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In this work was studied the immobilization process β-galactosidase from Aspergillus oryzae by adsorption and cross-linking with glutaraldehyde, using as carrier ions-exchangers such as Duolite A-568, Duolite S-761, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C and Amberlite 252 Na. Through innitial results, Duolite A-568 was choosed for the continuance of the work. The influence of the enzyme concentration and pH in the immobilization process was studied using a Central Composit Design (CCD) for a fixed time of 12 hours and temperature of 25°C. The optimal conditions for enzyme immobilization were pH 4,5 and galactosidase concentration 16 g/L. In the sequence, was studied the influence of glutaraldehyde concentration as cross-linking reagent and reaction time in the activity and in stability of the immobilized biocalyst, which were of 3,5 g/L and 1,50 h. The residual activity of the immobilized enzyme without cross-linking with glutaraldehyde after 30 uses was 51% as compared with the initial activity, while the enzyme immobilized with cross-linking was 90%. The immobilized enzyme with cross-linking presented higher pH stabilyt pH when compared to that without the referred treatment. The simultaneous influence of pH and temperature on the immobilized enzyme activity was studied through a PCC with the biocalyst produced in the optimized conditions of immobilization process. With the technique response surface it was possible to obtain the optimized pH of 4,1 and temperature of 34°C. The influence of the lactose concentration was studied in the range of 5 to 140 g/L and the Michaelis-Menten model was adjusted to the experimental results, with values of Vm and Km of 0,71 U and 12.07 g/L, respectively. In the study of the influence of the galactose as inhibitor of the lactose hydrolysis, the competitive inhibition model was adjusted to the experimental results and the values of Vm, Km and Ki were 0,77 U, 12,07 g/L and 4,94 g/L respectively. Neste trabalho estudou-se o processo de imobilização da enzima β-galactosidase de Aspergillus oryzae por adsorção e ligação cruzada com glutaraldeído, utilizando como suporte resinas de troca iônica Duolite A-568, Duolite S-761, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C e Amberlite 252 Na. Resultados preliminares da resina Duolite A-568 apresentaram melhor retenção de atividade enzimática, sendo assim a mesma foi utilizada para os trabalhos subsequentes. A influência da concentração da enzima e do pH no processo de imobilização foi estudada empregando um Planejamento Composto Central (PCC) fixando tempo de 12 horas e temperatura de 25°C. As condições ótimas de imobilização foram pH 4,5 e concentração de β-galactosidase de 16 g/L. Na seqüência, foi realizado um estudo da influência da concentração de glutaraldeído como agente reticulante e do tempo de reação na atividade e na estabilidade do biocatalisador imobilizado. A concentração de glutaraldeído que implicou em um biocatalisador de maior atividade enzimática foi de 3,5 g/L, num tempo de reação de 1,50 horas. A atividade da enzima imobilizada sem tratamento com glutaraldeído após 30 usos foi de 51% em relação à inicial, enquanto que a da enzima imobilizada com reticulação foi de 90%. A enzima imobilizada empregando ligação cruzada com glutaraldeído foi muito mais estável em relação ao pH quando comparada àquela sem o referido tratamento. A seguir foi realizado um estudo da influência conjunta da temperatura e do pH na atividade da enzima imbilizada por meio de um PCC, utilizando o biocatalisador produzido nas condições otimizadas de imobilização e ligação cruzada. Com o emprego da técnica de superfície de resposta foi possível otimizar, dentro das faixas estudadas, as variáveis pH igual a 4,1 e temperatura de 34°C. A influência da concentração de lactose foi estudada para uma faixa de 5 a 140 g/L e o modelo de Michaelis-Menten ajustou-se bem aos resultados experimentais, com valores de Vm e Km de 0,71 U e 12,07 g/L, respectivamente. No estudo da influência da galactose como inibidor da reação de hidrólise, o modelo que melhor se ajustou aos resultados experimentais foi o modelo de inibição competitivo, com valores de Vm, Km e Ki iguais 0,77 U, 12,07 g/L e 4,94 g/L respectivamente. Mestre em Engenharia Química

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Atualmente o Brasil é o segundo maior produtor mundial de etanol, apresentando uma posição favorável por apresentar vantagens na tecnologia de produção, como grandes áreas cultiváveis e condições climáticas favoráveis. Além disso, o Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, a qual é matéria-prima mais eficiente conhecida para a produção de etanol, sendo sua produção a partir do caldo de cana um processo bem estabelecido no país. Estes fatores, juntamente com a crescente demanda mundial por etanol, tornam o Brasil altamente competitivo na sua comercialização. O melaço, principal subproduto da indústria açucareira, apresenta elevadas concentrações de açúcares fermentescíveis, sendo por isso uma potencial matéria-prima para fins de produção de bioetanol. Com a finalidade de reduzir os custos de produção, estudos são impulsionados na direção de encontrar leveduras e processos alternativos que alcancem altos rendimentos e produtividades para a fermentação alcoólica. A utilização de leveduras floculantes na produção do bioetanol permite a eliminação da etapa de centrifugação, uma vez que estas leveduras são facilmente decantáveis na ausência de açúcares fermentescíveis. Adicionalmente, a tecnologia de fermentação sob alta concentração de açúcar, conduzida em batelada alimentada minimiza o efeito da inibição pelo substrato. O objetivo deste trabalho foi estudar as condições da fermentação em batelada alimentada, utilizando uma cepa de Saccharomyces cerevisiae de características floculantes em altas concentrações de melaço de cana-de-açúcar. Foi realizado um estudo da capacidade fermentativa e de floculação de quatro cepas floculantes, que resultou na escolha da cepa Saccharomyces cerevisiae C2/00, doada pelo Centro de Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA). Após a escolha da cepa foi determinado seu tempo de geração utilizando meio sintético, obtendo um valor igual a 1,071 h. Avaliou-se a influência da suplementação com os nutrientes (KH2PO4, MgSO4∙7 H2O, [NH4]2SO4 e extrato de levedura) na fermentação em batelada de meio à base de melaço de cana-de-açúcar em diferentes concentrações, obtendo a maior eficiência (85,4%) utilizando solução de melaço 30,0% v/v sem adição de nutrientes. Verificou-se também que a adição de nutrientes no meio fermentativo à base de melaço não melhora a eficiência do processo para concentrações de melaço acima de 20,5% v/v. A aeração na fermentação NG em batelada alimentada foi estudada como forma de melhorar o processo, entretanto a aeração favoreceu o crescimento celular em detrimento da produção de etanol. Posteriormente avaliou-se três fermentações, HG e VHG, com alimentação à base de melaço com concentrações diferentes de ART. O total de ART adicionado nas fermentações foi de 209, 222 e 250 g/L. A fermentação de 225 g/L de ART resultou em melhor eficiência (89,45%) com concentração final de etanol de 104,4 g/L enquanto a fermentação de 209 g/L de ART apresentou maior produtividade (2,98 g/(L.h)) dentre elas. A concentração máxima de etanol (P’máx) que a levedura C2/00 foi capaz de alcançar foi determinada, obtendo valor igual a 105,35 g/L. A partir dos dados experimentais da fermentação de 225 g/L foi proposto um modelo cinético, onde seus parâmetros foram determinados por meio do ajuste não linear dos dados. A velocidade específica máxima de crescimento foi de 0,555 h-1 com KS e KIS iguais a 2,63 e 12,437 g/L, respectivamente. Os resultados obtidos com os experimentos foram relevantes para a fermentação HG com melaço de cana-de-açúcar utilizando cepa floculante. Para aumentar a concentração de etanol final no vinho outras estratégias devem ser adotadas para que a levedura consiga suportar maiores concentrações de etanol. Currently Brazil is the second world's largest producer of ethanol, presenting a favorable position to present advantages in the technology of production, such as large cultivable areas and favorable climatic conditions. In addition, Brazil is the world's largest producer of sugarcane, which is the most efficient raw material known for the production of ethanol, being its production from sugarcane juice is a well-established process in the country. These factors together with the growing world demand for ethanol make Brazil highly competitive in its commercialization. Molasses, the main by-product of the sugar industry, has high concentrations of fermentable sugars, being therefore a potential raw material for the production of bioethanol. In order to reduce production costs, studies are promoted in the direction of finding yeasts and alternative processes that achieve high yields and productivities for alcoholic fermentation. The use of flocculent yeasts in the production of bioethanol allows the elimination of the centrifugation step, once these yeasts decant in the absence of fermentable sugars. Additionally, fermentation technology under high concentration of sugar, conducted in fed-batch, minimizes the effect of inhibition by substrate. The objective of this work was to study the conditions of fed-batch fermentation using a strain of Saccharomyces cerevisiae with flocculent characteristics in high concentrations of sugarcane molasses. A study of the fermentation and flocculation capacity of four flocculent strains was carried out, which resulted in the selection of the Saccharomyces cerevisiae C2/00 strain donated by the Center of Chemical, Biological and Agricultural Research (CPQBA). After the choice of the strain was determined its generation time using synthetic medium, obtaining a value equal to 1,071 h. It was evaluated the influence of supplementation with nutrients (KH2PO4, MgSO4∙7H2O, [NH4]2SO4 and yeast extract) in the batch fermentation of medium based on sugarcane molasses in different concentrations obtaining the highest efficiency (85.4%) using 30.0% v/v molasses solution without addiction of nutrients. It has also been verified that the addition of nutrients in the molasses based fermentation medium does not improve the efficiency of the process for molasses concentrations above 20.5% v/v. Aeration in the NG fermentation in fed-batch was studied as a way to improve the process, however aeration favored cell growth in detriment of ethanol production. Subsequently, three fermentations, HG and VHG, with molasses based feed with different concentrations of ART were evaluated. The total amount of ART added in the fermentations was 209, 222 and 250 g/L. Fermentation of 225 g/L of ART resulted in better efficiency (89.45%) with final concentration of ethanol of 104.4 g/L while fermentation of 209 g/L of ART showed higher productivity (2.98 g/(Lh)) among them. The maximum concentration of ethanol (P'max) that the yeast C2/00 was able to reach was determined, obtaining a value equal to 105.35 g/L. From the experimental data of the fermentation of 225 g/L a kinetic model was proposed, where its parameters were determined by means of the nonlinear adjustment of the data. The maximum specific growth rate was 0.555 h-1 with KS and KIS equal to 2.63 and 12.437 g/L, respectively. The results obtained with the experiments were relevant for HG fermentation with sugarcane molasses using flocculent strain. To increase the final ethanol concentration in the wine, other strategies must be adopted so that the yeast can withstand higher concentrations of ethanol. Dissertação (Mestrado)

FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais O setor energético é um dos campos de grande relevância econômica no Brasil e em diversos países no mundo. Nesse sentido, os combustíveis fosseis são os mais empregados, mas geram grandes impactos ambientais, além de serem uma fonte não renovável. Para substituir e suprir a grande demanda por combustíveis, o etanol de segunda geração, que é produzido a partir de resíduos ou subprodutos, tem sido uma alternativa promissora. No entanto, as usinas possuem desafios para tornar viável esta operação em larga escala. A biomassa utilizada como substrato é composta por um complexo de celulose, hemicelulose e lignina, sendo a lignina uma macromolécula que confere rigidez e impermeabilidade às células vegetais. Após a etapa de pré-tratamento, responsável pela quebra da lignina, a biomassa requer a hidrólise da celulose e da hemicelulose para disponibilizar os açúcares fermentescíveis para a fermentação. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar oito cepas de fungos para produção de complexo enzimático através de fermentação em estado sólido e estudar as melhores condições de processo (sistema de aeração forçada, composição do meio e tempo de fermentação) para a produção de celulases utilizando resíduos agroindustriais de farelo da casca do milho, bagaço de cana-deaçúcar, farelo da palha do arroz e resíduo da torra e trituração do café. As melhores condições de produção das celulases foram alcançadas com sistema sem aeração forçada, composição de substrato com 40% de bagaço de cana, 30% de farelo da casca do milho e 30% de resíduo do café e tempo de 72 horas de fermentação, utilizando os microrganismos Penicillium oxalicum e Trichoderma reesei, obteve-se atividade enzimática (FPase) 0,081±0,002 FPU/mL e 0,080±0,002 FPU/mL, respectivamente. Com a utilização do complexo enzimático obteve-se uma produção de etanol celulósico para Penicillium oxalicum de 3,13±0,21 g/L e Trichoderma reesei de 3,59±0,32 g/L de etanol, em fermentação batelada com Saccharomyces cerevisiae em 48 horas a 35°C. The energy sector is one of the fields of great economic importance in Brazil and in several countries in the world. In this sense, fossil fuels are the most used, but generate large environmental impacts, besides being a non-renewable source. Second-generation ethanol, which is produced from waste or by-products, has been a promising alternative to replace and supply the great demand for fuels. However, the plants have challenges to make this operation viable on a large scale. The biomass used as substrate is composed of a complex of cellulose, hemicellulose and lignin, with lignin being a macromolecule that gives rigidity and impermeability to plant cells. After the pre-treatment stage, responsible for the breakdown of lignin, the biomass requires the hydrolysis of cellulose and hemicellulose to make fermentable sugars available. Thus, the objective of this work was to evaluate eight fungal strains for the production of enzymatic complex through solid state fermentation and to study the best process conditions (forced aeration system, medium composition and fermentation time) for the production of cellulases using agroindustrial residues from corn husk meal, sugar cane bagasse, rice bran meal and roast residue and coffee grinding. The best conditions of cellulase production were achieved with a non-aerated system, substrate composition with 40% sugarcane bagasse, 30% corn husk meal and 30% coffee residue and 72 hours fermentation time using the microorganisms Penicillium oxalicum and Trichoderma reesei, enzymatic activity (FPase) was obtained 0.081±0.002 FPU/mL and 0.080±0.002 FPU/mL, respectively. With the use of the enzymatic complex, a cellulosic ethanol production for Penicillium oxalicum of 3.13±0.21 g/L and Trichoderma reesei of 3.59±0.32 g/L of ethanol was obtained in batch fermentation with Saccharomyces cerevisiae in 48 hours at 35°C. Dissertação (Mestrado) 2021-02-19

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The increase in energy consumption, depletion of fossil fuels and growing concerns about the environment have become strong justifications for energy generation applied to the use of biofuels. In expanding production of bioethanol by Brazilian plants, the incorporation of innovative processes and technological development have had a key role, with increased production efficiency and progressive reduction of environmental impacts and agricultural economy, especially with regard to reducing the volume of stillage, a byproduct of ethanol production. In this work was studied the yeast Saccharomyces cerevisiae Y904 resistance in alcoholic fermentation process operating in fed batch reactor by analyzing the effect of the reactor feeding time, temperature, concentration of inoculum and substrate on fermentation yield, productivity and concentration residual reducing sugars. Assays were carried out in a mini fermentor using a synthetic medium sucrose-based and yeast extract. The sugar and ethanol concentrations were determined by liquid chromatography (HPLC), and cell concentrations were determined by spectrophotometric method. Through a statistical analysis in Statistica 7.0 software was possible to determine the tracks that maximized the variables in the factorial experimental design and the Central Composed Design. As a result, it was found that the maximum concentration at which ethanol production thereof was completely inhibited (P\'max) was 137 g/L obtained at 25 °C. It was observed that using the condition that maximizes generated at the CCD variables, temperature 26 °C, 5 hours filling, 240 g/L concentration of ART and 35 g/L of inoculum concentration was obtained a value productivity of 6.0 g /Lh, 93% yield and 14.4 °GL in 10 hours of incubation, indicating that the optimization equations given and managed by the CCD describe the behavior of the fermentation process. With the yeast adapted at 4 °C, were obtained low time of fermentation and using sugarcane juice as the substrate using the same adapted yeast led to higher yields (94%) and productivity (10.1 g/L.h) when using the inoculum pH 2.5. Alcoholic fermentation using Saccharomyces cerevisiae yeast fed-batch reactor provided greater productivity and income when compared to data reported in the literature in which they used the same conditions studied in this work. O aumento do consumo de energia, o esgotamento dos combustíveis fósseis e o aumento das preocupações com o meio ambiente se tornaram fortes justificativas para geração de energia aplicada ao uso de biocombustíveis. Na expansão da produção de bioetanol pelas usinas brasileiras, a incorporação de processos inovadores e o desenvolvimento tecnológico cumpriram um papel essencial, com incremento da eficiência na produção e progressiva redução dos impactos ambientais e economia agrícola, principalmente no que diz respeito à redução do volume de vinhaça, subproduto da fabricação de etanol. Neste trabalho estudou-se a resistência da levedura Saccharomyces cerevisiae Y904 no processo de fermentação alcoólica operando em reator batelada alimentada, analisando o efeito do tempo de alimentação do reator, da temperatura, da concentração de inóculo e substrato sobre o rendimento fermentativo, produtividade e concentração residual de açúcares redutores. Os ensaios foram realizados em reator de bancada utilizando meio sintético à base de sacarose e extrato de levedura. As concentrações de açúcares e etanol foram determinadas por cromatografia líquida (HPLC), e as concentrações de células foram determinadas pelo método espectrofotométrico. Através de uma análise estatística realizada no Software Statistica 7.0 foi possível determinar as faixas que maximizaram as variáveis estudadas no planejamento fatorial e no planejamento composto central. Como resultado, observou-se que a concentração máxima de etanol na qual a produção do mesmo foi completadamente inibida (P máx) foi 137 g/L obtida em 25°C. Foi observado que utilizando a condição gerada no PCC que maximiza as variáveis estudadas, com temperatura de 26°C, 5 horas de enchimento, 240 g/L de concentração de ART e 35 g/L de concentração de inóculo, obteve-se um valor de produtividade de 6,0 g/L.h, 93% de rendimento e 14,4 °GL em 10 horas de fermentação, indicando que as equações de otimização fornecidas pelo PCC conseguiram descrever bem o comportamento do processo de fermentação. Com a levedura adaptada a 4°C, foram obtidos baixos tempos de fermentação e com o uso de caldo de cana como substrato empregando essa mesma levedura adaptada conduziu a altos rendimentos (94%) e produtividades (10,1 g/L.h) quando se utilizou pH de 2,5 no inóculo. A fermentação alcoólica, utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae em reator batelada alimentada forneceu maiores produtividade e rendimento quando comparados a dados reportados pela literatura, nos quais utilizaram as mesmas condições estudadas neste trabalho. Mestre em Engenharia Química

Among the various renewable feedstocks available for ethanol fuel production, special emphasis has been given to sweet sorghum because the extracted juice of its stalk is composed of sucrose, glucose, fructose and can therefore be easily fermented to produce ethanol. In this paper we evaluate the behavior of the concentrations of sugars (sucrose, glucose, and fructose), nutrients (N, Ca, Mg, P) and starch in the juice from four sweet sorghum cultivars developed by Embrapa Maize and Sorghum (BRS 506, BRS 507, BRS 509, BRS 511) during time of maturation. The industrial use period was also determining the yield of cane and ethanol production using sweet sorghum juice in different planting dates. The cultivars showed different concentrations of sugars, industrial use period, and productivity between them as well as between the ages of plantings, showing influence of climatic conditions and the characteristics of each cultivar. All cultivars showed similar behavior with regard to nutrient content which were characterized by decreased concentration of nutrients throughout the analysis and increase in starch period. After fermenting both cultivars for 8 hours, it was found that cultivar BR 508 showed the best performance in terms of productivity (9.0 g/Lh) and yield (YP/ART = 90.5 %). Also, the feasibility of freezing the juice of sweet sorghum was verified and it was observed that after 30 days the levels of total sugars were reduced in their concentrations. Characterizations of sugar content were made in different parts of the stalk for the four cultivars and found that higher concentrations of total sugars are at the base of the stalk. Fermentations of the sorghum cultivars was carried out in order to evaluate the effectiveness of nutrient addition and stirring during fermentation process, which found that these two parameters did not add gains during fermentation. The fermented broths with different concentrations of sorghum sugar , in comparison with the juice of sugar, in order to evaluate the effect of different concentrations of total sugar (160, 180, 220, 260, and 300 g/L) yield the fermentation. It was found that with increasing sugar concentration, it did not increase the production of ethanol to concentrations of 160, 180, 220, and 260 g/L and the concentration was reduced to 300 g/L, showing inhibition on ethanol production when using sorghum broth with increased initial concentration of sugar and it has been found that yield and productivity in 8 hours of fermentation broth for the sorghum was from 0.8 to 4.8% and from 2 to 3.7% higher fermentations sugarcane juice under the same conditions. Reviews the use of enzyme a-amylase and amyloglucosidase the enzymatic hydrolysis of the juice in the juice of this sweet sorghum starch were made. It was noticed that the joint action of the addition of the two enzymes in the broth provided greater hydrolysis of starch present in the juice of sweet sorghum, an increase of 1.67 gallons of ethanol per ton of processed sweet sorghum . Dentre as diversas matérias-primas renováveis disponíveis para produção de etanol, especial destaque vem sendo dado ao sorgo sacarino, pois o caldo extraído de seus colmos é composto por sacarose, glicose, frutose e podem, portanto, ser facilmente fermentados para produção de etanol. Neste trabalho avaliou-se o comportamento das concentrações de açúcares (sacarose, glicose e frutose), nutrientes (N, Ca, Mg, P) e amido no caldo do sorgo sacarino de 4 cultivares desenvolvidas pela Embrapa Milho e Sorgo (BRS 506, BRS 507, BRS 509, BRS 511) durante o seu período de maturação. Foi determinado também o período de utilização industrial, a produtividade dos colmos e a produção de etanol utilizando o caldo de sorgo sacarino em diferentes épocas de plantio. As cultivares apresentaram diferentes concentrações de açúcares, período útil industrial e produtividades entre si e entre as épocas de plantios, evidenciando influência das condições climáticas e das características de cada cultivar. Todas as cultivares apresentaram comportamentos similares com relação aos teores de nutrientes que foram caracterizados pela diminuição da concentração de nutrientes ao longo do período analisado e aumento na concentração de amido. Após 8 horas de fermentação alcoólica do caldo das cultivares, verificou-se que a cultivar BR 508 apresentou o melhor desempenho em termos de produtividade (9,0g/L.h) e rendimento (YP/ART = 90,5%). Também verificou-se a viabilidade do congelamento do caldo do sorgo sacarino e foi observado que após 30 dias, os teores de açúcar total sofreram redução em suas concentrações. Foram feitas caracterizações dos teores de açúcares em diferentes partes dos colmos para as quatro cultivares e constatouse que maiores concentrações de açúcar total encontram-se na base dos colmos. Foram realizadas fermentações alcoólicas a fim de avaliar o efeito da adição de nutrientes e de agitação durante a fermentação e verificou-se que estes dois parâmetros não acrescentavam ganhos durante a fermentação. Fermentaram-se caldos de sorgo sacarino com diferentes concentrações de açúcares, de forma comparativa com o caldo de açúcar, afim de avaliar o efeito de diferentes concentrações de açúcar total (160, 180, 220, 260 e 300 g/L) no rendimento da fermentação. Foi verificado que com o aumento da concentração de açúcar não houve aumento na produção de etanol para as concentrações de 160, 180, 220 e 260 g/L e houve redução para a concentração de 300 g/L, mostrando inibição na produção de etanol quando utilizou-se caldo com maior concentração inicial de açúcar e verificou-se que o rendimento e a produtividade em 8 h de fermentação para o caldo de sorgo foi de 0,8 a 4,8 % e de 2 a 3,7 % superior as fermentações do caldo de cana nas mesmas condições. Foram feitas avaliações da utilização da enzima a-amilase e amiloglicosidase na hidrólise enzimática do amido presente no caldo do sorgo sacarino. Verificou-se que a ação conjunta da adição das duas enzimas no caldo proporcionou uma maior hidrólise do amido presente no caldo do sorgo sacarino, com aumento de 1,67 litros de etanol para cada tonelada de sorgo processada. Doutor em Engenharia Química