendiments (5697%) i diastereoselectivitats en ocasions excel•lents (fins a rd 96:4), dins el context de l’aldòlica d’acetat. Les metodologies desenvolupades també s’han avaluat amb aldehids quirals en processos doblement asimètrics. La notable capacitat d’inducció asimètrica dels enolats de titani d’α-benziloxi metil cetones ha quedat demostrada per l’obtenció dels seus aldols amb unes diastereoselectivitats excel•lents, independentment de la configuració de l’aldehid. Fins i tot, un d’aquests aldols obtingut enantiomèricament pur s’ha utilitzat en la síntesi del fragment C12C16 de l’epotilona B. A més, una seqüència de reacció aldòlica-reducció desenvolupada anteriorment al grup s’ha aplicat a l’(S)-3-tert-butildimetilsililoxi-4-metil-2-pentanona per obtenir els corresponents triols 1,2-sin-2,4-sin amb rendiments excel•lents (9192%) i un control estereoquímic que depèn, majoritàriament, de la reacció aldòlica inicial (rd 80:2094:6). Al Capítol 2 s’ha demostrat la utilitat sintètica de les reaccions aldòliques d’enolats de titani d’α-hidroxi etil cetones desenvolupades anteriorment en el grup de recerca. Aquestes metodologies s’han aplicat amb èxit en la síntesi total de l’herboxidiè, contribuint a la construcció de gran part del seu esquelet carbonat i dels estereocentres requerits. La reacció aldòlica de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona i la seqüència d’aldòlica-reducció de l’(R)-2-tert-butildimetilsililoxi-3-pentanona han estat etapes clau en la síntesi dels fragments C1C9 (17%, deu etapes) i C10C19 (43%, set etapes), respectivament. La unió d’aquests fragments ha permès obtenir l’herboxidiè amb un 8% de rendiment global amb la seqüència lineal més llarga de catorze etapes. Després d’haver estudiat a fons les reaccions aldòliques d’enolats de titani d’α-hidroxi cetones, s’ha explorat la reactivitat d’aquests nucleòfils en altres processos de construcció d’enllaços CC. Al Capítol 3 s’ha desenvolupat l’addició de Michael de l’enolat de titani de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona a cetones α,β-insaturades, amb què s’han obtingut els corresponents adductes 1,3-anti-3,4-anti amb excel•lents diastereoselectivitats (rd ≥ 89:11). Partint del mateix nucleòfil, en aquest Capítol també s’ha iniciat un estudi d’addicions de Michael a nitro alquens. L’addició de l’enolat de titani de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona a l’(E)-4-metoxi-β-nitroestirè ha produït el corresponent adducte de Michael amb excel•lent diastereoselectivitat (rd ≥ 97:3). Aquests primers resultats són prou esperançadors i demostren l’interès sintètic que poden arribar a tenir aquestes reaccions, que actualment constitueixen una línia activa d’investigació al grup de recerca. Finalment, prenent com a punt de partida el caràcter biradicalari de determinats enolats de titani, en aquesta Tesi s’ha iniciat un estudi de la reactivitat d’aquests substrats en reaccions de formació d’enllaços CC i CO. Així, al Capítol 4 s’ha estudiat l’al•lilació d’N-acil oxazolidinones quirals amb al•lil estannans, amb què s’han obtingut els corresponents adductes amb un control estereoquímic excel•lent (rd ≥ 97:3). D’altra banda, en la constitució d’una nova línia d’investigació al grup, en el darrer Capítol també s’ha desenvolupat l’oxidació estereoselectiva d’N-acil oxazolidinones quirals amb TEMPO. S’ha demostrat que la utilització d’aquest radical estable permet l’oxidació dels corresponents enolats de titani i condueix als α-aminoxi derivats amb rendiments i diastereoselectivitats excel•lents (9095%, rd ≥ 93:7) i, a més, s’ha descrit l’aminoxilació estereoselectiva en la posició d’enolats conjugats. L’eliminació de l’auxiliar quiral i/o el trencament reductiu de l’enllaç NO han permès arribar a derivats sintèticament útils. Per últim, s’ha descobert que es pot assolir la hidroxilació directa d’aquests substrats a través de la reacció dels seus enolats de titani amb O2., The first Chapter of the present text deals with substrate-controlled titanium-mediated aldol reactions of chiral α-hydroxy methyl ketones. The appropriate choice of the Lewis acid and the protecting group in the α-hydroxy ketone gives access to either 1,4-anti or 1,4-syn aldol adducts in good yields (5697%) and diastereoselectivities up to ≥ 97:3 with a broad range of aldehydes. Furthermore, a sequential aldol reaction-reduction transformation from (S)-3-tert-butyldimethylsilyloxy-4-methyl-2-pentanone provides 1,2-syn-2,4-syn triols in excellent yields (9192%) and a stereochemical control which mostly relies on the aldol step of the sequence (dr 80:2094:6). The usefulness of these methodologies is proven in Chapter 2 with its application in the total synthesis of herboxidiene. Most of the carbon backbone and the required stereocentres are constructed through an aldol reaction of (S)-2-benzyloxy-3-pentanone and an aldol reaction-reduction sequence from (R)-2-tert-butyldimethylsilyloxy-3-pentanone, which are key steps in the synthesis of C1C9 fragment (17%, 10 steps) and C10C19 fragment (43%, 7 steps), respectively. Assembling of both fragments affords herboxidiene in 8% overall yield (14 steps, longest linear sequence). After a thorough study of aldol reactions of titanium enolates from α-hydroxy ketones, the reactivity of these nucleofiles is explored in other CC bond-forming reactions. In Chapter 3, the Michael addition of the titanium enolate of (S)-2-benzyloxy-3-pentanone to α,β-unsaturated ketones is developed, which provides 1,3-anti-3,4-anti adducts in excellent diastereoselectivities (dr ≥ 89:11). Finally, considering the biradical character of certain titanium enolates, in Chapter 4 the reactivity of such substrates in some CC and CO bond-forming reactions is investigated. Allylation of chiral N-acyl oxazolidinones with allyl stannanes is achieved and the corresponding adducts are obtained with excellent levels of stereocontrol (dr ≥ 97:3). Moreover, the stereoselective oxidation of chiral N-acyl oxazolidinones with TEMPO is described. The use of this stable radical leads to α-aminoxy derivatives in excellent yields and diastereomeric ratios (9095%, dr ≥ 93:7), and the stereoselective oxidation in the position of conjugate enolates is also accomplished. Elimination of the chiral auxiliary and/or reductive cleavage of the NO bond provides synthetically useful derivatives.

[spa] La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) inherente al trasplante hepático (TH), es la causa principal tanto de mal funcionamiento como del fallo primario del injerto hepático. Y si esto ocurre en hígados sanos, aun son mayores los casos de mal función o fallo primario cuando el injerto es esteatósico, ya que estos hígados toleran peor que los normales la lesión por I/R. De ahí que la esteatósis sea la causa principal del mayor número de órganos considerados no aptos para el trasplante, acentuando así la problemática de la falta de injertos hepáticos para TH. Por ello, es evidente la necesidad de desarrollar estrategias protectoras para minimizar los efectos adversos de la lesión por I/R en hígados esteatósicos. Por otro lado, el precondicionamiento (PC) isquémico basado en la inducción de breves periodos de I/R, reduce la lesión por I/R asociada a TH, pero se desconocen en gran parte sus mecanismos protectores. En la presente tesis se investigó el papel del AMP cíclico, del estrés del retículo endoplasmático y de las adipocitoquinas tales como la adiponectina, la resistina y la visfatina en la lesión por I/R en injertos hepáticos esteatósicos y no esteatósicos sometidos a TH, así como su implicación en los beneficios del PC. Además se evaluaron los mecanismos de protección de estrategias farmacológicas o quirúrgicas, como el PC capaces de modular el AMPc y la adiponectina en ambos tipos de injertos. Para el desarrollo de la presente tesis, se realizaron modelos de TH singénico y alogénico. La utilidad de estrategias dirigidas a modular AMPc en el trasplante de hígados esteatósicos no se había determinado previamente. En la presente tesis se evidencian los efectos perjudiciales del AMPc en los injertos hepáticos esteatósicos y se sugiere la utilidad clínica de estrategias que bloquean la acción del AMPc (tales como la inducción del PC o inhibidores de la adenilato ciclasa), para proteger a los injertos hepáticos esteatósicos frente a la lesión por I/R asociada al trasplante. Esta protección-mediada por el oxido nítrico-reduce el estrés oxidativo, el daño celular endotelial y las disfunciones microvasculares. Los beneficios de tales estrategias sobre el metabolismo energético en injertos esteatósicos fueron independientes del oxido nítrico. Además se demostró que el TUDCA es capaz de proteger sólo a los injertos hepáticos esteatósicos mediante un mecanismo independiente del estrés del retículo endoplasmático. Los mecanismos de protección del TUDCA cursan mediante una reducción en la expresión de PPARγ, lo cual a su vez activa la vía del TLR4, específicamente la vía del TRIF para proteger a los injertos esteatósicos frente a la lesión asociada al trasplante. Asimismo se evidencia por primera vez que la visfatina no está implicada en la vulnerabilidad de los hígados esteatósicos frente a la lesión por I/R en el trasplante hepático. Además se demostró que los injertos hepáticos esteatósicos están más predispuestos a una reducción en los niveles de adiponectina y resistina al someterlos a trasplante que los no esteatósicos. Los resultados obtenidos señalan que la adiponectina aumenta los niveles de resistina y esto a su vez favorece la activación de la vía PI3K/Akt, estableciendo entonces una posible vía de señalización. El tratamiento con adiponectina o resistina protegió a los injertos esteatósicos frente a la vulnerabilidad que presentan a la lesión inducida por I/R mientras que fue ineficaz en injertos no esteatósicos. En resumen se describen estrategias farmacológicas (inhibidores del AMPc, TUDCA, agonistas del TLR4, adiponectina y resistina) que son específicas para proteger a los injertos hepáticos esteatósicos sometidos a trasplante, y se refuerza el papel del PC como una estrategia quirúrgica promisoria que puede ejercer los mismos efectos protectores que las estrategias farmacológicas propuestas. Estos hallazgos podrían contribuir a nuevas aplicaciones del PC en la práctica clínica de los TH., [eng] In this thesis the role of cyclic AMP , the endoplasmic reticulum stress and adipocytokines such as adiponectin, resistin and visfatin injury in I/R in steatotic liver grafts and non- steatotic undergoing transplantation (TH) was investigated and their involvement in the benefits of the preconditioning (PC). Besides protection mechanisms pharmacological or surgical strategies, as the PC capable of modulating cAMP and adiponectin in both types of grafts were evaluated. The usefulness of strategies to modulate cAMP in steatotic liver transplantation has not been previously determined. In this thesis the harmful effects of cAMP in steatotic liver grafts are evident and clinical utility of strategies that block the action of cAMP (such as induction of PC or inhibitors of adenylate cyclase), is suggested to protect the grafts steatotic liver injury against I/R associated with the transplant. This protection - mediated nitric oxide reduces oxidative stress, endothelial cell damage and microvascular dysfunction. The benefits of such strategies on energy metabolism in steatotic grafts were independent of nitric oxide. In addition it was shown that TUDCA is able to protect only the steatotic liver grafts by a mechanism independent of endoplasmic reticulum stress. The mechanisms of protection by reducing TUDCA enrolled in PPARγ expression, which in turn activates TLR4 pathway, specifically TRIF pathway for steatotic grafts protect against transplant-associated lesion. Also evidenced for the first time that visfatin is not involved in the vulnerability of steatotic livers against injury by I/R in liver transplantation. It was further demonstrated that steatotic liver grafts are more prone to reduction in adiponectin and resistin when subjected to non- steatotic transplant. The results indicate that adiponectin increases resistin levels and this in turn promotes activation of the PI3K/Akt pathway, then establishing a possible signaling pathway. Treatment with adiponectin or resistin steatotic grafts protected against the vulnerability of the injury induced by I / R whereas it was ineffective in not steatotic grafts. Pharmacological strategies (cAMP inhibitors, TUDCA, TLR4 agonists, adiponectin and resistin) that are specific to protect steatotic liver grafts undergoing transplantation are described in brief, and the role of the PC is reinforced as a promising surgical strategy can exercise the same protective effects proposed that pharmacological strategies. These findings could contribute to new PC applications in clinical practice of TH. In terms of clinical application, these therapies might open new avenues for steatotic liver transplantation and improve the initial conditions of donor livers with low steatosis that are available for transplantation. Such therapies could also increase the use of numerous steatotic livers currently discarded for transplantation, thus reducing the risk of death of those patients on liver transplant waiting lists

Both immunological and non immunological factors are involved in chronic allograft nephropathy such as donor specific alloreactivity, chronic inflammation and nephrotoxicity induced by anticalcineurinics. Different degrees of nephrotoxicity are related to immunosuppression and to the level of inhibition of the different transporter proteins such as MDR1, MRP1 and MRP2. Those proteins could be subjected to genetic inter-individual variability thus modifying pharmacokinetics parameters. Furthermore, optimal immunosuppressive dose could be predicted by genotype characterization of MDR1, MRP1 or MRP2 genes. Polymorphisms in these genes have been related to immunosuppressive exposure, nephrotoxicity and renal allograft rejection. Those proteins have also been associated to immunological factors. Both MDR1 and MRP1 have been involved in T cell activation and also in dendritic cells (DCs) differentiation, migration and maturation. It has been hypothesized that ABC transporter proteins play a major role in drug efflux and also may be an underlying factor as an immunomodulator. Considering that many immunosuppressants are substrates and also inhibitors of this ABC transporter proteins, the hypothesis of this doctoral thesis is to evaluate if Pgp activity would participate in lymphocyte activation and if the polymorphisms of this protein in renal transplant recipients with different immunosuppressive regimen could have a functional role in the pharmacokinetics of the immunosuppressants. The main objective is to study the role of P-glycoprotein as an efflux pump and its contribution in the pharmacokinetics and pharmacogenetics of immunosuppressants. On the other hand, far from the well known role in drug exposition and nephrotoxicity, to improve the knowledge on its function in the alloimmunity responses. In the first study we compared Pgp expression and efflux activity by measuring Rho123 retention in lymphocytes stored under different conditions to evaluate the potential influence of any of the storing conditions on Pgp expression and functionality. To improve Pgp studies, especially multicentric ones, sampling strategies should be considered in order to optimize the sensitivity and reproducibility of efflux assays. There is no data which compares Pgp activity measured from fresh lymphocytes with cryo-preserved lymphocytes. Moreover, most authors do not specify under which conditions cells are preserved and stored before measuring Pgp activity. Here, we isolated lymphocytes from fresh venous blood from 12 healthy volunteers and four storage conditions of lymphocytes were used. 1) Fresh lymphocytes (Fresh/Non-frozen) (F/NFr); 2) Lymphocytes frozen immediately after the extraction (Fresh/Frozen) (F/Fr); 3) Lymphocytes isolated within 24 hours after the extraction (Non-fresh/Non-frozen) (NF/NFr); 4) And lymphocytes isolated within 24 hours after the extraction and immediately frozen (Non-fresh/Frozen) (NF/Fr). The objective of the second study was to investigate the association of different ABCB1 polymorphisms (C3435T, G2677T, C1236T and T129C) with Pgp activity and exposure of different immunosuppressive drugs in renal transplant patients from eight different centers. This substudy of pharmacogenomics was part of the Symphony study. The main objective of the Symphony trail was to establish the differences on MPA and its metabolites exposure among the four immunosuppressive groups: MMF in combination with normal or low doses of CsA, low doses of Tac and low doses of SRL. The study was evaluated in seventy patients: CsA (n=30), tacrolimus (n=13) and sirolimus (n=23). For the pharmacokinetic analysis, the AUC0-12 of all immunosuppressants was compared at each time along the follow-up. For this purpose, 11 blood samples were collected for each point: before the first MMF administration of the day and up to 12h post-dose. To perform the study, patients were genotyped for SNPs in ABCB1 gene and moreover, Pgp activity was evaluated in PBMCs using the Rho123 efflux assay. Considering earlier studies in our group which describes the in vivo impact of the association of Rapa (mTORi) with two calcineurin inhibitors (CsA and Tac) on Pgp function and the involvement of Pgp in this immunosupressor-related renal toxicity, in the next study, we analyzed the activity of Pgp on different T-cell subsets and we studied the effects of the same immunosuppressants in monotherapy and associated with rapamycin. Rho123 uptake, efflux and kinetic of extrusion in CD4+ and CD8+ subsets of peripheral blood mononuclear cells isolated from eight healthy volunteers were measured. We also studied the antigen-specific memory T-cell responses by measuring T-cell proliferation and cytokine secretion using an allogeneic mixed lymphocyte reaction., En la nefropatía crónica del aloinjerto renal (NCT) se implican factores aloinmunes y no aloinmunes tales como la aloreactividad donante específica, inflamación crónica y nefrotoxicidad inducida por los anticalcineurínicos. La nefrotoxicidad varía en función de la combinación de los inmunosupresores. Así mismo, el diferente grado de nefrotoxicidad podría estar relacionado con el grado de inhibición de las diferentes proteínas transportadoras (MDR1, MRP1 y MRP2) que son las responsables de afluir el fármaco hacia el exterior de las células. Considerando la importancia del papel de éstas proteínas, las diferentes variantes genéticas de los genes que las codifican y su función, pueden afectar a la variabilidad interindividual con sus consecuencias en la farmacocinética de muchos fármacos. La monitorización del genotipo de los genes MDR1, MRP1 y MRP2, así como también su función, podría predecir la dosis óptima de los inmunosupresores en receptores de trasplante renal y la dosis inicial que necesita cada paciente individual para obtener la inmunosupresión adecuada. Los polimorfismos de estos genes están relacionados con la exposición al fármaco, la nefrotoxicidad y el rechazo. Estas proteínas también se asocian a factores inmunológicos. Tanto MDR1 como MRP1 juegan un papel importante en la activación de la célula T y también en la diferenciación y maduración de la célula dendrítica. El papel de estas proteínas transportadoras va más allá de una bomba de extrusión ya que se conoce que participan en la respuesta inmune siendo una nueva diana terapéutica para la inmunosupresión. El principal objetivo fue estudiar el rol de la P-Glicoproteína (MDR1/Pgp) tanto como una bomba transportadora de fármacos como su contribución en la farmacocinética y farmacogenética de los inmunosupresores. También se estudió el rol de Pgp en la respuesta aloinmune. En un primer estudio, se comparó la expresión de Pgp y la actividad de eflujo mediante el ensayo de Rodamina (Rho123) en linfocitos de voluntarios sanos guardados en diferentes condiciones para evaluar la influencia que podían tener estas condiciones de almacenaje sobre la expresión y funcionalidad de Pgp. Se puso a punto un método para la medida de actividad de Pgp en linfocitos T, para poder ser aplicada en muestras de linfocitos de pacientes trasplantados renales. Se aislaron linfocitos de la sangre de 12 voluntarios sanos y se evaluó las diferencias de expresión de Pgp a nivel de RNA y proteína, entre linfocitos procesados y guardados en diferentes condiciones de almacenaje. En un segundo objetivo se analizó la asociación de diferentes polimorfismos (SNPs) de Pgp/ABCB1 (C3435T, C1236T, G2677T i T129C) con la actividad de Pgp y la exposición a diferentes fármacos inmunosupresores en 70 pacientes de trasplante renal de diferentes hospitales. En un estudio in vivo donde se describe un modelo de nefrotoxicidad en ratas, se estudió el papel de Pgp en la asociación de Rapa (mTORi) con dos inhibidores de calcineurina (CsA y Tac). A partir de este trabajo, se realizó el siguiente estudio donde se analizó la actividad de Pgp in vitro en diferentes sub-poblaciones de célula T y los efectos de los mismos inmunosupresores solos y asociados con Rapamicina.

[spa] Los tratados médico-farmacológicos del toledano Ibn Wāfid (siglo XI) tuvieron considerable influencia en la medicina árabe y judía medieval. El presente trabajo está dedicado a la parte de los simples de origen animal en la versión hebrea (del siglo XV) de su tratado Kitāb al-Adwiyah al-Mufradah, "Libro de los Medicamentos Simples". El estudio está basado en el ms. Moscú Guenzburg 766/2, combinado con una meticulosa comparación con otras versiones del tratado, principalmente la latina y la catalana. El trabajo consiste de los siguientes capítulos: 1. Introducción, que incluye novedades codicológicas y paleográficas, metodología y una biografía de Ibn Wāfid. 2. Edición crítica del texto. 3. Traducción comentada. 4. Capítulo donde se intenta rastrear el origen del texto hebreo y su relación con las versiones en otras lenguas. Entre otras, se presenta también la conclusión innovadora de que probablemente existía algún vínculo entre la versión hebrea y la versión catalana del tratado. 5. Capítulo que analiza la lengua en el texto, que contiene curiosos elementos árabes, hebreos y romances. Se presta especial atención al registro peculiar del traductor, excepcionalmente arabizado 6. Gosario que se centra en la terminología médico-anatómica, e incluye términos hebreos difíciles o ambiguos, algunos no recogidos por ninguna otra fuente. 7. Conclusiones, índices, anexos y una lista bibliográfica. El estudio, de corte multidisciplinar, pretende ser de interés para arabistas, hebraístas, romanistas e investigadores de la historia de la medicina árabe. El trabajo concierne también otras áreas de conocimiento, como la botánica, la zoología y la traductología., [eng] The medical-pharmacological treatise of Ibn Wafid of Toledo (XI century) had a considerable influence on Arab and Jewish medieval medicine. The present paper relates to the Hebrew version of Kitāb al-Adwiya al-Mufrada (The Book on Simple Drugs), in particular, the section dealing with drugs of animal origin. The study is based on the Moscow Guenzburg 766/2 manuscript, along with a meticulous comparison with other versions of the treatise, especially the Latin and Catalan versions. The paper consists of the following chapters: 1. An introduction, which includes codicological and paleographical new findings, methodology and a biography of Ibn Wāfid. 2. A critical edition of the text. 3. A commentated translation. 4. A chapter which attempts to track down the origin of the Hebrew text and its relation with versions in other languages. One of the new conclusions presented is that apparently a linkage existed between the Hebrew and the Catalan versions of the treatise. 5. A chapter that analyzes the language in the text, which contains curious Arab, Hebrew and Romance elements. Special attention is paid to the peculiar language of the translator, which is exceptionally arabicized. 6. A medical-anatomical glossary focusing on Hebrew terms that are of obscure or difficult interpretation, some of which do not appear in any other source. 7. Conclusion, indexes, appendices and a bibliography. The research, being of a multidisciplinary character, aspires to be of interest to researchers of Hebrew, Arab and Romance Philology, as well as for investigators of the History of Arabic Medicine. The study also concerns other fields of knowledge such as Zoology, Botany and Translation Studies.

El principal factor desencadenant de la neurodegeneració que caracteritza la malaltia d’Alzheimer (MA) és el pèptid β-amiloide (Aβ). La formació incrementada d’aquest pèptid i la seva agregació es troben a l’inici d’una cascada de processos neurotòxics que culminen amb una disfunció neuronal generalitzada i mort neuronal. Actualment, es troben en fase clínica diferents candidats a fàrmacs anti-Alzheimer denominats “modificadors de la malaltia” que van dirigits a inhibir la formació o l’agregació de l’Aβ. S’espera que aquests compostos puguin prevenir o frenar la neurodegeneració de la MA. L’arsenal terapèutic actual per al tractament de la MA continua estant dominat per un grup de fàrmacs que van estar desenvolupats per a tractar la seva simptomatologia, la qual apareix com a conseqüència de dèficits de diferents neurotransmissors, especialment d’acetilcolina (ACh), al sistema nerviós central. Concretament, quatre dels cinc fàrmacs actualment comercialitzats per al tractament de la MA són un grup d’inhibidors de l’enzim acetilcolinesterasa (AChE), enzim responsable de la hidròlisi de l’ACh. Recentment s’ha demostrat que l’AChE es pot unir a l’Aβ accelerant la seva agregació, augmentant-ne la neurotoxicitat i promovent el deteriorament cognitiu. A través del denominat lloc perifèric, el qual es troba a l’entrada d’una gorja catalítica d’uns 20 Å de longitud, al fons de la qual es troba el lloc catalític de l’enzim. Així, el bloqueig simultani amb ambdós llocs d’unió (actiu i perifèric) ha portat al desenvolupament dels denominats inhibidors d’AChE de lloc d’unió dual, els quals són candidats molt prometedors a fàrmacs anti-Alzheimer amb potencial per modificar positivament el curs de la malaltia. D’altra banda, degut al caràcter multifactorial de l’etiologia de la MA s’està començant a considerar el desenvolupament de nous compostos multipotents capaços d’interaccionar amb diferents dianes biològiques involucrades en la malaltia com a única via per a aconseguir incidir eficientment sobre la malaltia, com ara, l’estrès oxidatiu degut a la sobreproducció d’espècies reactives d’oxigen (ROS). S’ha demostrat que els compostos quelants d’ions metàl•lics són capaços d’inhibir la producció de ROS i s’està considerant la utilització d’antioxidants naturals contra processos en els quals està implicat l’estrès oxidatiu, com és el cas de la MA., The main factor triggering the process of neurodegeneration characteristic of Alzheimer's disease (AD) is the so-called β-amyloid peptide (Aβ). The increased formation of this peptide and its aggregation are placed at the beginning of a cascade of neurotoxic processes culminating in widespread neuronal dysfunction and death. Currently, there are several "disease-modifying" anti-Alzheimer drug candidates in clinical trials aimed at inhibiting the formation or aggregation of Aβ. It is expected that these compounds can prevent or slow the neurodegeneration of AD. The current treatment available for the treatment of AD is still dominated by a group of drugs that were developed to treat its symptoms, which appear as a result of the decrease in the production of various neurotransmitters, particularly acetylcholine (ACh) at the central nervous system. Consequently, the use of cholinomimetic agents capable to compensate this deficit should reduce cholinergic symptoms of AD. In fact, four out of the five drugs currently marketed for the treatment of AD are a group of inhibitors of the enzyme acetylcholinesterase (AChE), the enzyme responsible for the hydrolysis of ACh at the synapses, which increase levels of the neurotransmitter, thus reducing the symptoms of AD. Recently, it has been demonstrated that the enzyme AChE can bind to Aβ accelerating its aggregation, increasing the neurotoxicity and promoting cognitive decline. The binding site of AChE to Aβ is the so-called peripheral site, which is located at the entrance of a catalytic gorge of about 20 Å length, at the bottom of which the catalytic site of the enzyme is placed, where the hydrolysis of ACh takes place. Thus, the blockade of the peripheral site of AChE should lead to an inhibition of Aβ aggregation and of the neurodegenerative cascade. In addition, the particular architecture of the enzyme where the active and peripheral sites are separated but close enough to allow a molecule to simultaneously interact with the two binding sites has led to the development of dual binding site AChE inhibitors, which are very promising anti-Alzheimer drug candidates expected to positively alter the course of disease. Moreover, due to the multifactorial nature of the etiology of AD, development of multipotent compounds capable of interacting with different biological targets involved in the disease is beginning to be considered as the only way to achieve efficient impact on the course of the disease. Aβ aggregation plays a crucial role in the pathogenesis of AD, inducing processes in the neurodegenerative cascade and oxidative stress due to overproduction of reactive oxygen species (ROS). It also appears that the Cu2+ and Fe3+ ions are capable of generating ROS, after binding to the Aβ For these reasons, the metal ions and oxidative stress are interesting targets to modulate by multipotent anti-Alzheimer drug candidates. Thus, it has been shown that the compounds capable of chelating metal ions are able to inhibit the production of ROS and the use of natural antioxidants is also being considered to block the oxidative stress involved in Aβ. The aim of the present PhD is to develop multipotent compounds capable to interact with different biological targets involved in AD, namely cholinesterases, Aβ and oxidative stress, in order to block its neurodegenerative cascade.

The implementation of the subject Pharmacology and Toxicology in R+D+i in the Pharmacy Degree, has led to the launch of a new methodological approach and teaching performance with the aim of developing the generic skills of the University of Barcelona (e.g., self-learning, team-working). An additional objective was students' integration of knowledge from different subjects in the degree which form the basis of the preclinical and clinical development of a drug. For this purpose, the teaching strategy used in the development of the subject was based on: 1) re-developing the content that students had been taught previously or were being taught in the same semester as a part of other subjects, and framing them in the environment of the pharmaceutical industry, 2) introducing new and previously unseen contents to do with drug development and toxicology, 3) developing a battery of activities to be undertaken by teams of students relating to the R+D+i of a particular drug. During the development of these activities, students have to acquire generic skills in addition to the subject-specific skills. The results obtained from the student survey give us grounds for satisfaction and allow us to consider that we have reached the goal of improving students' learning in Pharmacology and Toxicology applied to drug development in the pharmaceutical world today.

[cat]Aquest treball estableix el catàleg etnoflorístic de Mallorca. És el primer estudi etnobotànic complet sobre l’illa i contribueix a incrementar les dades etnobotàniques disponibles dels territoris del domini lingüístic català. L’estudi es basa en 235 informants d’una mitjana d’edat de 76 anys i abraça 75 nuclis de població de tots els 53 municipis mallorquins. El 97% dels informants són autòctons de l’illa, el 89% són jubilats, i el 57% són homes. S’ha recollit majoritàriament informació de persones nascudes entre el 1931 i el 1940. La mitjana de citacions d’ús per informant és de 42,31 i el factor de consens d’informants (FIC) per a tot Mallorca és 0,94, un valor molt proper al consens total (1). La informació obtinguda de les entrevistes ha estat analitzada des del punt de vista botànic i etnogràfic, i s’ha fet servir el gestor de dades del grup EtnobotCat, ideat en el transcurs d’aquest estudi a partir de versions anteriors d’altres bases de dades etnobotàniques del nostre equip. El total de tàxons recollit de les entrevistes és de 517, i les citacions globals (amb consens u, és a dir, citades per almenys un informant) per a cada categoria d’ús són 1900 per a medicinals, 2872 per a alimentàries i 2235 per a altres usos. S’han recollit un total de 600 dades etnogràfiques no referents directament als vegetals. Dels 517 tàxons que conformen el catàleg etnoflorístic, majoritàriament fanerògames i hemicriptòfits de tipus biològic, un 52% són silvestres i la resta cultivats o obtinguts al comerç. L’índex d’etnobotanicitat és del 28%, o sigui, els informants han qualificat prop d’un terç de la flora de Mallorca com a útil. S’han recopilat 1401 noms populars, dels quals se n’identifiquen 250 de catalans no documentats en les obres incloses al projecte Recull de noms catalans de plantes. S’han recopilat 255 tàxons útils en medicina humana (137 de silvestres), amb un total de 1811 citacions d’ús amb un consens de tres informants. S’han recopilat 159 mescles de plantes (110 tàxons i 662 citacions d’ús), també amb activitat medicinal, majoritàriament anticatarral. Per a les dades referides a la medicina animal, els informants citen 92 remeis veterinaris referits a 53 tàxons. D’aquests remeis, 52 són exclusius per a animals i 40 són compartits amb la medicina humana. Del total de tàxons citats com a alimentaris en humans (199), el 67% són cultivats o comprats, i la resta, silvestres. S’han recollit 103 citacions d’ús de vegetals en alimentació animal per a 62 tàxons. Per als usos que no són ni alimentaris ni medicinals els informants han citat 351 tàxons i 1142 reports d’ús únics. El grau de novetat de l’etnomedicina mallorquina, després de fer un buidatge de més de 200 obres amb informació d’interès etnobotànic d’àmbit majoritàriament mediterrani, és força alt per a ser un estudi etnobotànic tan actual, car consisteix en 38 tàxons poc citats i 306 reports d’ús que no apareixen o són recollits en menys de tres obres de referència. Els estudis etnobotànics com aquest poden ser una eina molt útil per a les administracions en salut pública per tal de facilitar i millorar la detecció i prevenció d’interaccions i altres problemes resultants de combinar plantes medicinals i medicaments de síntesi, i també per a encoratjar la seguretat en la prescripció i el consell farmacèutic per part dels professionals de la salut. L’interès principal de portar a terme un estudi etnobotànic de Mallorca ha estat el de contribuir a conèixer l’ús tradicional que es fa de les plantes de l’illa i valorar els beneficis que es poden extraure d’aquests sabers, aplicats al present i futur de la societat estudiada., [eng]This work is a contribution to the ethnobotany of Mallorca. This is the first approach in this field entirely based on interviews with local people. We spoke with a total of 235 informants with a mean age of 76, covering 75 villages in all the 53 municipalities of Mallorca. The data collected has been analyzed from the botanical and ethnographical point of view, and managed using an online database designed in the course of this study starting from earlier versions developed in our research group, EtnobotCat. The organisation of the data into groups of three, for example, the categories of use, the results of the discussion and consensus facilitates both the design and the systematization of data analysis. The basic unit of the analysis is the use report, and the information has been organized into two catalogues (taxa and mixtures), and additional ethnographic data referred to plants has also been considered. The total number of collected taxa from the interviews is 517, and the overall citations (with consensus of one, i.e. cited by at least one informant) for each category of use are 1900 for medicinals, 2872 for food and 2235 for other uses. Moreover, we have collected a total of 600 ethnographic data not directly related to the plants. The main interest of carrying out an ethnobotanical study of Mallorca has been to contribute to the knowledge of the traditional use of plants of the island and appreciate the benefits of this knowledge, applied to the present and future of our society.

[eng] The work showed in this Thesis has been part of the “5-HT7 and neuropathic pain” project in the pharmaceutical company Esteve. Thus, the aim of this Thesis was in line with the goal of the 5-HT7 project at Esteve, focused on drug discovery of 5-HT7 receptor ligands for the treatment of neuropathic pain. Taking the advantage of a genetic approach (5-HT7 receptor knockout mice) and pharmacological tools (5-HT7 receptor ligands) we investigated at the preclinical level the role of 5-HT7 receptors in nociception and the therapeutic interest of 5-HT7 receptor ligands on pain treatment. The 5-HT7 receptor ligands used were SB-258719 and SB-269970 as 5- HT7 receptor antagonists, and AS-19, MSD-5a, E-55888 and E-57431 as 5-HT7 receptor agonists. E-55888 and E-57431 developed by Esteve were described for the first time and their binding profile and functionality (cAMP formation) were examined. In vivo behavioural studies were performed in mice and rats subjected to nociceptive, inflammatory, neurogenic or neuropathic pain conditions. Our results showed that 5-HT7 receptors per se were not involved in the nociceptive response to a normally noxius stimulus, although when co-activated together with opioid receptors potentiated the opioidergic analgesic response in nociceptive pain conditions. Indeed, 5-HT7 receptor knockout and wild-type mice showed similar sensitivity to a noxious heat stimulus, and systemic administration of the 5-HT7 receptor agonist E-55888 or the 5-HT7 receptor antagonist SB-258719 showed no effects on acute nociceptive pain using the tail flick test in mice. However, the 5-HT7 receptor agonist E-55888 enhanced the morphine-induced analgesia in this test and this potentiation was significantly reversed by the 5-HT7 receptor antagonist SB-258719. On the other hand, we studied the role of 5-HT7 receptors in pain conditions involving central sensitization. We showed that the 5-HT7 receptor agonists AS-19, E-55888 and E-57431 inhibited capsaicin-induced mechanical hypersensitivity, nerve injury-induced mechanical and thermal hypersensitivity and reduced the phase II formalin-induced nociception. In contrast, a promotion of mechanical hypersensitivity after administration of the 5-HT7 receptor antagonists SB-258719 and SB-269970 was observed. This reduction of hypersensitivity by agonists and promotion of hypersensitivity by antagonists was reversed by antagonists and agonists, respectively. It is important to note that effectiveness of the treatment with 5-HT7 receptor agonists was not masked by non-specific motor effects, as no motor incoordination was found in the rota-rod test at the doses used and no tolerance to the effect was evidenced following repeated systemic administrations. The antinociceptive effects exerted by systemic 5-HT7 receptor agonists seemed to be mediated by 5-HT7 receptors localized in the spinal cord. We found that intrathecal administration of the 5-HT7 receptor agonist E-57431 inhibited mechanical hypersensitivity secondary to capsaicin injection and nerve injury-induced mechanical hypersensitivity. In contrast, a pronociceptive effect was observed after local intraplantar injection of the selective 5-HT7 receptor agonist E-57431 in the capsaicin model. Thus, the antinociceptive role mediated by central 5-HT7 receptors seems to predominate over their pronociceptive role at the periphery, resulting in an overall analgesic effect when 5-HT7 receptor agonists are administered by a systemic route. In line with these spinal antinociceptive effects, we found an increased immunoreactivity of 5-HT7 receptors in the ipsilateral dorsal horn of the spinal cord in sciatic nerve-injured mice. This increased 5-HT7 receptor expression in the dorsal horn induced by nerve injury could represent a physiological, compensatory, protective spinal mechanism relevant to the control of nociception in neuropathic pain conditions. We observed that 5-HT7 receptors co-localized with GABAergic neurons in the ipsilateral dorsal horn of the spinal cord. Therefore, we suggested that an indirect action through activation of 5-HT7 receptors localized on inhibitory interneurons may be responsible of the antinociceptive effects observed after administration of 5-HT7 receptor agonists. Finally, using 5-HT7 receptor knockout mice, we demonstrated that the 5-HT7 receptor agonists AS-19, E-55888 and E-57431 exerted in vivo target specific effects on pain control. We observed that systemic administration of these 5-HT7 receptor agonists reduced phase II formalin-induced nociception in wild-type but not in 5-HT7 receptor knockout mice. Taken together, these data add a piece of knowledge to the role played by 5-HT7 receptors in the control of pain and point to a new potential use of 5-HT7 receptor agonists as promising drugs for the treatment of neuropathic pain., [cat] El treball mostrat en aquesta Tesi ha format part del projecte “5-HT7 i dolor neuropàtic” de l’empresa farmacèutica Esteve. Per tant, els objectius d’aquesta Tesi estan en línea amb l’objectiu del projecte 5-HT7 d’Esteve focalitzat en el descobriment de compostos amb afinitat pel receptor 5-HT7 pel tractament del dolor neuropàtic. A partir de l’aproximació genètica amb l’ús de ratolins genoanul•lats pel receptor 5-HT7 i d’eines farmacològiques com compostos amb afinitat pel receptor 5-HT7, vàrem investigar a nivell preclínic el paper dels receptors 5-HT7 en el dolor i l’interès terapèutic dels lligands del receptor 5-HT7 en dolor. Entre els compostos utilitzats hi trobem el SB-258719 i el SB- 269970 com antagonistes pel receptor 5-HT7, i el AS-19, MSD-5a, E-55888 i el E-57431 com agonistes pel receptor 5-HT7. E-55888 i E-57431 van ser descrits per primera vegada i es va estudiar el seu perfil d’afinitat, selectivitat i funcionalitat. Es van realitzar estudis de comportament in vivo en ratolí i rata sotmesos a unes condicions de dolor nociceptiu, inflamatori, neurogènic i neuropàtic. Els nostres resultats van mostrar que els receptors 5-HT7 per si mateixos no estaven implicats en la resposta a un estímul nociu, mentre que sí interaccionen amb el sistema opiodèrgic en condicions de dolor nociceptiu. Ratolins genoanul•lats pel receptor 5-HT7 van mostrar la mateixa sensibilitat enfront un estímul tèrmic nociu. L’administració sistèmica de l’agonista del receptor 5-HT7 E-55888 o l’antagonista del receptor 5-HT7 SB-258719 no van mostrar efecte en el dolor agut nociceptiu. En canvi, vàrem observar que els efectes antinociceptius de la morfina per via oral obtinguts en resposta a l’estímul tèrmic nociu del tail-flick, eren potenciats amb l’administració sistèmica conjunta de l’agonista del receptor 5-HT7 E-55888. Aquesta potenciació va ser revertida al mateix temps amb la coadministració de l’antagonista del receptor 5-HT7 SB-258719. També vàrem estudiar el paper dels receptors 5-HT7 en condicions de dolor i sensibilització central. L’administració sistèmica d’agonistes selectius pel receptor 5-HT7 inhibia la hipersensibilitat mecànica induïda per capsaicina, la hipersensibilitat mecànica i tèrmica induïda per la lesió del nervi ciàtic, i el dolor induït per la fase II del model de la formalina. Això suggeria la implicació dels receptors 5-HT7 en condicions de sensibilització central. En canvi, es va observar una promoció de la hipersensibilitat mecànica amb els antagonistes del receptor 5-HT7. Tant els efectes dels agonistes i antagonistes del receptor 5-HT7 es van revertir amb la coadministració d’antagonistes i agonistes del receptor 5-HT7, respectivament. És important senyalar que les dosis amb eficàcia analgèsica dels agonistes del receptor 5-HT7 eren inferior a les dosis que produïen efectes adversos amb el test del rota-rod. A més, no es va observar tolerància de l’efecte analgèsic amb l’administració de dosis repetides de l’agonista del receptor 5-HT7 E-57431. L’efecte analgèsic obtingut amb l’administració sistèmica dels agonistes pel receptor 5-HT7 semblava ser degut a l’activació de receptors 5-HT7 localitzats a nivell espinal. Vàrem trobar que l’administració intratecal de l’agonista del receptor 5-HT7 E-57431 inhibia la hipersensibilitat mecànica secundària a la injecció de capsaicina i la induïda per la lesió del nervi ciàtic. En canvi, es va observar un increment de la hipersensibilitat mecànica induïda per capsaicina amb la injecció local intraplantar de l’agonista del receptor 5-HT7 E-57431. En resum, l’efecte antinociceptiu obtingut a través de l’activació dels receptors 5-HT7 a nivell espinal sembla predominar respecte l’efecte pronociceptiu de la perifèria quan s’administra sistèmicament un agonista pel receptor 5-HT7. En línea amb l’efecte antinociceptiu observat a nivell espinal, vàrem trobar un increment de la immunoreactivitat dels receptors 5-HT7 de l’asta dorsal de la medul•la espinal en ratolins amb lesió del nervi ciàtic. Aquest increment en l’expressió del receptor 5-HT7 en l’asta dorsal induït per la lesió del nervi podria representar un mecanisme espinal fisiològic, compensatori i protector rellevant pel control de dolor en condicions de dolor neuropàtic. Vàrem observar una col•localització dels receptors 5-HT7 en cèl•lules GABAèrgiques. En aquest sentit, l’activació dels receptors 5-HT7 col•localitzats en interneurones inhibitòries de l’asta dorsal de la medul•la espinal podria ser el mecanisme d’acció implicat en els efectes antinociceptius observats amb els agonistes del receptor 5-HT7. Finalment, utilitzant ratolins genoanul•lats pel receptor 5-HT7, vàrem demostrar que els agonistes pel receptor 5-HT7 AS-19, E-55888 i E-57431 exercien efectes diana específics em el control de dolor. L’administració subcutània d’aquests agonistes pel receptor 5-HT7 reduïren la nocicepció induïda per formalina de la fase II en ratolins salvatges però no en ratolins genoanul•lats, suggerint una especificitat dels efectes obtinguts in vivo a través del receptor 5-HT7. Aquest treball aporta un millor coneixement del paper del receptor 5-HT7 en el control del dolor i suggereix un nou potencial ús terapèutic dels agonistes pel receptor 5-HT7 com a fàrmacs prometedors pel tractament del dolor neuropàtic.

Despite a renewed impetus on bringing together efforts to wipe malaria from the globe, the truth is that this ancient disease remains one of the principal threats to child survival in vast areas of the world. The existing control measures are largely insufficient to reduce globally the malaria burden, and as of today, malaria remains endemic in more than 100 countries, where at least half of the world's population live exposed to the risk of being infected. Indeed, the burden of malaria morbidity and mortality continues to be unacceptably high, with more than 250 million clinical episodes and at least one million deaths per year. While morbidity due to malaria affects all age groups and is scattered throughout the world, Sub-Saharan Africa concentrates the brunt of the malaria deaths, which overwhelmingly occur in children under five years of age infected with P. falciparum. The exciting and almost palpable perspective of an effective malaria vaccine, added to the promotion of innovative control strategies such as intermittent preventive treatment for infants or pregnant women, have in the recent years centred the scientific discussions regarding the approach to malaria control. However, in contrast to these innovative perspectives, malaria control has remained in the last two decades essentially dependent on the early identification and prompt treatment of clinical malaria cases and the reduction of man-vector contact. Unless there is a major renewal, optimisation and scale-up of the antimalarial arsenal and strategies, malaria will continue to dictate the health status of the world, and eradication will not be achievable in a realistic timeframe. As malaria is a life-threatening infection, a fundamental requirement for its adequate control is the availability of effective antimalarial drugs. The first paper in this thesis describes a large randomised clinical trial (around 1500 children) performed in five different African countries to assess the non-inferiority of a novel combination, dihydroartemisinin-piperaquine, produced under strict good manufacturing practices, when compared to the standard combination therapy AL, for the treatment of uncomplicated malaria in African children under the age of five years. In the second paper, we describe the results of another large (around 900 patients) randomised clinical trial in which we assessed in 5 different African countries the non-inferiority of a new, paediatric-suited cherry-flavoured, dispersible formulation of AL, when compared to standard crushed AL tablets, for the treatment of uncomplicated malaria in children younger than 12 years of age. The results of these two trials, reflected in paper 1 and paper 2 of this thesis, bring to the malaria community public-health relevant data on alternatives to the currently limited antimalarial drug arsenal. The third paper in this thesis describes the clinical presentation of severe malaria in a rural Mozambican Hospital, and the associated risk factors for a negative outcome. It also presents minimum community based incidence rates, a useful indicator of the malaria burden in the area. Finally, the fourth paper addresses the relationship between severe malaria and bacterial invasive disease in children younger than 5 years admitted to a Manhiça's rural hospital, Mozambique. Malaria is an ancient disease of terrible consequences for mankind. All efforts devised to diminish the burden that malaria imposes in endemic areas need to be embraced and brought together on a coordinated manner to fight this infection from all possible fronts. Understanding the clinical determinants of the infection and its relation with other coexistent infectious diseases will give an insight to the basic pathophysiology of malaria, and thus guide appropriate management strategies. New highly effective drugs, and their paediatric-orientated formulations, need to be developed and made available to those most at need., A pesar del renovado afán por eliminar la malaria de la faz de la tierra, esta histórica enfermedad se mantiene como uno de los principales peligros para la salud infantil en amplias zonas del mundo. Las medidas de control existentes son claramente insuficientes a la hora de reducir globalmente el impacto de esta enfermedad, y a día de hoy la malaria es endémica en más de 100 países en dónde más de la mitad de la población mundial está expuesta al riesgo de infectarse. De hecho, la carga de esta enfermedad en términos de morbilidad y mortalidad persiste inaceptablemente alta con, anualmente, más de 250 millones de episodios clínicos y cerca de un millón de muertes. Mientras que la enfermedad clínica puede afectar a cualquier grupo de edad, la mortalidad por malaria se ve esencialmente circunscrita a los niños menores de cinco años infectados por P. falciparum.La apasionante y casi palpable perspectiva de una vacuna efectiva contra la malaria, sumada a la promoción de innovadoras estrategias de control como el tratamiento intermitente en lactantes o mujeres embarazadas han centrado, en los últimos años, el debate científico relacionado con las estrategias de control. En contraste con estas innovadoras estrategias, el control de la malaria se ha visto sin embargo limitado en las últimas décadas a la identificación y tratamiento precoz de los episodios clínicos y a la reducción del contacto entre el reservorio humano y el vector. A menos que se produzca una importante renovación y optimización del arsenal terapéutico y de las estrategias frente a esta infección, acompañado por un despliegue masivo de las intervenciones en aquellas áreas dónde son más necesarias, la malaria continuará dictando el estado de salud global, y su erradicación no dejará de ser una utopía irrealizable a corto plazo.La malaria es una enfermedad potencialmente mortal, y por lo tanto, un requerimiento fundamental para su control es la disponibilidad de fármacos antimaláricos efectivos para su tratamiento. El desarrollo de la farmacopea antimalárica, estrechamente relacionada a los diferentes conflictos bélicos del último siglo, ha representado un constante desafío y debido a los repetidos problemas de financiación ha resultado claramente inadecuado, especialmente en comparación con el desarrollo de fármacos para otras enfermedades. Como ejemplo cabe destacar que, entre los años 1975-1999, apenas 4 de los cerca de 1400 fármacos registrados en el mundo, eran antimaláricos. Además, la aparición de resistencias por parte del parásito a los fármacos, un problema creciente y global, resulta un grave peligro para el control de esta infección, y representa una presión añadida para los pocos fármacos efectivos todavía disponibles. Con todo, en los últimos años, la malaria se está desprendiendo del status de enfermedad olvidada que arrastraba, e importantes esfuerzos han surgido para el desarrollo e investigación de nuevos fármacos con actividad antimalárica. Basado en el conocimiento adquirido con otras enfermedades infecciosas como la tuberculosis, la organización mundial de la salud promulga actualmente que el tratamiento frente a P. falciparum, la especie responsable de la mayoría de casos graves y la práctica totalidad de las muertes, debe basarse en la terapia combinada, incluyendo a ser posible un derivado de las artemisininas. La elección de los fármacos a combinar debe basarse en la potencial sinergia entre los perfiles farmacocinéticos y terapéuticos de los diferentes componentes, con el objetivo de conseguir una eliminación de la parasitemia rápida, protegiendo al mismo tiempo a los diferentes componentes frente al desarrollo de resistencias.

Malaria is caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium, Plasmodiidae family, transmitted to humans through the bite of infected female Anopheles.spp mosquitoes. It is one of the major global public health problems and an important cause of death in young children in Subsaharian Africa.Malaria is both a cause and a consequence of poverty. It best represents the paradigm of the vicious circle of disease and poverty. Recent estimates suggest that malaria alone costs about 12 billion US dollars to the endemic countries of Africa, and therefore represents a major constraint to economic progress. Today, Africa continues to carry the brunt of the global malaria burden with around 350-550 million clinical episodes and between 700.000 and 1.6 million deaths annually, representing 80-90% of the all malaria deaths in the world, mostly in children younger than five years and pregnant women. Estimates of malaria mortality are rather imprecise. However, describing the contribution of malaria to under five mortality is a very important and relevant objective. It improves the precision of our burden estimate, and helps prioritize and guide control efforts, as well as evaluate its impact. However in rural areas of Africa such as Mozambique, many children are born and die without ever being registered, and a significant proportion of all deaths take place outside health facilities. In this scenario, the only way of estimating the likely cause of death is through an interview of a witness of the final illness. This is called a verbal autopsy (VA).The last decades have witnessed the establishment of a network of centres throughout the continent that include continuous demographic surveillance of defined populations, the so called Demographic Surveillance Sites (DSS). The DSS have been established to record prospectively demographic information, including births and deaths, to investigate epidemiological and social determinants, and to provide a platform on which to undertake large-scale community interventions trials.The first article of this thesis describes 10 year data from the Manhiça DSS on the most frequent causes of mortality in children under 15 years of age, between 1997 and 2006. During this period, 10037 deaths were recorded, of which 3730 were recorded in children under 15 years old. Verbal autopsy interviews were conducted for 3002 (80.4%) of these deaths. According to respondents, 54% of deaths occurred outside a health facility. Overall, malaria accounted for 22% of all deaths, but the relative frequency was highest in children 1 to 4 years of age, accounting for 34% of all deaths corresponding to a mortality rate of 6.1 deaths/1000 pyrs.The last decade has witnessed a renewed effort in the study and control of this disease. New tools are becoming available, and the development of a vaccine is considered a potentially key component for improved control.GlaxoSmithKline (GSK) Biological's RTS,S,AS02A is a currently the world's most clinically-advanced malaria vaccine candidate. RTS,S/AS02A specifically targets the pre-erythrocytic stage of P. falciparum, and has been shown to confer protection against P. falciparum infection, delivered via laboratory-reared infected mosquitoes, in immunised malaria naive volunteers and against natural infection in semi-immune adult and immune children.As part of the clinical development plan, we conducted a Proof of Concept randomised, controlled, phase IIb trial of RTS,S/AS02A in 2022 Mozambican children aged 1-4 years living in a rural endemic area of Mozambique. The initial double blind phase included study months 0 to 8.5 and the single blind phase from study months 8.5 to 21. The open phase included study months 21 to 45. Children were randomised in a 1:1 ratio to receive RTS,S/AS02A or the control vaccines. The RTS,S/AS02A was administered intramuscularly in the deltoid region according to a 0, 1, and 2 month schedule. Children aged 24 months and older in the control group received three paediatric doses (0.5 ml) of Engerix-B . Children under 24 months received two paediatric doses of Prevenar , administered at the first and third vaccinations and one dose of Hiberix , at the second vaccination. Good safety profile and immunogenicity has been confirmed. Considering the entire follow up period of 45 months, Vaccine Efficacy (VE)(2.5-45) against first or only episode of clinical malaria disease was 30.5% (95% CI 18.9-40.4; p=These results highlight the feasibility of developing a malaria vaccine that may protect children against malaria, and may therefore be a useful component of the strategies to improve malaria control., EN CASTELLANO: La malaria es causada por un parásito protozoario del género "Plasmodium", de la familia "Plasmodium Plasmodiiade", transmitido a los humanos a través de la picadura de un mosquito Anófeles.spp hembra infectado. Es uno de los mayores problemas de salud pública en el África Subsahariana y una de las causas más importantes de muerte en niños pequeños en la región.La malaria es tanto una causa como una consecuencia de la pobreza. Recientes estimaciones sugieren que la malaria cuesta aproximadamente 12.000 millones de dólares americanos a los países endémicos de África, y por consiguiente, representa un constreñimiento mayor al progreso económico de dichos países. Actualmente, África continúa soportando la mayor carga de malaria del mundo, con aproximadamente 350-550 millones de episodios clínicos y entre 700.000 y 1.6 millones de muertes anuales. Así, representa el 80-90% de la malaria en el mundo, la mayoría en niños menores de 5 años y mujeres embarazadas. Las últimas décadas han sido testimonio del establecimiento de una red de centros a lo largo del continente, que incluye a vigilancia demográfica continuada de poblaciones definidas, los llamados Sistemas de Vigilancia Demográficos (DSS). Los DSS han sido creados para registrar prospectivamente informaciones demográficas, incluyendo los nacimientos y las muertes, para investigar los determinantes epidemiológicos y sociales, y para proveer con una plataforma en la cual se puedan llevar a cabo ensayos de intervención comunitaria a gran escala.Durante los últimos diez años se ha asistido a un esfuerzo renovado en el estudio y el control de esta enfermedad. Se dispone de nuevas herramientas y en concreto se está avanzando en el desarrollo de una vacuna como componente potencialmente importante para un mejor control. Actualmente, la RTS,S/AS02A GlaxoSmithKline (GSK) Biological es la vacuna candidata contra la malaria más avanzada del mundo. Su objetivo específico es la actuación en el estado pre-eritrocítrico del "P.falciparum" y ha demostrado su validez a la hora de conferir protección contra la infección experimental por P.falciparum, administrada via mosquitos infectados criados en el laboratorio, en voluntarios nunca expuestos previamente y contra la infección natural en adultos semi inmunes y niños inmunes.Como parte del plan de desarrollo clínico, realizamos un estudio prueba de concepto, aleatorizado, controlado, de fase IIb de RTS,S/AS02A en 2022 niños mozambiqueños de 1 a 4 años de edad viviendo en una área rural endémica. Los resultados demostraron un buen perfil de seguridad y una buena respuesta inmunitaria. Durante el periodo de vigilancia, la eficacia de la vacuna (VE) (2.5-45) contra un primer o único episodio de malaria clínica fue del 30.5% (95% CI 18.9-40.4; p=p=0.045).Estos resultados resaltan la viabilidad del desarrollo de una vacuna contra la malaria y puede ser, por consiguiente, un componente útil entre las estrategias para mejorar su control.

L'Alt Empordà és una de les comarques catalanes més extenses (1357,53 km2) amb un total de 68 municipis i 129.160 habitants. La seva situació geogràfica (es troba en una zona de pas i ha estat habitada des de temps immemorials) i les seves característiques orogràfiques (és una plana oberta al mar que va pujant a mida que ens desplacem cap a l'interior), fan que hagi estat una zona òptima per a dur-hi a terme un estudi etnobotànic.S'han realitzat 101 entrevistes, durant les quals hem parlat amb 178 persones (126 dones i 52 homes) amb una mitjana d'edat de 69 anys. Les dades més rellevants dels resultats obtinguts són les següents:Dels 518 tàxons citats, 335 tenen aplicació en medicina humana o veterinària i 147 formen part de barreges amb finalitats terapèutiques.Les 338 espècies medicinals sobre les quals hem obtingut informació pertanyen a 80 famílies botàniques, essent les cinc més representades les més freqüents al territori.El 98% de les aplicacions medicinals inventariades fan referència a medicina humana i el 2% restant, a veterinària.Els trastorns digestius són un dels cinc principals grups d'afeccions guarides amb remeis vegetals de manera majoritària (entre les que predominen les propietats digestives, laxants, antidiarreiques, hepatoprotectores i antiflatulents). També destaca la importància dels remeis antiinflamatoris (intestinals, oculars, gàstrics, faringis i òtics com a més citats), els remeis contra infeccions i infestacions (sobretot d'origen víric), els trastorns del sistema genitourinari i per últim, les referències a trastorns de la pell o del teixit cel·lular subcutani.En la preparació dels remeis, les estructures florals són la part més utilitzada (31,9%), seguida de la fulla (20,68%) i de la part aèria (16,28%). Segueix, per ordre d'importància, la utilització del fruit o la infructescència (14%) i de les estructures caulinars (7,65%).El 75% de les preparacions per via interna són tisanes seguides de lluny per l'administració directa de la planta o d'alguna part de la planta sense preparació prèvia i de la inhalació d'essències, bafs i perfums. Destaquem les citacions a l'elaboració de xarops i d'essències per la laboriositat que representa la seva preparació.Per via externa també en destaquen les preparacions amb base aquosa seguides de l'aplicació de la planta o part d'ella directament o prèviament manipulada. Cal destacar també les preparacions en base alcohòlica o en oli d'oliva.Al llarg de l'estudi hem recopilat informació sobre 375 barreges, 183 d'aplicació externa i 192 per a administració interna en les que hi intervenen 147 espècies vegetals diferents. Prop de 800 usos de 200 espècies botàniques diferent no els hem trobat citats en les obres consultades i d'aquests, 32 usos de 30 espècies diferents han estat citats per tres o més informants independents, la qual cosa les fa bones candidates a estudis posteriors.Han estat descrits efectes nocius o tòxics per a 103 espècies de plantes, en 35 d'elles com a efectes secundaris a l'ús terapèutic. El nombre total d'espècies citades com a alimentàries és de 248 (de les quals se n'usen 212 en alimentació humana, 74 en alimentació animal i 38 tant en humana com en veterinària). Hem recollit 228 plantes (algunes d'elles amb més d'un ús) que es fan servir per a finalitats no terapèutiques ni alimentàries.En l'aspecte lingüístic, hem recopilat 1.013 noms populars per a les 518 espècies referenciades; d'aquests, n'hi ha 418 de no documentats prèviament per a l'espècie a la que es designen., "ASSESSMENT AND ANALYSIS OF THE ETHNOFLORA OF ALT EMPORDÀ (CATALONIA, IBERIAN PENINSULA)"TEXT:The district of Alt Empordà (1,358 km2, 129,160 inhabitants) is located in the north-eastern corner of the Iberian Peninsula. With a big diversity of landscapes (from sea level to 1,400 m in a few kilometres), having been a crossroad for many cultures and conserving to a certain extent rural life, it constitutes a good candidate for ethnobotanical research within Europe. To collect, analyse and evaluate the folk plant knowledge in this territory we performed 101 semi-structured interviews to 178 informants (mean age 69; 71% women), identified the plant taxa reported and analysed the results, comparing the statistic results obtained with those from other territories. The informants reported data on 518 species. Of these, 335, belonging to 80 botanical families, were claimed as medicinal and 103 as toxic. Human medicine represents 98% of the pharmaceutical uses (3,581 out of 3,643 use reports). Around 800 medicinal uses, concerning 200 species (often very well known for other therapeutic uses), have not, or have very rarely been cited; of these, 32 uses of 30 species could be object of further studies because they have been reported by three or more independent informants, indicating a high degree of reliability. The number of food plants is 248 (212 human food, 74 animal feed and 38 both). Finally, 228 species are used for other purposes. An amount of 1,015 popular names (1,347 phonetic variants) have been collected to designate the 518 catalogued taxa. Frequently, phenomena of polysemy (the same popular name for different species) and synonymy (different popular names for one species) appeared, even together. The folk knowledge about medicinal and other plant uses is still alive in the studied area. Nevertheless, being a tourist and industrialised region, some degree of acculturation exists, so that there is urgency in recording such data and in reverting them to the population as soon as possible.

El objetivo principal de este estudio es el desarrollo de un nuevo medicamento en forma de comprimidos de 0.625 mg de estrógenos conjugados que posean una liberación "in vitro" del principio activo que cumpla con las especificaciones indicadas en la USP 29 y a su vez dé lugar a un medicamento estable, seguro y eficaz. Para consolidar el objetivo principal se han establecido unos objetivos secundarios pero totalmente necesarios. Estos objetivos son los siguientes: • Estudio y establecimiento de las características fisicoquímicas y biofarmacéuticas que debe cumplir el principio activo, estrógenos conjugados, para la obtención de una formulación adecuada. • Estudio de los excipientes susceptibles de utilizarse para el diseño de la formulación. • Diseño de la formulación y técnica de elaboración más adecuada en función de las características que debe cumplir la formulación. • Una exigencia para alcanzar los objetivos secundarios es la investigación y desarrollo de una metódica analítica que nos permita la correcta determinación cualitativa y cuantitativa del principio activo en el producto acabado. • Estudio de estabilidad de las formulaciones más idóneas en condiciones forzadas como a tiempo real por un mínimo de un año, siguiendo los criterios establecidos en las normas ICH.

El objetivo del presente trabajo es el diseño de un excipiente tecnoprocesado para compresión directa exento de lactosa en razón del handicap que supone, actualmente, su presencia en la mayoría de formulaciones de comprimidos. Excipiente que además presente una disgregación rápida que permita la vehiculación de fármacos tipo antiinflamatorios, analgésicos y antihipertensivos que requieren una rápida liberación con objeto de que esta fase del LADME no constituya una limitación para la consecución de una rápida acción terapéutica a nivel sistémico.La tecnología de la compresión directa presenta, entre otras ventajas, una simplificación de las fases operativas y en consecuencia ventajas económicas, cuando se aplica a nivel industrial. La elección de los diluyentes por compresión directa considera las características intrínsecas de los polvos (tamaño de partícula, forma, densidad aparente, y solubilidad) como las características necesarias para la elaboración de formas compactas. Una de las líneas de investigación actuales en este campo, se dirige hacia el desarrollo de excipientes tecnoprocesados, referenciados en la bibliografía anglosajona como "multipurpose excipients", o "co-processed excipients". Técnicamente, estos productos son granulados constituidos por mezclas de distintos componentes obtenidos por diferentes técnicas de granulación. La primera etapa en el diseño de un nuevo excipiente tecnoprocesado es la de determinar la composición cuali y quantitativa de sus componentes. Se propone la utilización de asociaciones fosfatodicálcico dihidratado/celulosa microcristalina ya que permiten compensar las deficiencias de compresibilidad del fosfato y las de capacidad de flujo de la celulosa y constituir composiciones "sinérgicas" que permitan conseguir las especificaciones requeridas y exigibles a un buen excipiente para compresión directa. En este sentido, se estudian en una primera fase, el comportamiento de diferentes mezclas físicas se caracterizan en cada caso determinando: ángulo de reposo, velocidad de deslizamiento e índices de Hausner y de Compresibilitat como parámetros reológicos. Se comprimen las diferentes mezclas, se estudia el ciclo de Heckel para cada una de ellas y por último se determinan los parámetros farmacotécnicos de los comprimidos obtenidos con las mismas. En paralelo se estudian las mezclas físicas anteriormente descritas sometidas a un proceso de granulación por vía húmeda con el objetivo de mejorar las características de las mismas. Estos granulados constituyen los primeros prototipos del proyecto. Este estudio preliminar permite seleccionar una serie de granulados con características reológicas adecuadas (elevada resistencia a la rotura, rápida disgregación y baja friabilidad) y que muestran su aptitud para la compresión en un amplio intervalo de fuerzas. En el proceso de obtención del prototipo de excipiente tecnoprocesado, a través de granulación húmeda, se involucran diferentes variables La utilización de métodos estadísticos de diseño experimental permiten optimizar el proceso.A partir de estos resultados se escogen las variables para el diseño estadístico de experiencias. Se optimizan los granulados elaborados en los estudios preliminares y obtenemos una primera propuesta de excipiente tecnoprocesado.Una vez determinadas las condiciones óptimas para el proceso de elaboración del excipiente tecnoprocesado, se escogen los dos lotes que se acercan más a las mismas con objeto estudiar el comportamiento del mismo cuando se le incorpora un trazador, en este caso se escoge la hidroclorotiazida como modelo de principio activo poco soluble en agua., The aim of this study is the design of a coprocessed excipient for direct compression, free of lactose, because of the handicap that lactose supposes with its presence in most tablet formulations.This excipient must have furthermore, a fast disintegration for tablets containing antiinflammatory, analgesic and antihypertensives drugs that require a fast liberation so that this phase of the LADME does not constitute a limitation for the attainment of a rapid therapeutic action at systemic level.The potential advantages of tablet production by direct compaction are well known. The most striking feature of direct compaction is its apparent simplicity.The main aim of co-processing is to obtain a product with added value related to the functionality/price ratio. Development of co-processed directly compressible adjuvant starts with the selection of the excipients to be combined, their targeted proportion, and selection of preparation method to get an optimized product with desired physico-chemical parameters.The used excipients are dicalciumphosphate and microcrystalline cellulose in a proportion of 75-25% respectively. In the process of obtaining the coprocessed excipient prototype, through wet granulation, involves different variables. The use of statistical methods for experimental design allows the optimization of the process.Once determined the optimal conditions for the elaboration process of the coprocessed excipient, two lots are chosen, both with the best object of study behaviours. Then, the drug is added, in this case, the hydrochlorothiazide as a model of a poorly hydrosoluble water drug.