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The development of high-throughput sequencing technologies has prompted the evaluation of large cohorts of different tumor types. The results from these comprehensive genomic studies have revealed the most commonly mutated genes across human cancers, providing further understanding of the pathogenesis, molecular classification, and therapeutic strategies for this disease. PIK3CA, the gene encoding the PI3Kα isoform, is among the most frequently mutated genes in breast, head and neck, colorectal, and lung cancer, among others. Activating mutations in PIK3CA promote hyperactivation of the PI3K/AKT pathway, leading to increased proliferation, cell growth, survival, and metabolism. Current efforts are aimed to develop PI3K inhibitors as an effective therapy for PIK3CA mutated cancers and, despite promising clinical responses, the emergence of drug resistance is a clear limitation. In this doctoral thesis, we have explored these mechanisms of resistance in order to provide a better understanding of tumor evolution upon therapy, define subpopulations of patients that are likely to respond to PI3K inhibitors, and provide novel pharmacological combinations to overcome therapy refractoriness. The loss of the tumor suppressor PTEN was found to play an important role in the resistance of PI3Kα inhibitors in preclinical models and patients, mainly by reactivating the PI3K/AKT pathway as a result of an increased dependency on the PI3Kβ isoform. Our work also demonstrated the notion of tumor evolution and phenotypic convergent evolution in response to therapeutic pressure. Moreover, we have established that intrinsic resistance to PI3Kα inhibitors occurs as a result of incomplete inhibition of the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1), a downstream effector of the PI3K/AKT pathway. PI3Kα inhibitor-resistant cells could be re-sensitized through the blockade of phosphoinositide-dependent kinase (PDK1), a constitutively active kinase, using genetic or pharmacologic inhibition. Further experiments showed that the downstream effector of PDK1 is the serum and glucocorticoid-induced kinase 1 (SGK1), which promotes cell survival through the phosphorylation of key proteins such as FOXO3 and TSC2. Accordingly, the resistant phenotype could be also reverted by inhibiting SGK1, a novel pharmacological approach that has revealed interesting roles of this kinase in tumor biology. Genetically engineered mouse models represent reliable tools for investigating the etiology, biology, and progression of human diseases, as well as for exploring novel therapeutic approaches. By serendipity, we discovered the role of PIK3CA mutations in the genesis of venous malformations, an aberration of normal venous development that currently lacks effective treatments. Our mouse models recapitulated the histopathologic features of the disease and provided an experimental platform to test novel pharmacological approaches. PI3Kα inhibitors were effective at reducing the morbidity and mortality of mice carrying venous malformations. The results from this thesis highlight the importance of defining the molecular determinants of sensitivity and resistance to PI3K inhibitors, a therapy that will most likely benefit PIK3CA mutant patients., El desenvolupament de noves tècniques de seqüenciació massiva ha fomentat l’estudi d’un gran nombre de mostres de diversos tipus tumorals. Els resultats d’aquests estudis genòmics exhaustius ha revelat els gens que es troben mutats en major prevalença, contribuint a una millor comprensió dels processos de patogènesis, classificació molecular i estratègies terapèutiques per a aquesta malaltia. PIK3CA, el gen que codifica per a la isoforma PI3Kα, es troba entre els gens mes freqüentment mutats en el carcinoma de mama, cap i coll, colorectal, pulmó, entre d’altres. Les mutacions activadores a PIK3CA promouen la hiperactivació de la via de senyalització de PI3K/AKT, donant lloc a un increment en la proliferació, la supervivència, i el metabolisme de les cèl·lules tumorals. Els esforços actuals es centren en el desenvolupament d’inhibidors de l’enzim PI3K com a una possible teràpia efectiva en tumors que presenten mutacions a PIK3CA. Tot i que els assajos clínics inicials son prometedors, l’emergència de resistència a aquestes teràpies és una clara limitació. En aquesta tesis doctoral s’han explorat els possibles mecanismes de resistència per intentar entendre com els tumors evolucionen enfront d’aquest fàrmacs, poder definir les subpoblacions de pacients que respondran als inhibidors de PI3K i proporcionar noves combinacions farmacològiques per combatre el fenomen de la resistència. Hem demostrat que la pèrdua del supressor tumoral PTEN juga un paper important en la resistència als inhibidors de PI3Kα, tant en models preclínics com en pacients, mitjançant la reactivació de la via de PI3K/AKT que és resultat d’un increment en la dependència de la isoforma PI3Kβ. El nostre treball també ha evidenciat la noció d’evolució tumoral i ha demostrat el concepte d’evolució convergent fenotípica en resposta a la pressió terapèutica. També s’ha demostrat que la resistència intrínseca als inhibidors de PI3Kα es pot donar com a resultat d’una inhibició incompleta del complex 1 de mTOR (mTORC1), un efector clau de la via de PI3K/AKT. Cèl·lules resistents a inhibidors de PI3Kα es van poder sensibilitzar amb el bloqueig genètic o farmacològic de PDK1, una quinasa constitutivament activa. Experiments addicionals van poder demostrar que l’efector molecular de PDK1 era la quinasa SGK1, la qual promou la supervivència cel·lular a través de la fosforilació de proteïnes clau com FOXO3 i TSC2. El fenotip resistent es va poder revertir mitjançant la inhibició farmacològica d’aquesta proteïna, una aproximació terapèutica que ha revelat un rol interessant en la biologia tumoral. Els models murins modificats genèticament representen una eina segura per a l’estudi de la etiologia, biologia i progressió de malalties humanes, així com per explorar noves aproximacions terapèutiques. Com a resultat d’un descobriment imprevist, també hem pogut revelar el rol de les mutacions de PIK3CA en la formació de malformacions venoses, una aberració del desenvolupament normal de les venes que actualment no tenen un tractament específic. El nostre model animal de malformació venosa recapitula les característiques histopatològigues de la malaltia i proporciona una plataforma experimental única per a l’estudi de noves teràpies. En aquests models animals, els inhibidors de PI3Kα han demostrat ser efectius en la reducció de la morbiditat de les malformacions venoses.

La expresión de HER1 y HER2 (dos miembros de la familia de receptores con actividad quinasa de tirosinas HER) está alterada en diversos tumores de origen epitelial, entre ellos el cáncer de mama donde se correlacionan con un peor pronóstico. Consecuentemente, HER1 y HER2 están siendo exhaustivamente estudiados, tanto desde el punto de vista de la biología del cáncer como desde el punto de vista terapéutico. De hecho, se han desarrollado distintos fármacos dirigidos contra estos receptores, como por ejemplo Iressa, un compuesto sintético de bajo peso molecular que inhibe específicamente la quinasa de tirosinas de HER1. Otro ejemplo es Herceptin, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el ectodominio de HER2.En la primera parte de esta Tesis hemos explorado el espectro de actividad y el potencial terapéutico de Iressa. Para ello hemos investigado los efectos del Iressa sobre un panel de líneas celulares humanas de cáncer de mama, seleccionadas en base a sus niveles de expresión de HER1 y HER2. Como era predecible, nuestros hallazgos mostraron que Iressa inhibe el crecimiento de células con niveles elevados de expresión de HER1. Sin embargo, sorprendentemente, observamos que Iressa también inhibe el crecimiento de células, como las BT-474, que tienen bajos niveles de HER1 pero que sobreexpresan HER2. Además en esta línea celular, Iressa inhibe la activación de las vías de transducción de señal activadas por el EGF (un ligando que se une al EGFR) o la heregulina (un ligando que se une a HER3 y HER4 pero no a HER1 y HER2). Nuestros datos demuestran que Iressa bloquea esta activación mediante un mecanismo doble. Por un lado, Iressa inhibe directamente la quinasa de tirosinas de HER1; por otro, impide la formación de heterodímeros HER2/HER3 mediante el secuestro de los receptores HER2 y HER3 en heterodímeros inactivos HER1/HER2 y HER1/HER3. Conjuntamente, estos hallazgos desvelan un nuevo mecanismo de acción de los inhibidores de la quinasa de HER1 y sugieren que Iressa podría tener utilidad terapéutica para el cáncer de mama no solo en pacientes que presentan niveles elevados de HER1 sino también en pacientes cuyos tumores sobreexpresen HER2.En la segunda parte de esta Tesis hemos profundizado en la biología de los CTFs (Carboxy-Terminal Fragments, Fragmentos Caborxilo-Terminales). Los CTFs son una forma truncada de HER2 que se detecta en el 25% de las muestras de pacientes con cáncer de mama. De acuerdo a su movilidad electroforética, los CTFs contienen el dominio citoplasmático de HER2 incluyendo su dominio tirosina quinasa. Recientemente se ha demostrado que los CTFs correlacionan con metástasis en los ganglios linfáticos y peor pronóstico. A pesar de esto, el mecanismo de generación de estos CTFs y su posible papel en cáncer se desconocía.En este trabajo demostramos que los CTFs se generan mediante inicio alternativo de la traducción a partir de las metioninas 611 y 687 de HER2. Dichas metioninas están situadas justo delante y detrás del dominio transmembrana, respectivamente. Los CTFs están fosforilados y tienen actividad quinasa in vitro. Se localizan en el citoplasma y núcleo de las células que los expresan, tanto en cultivos celulares como en muestras de pacientes con cáncer de mama. Finalmente, mostramos que la inyección subcutánea de células que sobreexpresan los CTFs en ratones atímicos da lugar a tumores que son resistentes al tratamiento con Herceptin, pero que responden a inhibidores de la quinasa de tirosinas de HER2.Dado que un 60% de los pacientes con cáncer de mama que sobreexpresan HER2 (candidatos al tratamiento con Herceptin) sobreexpresan también los CTFs, nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de los CTFs en estos pacientes pueda tener un papel en la resistencia que se desarrolla al tratamiento con Herceptin., The HER1 and HER2 are frequently overexpressed in breast cancer, and their overexpression is associated with a more aggressive clinical behavior. As a consequence, different compounds targeting these receptors have been developed as a fruitful approach to the therapy of breast cancer. One example is Iressa, an oral nonpeptide compound that selectively inhibits the TK activity of HER1; or Herceptin, a monoclonal antibody that targets HER2. To characterize the potential role of Iressa in the treatment of breast cancer, we have studied its effects in a variety of breast carcinoma cell lines expressing different levels of HER1 and HER2 receptors. Our studies demonstrate that Iressa, despite being a specific inhibitor of the EGFR TK, is a potent inhibitor of HER2-over expressing breast cancer cells. We have demonstrated that these effects are explained by a novel and double mechanisms of action. Iressa inhibits the quinase activity of HER1 in one hand and promotes the formation of inactive (unphosphorylated) HER1/HER2 and HER2/ HER3 heterodimers on the other. In the second part of this work we have characterized the CTFs (Carboxi-terminal fragments) of HER2, a truncated form of the HER2 receptor encoding its cytoplasmic domain. CTFs are frequently found in human mammary tumors and associate with nodal metastasis and poor prognosis. However the mechanism of generation is not understood. Here we show that HER2 CTFs are generated by alternative initiation of translation from methionines located near the transmembrana domain of the full-length molecule. In vitro and in vivo, HER2 CTFs are found in the cytoplasm and nucleus. Expression of HER2 CTFs induces the growth of breast cancer xenografts in nude mice. Tumors dependent on CTFs are sensitive to inhibitors of the kinase activity but do not respond to Herceptin. Thus, the kinase domain seems necessary for the activity of HER2 CTFs and the presence of the CTFs could account for the resistance to treatment with Herceptin.