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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Os experimentos foram conduzidos no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa, UFV, campus de Viçosa, gerando informações apresentadas em dois capítulos. No primeiro capítulo, objetivou-se isolar e identificar bactérias do ácido lático em silagem de sorgo, quantificar por qPCR a população do L. buchneri, bem como, avaliar mudanças no perfil fermentativo e valor nutritivo de silagens de sorgo inoculadas com cepas autóctones. Os tratamentos foram dispostos em esquema fatorial 4 × 5, sendo quatro inoculantes (I), controle (CON), L. buchneri estirpe 50.1 (LB.1), L. buchneri estirpe 50.4 (LB.4) e LALSIL AS, L. buchneri CNCM I-4323, Lallemand (LAS) e cinco períodos de fermentação (7, 14, 28, 45 e 90 dias) no delineamento inteiramente casualizado, com três repetições. Foram obtidos quarenta e sete isolados, com predominância de L. buchneri após 45 e 90 dias de fermentação. Os dados do qPCR demonstraram que L. buchneri predominou durante todos períodos de fermentação (P) nas silagens inoculadas. Foi verificado efeito da interação I × P (P0,05), exceto nas doses de 1,2 e 1,5% da enzima, nas quais silagens de GS apresentaram maiores concentrações (P0,05) entre silagens de GM e GS. Silagens de GS apresentaram populações de LEV superiores (P0.05) LAB count between CG and SG silages at 60 and 90 d of fermentation. Sorghum grain silages showed greater yeast population (P

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A soja é o quarto grão mais consumido e produzido em todo o mundo. Está entre as atividades econômicas que cresceram significativamente nas últimas décadas devido às múltiplas aplicações alimentares e industriais. A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis Hiuúbner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae), é uma praga que causa grande prejuizo na produtividade dessa cultura, mesmo em baixas densidades populacionais, devido ao desfolhamento severo durante sua fase larval. As plantas têm mecanismos de defesa ao ataque de insetos que levam à inibição da atividade proteolítica desses herbívoros, retardando seu desenvolvimento. Por outro lado, os insetos mostram uma importante diversidade e plasticidade de suas proteases digestivas. Além do papel de digerir proteinas da dieta, essas proteases também desempenham um papel importante na defesa contra inibidores de proteases (IP) de plantas. Essa complexa relação protease- inibidor é importante para a elaboração de métodos alternativos de controle. Baseado nisso, a busca por IP potentes depende do conhecimento acerca das proteases intestinais do inseto fitófago. Portanto, o trabalho teve como objetivo avaliar os perfis enzimáticos das proteases intestinais da lagarta da soja em diferentes instares e identificar as proteases encontradas no intestino. Os resultados mostraram que há uma plasticidade no perfil proteolítico do intestino da A. gemmatalis ao longo do desenvolvimento larval. As atividades de enzimas do tipo cisteino proteases foram mais importantes nos primeiros instares. Por outro lado, as enzimas do tipo sermno proteases tiveram maiores atividades nas etapas mais tardias da fase larval. Além disso, três proteases foram identificadas por espectrometria de massas, através de homologia do banco de dados para Lepidoptera. O comportamento proteolítico do extrato bruto do intestino da lagarta da soja seguiu a cinética de Michaelis-Menten. Foi demonstrado pela primeira vez que o perfil de proteases do intestino de A. gemmatalis se altera ao longo do seu desenvolvimento. Estes resultados podem mudar o foco do desenvolvimento racional de IP para a lagartada soja e outras Lepidoptera, uma vez que a expressão das principais proteases de insetos não é constante. Soybean 1s the fourth most consumed and produced gram in the world. It is among the economic activities that have grown significantly in recent decades due to multiple food and industrial applications. The soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis Húbner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae), 1s a pest that causes great damage to the productivity of this crop, even at low population densities, due to severe defoliation during 1ts larval phase. The plants have mechanisms of defense to the attack of insects that lead to the inhibition of the proteolytic activity of these herbivores, retarding their development. On the other hand, insects show an important diversity and plasticity of their digestive proteases. In addition to the role of digesting dietary proteins, these proteases also play an important role in the defense against plant protease inhibitors (PIs). This complex protease-inhibitor relationship 1s important for the development of alternative methods of control. Based on this, the search for potent PI depends on the knowledge about the intestinal proteases of the phytophagous insect. Therefore, the objective of this work was to evaluate the enzymatic profiles of the intestinal proteases of the soybean caterpillar at different instars and to identify the proteases found 1n the intestine. The results showed that there 1s a plasticity in the proteolytic profile of the intestine of 4. gemmatalis throughout larval development. The activities of cysteme protease type enzymes were more important in the first instars. On the other hand, the serine protease enzymes had greater activities mn the later stages of the larval phase. In addition, three proteases were identified by mass spectrometry, through homology of the Lepidoptera database. The proteolytic behavior of the crude intestinal extract of the soybean caterpillar followed the Michaelis-Menten kimmetics. It has been demonstrated for the first time that the protease profile of the gut of A. gemmatalis changes throughout its development. These results may shift the focus of rational PI development to the soybean caterpillar and other Lepidoptera, since the expression of major insect proteases Is not constant.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico As cigarrinhas-das-pastagens, Mahanarva spectabilis causam danos severos em pastagens tropicais, comprometendo a produção bovina. O controle-químico de cigarrinha-das-pastagens é economicamente inviável. Sendo assim, a seleção de cultivares forrageiras gramíneas resistentes é uma alternativa de controle muito importante. Estudos relatando a bioquímica da interação entre M. spectabilis e diferentes forrageiras gramíneas são raros. O objetivo foi avaliar o impacto do ataque de M. spectabilis na resposta defensiva de plantas de capim-elefante (Pennisetum purpureum), cv. Roxo Botucatu (RX) e cv. Pioneiro (PI), Brachiaria brizantha cv. Marandú (MA) e Brachiaria decumbens cv. Basilisk (DE). O impacto da alimentação em diferentes cultivares de forrageiras nas proteases digestivas do inseto também foi avaliado. O experimento foi realizado com os quatro genótipos distintos, infestados ou não por M. spectabilis. A atividade de lipoxigenases (LOX), inibidores de proteases e as concentrações de fitohormônios foram avaliadas nas folhas das forrageiras. A atividade de proteases totais e tripsina-like foram avaliadas na região do intestino de M. spectabilis. Os genótipos RX, MA e DE tiveram aumento na atividade de LOX após injúrias por M. spectabilis. A ativação da via da LOX está relacionada com o aumento nos níveis do hormônio jasmonato. O aumento na concentração de ácido abscisico aconteceu nos quatro cultivares. O ácido abscisico pode atuar sinergicamente com o jasmonato na transcrição de genes de defesa. Os cultivares MA e DE tiveram maiores níveis basais de ácido salicílico, mas apenas o cultivares DE foi capaz de aumentar os níveis do hormônio em resposta à herbivoria. A atividade de proteases totais foi maior em M. spectabilis que se alimentaram de DE, indicando secreção de enzimas. Há varialibidade na indução de LOX dentro da espécie Pennisetum purpureum. Todos os cultivares analisados apresentaram aumento nas concentrações de ABA e JA, quando atacados por M. spetabilis, indicando ações de defesa em comum. A indução nas concentrações de SA apenas em DE, pode indicar aumento nos níveis de radicais livres, que causam danos aos herbívoros. O aumento na atividade de proteases totais de M. spectabilis alimentadas com DE indica mecanismos de secreção de proteases para compensar àquelas inibidas, que não estão relacionado com enzimas tripsina-like. Mahanarva spectabilis are spittlebugs that cause several damages in tropical pastures, compromising cattle production. The chemical control of spittlebugs is economically unfeasible. Therefore, the selection of resistant forage grasses cultivars is an important control alternative. Studies reporting the biochemistry of the interaction between M. spectabilis and different forage grasses are rare. Thus, the goal was to assess the impact of M. spectabilis injury on the defensive response of elephant grass (Pennisetum purpureum), cv. Roxo Botucatu (RX) and cv. Pioneiro (PI), Brachiaria brizantha cv. Marandú (MA) and Brachiaria decumbens (DE). The impact of feeding on different cultivars of forages in the digestive proteases of the insect was also assessed. The experiment was carried out with four distinct cultivars, infested or not by M. spectabilis. The lipoxygenases activity, protease inhibitors and concentrations of phytohormones were evaluated in leaves of forage grasses. Total proteases and trypsin-like activities were evaluated in the gut region of M. spectabilis. RX, MA and DE genotypes showed increased LOX activity after injury by M. spectabilis. The LOX pathway activation is related to the increase in levels of the hormone jasmonate. The increase in abscisic acid concentration after injury occurred in the four genotypes. Abscisic acid acts synergistically with jasmonate in the transcription of defense genes. MA and DE cultivars had higher basal salicylic acid levels, but only DE was able to increase concentration in response to herbivory. There is variability in the induction of LOX within the species Pennisetum purpureum. All cultivares showed increased concentrations of ABA and JA when attacked by M. spectabilis, indicating common defense actions. Total proteases activity was higher in M. spectabilis fed with DE. The induction of SA concentration only in DE, may indicate an increase in free radical levels, which cause damage to herbivores. The increased activity of total proteases of M. spectabilis fed with DE indicates protease secretion mechanisms to compensate for those inhibited, which are not related to trypsin- like proteases.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A lagarta-da-soja, Anticarsia gemmatalis, é considerada uma das principais pragas da cultura da soja. Os danos causados pelo ataque deste inseto associado à relevância econômica do cultivo da soja para o Brasil e para o mundo fomentam a busca por alternativas no controle deste inseto. Estratégias de controle de insetos-pragas baseadas no uso de inibidores de proteases têm sido estudadas, o conhecimento das enzimas digestivas e metabolismo do inseto tem se mostrado fundamental. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo identificar proteínas com abundância diferencial no intestino de A. gemmatalis em resposta a inibidor de protease, visando obter dados que poderão contribuir para esclarecer o mecanismo adaptativo de A. gemmatalis em resposta a inibidores de proteases na interação planta-inseto. Foram dissecados intestinos de lagartas alimentadas com os inibidores de proteases berenil e o Kunitz, nas horas 6 h, 12 h, 24 h e 48 h e as proteínas extraídas por maceração. Os spots com abundância diferencial foram digeridos e os peptídeos analisados no espectrômetro de massa MALDI/TOF-TOF. Os espectros (MS/MS) foram pesquisados em bancos de dados usando a ferramenta MASCOT e as proteínas identificadas foram validadas usando o software Scaffold. Foram 44 spots de proteínas identificados, nos tratamentos com os inibidores berenil e Kunitz, nas diferentes horas, que correspondeu a 33 proteínas distintas. As proteínas identificadas pertenciam a diferentes categorias funcionais envolvidas no metabolismo energético, do carbono, de aminoácido, de carboidratos, de lipídeos, no estresse oxidativo e no turnover proteico e chaperonas moleculares. Algumas isoformas da proteína ATPase apresentaram menor abundância em relação ao controle, em ambos tratamentos. Enquanto a maioria das proteínas de choque térmico 70 apresentaram maior abundância que o controle. As proteínas piruvato desidrogenase, fosfoglicerato mutase e a ATP sintase aumentaram abundância e as proteínas aldeído desidrogenase e carbonil redutase diminuíram abundância no tratamento com berenil. No tratamento com Kunitz as proteínas arginina quinase e a choque térmico Hsp 90 aumentaram a abundância enquanto as proteínas enoil-CoA hidratase, ATP sintase e a aspartato aminotransferase diminuíram a abundância. A presença dos inibidores berenil e Kunitz na lagarta A. gemmatalis alterou o perfil de proteínas no intestino em ambos tratamentos. The soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, is considered one of the main pests of soybean crop. The damage caused by the attack of this insect associated to the economic relevance of soybean cultivation to Brazil and to the world foments the search for alternatives in the control of this insect. Strategies for control of insect pests based on the use of protease inhibitors have been studied, knowledge of digestive enzymes and insect metabolism has been shown to be fundamental. In this context, this work aimed to identify proteins with differential abundance in the midgut of A. gemmatalis in response to protease inhibitor, aiming to obtain data that could contribute to scientifically elucidate the adaptive mechanism of A. gemmatalis in response to protease inhibitors in the interaction plant and insect. Midgut of caterpillars fed with a berenyl protease inhibitor and Kunitz type soybean inhibitor were dissected at 6h, 12 h, 24 h and 48 h and the proteins extracted. Protein extracts were submitted to two-dimensional gel electrophoresis. The differential abundance spots were digested and the peptides analyzed in the MALDI / TOF-TOF mass spectrometer. Fragmentation spectra (MS / MS) were searched in databases using the MASCOT tool, and the identified proteins were validated using the Scaffold software. A total of 44 protein spots were identified in the berenyl and Kunitz treatments at different times, which corresponded to 33 distinct proteins. The proteins identified belong to different functional categories involved in the energy, amino acids, carbohydrates, lipids metabolism, oxidative stress, protein turnover and chaperones. Some ATPase protein isoforms presented lower abundance than control in both treatments. While most heat shock 70 proteins were more abundant than control. Pyruvate dehydrogenase, phosphoglycerate mutase and ATP synthase proteins increased abundance, and aldehyde dehydrogenase and carbonyl reductase proteins decreased abundance in berenyl treatment. In Kunitz treatment arginine kinase and heat shock Hsp 90 proteins increased abundance, while enoyl-CoA hydratase, ATP synthase and aspartate aminotransferase proteins decreased abundance. Berenyl and Kunitz inhibitors in caterpillar A. gemmatalis altered the protein profile in the midgut in both treatments.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Fungos nematófagos e fungos produtores de compostos com atividade nematicida representam uma alternativa potencialmente viável para o controle da população de nematoides parasitas. Além de promover a captura de nematoides por meio de hifas especializadas ou liberação de toxinas imobilizantes, a principal característica que confere potencial nematicida a esses fungos é a produção de enzimas extracelulares, principalmente as proteases, que atuam destruindo a cutícula dos nematoides por meio de hidrólise enzimática. Diante deste contexto o presente trabalho teve como objetivo produzir, purificar parcialmente, caracterizar e avaliar a aplicação de proteases do fungo Pycnoporus sanguineus PYC 02 no controle de Panagrellus redivivus. Micélios fúngicos foram obtidos através da transferência de discos de cultura do isolado previamente mantidos em meio BDA 2% (batata-dextrose-ágar), os quais foram transferidos para frascos contendo meio sólido composto por farelo de trigo acrescido de solução mineral estéril. O extrato bruto foi obtido após seis dias de incubação do fungo em BOD no escuro a 28°C. A purificação do extrato bruto se deu em duas etapas: ultrafiltração e cromatografia de troca iônica. Todas as etapas de purificação foram acompanhadas por eletroforese SDS-PAGE e o perfil de proteases das amostras foi avaliado por meio de um zimograma. As enzimas parcialmente purificadas, assim como o extrato bruto, foram caracterizadas em relação ao pH, à temperatura e à influência de íons e efetores no meio de reação. Por fim, foi avaliada a atividade nematicida dos extratos e das proteases parcialmente purificadas de P. sanguineus sobre larvas de P. redivivus. Após a purificação foram obtidos dois pools com atividade proteolítica denominados pool 1 e pool 2, que obtiveram fator de purificação de 6,14 e 1,67 respectivamente. O pool 1 apresentou atividade máxima em pH 8 e 50 °C. Observou-se um aumento da atividade enzimática em presença de íons Fe 2+ enquanto que a atividade foi inibida em presença de EDTA, SDS e Zn 2+ . Já o pool 2 apresentou atividade máxima em pH 3 e 50 °C, sua atividade foi fortemente inibida por SDS. Quanto ao potencial nematicida foi observado um percentual de redução de xlarvas de P.redivivus após 24 horas equivalente a 81,5% para os micélios do fungo, 24,4% para o extrato bruto, 50,5% para o pool 1 e 41% para o pool 2. Após 48 horas de ensaio essas percentagens foram de 80,9%, 55,8%, e 61,2% e 68,8% respectivamente. Diante dos resultados, foi demostrado que o fungo Pycnoporus sanguineus PYC 02, embora não seja classificado como fungo nematófago foi eficiente no controle de larvas de Panagrellus redivivus. Além das proteases ácidas já descritas na literatura, P. sanguineus quando cultivado em fermentação no estado sólido utilizando farelo de trigo como substrato, também produz ao menos uma protease alcalina. Estudos futuros sobre a produção de enzimas e metabólitos com atividade nematicida de Pycnoporus sanguineus PYC 02 são necessários para elucidar os mecanismos moleculares de atuação deste fungo como um possível agente biocontrolador. Nematophagous fungi and fungi that produce compounds with nematicidal activity represent a potentially viable alternative for controlling the population of nematode parasites. In addition to promoting the capture of nematodes by specialized hyphae or release of immobilizing toxins, the main feature which confers nematicidal potential these fungi is the production of extracellular enzymes, particularly proteases that act by destroying the cuticle of the nematode by enzymatic hydrolysis. Given this context, this study aimed to produce, purify partially, characterize and evaluate the application of Pycnoporus sanguineus PYC 02 proteases in Panagrellus redivivus control. Fungal mycelia were obtained by transferring dishes of the isolated culture previously maintained on 2% PDA medium (potato dextrose agar), which was transferred to vials containing solid medium composed of wheat bran plus sterile mineral solution. The crude extract was obtained after six days of incubation of the fungus in BOD in the dark at 28 ° C. Purification of the crude extract was given in two stages: ultrafiltration and ion exchange chromatography. All purification steps were monitored by SDS- PAGE and samples of the protease profile was assessed by a zymography. The previously purified enzymes, as well as crude extract, were characterized with regard to pH, temperature and the influence effectors and ions in the reaction medium. Finally, we evaluated the nematicidal activity of the extracts and purified proteases of P. sanguineus on P. redivivus. After purification were obtained two pools with proteolytic activity, called pool 1 and pool 2, which purification factor was 6.14 and 1.67, respectively. Pool 1 showed maximum activity at pH 8 and 50 °C. There was an increase of enzyme activity in the presence of Fe 2 + , while the enzyme was inhibited in the presence of EDTA, SDS, and Zn 2 + . On the other hand the pool 2 had maximum activity at pH 3 to 50 ° C and its activity was strongly inhibited by SDS. Regarding the potential nematicidal activity, it was observed the reduction percentage of P.redivivus, after 24 hours equivalent to 81.5% for the mycelia of fungi, 24.4% for the crude extract, 50.5% for pool 1 and 41% for pool 2. After 48 hours of testing, these percentages were 80.9%, 55.8% and 61.2% and 68.8%, respectively. Given the results, xiiit was shown that the fungus Pycnoporus sanguineus PYC 02, although it is not classified as nematophagous fungus was effective in controlling Panagrellus redivivus larvae. Besides the acidic proteases described in the literature, P. sanguineus when grown in solid state fermentation using wheat bran as substrate, also produces at least one alkaline protease. Future studies on the production of enzymes and metabolites with nematicidal activity by Pycnoporus sanguineus PYC 02 are needed to elucidate the molecular mechnisms of action of this fungus as a potential biocontrol agent.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior This study evaluated the effect of the growth of a proteolytic psychrotrophic strain of Pseudomonas fluorescens at temperatures of 4, 7 and 10 °C on the physicochemical characteristics and proteolysis of microfiltered milk. Skim milk was pasteurized and inoculated with the strain Pseudomonas fluorescens 041 at a concentration of approximately 104 mL CFU-1 and incubated at three temperatures for 48 h and, subsequently subjected to the microfiltration process. The proteolytic activity of the microfiltered milk was monitored until the thirtieth day of analysis by means of electrophoresis and by the analysis of the composition of the non-protein nitrogen (NPN) and not casein nitrogen (NCN). Monitoring of the microbiological and physico-chemical characteristics was conducted until the time of 45 d. After the incubation time counts of psychrotrophic microorganisms reached 1,7 x 106, 3,2 x 106 and 4,8 x 106 CFU mL-1 at the temperatures 4, 7 and 10 °C, respectively. After microfiltration using a membrane with pore size 0.8 μm in average, no presence of microorganisms per mL of milk could be detected, the logarithmic reductions were 6,9, 7,1 and 7,2 of aerobic mesophilic microorganisms, 6,2, 6,1 and 6,7 of psychrotrophic microorganisms and 2,9, 3,0 and 2,1 of aerobic spores in the milk pre-incubated at 4, 7 and 10 ° C, respectively. During the 45 d of storage the milk showed approximately constant values of acidity, pH and freezing point. The content of the fractions of α-S1, α- S2, β and κ-casein in microfiltered milk measured by gel electrophoresis remained constant over 30 d of monitoring indicating the absence of proteolysis. Fractions (NPN) and (NCN) in microfiltered milk were also monitored until the thirtieth day, not showing a linear increase over time, although the value of NCN at a pre-incubation temperature of 10 °C has provided higher values than those of pre-incubation temperatures of 4 and 7 °C. The results show that the useof a temperature of 10 °C caused proteolysis during pre-incubation which is stopped after microfiltration. A possible explanation for the lack of proteolysis during the storage time of the microfiltered milk is that concentrations of the psychrotrophic strain achieved after the time of pre-incubation were not sufficient for the production of extracellular enzymes at levels at which they could hydrolyze microfiltered milk. Thus, the proteolysis during pre-incubation at 10°C was attributed to proteolytic enzymes which are linked to the bacterial cell and these would have been removed during the microfiltration together with the bacteria. Este trabalho objetivou avaliar o efeito da multiplicação de uma estirpe psicrotrófica proteolítica de Pseudomonas fluorescens nas temperaturas de 4, 7 e 10 ºC, estabelecidas pela Instrução Normativa 62 do MAPA, nas características físicoquímicas e proteólise do leite microfiltrado. Amostras leite desnatado e pasteurizado foram inoculadas com a cepa Pseudomonas fluorescens 041 em uma concentração de aproximadamente 104 UFC mL-1 e incubadas nas três temperaturas por 48 h e, posteriormente, submetidas ao processo de microfiltração. O leite microfiltrado teve a atividade proteolítica monitorada até o trigésimo dia por meio das análises de eletroforese e da composição das frações nitrogenadas nitrogênio não proteico (NPN) e nitrogênio não caseínico (NCN). Enquanto, o monitoramento microbiológico e das características físico-químicas foi realizado até o tempo 45 d. Após o tempo de incubação as contagens de micro-organismos psicrotróficos atingiu 1,7 x 106, 3,2 x 106 e 4,8 x 106 UFC mL-1 nas temperaturas de 4, 7 e 10 ºC, respectivamente. Após a microfiltração utilizando membrana de 0,8 μm de tamanho médio de poros não foi detectada a presença de micro-organismos por mL de leite, alcançando reduções logarítmicas de 6,9, 7,1 e 7,2 de micro-organismos mesófilos aeróbicos, 6,2, 6,1 e 6,7 para psicrotróficos e 2,9, 3,0 e 2,1 de esporos aeróbicos nos leites préincubados a 4, 7 e 10 ºC, respectivamente. Durante os 45 d de estocagem o leite apresentou valores aproximadamente constantes de acidez, pH e crioscopia. O teor das frações de α-S1, α-S2, β, κ-caseínas mensurados no leite microfiltrado por meio dos géis de eletroforese permaneceram constantes ao longo de 30 d de monitoramento indicando ausência de proteólise. As frações (NPN) e (NCN) no leite microfiltrado também foram monitoradas até o trigésimo dia, não demonstrando aumento linear ao longo do tempo, embora o valor de NCN da temperatura de préincubação a 10 ºC tenha apresentado valores médios superiores aos das temperaturas de pré-incubação de 4 e 7 ºC. Os resultados mostram que na temperatura de 10 ºC ocorreu o início de proteólise durante a pré-incubação, sendo cessada após a microfiltração. A possível explicação da ausência de proteólise ao longo do tempo de estocagem do leite microfiltrado é porque nas concentrações atingidas da cepa psicrotrófica após o tempo de pré-incubação não tenham sido suficientes para produção de enzimas extracelulares em níveis que pudessem proteolisar o leite microfiltrado. Com isso, a proteólise durante a pré-incubação a 10 ºC foi atribuída a enzimas proteolíticas ligadas à célula bacteriana e teriam sido removidas durante a microfiltração junto com a bactéria por serem enzimas de membrana.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The insects may cause considerable losses to plants, necessitating the control of these pests. However, some insects inhabit plants without causing considerable losses. For example, Thyrinteina leucoceraea, native insect, inhabit guava plants, native Myrtaceae harbor, and don t need to be controled. The Eucalyptus ssp., however, is a novel Myrtaceae host in Brazil, from Austrália, and suffer attacks by T. leucoceraea, that became a severe pest to this plant. Plants can defend themselves and use proteinase inhibitors for defense against insects. The introduction of genes that encode proteinase inhibitors into plants can confer significant insect pest resistance to the transformants, moreover, researches have demonstrated the potential of the proteinase inhibitors in the insect food to reduce its development. Thus, the objectives of this work was to verify the production of proteinase inhibitors by guava plants, host apparently resistent, and eucalyptus plants upon T. leucoceraea attack, and to analyse the biochemistry answer of these caterpillars to the serine-proteinase inhibitor benzamidine, in both hosts, in three concentrations: 0.12, 0.25 and 0.5%, to evaluate its possibility use to control this insect. Eucalyptus plants produced more proteinase inhibitors than guava plants. The good development of T. leucoceraea in eucalyptus plants despite the high concentration of proteinase inhibitors, may be due to the elevation to the enzymes activity into the midgut of the caterpillars. The data suggest that T. leucoceraea developed an adaptation to the proteinase inhhibitor produced by eucalyptus plants, by increasing the serine-proteinase activity. This increase may be due to the ativation of the secundary site of the enzimes. The benzamidine interfered the biochemistry answer of the caterpillars, but didn t reduce its proteinase activity, probably due to the adaptation capacity of these insects to the inhibitor Os insetos são responsáveis por grandes perdas nas plantas, por isso há a necessidade de controlá-los. Entretanto, alguns insetos convivem com as plantas sem causarem danos, não havendo, portanto, necessidade de se realizar o controle. Esse é o caso da Thyrinteina leucoceraea se alimentando da goiabeira, espécie nativa da família das Myrtaceae. O Eucalyptus ssp., entretanto, é exótico, vindo da Austrália, também pertence à família das Myrtaceae, e tem sofrido danos pela T. leucoceraea, que se tornou uma praga séria à eucaliptocultura brasileira. Sabe-se que as plantas, em geral, reagem aos danos que sofrem. Existem nas plantas compostos chamados inibidores de proteases que podem ser produzidos nelas como resposta ao ataque de insetos. A introdução de genes que codificam a produção de inibidores de proteases em plantas constitui em método que vem sendo muito estudado por conferir resistência a insetos; além disso, muitas pesquisas vêm demonstrando o potencial dos inibidores de proteases introduzidos na dieta com a finalidade de prejudicar o desenvolvimento do inseto. Assim, o presente trabalho teve por objetivo verificar a produção de inibidores de proteases pelas plantas de goiaba, hospedeiro aparentemente resistente, e de eucalipto quando atacadas pela T. leucoceraea, bem como a resposta bioquímica dessas lagartas quando ingeriram o inibidor de serino-proteases benzamidina em ambos os hospedeiros, em três diferentes concentrações: 0,12, 0,25 e 0,5%, para avaliar sua possibilidade de uso no controle do inseto. Verificamos que as plantas de eucalipto produziram mais inibidores de proteases do que as plantas de goiaba. A capacidade da T. leucoceraea em se desenvolver bem no eucalipto mesmo com a alta concentração de inibidores, pode ser explicada observando as atividades das enzimas nos intestinos das lagartas. A T. leucoceraea parece ter desenvolvido uma adaptação ao inibidor produzido pela planta de eucalipto e responde com uma elevação da atividade das serino-proteases, o que pode ser devido a uma ativação enzimática frente à ingestão crônica do inibidor. A benzamidina interferiu na resposta bioquímica das lagartas, entretanto não se mostrou eficiente em reduzir a atividade enzimática no intestino médio delas, provavelmente devido à adaptação das mesmas ao inibidor de proteases

O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de fatores determinados pela granelização do leite cru refrigerado na estabilidade do leite. Foram enfati- zados os efeitos da temperatura de refrigeração e do tempo de estocagem na composição da microbiota contaminante do leite cru, na atividade proteolítica do leite, na atividade enzimática residual após tratamento UHT, bem como seu possível efeito na estabilidade do leite UHT. Amostras de leite cru coletadas em tanques de refrigeração, na fonte de produção e no silo de uma indústria processadora de leite UHT, foram analisadas quanto as suas características microbiológicas. Bactérias psicrotróficas proteolíticas Gram-negativas e Gram- positivas foram isoladas do leite cru refrigerado, sendo o gênero Pseudomonas o mais freqüentemente isolado, especialmente a espécie P. fluorescens. Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas fermentadoras de glicose apre- sentaram predominantemente atividade proteolítica a 6,5, 21 e 35oC e bactérias Gram-negativas não-fermentadoras de glicose apresentaram um maior percentual de isolados com atividades associadas de proteases, lipases e lecitinases a 6,5 e 21oC, ressaltando seu maior potencial deteriorador. A presença de atividade de enzimas proteolíticas termorresistentes foi observada em sobrenadantes de culturas de bactérias psicrotróficas proteolíticas. A capacidade de adesão a superfícies de aço inoxidável foi constatada em bactérias psicrotróficas proteolíticas Gram-positivas e Gram-negativas até uma densidade de 10 5 células por cm 2 , quando inoculadas em leite desnatado esterilizado a 7oC, por 48 horas. Observou-se o crescimento de P. fluorescens inoculado em leite desnatado a 2, 4, 7 e 10°C, constatando-se o aumento de sua população, do grau de proteólise e da velocidade específica máxima de crescimento com o aumento da temperatura de estocagem. O tempo, em dias, para a perda de estabilidade térmica dessas amostras foi maior a 2 e a 4oC, em relação a 7 e 10oC. Por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida obser- vou-se que a temperatura e o tempo de estocagem influenciaram na hidrólise das frações de caseína e da albumina. As amostras de leite cru integral, coletadas assepticamente e usadas como controle, não diferiram quanto aos perfis eletroforéticos após seis dias de estocagem, nas temperaturas avaliadas, demonstrando a importância de investimentos para a implementação de práticas higiênicas de obtenção e conservação da matéria-prima. O tratamento UHT reduziu, em média, 93,2% da atividade proteolítica presente no leite cru integral usado como matéria-prima para o processamento do leite UHT, indicando a presença de atividade proteolítica residual de origem bacteriana e, ou, endógena. Observou-se o aumento da massa de sedimentos, do grau de proteólise e da atividade proteolítica durante a estocagem do leite UHT integral a 37°C, por 120 dias. Em nenhuma das amostras de leite UHT foram consta- tadas contaminações por bactérias mesofílicas e por bactérias mesofílicas esporuladas, além de indícios de gelificação. Todas as amostras permane- ceram termicamente estáveis durante o período de validade do produto. This work aimed at investigating the effect of variables determined for refrigerated bulk raw milk on milk stability. Emphasis was given to the effects of refrigeration temperature and storage time on raw milk s contaminant microbiota composition, proteolytic activity, residual enzymatic activity after UHT treatment as well as their possible effect on UHT milk stability. Samples of bulk raw milk, collected from cooling tanks at the production sites and from a silo of a UHT milk processing industry were analyzed for microbiological characteristics. Gram-negative and Gram-positive proteolytic psychrotrophs were isolated from the refrigerated raw milk, with the genus Pseudomonas being the most frequently isolated strain, especially the species P. fluorescens. Gram-positive and Gram-negative glucose-fermenting bacteria presented a predominantly proteolytic activity at 6.5, 21, and 35oC and Gram-negative non-glucose fermenting bacteria presented a higher percentage of isolates with activities associated to proteases, lipases, and lecithinase at 6.5 and 21oC, indicating their higher deteriorating potential. The presence of heat-resistant proteolytic activity was observed in the supernatants of psychrotrophic bacterial cultures. The capacity to adhere to stainless steel surfaces was confirmed in Gram- positive and Gram-negative proteolytic psychrotrophics up to a density of 10 5 cells per cm 2 inoculated in sterilized skim milk at 7oC after 48 h of incubation. The maximum specific growth rate and the proteolytic activity of P. fluorescens inoculated in skim milk increased with increasing storage temperatures (2, 4, 7 and 10°C). Heat-stability loss (in days) for these samples was higher at 2 and at 4oC, in relation to 7 and 10oC. Temperature and storage time influenced the hydrolysis of casein and albumim. The raw whole milk samples, aseptically collected and used as control, showed no changes in the eletrophoretic profiles after six storage days under the temperatures evaluated, showing the importance of investing on the implementation of hygienic practices of raw material acquisition and conservation. The UHT treatment reduced, on average, 93.2% of the proteolytic activity in the raw whole milk used as raw material for UHT milk processing, indicating the presence of residual proteolytic activity of bacterial and, or endogenous origin. Increased sediment mass, proteolysis degree, and proteolytic activity were observed during storage of UHT whole milk at 37°C, for 120 days. None of the UHT milk samples were found to be contaminated with sporulating mesophilic bacteria or showed signs of gelation. All the samples remained heat stable during shelf-life.