Search

Desde que se establecen las sinapsis hasta que son plenamente maduras, experimentan diversos cambios. En el terminal presináptico, a nivel morfológico se produce un rellenado progresivo del número de vesículas sinápticas que modificará las propiedades funcionales de las sinapsis. La disponibilidad de vesículas es necesaria mantener la neurotransmisión en períodos de actividad y la endocitosis es el mecanismo encargado de reformar las vesículas que han sido previamente liberadas. Sin embargo, es >1000 veces más lenta que la exocitosis, convirtiéndose en el factor limitante de la neurotransmisión. Además, en el contexto in vivo, las sinapsis están rodeadas de otros tipos celulares, como la glía, que pueden sentir y modificar las propiedades sinápticas mediante la secreción de factores. En esta tesis, se ha empleado un sistema de microcultivos conocidos como single-cell microcultures (SCM) establecidos a partir de neuronas del ganglio cervical superior de rata. Así, una neurona única crece formando contactos sinápticos colinérgicos con ella misma, siendo a su vez presináptica y postsináptica y permitiendo el registro de la actividad sináptica con un sólo electrodo. Además, como las neuronas se desarrollan en ausencia de glía, se puede estudiar el efecto de factores gliales sobre la neurotransmisión, añadiéndolos al medio de cultivo. Tras el registro de las neuronas, se realiza un estudio correlativo de microscopía de inmunofluorescencia ó microscopía electrónica. Los resultados de esta tesis demuestran que las sinapsis pueden establecerse y desarrollarse en ausencia de glía. Tras el comienzo de la neurotransmisión (.13 d.i.v.), las sinapsis son inmaduras y presentan una disminuida respuesta sináptica, una marcada depresión a corto plazo y un reducido tamaño de los depósitos de vesículas de liberación. Con la maduración se producen cambios debido al incremento de los depósitos de vesículas. In vitro, los cambios ocurren en las mismas sinapsis que se establecieron inicialmente, ya que no se observan variaciones en el número de contactos sinápticos. Sin embargo, in vivo el número de sinapsis que se forman en un principio es superior a aquéllas que finalmente se consolidan y maduran. Es decir, existe un proceso de refinado y eliminación sináptica que debe desencadenarse por factores externos. En esta tesis se ha encontrado que Secreted protein acidic and rich in cystein (SPARC), una proteína matricelular de origen glial secretada durante el desarrollo, es capaz de ejercer un efecto dosis dependiente sobre el desarrollo sináptico. 10 nM desencadena un proceso de eliminación sináptica, mediante una endocitosis masiva de la superficie plasmática y la generación de cuerpos endosomales degradados vía lisosomal. Los resultados se corroboran in vivo, inyectando la proteína en la cola del renacuajo de Xenopus tropicalis provocando la eliminación de las uniones neuromusculares. Paralelamente, en SCMs plenamente funcionales, se ha observado que una intensa actividad también favorece la reducción de la cantidad y la calidad de las vesículas sinápticas, que se manifiesta en una incapacidad para mantener la neurotransmisión. Asumiendo que la endocitosis mediada por clatrina es el principal mecanismo de reciclaje de las sinapsis, y clatrina es la proteína más específica del mecanismo, se estudió el comportamiento de esta proteína durante períodos de estimulación. Se observó que clatrina sale de las sinapsis hacia las regiones perisinápticas. Usando lentivirus para reducir la expresión de clatrina (shRNA), se observaron resultados funcionales similares a los obtenidos en períodos de alta estimulación: una reducción del número de vesículas y un menor contenido de neurotransmisor. Este fenotipo fue rescatado dializando clatrina exógena purificada en la pipeta de registro. Así, clatrina y SPARC, son factores importantes para el desarrollo y la plena funcionalidad de las sinapsis., The required mechanisms that regulate synaptic maturation are not deeply known, although the presynaptic changes such as a high number of synaptic vesicles and the grouping of these at the active zone, are well-characterized features. It is believed that these changes are mediated by neurotrophins or glial molecules. After the synaptogenic period, non-functional synapses tend to disappear. Although, the factors involved in synapses elimination are not known, it is suggested that glia triggers it. In functional neurons, to maintain communication, synapses must recycle their released vesicles with high efficiency. In this process mainly participates the clathrin-mediated endocytic machinery, but the consequences of this are poorly understood. Thus, in this dissertation, synaptic plasticity has been studied based on the degree of maturity and the effect of endocytosis capacity. We made use of a cholinergic microculture model, called Single-cell microculture (SCM) established from rat superior cervical ganglion neurons in the absence of glia. SCMs provide a good model to study synaptic function because a given neuron is both presynaptic and postsynaptic. Furthermore, SCMs permit to study the effect of glial factors on neurotransmission, by adding them on the culture medium. We have found that SPARC, a secreted protein by glia during development, triggers a cell-autonomous program of synapse elimination in SCMs. The loss of synaptic contacts is associated to the formation of retracted axon terminals, containing multivesicular bodies and secondary lysosomes. The biological relevance of culture results is supported by injecting the tail of Xenopus tropicalis tadpoles with SPARC. Swimming is severely impaired, caused by the massive elimination of neuromuscular junctions. On the other hand, we have found that the amount of clathrin in a presynaptic terminal is not fixed. During stimulation, clathrin moves out of synapses as a function of stimulus strength and neurotransmitter release probability. Correlative functional and morphological experiments show that presynaptic synaptic transmission is compromised if clathrin levels fall by 20% after clathrin heavy chain knock down using RNAi. However, synaptic depression reverts after dialysis of exogenous clathrin, thus compensating RNAi-induced depletion. Together, our results show that clathrin levels and SPARC actively affect synaptic plasticity during development.

[spa] La clatrina es una molécula evolutivamente conservada que envuelve las membranas que se endocitan desde la membrana plasmática y aquellas que se mueven entre la red trans-Golgi (TGN) y los endosomas de las células eucariotas, en las principales vías celulares reguladas secretoras y endocíticas. Muchas proteínas que interactúan con clatrina han sido identificadas, pero en algunos casos se desconoce la relevancia funcional de estas interacciones. Entre ellas, la interacción de la clatrina con la calmodulina, dos proteínas esenciales evolutivamente conservadas, fue detectada in vitro hace décadas pero no se sabe si interactúan in vivo y cuál es el significado funcional de esta interacción. La calmodulina es un sensor de calcio que juega un papel importante la regulación de una amplia variedad de proteínas y rutas de señalización importantes en todos los organismos eucariotas. Es importante destacar que también se ha visto implicada en la endocitosis, el tráfico de membranas y la fusión de endosomas. Sin embargo, muchas de las dianas de calmodulina y los mecanismos por los que la calmodulina regula eventos específicos de transporte de membranas son desconocidos. En esta Tesis se aborda el estudio de la interacción clatrina-calmodulina, cuyo significado funcional no se ha estudiado hasta el momento, utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo. En el estudio, revelamos que las cadenas pesada y ligera de clatrina se unen a calmodulina no sólo in vitro sino también en levadura, probablemente de una forma dependiente de calcio. Además, describimos un sitio de unión a calmodulina que no estaba previamente caracterizado, en el extremo C-terminal de la cadena pesada de clatrina, e identificamos mutaciones puntuales en calmodulina que alteran específicamente su interacción con la clatrina. Por último, aportamos pruebas que respaldan una función específica de la interacción clatrina-calmodulina en el transporte retrógrado desde los endosomas al TGN., [eng] Clathrin is an evolutionary conserved molecule that coats membranes endocytosed from the plasma membrane and those that move between the trans-Golgi network (TGN) and endosomes of eukaryotic cells. It also plays roles in early stages of mitosis, cytokinesis, chromosome alignment and in certain phagocytic events. At the cellular level, clathrin is required for major regulated secretory and endocytic pathways, which transport proteins, lipids, soluble factors, and extracellular ligands between the plasma membrane and the intracellular compartments. In multicellular organisms clathrin is involved in numerous specialized pathways of physiological relevance, such as the production of morphogen gradients, the formation of secretory granule, antigen presentation by the immune system, virus maturation, the control of glucose homeostasis, or synaptic vesicle generation. Many proteins that interact with clathrin have been identified. In some cases the functional relevance of these molecular interactions remains unknown. Among those, the clathrin-calmodulin interaction is probably one of the most striking examples since it involves two evolutionary conserved essential proteins and it was detected in vitro decades ago. However, it was not clarified whether clathrin and calmodulin interacted in vivo and what was the functional significance of this interaction. The calcium sensor calmodulin plays an important role regulating a wide variety of proteins and important signaling pathways in all eukaryotes. It modulates the activity of key regulatory enzymes, ion pumps and proteins implicated in motility and it has essential roles in mitosis. Importantly, it has also been found to be implicated in endocytosis, membrane traffic and endosome fusion. Nevertheless, most targets of calmodulin and the mechanisms by which calmodulin regulates specific membrane transport events are mainly unknown. The objective of this Thesis is to address the study of the clathrin-calmodulin interaction, whose functional significance has not been studied thus far, using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system. S. cerevisiae has proven to be an extremely versatile organism for studying many cellular processes, because of the ease of combining biochemical analyses with genetic studies and live imaging in this organism and the evolutionary conservation of most essential eukaryotic cellular processes and proteins involved. In this study, we reveal that the clathhrin heavy and light chains bind calmodulin not only in vitro but also in yeast, most likely in a calcium-dependent manner. Further, we describe a not-previously­characterized calmodulin binding site at the C-terminus of the clathrin heavy chain, and identify calmodulin point mutations that specifically disrupt their interaction with clathrin. Finally, we provide evidence supporting a specific role of the clathrin-calmodulin interaction in the retrograde transport from endosomes to the TGN.

S. cerevisiae (budding yeast) is particularly powerful to study the relation between the molecular mechanisms of actin regulation and its biological significance due to its powerful molecular and genetic methods, well-established biochemical techniques, and development of live cell imaging and immuno-electron microscopy. Further, budding yeast has a simple cytoskeleton but the molecular mechanisms controlling its remodeling are conserved from yeast to mammals. Interestingly, a dynamic actin cytoskeleton is mandatory for endocytosis in S. cerevisiae. In this organism the formation of the primary endocytic profiles in yeast occurs concomitant with the assembly of a complex actin structure (the endocytic actin module), which includes the actin nucleator Arp2/3 complex. Consistent with observations indicating that the myosin-I Myo5 in complex with the WIP homolog Vrp1 is a major Arp2/3-dependent actin nucleating promoting factor (NPF) driving productive membrane invagination, our laboratory has demonstrated that the C-terminal domain of Myo5 immobilized on the surface of Sepharose beads induces assembly of the endocytic actin module in the presence of yeast extracts. Analysis of the in vitro actin assembly assay demonstrated that Myo5 is phosphorylated by the casein kinase CK2 at the serine 1205 during the assay. In this study, we have characterized the CK2 activity that phosphorylates Myo5 at the C-terminus and investigated the functional significance of this phosphorylation in vivo and in vitro. Our results indicate that a non-tetrameric and particulate-associated CK2 activity that includes the catalytic subunit Cka2 but not Cka1 or the regulatory subunits Ckb1 and Ckb2 phosphorylates Myo5 S1205. Our results also indicate that this phosphorylation event down-regulates the assembly of complex actin structures in vitro and slows down the internalization process and the dissociation of the myosin from the plasma membrane in vivo. The Cka2-mediated phosphorylation at Myo5 S1205 does not seem to regulate the affinity of the NPF for the Arp2/3 complex but rather down-regulates the interaction of Myo5 with its co-activator Vrp1. This phosphorylation also increases directly or indirectly the binding of the myosin to the endocytic coat components Sla1 and Pan1 and to the syndapin Bzz1, suggesting that the phosphorylation event occurs late during the maturation of the endocytic invagination. Finally, our data suggest that Cka2 have endocytic targets other than Myo5 and that its activity might also regulate early steps during the assembly of the endocytic coat., La levadura S. cerevisiae es un organismo modelo muy utilizado para estudiar los mecanismos moleculares que regulan el citoesqueleto actina y su función biológica, ya que los mecanismos moleculares que controlan la organización del citoesqueleto de actina están conservados, por lo que muchos de los descubrimientos realizados en S. cerevisiae son aplicables también en eucariotas superiores. Una de las principales funciones biológicas de la actina en S. cerevisiae es la formación de una vesícula endocítica. En este organismo, la formación de los perfiles endocíticos primarios ocurre de forma simultánea con el ensamblaje de una estructura de actina compleja (módulo de actina) que incluye al complejo nucleador de actina Arp2/3. Diferentes estudios indican que la miosina-I Myo5 junto su co-activador Vrp1 activan al complejo Arp2/3 produciendo la elongación del perfil endocítico. Nuestro laboratorio ha demostrado que el dominio C-terminal de Myo5 inmovilizado en la superficie de bolas de sefarosa induce el ensamblaje del módulo de actina en presencia de extracto de levadura. El análisis del ensayo demostró además que Myo5 está fosforilada por la quinasa CK2 en la S1205. En este estudio hemos caracterizado la actividad CK2 que fosforila a Myo5 en la S1205 y hemos investigado el significado funcional de dicha fosforilación in vivo e in vitro. Nuestros resultados indican que una actividad CK2 asociada a partículas, que incluye la subunidad catalítica Cka2 pero no Cka1 ni las subunidades reguladoras Ckb1 y Ckb2 fosforila la S1205 de Myo5. Esta fosforilación perturba la interacción entre Myo5 y su co-activador Vrp1, regulando negativamente la formación de las estructuras de actina complejas in vitro, y consistentemente, disminuyendo la velocidad de la internalización endocítica in vivo. Además, nuestros resultados también sugieren que Cka2 seguramente tiene otras dianas además de Myo5, y que su actividad podría regular otras fases iniciales durante la formación de la vesícula endocítica.