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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório capaz de infectar uma grande variedade de células. Este parasito apresenta uma grande habilidade de explorar diversas moléculas presentes na superfície das células e ultrapassar diferentes barreiras biológicas, e finalmente alcançar os tecidos considerados imunologicamente privilegiados, como a placenta. Embora esse órgão represente uma formidável barreira contra a infecção por T. gondii, a transmissão deste para o feto pode ocorrer em alguns casos. Entretanto, os mecanismos envolvidos na transmissão do parasito pela placenta ainda são mal compreendidos. Assim, o presente trabalho teve dois objetivos gerais: (i) avaliar o papel de ICAM-1 na passagem transplacentária de T. gondii em modelos animais murinos C57BL/6 WT e ICAM-1 knockouts (ICAM-1-/-); e (ii) caracterizar células trofoblásticas mesenquimais humanas (TSCT) para avaliar se elas recapitulam a sensibilidade de células trofoblásticas primárias humanas frente a infecção por T. gondii, bem como avaliar a expressão diferencial de genes entre células citotrofoblásticas (TSCYT) e sinciciotroblásticas (TSSYN) após a infecção. Para responder ao primeiro objetivo, fêmeas WT e ICAM-1-/- foram acasaladas e após a detecção do início da gestação, os animais foram infectados com 5 cistos da cepa ME-49 de T. gondii e divididos em diferentes grupos de acordo com o dia de infecção e eutanásia (8dg/8di, 14dg/7di, 19dg/12di e 19dg/8di). Fêmeas prenhes não infectadas foram usadas como controles (8dg/ni, 14dg/ni, 19dg/ni). Em todos os animais foram avaliados o número de sítios de implantação, e de reabsorção. Além do mais, foi coletado o soro para análise de citocinas por CBA; os órgãos maternos, incluindo cornos uterinos, e embriões/fetos e placentas foram coletados para avaliação do parasitismo por qPCR. Os resultados mostraram que fêmeas ICAM-1-/- infectadas no início da gestação (8dg/8di) e no final do terço médio de gestação (19dg/8di) tiveram maior comprometimento do sucesso gestacional se comparado às fêmeas WT. Em relação ao parasitismo, fêmeas ICAM-1-/- 8dg/8di e 14dg/7di apresentaram maior taxa de infecção por T. gondii no corno uterino gravídico e na placenta, respectivamente, ao comparar com fêmeas WT. Por outro lado, não foram verificadas diferenças significativas na carga parasitária no baço e fígado entre as fêmeas ICAM-1-/- e WT nos grupos 8dg/8di e entre os tecidos fetais dos animais ICAM-1-/- e WT nos grupos 14dg/7di. Adicionalmente, a dosagem de citocinas mostrou que IFN-γ, TNF- α, IL-6 e IL-10 foram moduladas pela infecção dependendo do tempo gestacional. Para a realização do segundo capítulo, células TSCYT foram cultivadas em cultura e diferenciadas em TSSYN e infectadas ou mock infectadas (apenas meio) com T. gondii. Em seguida, foi avaliada a porcentagem de diferenciação em células TSSYN, bem como a taxa de infecção entre as células TSCYT e TSSYN por meio ensaio de RT-qPCR. O sobrenadante foi coletado para dosagem da quimiocina CCL22. Em seguida, células infectadas e mock infectadas foram coletadas e submetidas à análise pelo sequenciamento de RNA. Os dados mostraram que TSSYN foram altamente refratárias à adesão e replicação de T. gondii quando comparado com as células TSCYT. Além do mais, os resultados mostraram que ambas as células não foram capazes de produzir CCL22 em reposta à infecção pelo parasito. Também, os dados de RNA-seq mostraram diferenças no transcriptoma entre TSSYN e TSCYT após a infecção com T. gondii, evidenciando que vias relacionadas ao metabolismo e ao ciclo celular foram reguladas negativamente em células TSSYN em comparação com TSCYT. Finalmente, o perfil transcricional de T. gondii identificou diferenças significativas na expressão de genes em parasitos que infectaram/ou estavam associados às células TSSYN em relação às células TSCYT, evidenciando alterações nos genes envolvidos na replicação do DNA e no metabolismo, principalmente nas vias relacionadas com a síntese de ácidos graxos. Em conjunto, nossos dados indicaram que células TSCT representam um promissor modelo no estudo das interações T. gondii/placenta, além disso, os resultados sugerem que a resistência das células TSSYN pode estar associada ao baixo metabolismo celular e baixa produção de nutrientes por tais células, conferindo um ambiente estressante para o desenvolvimento do parasito. Toxoplasma gondii is an intracellular protozoan parasite that is able to infect a wide variety of cells. This parasite has a great ability to explore various molecules present on the surface of cells and overcome different biological barriers, and finally reach the tissues considered immunologically privileged, such as placenta. Although this organ represents a formidable barrier against a T. gondii infection, its transmission to the fetus can occur. However, the mechanisms involved in the transmission of the parasite through the placenta are still poorly understood. Therefore, the present work had two major goals: (i) evaluate the role of ICAM-1 in the transplacental passage of T. gondii in murine animal models C57BL/6 WT and ICAM-1 knockouts (ICAM-1-/-); and (ii) characterize human mesenchymal trophoblastic cells (TSCT) to assess whether they recapitulate the sensitivity of primary human trophoblastic cells by T. gondii infection, as well as to evaluate the differential gene expression between cytotrophoblastic (TSCYT) and synciciotroblastic cells (TSSYN) after the infection. To answer the first objective, WT and ICAM-1-/- mice were mated and after detecting the first day of pregnancy, the animals were infected with 5 cysts of ME-49 strain of T. gondii and divided in different groups according to the day of infection and euthanasia (8dg / 8di, 14dg / 7di, 19dg / 12di and 19dg / 8di). Uninfected pregnant females were used as controls (8dg/ni, 14dg/ni, 19dg/ni). The number of implantation and resorption sites was evaluated. In addition, serum was collected for cytokine analysis; maternal organs, including uterine horns, and embryos/fetus and placentas were collected to assess the parasitism by qPCR. The results showed that ICAM-1-/- females infected at the beginning of pregnancy (8dg/8di) and at the end of the middle third of pregnancy (19dg/8di) had a greater impairment of gestational success compared to the WT females. Regarding to the parasitism, ICAM-1-/- 8dg/8di and 14dg/7di presented higher rates of infection in uterine horns and in the placenta, respectively, compared to WT. On the other hand, no significant differences were seen in the parasitism in the spleen and liver between ICAM-1-/- and WT in the 8dg/8di groups, and between fetal tissues of ICAM-1-/- and WT animals in the group 14dg/7di. Additionally, the cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-6 and IL-10 were modulated by infection depending on the gestational time. For the second chapter, TSCYT cells were cultured and differentiated into TSSYN and infected or mock infected (only medium) with T. gondii. Then, the percentage of differentiation in TSSYN cells was evaluated, as well as the infection rate between TSCYT and TSSYN cells through the RT-qPCR assay. The supernatant from the different experimental conditions was collected to measure the chemokine CCL22. Then, infected and mock infected cells were collected and subjected to analysis by RNA sequencing. The data showed that TSSYN were highly refractory to the adhesion and replication of T. gondii when compared with TSCYT cells. Furthermore, the results suggested that both cells are not able to produce CCL22 in response to the parasite infection. Evaluating the RNA-seq data, we observe a huge difference in the transcriptome between TSSYN and TSCYT after the infection by T. gondii, showing that pathways related to metabolism and the cell cycle are negatively regulated in TSSYN cells compared to TSCYT. Finally, the transcriptional profile of T. gondii identified differences in gene expression in the parasites that infected/or were associated with TSSYN cells in relation to TSCYT cells, showing differences in genes involved in DNA replication and metabolism pathways, especially those related to the biosynthesis of fatty acids. Together, our data indicate that TSCT cells represent a promising model in the study of T. gondii/placenta interactions; moreover, we suggest that the resistance of TSSYN cells may be associated with low cell metabolism and low nutrient production by such cells, providing a stressful environment for the development of the parasite. Tese (Doutorado)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O tratamento clássico para a toxoplasmose congênita é baseado na combinação de sulfadiazina e pirimetamina mais ácido folínico. Devido aos efeitos teratogênicos e a supressão da medula óssea causados pela pirimetamina, o estabelecimento de novos alvos terapêuticos é indispensável para minimizar os efeitos indesejáveis e melhorar o controle da infecção por T. gondii. Estudos prévios demonstraram que enrofloxacina e toltrazuril são capazes de controlar o parasitismo em infecções por Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de enrofloxacina e toltrazuril no controle da proliferação de Toxoplasma gondii em células trofoblásticas humanas (linhagem BeWo) e em explantes de vilos placentários humanos de terceiro trimestre. Células BeWo e vilos foram tratados com diferentes concentrações de enrofloxacina, toltrazuril, sulfadiazina, pirimetamina ou associação (sulfadiazina + pirimetamina) com o objetivo de avaliar a viabilidade pelo ensaio de MTT ou LDH, respectivamente. Em seguida, células BeWo foram infectadas com as cepas RH (clone 2F1) ou ME-49 de T. gondii, enquanto que os vilos foram infectados somente com a cepa RH. Em seguida, células e vilos foram tratados ou não com os mesmos medicamentos e a proliferação intracelular do parasito foi analisada pelo ensaio da β-galactosidase (para a cepa RH) ou coloração com azul de toluidina (para a cepa ME-49) e o perfil de citocinas foi analisado. Enrofloxacina e toltrazuril não alteraram a viabilidade nas células BeWo e nos vilos quando administrados nas menores concentrações. Além do mais, as drogas diminuíram a proliferação intracelular de T. gondii independentemente da cepa utilizada em células BeWo e em explantes de vilos quando comparado as condições infectadas e não tratadas. Em células BeWo infectadas por RH, enrofloxacina induziu altos níveis de IL-6 e não modificou significativamente a produção de MIF, enquanto que ambas as citocinas IL-6 e MIF foram produzidas por células BeWo infectadas com a cepa ME-49 e tratadas com enrofloxacina e toltrazuril. Adicionalmente, em vilos placentários, enrofloxacina induziu alta produção de MIF. Assim, podemos concluir que enrofloxacina e toltrazuril foram capazes de controlar o parasitismo em células BeWo e em explantes de vilos placentários humanos. Provavelmente este controle do parasitismo mediado por estas drogas ocorra por modulação da resposta imune nas células BeWo e tecidos placentários, mas não exclui a possibilidade de ação direta no parasito, entretanto futuros experimentos devem ser conduzidos para verificar esta hipótese. The classical treatment for congenital toxoplasmosis is based on combination of sulfadiazine and pyrimethamine plus folinic acid. Due to teratogenic effects and bone marrow suppression caused by pyrimethamine, the establishment of new therapeutic targets is indispensable to minimize the undesirable effects and improve the control of the infection. Previous studies demonstrated that enrofloxacin and toltrazuril were able to control the infection triggered by Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Therefore, the aim of this present study was evaluate the efficacy of enrofloxacin and toltrazuril in the control of T. gondii proliferation in human trophoblast cells (BeWo lineage) and in human villous explants from third trimester. BeWo cells and villous were treated with several concentrations of enrofloxacin, toltrazuril, sulfadiazine, pyrimethamine or association (sulfadiazine + pyrimethamine) in other to verify their viability by MTT or LDH assay, respectively. Next, BeWo cells were infected with T. gondii RH (2F1 clone) or ME49 strain, whereas villous were infected only with RH strain (2F1 clone), after, both cells and villous were treated or not with the same antibiotics and analyzed to T. gondii intracellular proliferation by beta-galactosidase assay (for RH strain) or blue toluidine staining (for ME49 strain). ELISA was performed in the supernatant to evaluate the cytokine profile. Enrofloxacin and toltrazuril did not change strongly the viability in cells and villous. Furthermore, the drugs decreased the parasite intracellular proliferation regardless T. gondii strain in BeWo cells and villous explants when compared to untreated and infected conditions. In BeWo cells infected by RH, enrofloxacin induced high levels of IL-6 low levels of MIF, while both cytokines were upregulated by enrofloxacin and toltrazuril in BeWo cells infected by ME49 strain. Additionally, in villous explantes, enrofloxacin induced high MIF production. Thus, enrofloxacin and toltrazuril were able to control the parasitism in BeWo cells and villous explants, and probably it occurs by modulation of immune response in these cells or tissues and direct action on parasite, but future experiments are necessary to verify this hypothesis. Dissertação (Mestrado)