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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A toxocarose é uma zoonose, que tem como principal agente etiológico o Toxocara canis. É uma doença negligenciada, cosmopolita e que possui soroprevalência de 19% em todo o mundo. Os humanos são infectados pela ingestão acidental de ovos contendo larvas infectantes de T. canis, que, ao chegarem ao intestino, eclodem, penetram na mucosa e migram para vários tecidos, como fígado, pulmões e cérebro. De forma geral a resposta contra helmintos segue o padrão Th2, mas são poucos os estudos que esclarecem o padrão de resposta imunológica e fisiopatológica desencadeada pelo hospedeiro na toxocarose. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os mecanismos imunológicos e fisiopatológicos envolvidos na infecção por Toxocara canis em modelo experimental murino, investigando a via IL-33/ST2, a presença de eosinófilos e a via IL-17/IL-17RA. Para isso, foram utilizados camundongos geneticamente deficientes para ST2, GATA1, IL-17RA e os respectivos selvagens (BALB/c e C57BL/6) infectados por gavagem com 1000 ovos embrionados de T. canis sendo realizada a avaliação parasitológica, imunológica e fisiopatológica com 0 dias pós-infecção (dpi) (controle), 3dpi, 14dpi e 63dpi. Os resultados demonstraram que os camundongos ST2-/- e GATA1-/- durante a infecção por T. canis reduziram a carga parasitária hepática, pulmonar e cerebral e diminuíram a formação de granulomas associado a menores danos teciduais. Por outro lado, os camundongos IL-17RA-/- apresentaram aumento na carga parasitária pulmonar, reduziram a frequência de neutrófilos produtores de IL-17 no lavado broncoalveolar e diminuíram o número de granulomas nos pulmões. Assim, observamos que as vias IL-33/ST2 e a presença de eosinófilos induzem susceptibilidade à infecção por T. canis e aumentam o número de granulomas, enquanto a via IL-17/IL-17RA está associada a resistência à migração larval, porém induzem maior formação de granulomas que podem resultar em dano tecidual. Toxocariasis is a zoonosis, whose main etiological agent is Toxocara canis. It is a neglected, cosmopolitan disease that has a 19% seroprevalence worldwide. Humans become infected by accidental ingestion of eggs containing T. canis infective larvae, which upon reaching the intestine, hatch, penetrate the mucosa and migrate to various tissues such as liver, lungs and brain. In general, the response against helminths follows the Th2 pattern, but there are few studies that clarify the pattern of immune and pathophysiological response triggered by the host in toxocarosis. This study aimed to evaluate the immunological and pathophysiological mechanisms involved in T. canis infection in a murine experimental model, investigating the IL-33/ST2, IL-17/IL-17RA pathway and the presence of eosinophils. For this purpose, mice genetically deficient for ST2, GATA1, IL-17RA and the respective wild ones (BALB/c and C57BL/6) infected by gavage with 1000 embryonated eggs of T. canis were used, and the parasitological, immunological and pathophysiological evaluation was performed with 0 days post-infection (dpi) (control), 3dpi, 14dpi and 63dpi. The results demonstrated that ST2-/- and GATA1-/- mice during T. canis infection reduced the hepatic, pulmonary and cerebral parasite load and decreased the formation of granulomas associated with less tissue damage. On the other hand, IL-17RA-/- mice showed an increase in the pulmonary parasite load, reduced the frequency of IL-17-producing neutrophils in the bronchoalveolar lavage, and decreased the number of granulomas in the lungs. Thus, we observed that the IL-33/ST2 pathways and the presence of eosinophils induce susceptibility to infection by T. canis and increase the number of granulomas, while the IL-17/IL-17RA pathway is associated with resistance to larval migration, however induce greater formation of granulomas that can result in tissue damage.

Introdução: A Polipose Nasossinusal Eosinofílica (PNSE) é uma doença inflamatória crônica com formação de pólipos nasais múltiplos e bilaterais. Apresenta etiologia multifatorial, estando a inflamação crônica sempre associada. Trata-se de uma doença benigna, porém com grande comprometimento da qualidade de vida dos portadores. Quando associada a asma e história de intolerância à aspirina apresenta maior gravidade em relação ao acometimento dos seios paranasais e maior chance de recidiva após o tratamento cirúrgico. Tendo em vista que não há um tratamento eficiente conhecido para controle eficaz ou cura da PNSE associada a asma e história de intolerância à aspirina. Torna-se possível, avaliar a ação de novo tratamento (Azitromicina) utilizada como imunomodulador. Objetivos: Avaliar a ação da Azitromicina, usada como imunomodulador, em pacientes portadores da tríade PNSE, asma e história clínica de intolerância à aspirina, em comparação ao placebo. Casuística e Método: Trata-se de estudo experimental, randomizado, duplo mascarado com placebo, em pacientes com a tríade PNSE, asma e história clínica de intolerância à aspirina. Foi realizada a comparação dos pacientes pré-tratamento e pós-tratamento com Azitromicina na dose de 500mg, via oral, três vezes por semana durante 12 semanas. Os pacientes foram submetidos a exame clínico, aplicação da Escala Visual Analógica (EVA), estadiamento, aplicação do questionário SNOT-22 e biópsia dos pólipos nasais no início e ao final do tratamento. Resultados: Quarenta e oito pacientes completaram o estudo. Sendo 27 pacientes tratados com Azitromicina e 21 com placebo. A medicação foi bem tolerada de maneira geral. Houve melhora clínica no pós-tratamento (EVA) nos dois grupos, sendo que no grupo Azitromicina foi mais significativa. Em relação ao SNOT e estadiamento, houve queda apenas no grupo tratado (p

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O aumento da expectativa de vida populacional tem contribuído para a instalação de quadros de imunossupressão. Além disso, o aumento da prevalência de doenças crônicas e autoimunes resulta em maior uso de corticoides, quimioterápicos citotóxicos e terapias imunossupressoras pós-transplantes. Esses tratamentos podem comprometer o sistema imune e desencadear infecções oportunistas, como a candidíase. A candidíase oral é uma infecção fúngica oportunista que tem aumentado sua incidência nas últimas décadas. Tem como agente etiológico fungos do gênero Candida ssp, principalmente a espécie C. albicans. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi padronizar modelos de candidíase oral em camundongos imunossuprimidos pelo corticoide dexametasona e pelo anti-neoplásico 5-FU a fim de estudar a patogênese da doença e o papel de eosinófilos nessa infecção. Foram utilizados camundongos selvagens (WT) da linhagem C57BL/6 e BALB/c. Foi realizada uma padronização para definição do inóculo a ser utilizada e uma cinética de infecção após a inoculação sublingual de C. albicans e diversos parâmetros foram avaliados. Nossos resultados com dexametasona demonstram que a infecção por C. albicans em camundongos imunossuprimidos induziu uma menor resposta inflamatória frente à infecção, demonstrada por um menor recrutamento de neutrófilos e macrófagos para os sítios de infecção e maior carga fúngica na língua e baço dos animais. Os camundongos infectados apresentaram uma perda de peso corporal significativa em relação ao controle. Ainda, demonstramos alterações histopatológicas importantes na língua dos animais tratados com 5-FU como a perda total da arquitetura tecidual. Além disso, nós notamos através da utilização do antitumoral 5-FU que os camundongos ficam extremamente imunossuprimidos e susceptíveis à candidíase oral, com elevada carga fúngica. Ao utilizar camundongos deficientes em eosinófilos (Δdb/Gata1-/-) observamos que o curso da doença induzida pela infecção oral por C. albicans associado ao tratamento com 5-FU é mais brando e está associado a melhora dos parâmetros clínicos e inflamatórios descritos anteriormente. De maneira geral, desenvolvemos dois modelos experimentais em camundongos WT imunossuprimidos que mimetizam alguns parâmetros da candidíase oral clínica. Ainda, demonstramos que, muitas vezes, os eosinófilos podem causar danos ao hospedeiro frente à infecção por C. albicans. Estes modelos contribuirão para a elucidação de futuros mecanismos associados à patogênese da interação C. albicans-hospedeiro e no desenvolvimento de novos potenciais terapêuticos. The increase in life expectancy as well as the modern lifestyle has contributed to the establishment of immunosuppressive conditions. In addition, the increased prevalence of chronic and autoimmune diseases results in increased use of corticosteroids, cytotoxic chemotherapeutics, and post-transplant immunosuppressive therapies. These treatments can compromise the immune system and trigger opportunistic infections such as candidiasis. Oral candidiasis is an opportunistic fungal infection that has increased its incidence in the last decades. It has as etiological agent fungi of the genus Candida ssp, mainly the species C. albicans. In this context, the objective of this study was to standardize models of oral candidiasis in mice immunosuppressed by corticoid dexamethasone and anti-neoplastic 5-FU in order to study the pathogenesis of the disease and the role of eosinophils in this infection. Wild mice (WT) of the C57BL/6 and BALB/c strain were used. The standardization was done to define the inoculum to be used and an infection kinetics after sublingual inoculation of C. albicans and several parameters were evaluated. Our results with dexamethasone demonstrate that C. albicans infection in immunosuppressed mice induced a lower inflammatory response to infection, demonstrated by a lower recruitment of neutrophils and macrophages to the sites of infection and increased fungal load on the tongue and spleen of the animals. The infected mice showed a significant body weight loss in relation to the control. Furthermore, we demonstrated important histopathological changes in the tongue of animals treated with 5-FU as the total loss of tissue architecture. In addition, we detonate through the use of anti-tumor 5-FU that mice are extremely immunosuppressed and susceptible to oral candidiasis, with high fungal load. We used eosinophil-deficient mice (Δdb /Gata1-/-) and found that the course of disease induced by oral infection by C. albicans associated with 5-FU treatment is milder and is associated with an improvement in the clinical and inflammatory parameters previously describe. In general, we developed two experimental models in immunosuppressed WT mice that mimic most of the parameters of clinical oral candidiasis. Furthermore, we have shown that eosinophils can often cause damage to the host against C. albicans infection. These models will contribute to the elucidation of future mechanisms associated with the pathogenesis of C. albicans-host interaction and the development of new therapeutic potentials.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Os eosinófilos são leucócitos do sistema imune inato, capazes se secretar inúmeras moléculas que são armazenadas pré-formadas dentro de seus grânulos secretores (específicos). Essa secreção pode ocorrer por: (i) desgranulação por piecemeal (PMD), mediada por vesículas, principalmente carreadores de grande porte conhecidos como vesículas sombrero (EoSVs) que brotam dos grânulos e levam os produtos até a superfície celular; (ii) exocitose clássica, caracterizada por fusão de grânulos individuais com a membrana plasmática; (iii) exocitose composta, quando há fusão grânulo-grânulo antes da liberação extracelular e (iv) citólise, deposição de grânulos intactos após a lise celular. Considerando que a atividade funcional dos eosinófilos depende de sua capacidade secretora, o estudo dos mecanismos de secreção, bem como das proteínas envolvidas e de seu tráfego intracelular são importantes para o entendimento das respostas de eosinófilos durante doenças alérgicas e inflamatórias. Uma proteína relacionada com secreção de eosinófilos é o CD63, molécula da família das tetraespaninas, enquanto a sintaxina-17 (STX17) é uma proteína SNARE envolvida na fusão de vesículas durante a secreção constitutiva e potencialmente no transporte de cargas especificas em células especializadas. A molécula de interferon-gama (IFN-γ) é encontrada em grande quantidade em eosinófilos, com papel importante na resposta inflamatória. Entretanto, o tráfego intracelular dessas proteínas e seu envolvimento nos mecanismos de secreção de eosinófilos é desconhecido. Neste trabalho, foram investigados a localização ultraestrutural e o tráfego intracelular das moléculas de CD63, STX17 e IFN-γ em eosinófilos humanos estimulados ou não com os mediadores inflamatórios CC-chemokine ligand 11- CCL11 e fator de necrose tumoral -TNF-α). Em paralelo, foi verificada se eosinófilos humanos secretam vesículas extracelulares (VEs), que podem estar associadas com respostas imunes. Técnicas de microscopia eletrônica (convencional e imunomarcação ultraestrutural/pre-embedding immunonanogold), além de citometria de fluxo e western blotting foram utilizadas para responder essas questões. Primeiramente foi demonstrado que a STX17 se localiza em grânulos e EoSVs em eosinófilos humanos, as quais são estruturas fundamentais na secreção de eosinófilos. Foi evidenciado também que o CD63 está fortemente associado com os processos de secreção de eosinófilos (PMD e exocitose composta) e que as EoSVs atuam translocando o CD63 de/para grânulos secretores. Em outras análises, demonstrouse que o IFN-γ é localizado em grânulos secretores de eosinófilos humanos e pode ser transportado em EoSVs para a periferia celular após a estimulação das células. Interessantemente, verificou-se que eosinófilos humanos produzem microvesículas (VEs produzidas diretamente da membrana plasmática) que essa produção é aumentada quando estas células respondem a estímulos inflamatórios. Em conclusão, nossos resultados levaram a importantes descobertas sobre a atividade secretora de eosinófilos e de moléculas associadas à mesma, contribuindo para o entendimento sobre as reações mediadas por eosinófilos frente a ambientes inflamatórios. Eosinophils are able to release numerous mediators that are pre-synthesized and stored within their cytoplasmic specific (secretory) granules. Secretion can occur by: (i) piecemeal degranulation (PMD), characterized by vesicle-mediated transport of products from granules to cell surface, involving mainly large carriers termed Eosinophil Sombrero Vesicles (EoSVs); (ii) classical exocytosis, characterized by fusion of individual granules with the plasma membrane; (iii) compound exocytosis, characterized by large channels formed by granule–granule fusions before granule content release and (iv) cytolysis, characterized by release of intact granules after cell lysis. Considering that the functional activity of eosinophils is based on their secretory capacity, the study of the molecules involved in eosinophil secretion, as well as their intracellular trafficking is important to understand eosinophil responses during allergic and inflammatory diseases. CD63, a tetraspanin family member, has been associated to eosinophil granules and secretion. Syntaxin 17 (STX17), a SNARE family molecule, is involved with vesicle fusion during constitutive secretion and potentially in cargo transport within specialized cells. High levels of interferongamma (IFN-γ), an important inflammatory cytokine, are constitutively expressed in human eosinophils. However, the intracellular trafficking of these molecules and their association with eosinophil secretory mechanisms remain to be established. In this work, we investigated the ultrastructural localization and the intracellular trafficking of CD63, STX17 and IFN-γ in human eosinophils stimulated or not with inflammatory mediators (CC-chemokine ligand 11- CCL11 - e tumor necrosis fator alpha -TNF-α-). Moreover, we investigated if human eosinophils can secrete extracellular vesicles (EVs), that might be involved in inflammatory responses. Pre-embedding immunonanogold and conventional transmission electron microscopy (TEM), flow cytometer and western blotting techniques were used to investigate these questions. First, our results showed that STX17 is localized on granules and EoSVs, important structures involved in eosinophil secretory mechanisms. The data also demonstrated that CD63 is strongly associated with eosinophil secretory processes (piecemeal degranulation and compound exocytosis) and EoSVs are translocating CD63 to/from granules. Results demonstrated that IFN-γ is localized on secretory granules and can be translocated to cell periphery by EoSVs after eosinophil stimulation. In addition, we demonstrated that human eosinophils can produce microvesicles and the number of these extracellular vesicles increased after stimulation with CCL11 or TNF-a. Altogether, our results shed light to eosinophil secretory mechanisms and their associated molecules, leading to new insights to understand how eosinophil respond to inflammatory conditions through vesicular trafficking of their granule contents secretion.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A ascaridiose humana é a doença tropical negligenciada mais prevalente do mundo afetando cerca de 800 milhões de pessoas. Em áreas endêmicas, a reinfecção é recorrente devido às precárias condições de saneamento básico e, sobretudo, à simplicidade do ciclo de vida do parasito. Após a ingestão de ovos infectantes, larvas de terceiro estádio (L3) eclodem e penetram no intestino grosso, ganham a circulação sanguínea, chegando ao fígado e posteriormente aos pulmões do hospedeiro, caracterizando a ascaridiose larval. Nesses órgãos, as L3 migram gerando lesões tanto mecânicas quanto provenientes da intensa resposta inflamatória, que é caracterizada principalmente pela intensa infiltração de neutrófilos e eosinófilos. O presente trabalho visou descrever e caracterizar os efeitos fisiopatológicos da migração das larvas de Ascaris suum nos pulmões de camundongos infectados, bem como avaliar o papel dos eosinófilos e da regulação das respostas Th1, Th2 e Th17 na patogênese da ascaridiose larval após primoinfecção e reinfecção. Para tal, inicialmente, foi realizada a avaliação parasitológica e imunopatológica em camundongos BALB/c primoinfectados e reinfectados durante o pico de migração larval pelo fígado, pulmão e intestino. Posteriormente, camundongos geneticamente deficientes em GATA1, IFN-γ, IL-17RA, ST2, IL-4 e os respectivos selvagens foram infectados e reinfectados e, após oito dias de infecção, foram submetidos à avaliação imunoparasitológica e fisiopatológicas. Os resultados mais importantes deste trabalho demonstraram que camundongos reinfectados apresentaram uma relevante redução da carga parasitária no pulmão e aumento da celularidade no lavado broncoalveolar associado à intensa inflamação pulmonar granulocítica, que levaram ao comprometimento da função respiratória. Foi evidenciado que a inflamação pulmonar mista contribui para o controle da migração larval, contudo, no que se refere as respostas Th2/Th17, foram associadas ao maior comprometimento da função pulmonar. Além disso, este trabalho trouxe evidências contundentes da contribuição dos eosinófilos no controle da carga parasitária na ascaridiose em modelo de simples e múltiplas exposições. Foi evidenciado também que os eosinófilos são indispensáveis para a produção de SIgA e, que essas células dependem da sinalização mediada pela a ativação de TLR2 e TLR4 para induzir a produção de SIgA na mucosa e, como consequência, controlar a carga parasitária. Por outro lado, foi comprovado que os eosinófilos contribuem para a fibrose do parênquima pulmonar em resposta às lesões teciduais, contudo, a maior perda fisiológica da função pulmonar foi associada às lesões agudas provocadas pela migração larval pelo parênquima pulmonar. Human ascariasis is the most prevalent neglected tropical disease in the world affecting about 800 million people. In endemic areas, reinfection is recurrent due to poor basic sanitation conditions and, above all, the readiness of the parasite life cycle. After ingestion of infective eggs, third stage larvae (L3) hatches and penetrates the large intestine, gaining blood circulation and reaching the liver and later the host lungs, characterizing larval ascariasis. In these organs, L3 migrates generating both mechanical lesions and intense inflammatory response, which is characterized mainly by intense neutrophil and eosinophil infiltration. The present work aimed to describe and characterize the pathophysiological effects of the Ascaris suum larvae migration on the lungs of infected mice, as well as to evaluate the role of eosinophils and regulation of the Th1, Th2 and Th17 responses in the pathogenesis of larval ascariasis after single- and re-infection. For this, parasitological and immunopathological evaluation was initially performed in BALB / c mice single- and re-infected during the peak of larval migration within the liver, lung and intestine. Afterwards, mice genetically deficient in GATA1, IFN-γ, IL-17RA, ST2, IL-4 and the respective wild-type were infected and re-infected and, after eight days of infection, underwent immunoparasitological and pathophysiological evaluation. The most important results of this work demonstrated that re-infected mice presented a significant reduction of the parasitic load in the lung and increased cellularity in the bronchoalveolar lavage (BAL) associated to an intense granulocytic pulmonary inflammation, which led to a compromised respiratory function. It was evidenced that mixed pulmonary inflammation is of extreme importance for the control of larval migration. However, regarding Th2 / Th17 responses, they are associated with a greater impairment of pulmonary function, especially Th2. In addition, this work has brought strong evidence of the contribution of eosinophils in a ascariasis multiple exposition model. It was evidenced that eosinophils are indispensable for the production of SIgA in the pulmonary mucosa and that these cells depend on the signaling by TLR2 and TLR4 activation to induce SIgA production in the mucosa and to control the parasitic load. It has been demonstrated that eosinophils contribute to pulmonary parenchymal fibrosis in response to A. suum tissue damage. Extrapolating to the current scenario of human ascariasis, the data of this work could also explain the epidemiological distribution of Ascaris sp. since most of the infected individuals in high endemicity areas, where they are exposed multiple times to the parasite, present low parasitic load.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Os receptores ativados por proteases (do inglês, proteinase-activated receptor, PAR) fazem parte de uma família de receptores acoplados a proteína G, que são ativados principalmente pela clivagem proteolítica de uma sequência específica de aminoácidos localizados em seu domínio N-terminal. Sua ativação vem sendo associada à regulação de diferentes fenômenos inflamatórios. PAR-2 é um receptor com potencial para regular a inflamação alérgica uma vez que está presente em uma grande variedade das células das vias aéreas como, por exemplo, células epiteliais e macrófagos alveolares. O objetivo do presente estudo foi avaliar a importância da ativação do PAR-2 na produção de mediadores inflamatórios e no recrutamento de leucócitos em modelos experimentais de asma induzidos por ovalbumina (OVA). Os protocolos experimentais foram aprovados pela comissão de ética no uso de animais (CEUA/UFMG, nº348/2014). A inflamação pulmonar alérgica foi induzida por OVA (10μg, via intranasal) em camundongos Balb/c fêmeas (8-10 semanas) previamente iminizados para o antígeno, em dois modelos experimentais diferindo entre si o número de desafios intranasais, três ou seis. Dentre o período de 30min à 72h após último desafio com o alérgeno, os camundongos foram sacrificados, sendo em seguida coletados os lavados broncoalveolares (LBA) e feita a remoção dos pulmões. Para avaliar a participação do PAR-2 na asma experimental, os camundongos imunizados foram pré-tratados com o antagonista seletivo de PAR-2, ENMD1068 (0,1–1,0 mg/ kg, via intraperitoneal) 1 hora antes da administração intranasal de OVA. O bloqueio de PAR-2 promoveu efeito considerável no controle da inflamação pulmonar alérgica em ambos os modelos de asma, reduzindo a presença de neutrófilos, eosinófilos e células mononucleares no LBA dos camundongos quando comparado aqueles desafiados com OVA e pré-tratados apenas com PBS. Especificamente no modelo de três exposições à OVA, o antagonismo do receptor reduziu a expressão protéica de PAR-2 em leucócitos alveolares, a produção de CXCL1, IL-6 e CCL5 no LBA e de IL-1β no pulmão, a permeabilidade vascular no tecido pulmonar e a população de macrófagos pulmonares com fenótipo M2, além de aumentar os níveis de IL-10 no LBA quando comparado ao grupo OVA. No modelo de seis exposições à OVA, o bloqueio de PAR- 2 conduziu à redução nas atividades de peroxidase eosinofílica (EPO) e mieloperoxidase (MPO) no parênquima pulmonar, no extravasamento de proteínas para o LBA, evitou a perda da complacência pulmonar induzida pela OVA, diminuiu a resistência ao fluxo de ar basal e em reposta à provocação com metacolina, além de diminuir a produção de muco e deposição de colágeno em tecido pulmonar, quando comparados aos animais desafiados com OVA. Nossos resultados demonstram que há modulação da resposta imunológica via ativação de PAR-2 na asma experimental em camundongos BALB/c nos diferentes modelos avaliados. Além disso, o bloqueio da ação de proteases endógenas ativando PAR-2 em camundongos tratados com o antagonista seletivo desempenhou um papel importante no controle da inflamação pulmonar alérgica, sugerindo que o bloqueio de PAR-2 pode ser útil como uma nova abordagem farmacológica em relação ao tratamento de doenças respiratórias das vias aéreas. Proteinase-activated receptors (PAR) are part of a family of G-protein-coupled receptors that are activated via proteolytic cleavage of a specific sequence of amino acids in N-terminal portion, and their activation has been implicated in the regulation of inflammation. PAR-2 has been implicated in mediating allergic airway inflammation once is expressed by many cells in the airways as well as in epithelial and alveolar macrophages. The aim of this study was to study the role of PAR-2 activation in the production of inflammatory mediators and on the recruitment of leukocytes in experimental ovalbumin (OVA)-induced asthma models. All experimental protocols were approved by local UFMG Ethics’s Committee for Animal Use - certificate number 348/2014. Allergic lung inflammation was induced in sensitized BALB/c mice (female, 8-10 weeks) through the intranasal instillation of ovalbumin (OVA, 10μg) in two distinct experimental models differing in relation to the number of intranasal challenges (3 or 6 challenges). Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed and lungs were obtained in different intervals of time, from 30 min to 72 h after challenging. To evaluate the participation of PAR-2 in experimental asthma, sensitized mice were pretreated with selective PAR-2 antagonist (ENMD1068, 0.1-1.0 mg / kg, intraperitoneal) 1 hour before intranasal instillation of OVA. The blockade of the action of PAR-2 activating endogenous proteases in PAR-2 antagonist-treated mice, played an important role on the control of allergic respiratory inflammation in both asthma’s models. Overall, pretreatment with PAR-2 antagonist ENMD1068 inhibited the recruitment of neutrophils, eosinophils, mononuclear cells to LBA when compared to OVA-treated mice. After OVA instillation (3 intranasal challenge model), PAR-2 blockade reduced PAR-2 protein expression in leukocytes, CXCL1, IL-6 and CCL5 production in BAL and IL-1β releasing into the lung, vascular permeability in lung and M2 lung macrophages population. In addition, PAR-2 blockade increased IL-10 levels in BAL when compared to OVA group. Six intranasal challenge model also promotes leukocyte infiltrating into BAL in a PAR2-dependent manner. PAR-2 blockade impairs eosinophil peroxidase (EPO) and myeloperoxidase (MPO) activity at the parenchyma lung, proteins extravasation into BAL, reduces the loss of dynamic pulmonary compliance and the lung resistance in response to methacholine, as well as mucus production and collagen deposition when compared to OVA-challenged. In the present study we demonstrated a role for PAR-2 activation in the modulation of essential phenomena leading to allergic asthma in BALB/c mice both models. In addition, the blockade of the action of PAR-2 activating endogenous proteases in PAR-2 antagonist-treated mice played an important role on the control of allergic respiratory inflammation, suggesting that PAR-2 blockade may be useful as a new pharmacological approach regarding the treatment of airways allergic diseases.

O megacólon é a complicação mais frequentemente observada entre os indivíduos que desenvolvem a forma clínica digestiva da doença de Chagas. Os pacientes apresentam dilatação e distúrbios de motilidade da porção reto-sigmóide do órgão, devido ao processo de desnervação. Números elevados de mastócitos (MC) e eosinófilos são constantemente observados no cólon dilatado, o que sugere um papel para essas células no desenvolvimento desse processo patológico. Além disso, os números de MCs expressando triptase (triptase -imunorreativo - IR) estão negativamente correlacionados com a área de fibras nervosas que expressam PGP 9.5 (marcador pan-neuronal) ou polipeptídio intestinal vasoativo (VIP-IR), um neuromediador anti-inflamatório. Em vista desses dados, levantamos a hipótese de que MCs triptase-IR desempenham um papel relevante no processo de inflamação e desnervação, relevantes na patologia do megacólon chagásico. A triptase é uma protease que cliva o receptor ativado por protease 2 (PAR2) na superfície de neurônios e de células inflamatórias, induzindo a produção de citocinas pró-inflamatórias, o recrutamento de leucócitos, especialmente eosinófilos, e a ativação e morte neuronal. Aqui, demonstramos a expressão de PAR2 por neurônios, confirmando os dados da literatura. Em cólon de pacientes com megacólon, observamos números elevados de MCs triptase-IR ou quimase-IR, estando a maioria deles com sinais de ativação (desgranulação piecemeal ou anafilática), e alguns localizados bem próximos (menos de 5 um) de neurônios. Além disso, observamos uma correlação positiva entre o número de MCs triptase-IR e eosinófilos, bem como aumento do número de eosinófilos PAR2-IR no cólon de pacientes com megacólon. Em conjunto com os dados da literatura, os resultados aqui apresentados sugerem um papel para MCs triptase-IR na ativação e recrutamento de eosinófilos, no processo de desnervação e, consequentemente, no desenvolvimento do megacólon. Megacolon is the most frequently observed complication among individuals who develop the digestive clinical form of Chagas disease. Patients present dilation of the rectum-sigmoid portion and motility disorders, due to the denervation process. Increasing of mast cell (MCs) and eosinophil numbers are constantly observed in the dilated colon, which suggests a role for those cells in such pathology. Besides, the numbers of tryptase-immunoreactive (IR) MCs are negatively correlated with the area of nerve fibers expressing PGP 9.5 or vasoactive intestinal polypeptide (VIP-IR), an anti-inflammatory neuromediator. On view of those data, we suggest that tryptase-IR MCs could play a role in the chronic infection associated inflammation and denervation process. Tryptase is a protease that cleaves the protease-activated receptor type 2 (PAR2) on the surface of inflammatory cells and neurons, inducing the production of pro-inflammatory cytokines, leukocyte recruitment, specially eosinophils, and neuronal activation and death. Here we demonstrated the expression of PAR2 by neurons, confirming data from the literature. In colon of patients with megacolon, we observed increased numbers of tryptase-IR or chymase-IR MCs, being most of them with signs of activation (piecemeal or anaphylactic degranulation), and some in close proximity (less than 5 um) to neurons. Besides, we observed a positive correlation between numbers of tryptase-IR MCs and eosinophils, and increased numbers of PAR2-IR eosinophils in colon of patients with megacolon. In conjunction with data from the literature, the results presented here suggest a role for tryptase-IR MCs in eosinophil activation and recruitment, in the denervation process and, consequently, in the development of megacolon.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Introdução: Os eosinófilos são células efetoras que desempenham um papel importante nas doenças alérgicas. Uma falha na remoção destas células do sítio inflamatório pode resultar em doenças inflamatórias crônicas, como a asma. Assim, há um grande interesse em compreender os mecanismos e mediadores envolvidos na eliminação dos eosinófilos dos sítios inflamatórios. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismos envolvidos na morte celular programada de eosinófilos induzida por ROS na resposta inflamatória alérgica. Métodos: A inflamação alérgica foi induzida por ovalbumina (OVA) em camundongos e o peróxido de hidrogênio (H2O2) foi administrado no pico do infiltrado inflamatório (24 horas). O número total de leucócitos, de eosinófilos e células mononucleares foram avaliados no lavado bronco-alveolar (LBA). Além disso, verificamos os níveis de expressão de citocinas e quimiocinas, o estresse oxidativo, a produção de muco, deposição de colágeno no parênquima pulmonar e função respiratória. Avaliamos também o efeito do H2O2 nas vias de sinalização de sobrevida de leucócitos e em uma linhagem celular eosinofílica humana (EOL-1) Resultados: O tratamento com H2O2 na fase de maior acúmulo de eosinófilos acelerou a resolução de inflamação alérgica através da indução de apoptose de eosinófilos dependente de caspase-3 e inibição de vias de sinalização associadas ao aumento à sobrevida de leucócitos em sítios inflamatórios. Além disso, H2O2 diminuiu o remodelamento, deposição de muco, produção de citocinas inflamatórias e hiper-reatividade das vias aéreas. Conclusão: H2O2 induz a apoptose de células EOL-1 in vitro e é necessário para a resolução da inflamação in vivo através da indução de apoptose eosinófilos e inibição de vias de sobrevivência celular. De maneira importante, H2O2 mantém a integridade e função do tecido Introduction: Eosinophils are effector cells that have an important role in the pathogenesis of allergic disease. Defective removal of these cells likely leads to chronic inflammatory diseases such as asthma. Thus, there is great interest in understanding the mechanisms responsible for the elimination of eosinophils from inflammatory sites. Previous studies have demonstrated a role for certain mediators and molecular pathways responsible for the survival and death of leukocytes at sites of inflammation. Reactive oxygen species have been described as proinflammatory mediators but their role in the resolution phase of inflammation is poorly understood. The aim of this study was to investigate the mechanisms whereby hydrogen peroxide resolves the allergic inflammatory responses. Material and methods: An eosinophilic cell line (Eol-1) was treated with hydrogen peroxide and apoptosis was measured. Allergic inflammation was induced in ovalbumin sensitized and challenged mouse and reactive oxygen species were administered at the peak of inflammatory cell infiltrate. Inflammatory cell numbers, cytokine and chemokine levels, mucus production, inflammatory cell apoptosis and peribronchiolar matrix deposition was quantified in the lungs. Resistance and elastance were measured at baseline and after aerosolized methacholine. The expression of caspase-3 and signal transduction pathways in leukocytes were measured of immunofluorescence and confocal analysis. Phosphatidylserine expression was measured after hyrdrogen peroxide treatment in leukocytes by flow cytometry. Results: Hydrogen peroxide accelerates resolution of airway inflammation by induction of caspasedependent apoptosis of eosinophils and inhibit survival from of pathways in eosinophils especifically. Moreover, H2O2 decrease remodeling, mucus deposition, inflammatory cytokine production and airway hyperreactivity. Conclusion: These data presented indicate a pro-resolving effect of hydrogen peroxide in allergic inflammation by inducing apoptosis of eosinophils, and inhibiting cell survival pathways. These results, could have fundamental implications for the basic concept of resolution of inflammation and may have therapeutic implications.

Estudos relacionados aos aspectos imunobiológicos da infecção por Ascaris sp. continuam escassos, principalmente aqueles que objetivam elucidar os eventos imunológicos da fase inicial da infecção, denominada ascaridíase larval. Neste trabalho, foi demonstrada uma nova padronização para a infecção experimental e os principais aspectos sobre a imunopatologia pulmonar causada pela migração das larvas de Ascaris sp. Além disso, a resposta imune celular, com ênfase no papel dos eosinófilos no controle da carga parasitária e patogênese da inflamação pulmonar foi avaliada, utilizando camundongos deficientes em eosinófilos (dblGATA) como estratégia experimental. Por fim, a coinfecção com o Vaccinia virus (VACV) respiratório foi realizada como um modelo de inflamação pulmonar que objetivou a avaliação da influência da migração das larvas de Ascaris spp. em um microambiente inflamatório já estabelecido nos pulmões dos animais e a capacidade da ascaridíase larval em alterar o percurso de infecções virais respiratórias. Os principais resultados deste trabalho sugerem que o modelo de proteção na ascaridíase larval seja mediado por uma intensa resposta inflamatória inata, caracterizada inicialmente pela ativação de eosinófilos por meio da produção de IL-5 por células pulmonares residentes. Estes eosinófilos, por sua vez, são responsáveis em ativar e potencializar a resposta imune celular inata, principalmente neutrófilos, que são responsáveis em produzir IL-6 e MPO, aumentando a inflamação pulmonar. A intensa inflamação tecidual reduz o número de larvas de Ascaris spp. no pulmão, mas por outro lado, provoca lesão e perda de função no tecido pulmonar. Por essa razão, após a migração das larvas pelos pulmões, os eosinófilos produzem TNF e EPO que irão participar ativamente no processo de cicatrização e remodelamento do tecido pulmonar lesado. Esta hipótese de proteção para a ascaridíase larval foi comprovada por meio da utilização de um modelo de inflamação pulmonar induzido pelo VACV respiratório e subsequente associação à infecção concomitante por A. suum. Em conclusão, os novos aspectos apresentados sobre a ascaridíase larval possibilitaram um melhor entendimento sobre os eventos imunopatológicos associados à proteção na ascaridíase larval, os quais contribuirão para futuros estudos direcionados a ensaios de imunoprofilaxia e imunização. Studies related to the immunobiological aspects of an Ascaris spp. infection are still scarce, especially those that aim to elucidate the early events of the immune response. In this study, we demonstrated a novel standardized method for early experimental Ascaris infection, using a murine model, and we evaluated the main aspects about the lung immunopathology induced by the Ascaris larvae migration. Besides that, the innate immune response, highlighting the role of eosinophils in the control of parasitic burden and into the pathogenesis of lung inflammation was evaluated, using an eosinophil-deficient mice model (dblGATA mice). Finally, a coinfection model by respiratory Vaccinia virus (VACV) and pulmonary ascariasis was performed in order to evaluate the impact of Ascaris larvae migration through an inflammatory microenvironment, and to evaluate the capacity of larval ascariasis on alter the course of viral infection. The main findings of this study suggest that the protective immunity against larval ascariasis is mediated by an intense innate inflammatory response, characterized by the activation of eosinophils by IL-5 producing innate lymphoid cells. These eosinophils are responsible to potentiate the innate immunity, activating neutrophils, which produce IL-6 and MPO, increasing the lung inflammation. This lung inflammation decreases the number of migrating larvae, however causes tissue damage and fibrosis. To restore lung homeostasis, eosinophils start to produce TNF and EPO, which are involved in the lung remodeling and repairing after larvae migration. This hypothesis on the mechanisms of protection against larval ascariasis was supported by the experiments of coinfection with VACV and A. suum. The results revealed that the increase of lung inflammation induced by the airway concomitant infection was responsible to reduce consistently the number of migrating larvae through the lungs of coinfected mice. Taken together, the novel aspects of Ascaris infection presented here enabled a better understanding of the immunopathological events during larval migration, providing insight for further studies focused on immunization and immunoprophylatic assays.

Os receptores ativados por proteases (proteinase-activated receptor, PAR) fazem parte de uma família de receptores acoplados à proteína G que são ativados por serino-proteases através da clivagem proteolítica de uma sequência específica de aminoácidos em sua porção N-terminal. Sua ativação vem sendo associada à regulação de diferentes fenômenos inflamatórios. Estes receptores foram classificados de 1 a 4 por ordem de descoberta apresentando similaridade estrutural mas, também possuem diferenças no grupamento N-terminal e da serino-protease responsável pela clivagem. PAR-2 é expresso nas vias aéreas, no epitélio, endotélio e músculo liso do tecido pulmonar, fibroblastos da traqueia e brônquios, e células inflamatórias tais como mastócitos e eosinófilos. Nos últimos anos, estudos têm demonstrado o envolvimento de PAR-2 no recrutamento e na ativação de leucócitos, no entanto, embora existam na literatura alguns estudos mostrando a presença e ativação de receptores PAR-2 em eosinófilos, ainda não estão bem esclarecidos os mecanismos moleculares envolvidos na sinalização desencadeada pela ativação deste receptor pelos seus respectivos agonistas. Nosso objetivo foi avaliar o papel do PAR-2 para o recrutamento de eosinófilos em pleurisia experimental, bem como a participação da triptase de mastócitos e a importância de sua inibição para este fenômeno. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética animal (CEUA/UFMG, 193/2012). Após realização do protocolo de tratamento os animais foram sacrificados em câmara de CO2, e o lavado pleural foi coletado para posteriores análises nos tempos adequados. As análises estatísticas utilizadas foram: One-Way ANOVA seguido do pós-teste de Newman-Keuls para as análises de migração celular e Students t test para as análises de western blotting. A injeção intrapleural (i.pl.) em camundongos BALB/c naive com agonista seletivo de PAR-2 SLIGRL-NH2 (30 g), ou triptase de mastócitos (300 ng) ou ovalbumina (1 g), em animais previamente sensibilizados para este antígeno, induziu recrutamento de eosinófilos para a cavidade pleural destes animais. Sendo assim, camundongos foram injetados por via i.pl. com antagonista seletivo de PAR-2 ENMD1068 (3 g) 15 minutos antes da injeção i.pl. de OVA (OVA; 1 g), em camundongos imunizados, ou com triptase de mastócitos (300 ng) ou eotaxina-1 (100 ng) em camundongos naive para estudar o papel de PAR-2 no recrutamento de eosinófilos. O ENMD1068 inibiu a eosinofilia induzida por OVA (97%), por triptase (87%) como também por eotaxina-1 (61%), o que sugere a participação da ativação de PAR-2 no recrutamento de eosinófilos induzido por estes estímulos. De outra forma, em camundongos tratados com triptase (300 ng) foi avaliada a expressão de PAR-2 por western blotting 4, 8, 24 e 48 horas após o estímulo i.pl. demonstrando aumento da expressão do receptor 24 e 48 horas após o tratamento quando comparados aos respectivos controles, em leucócitos obtidos do lavado pleural. Além disso, testes de imuno-citoquímica demonstraram co-localização do receptor PAR-2 na membrana e citoplasma de eosinófilos e células mononucleares 24 e 48 horas após desafio i.pl. com triptase. Uma vez demonstrada a participação do PAR-2 no recrutamento de eosinófilos induzido pela triptase, foi avaliada a importância da triptase endógena para o recrutamento de eosinófilos no modelo de pleurisia, e o pré-tratamento com APC366 (5 mg/kg) via um inibidor seletivo de triptase, diminuiu o recrutamento de eosinófilos induzido pelo SLIGRL-NH2 (30 g) ou eotaxina-1 (100ng). Em conclusão, nossos resultados sugerem um papel de PAR-2 e de sua ativação no controle do recrutamento de eosinófilos, e consequentemente para o desenvolvimento da resposta inflamatória na cavidade pleural. O presente estudo contribui para o entendimento dos mecanismos envolvidos na eosinofilia, sugerindo uma nova estratégia terapêutica para o seu controle, através do bloqueio de PAR-2. Suporte financeiro: CNPq/CAPES/ FAPEMIG. Proteinase-activated receptors (PAR) are part of a family of G-protein-coupled receptors that are activated by serine proteases via proteolytic cleavage of a specific sequence of amino acids in N-terminal portion, and its activation has been associated with the regulation of different inflammatory phenomena. These receptors were classified from 1 to 4 by order of discovery, have structural similarities but also have differences in the group N-terminal and the serine-protease responsible for cleavage. PAR-2 is expressed in the airways, the epithelium, endothelium and smooth muscle tissue of the lung, trachea and bronchial fibroblasts and inflammatory cells such as mast cells and eosinophils. In recent years, studies have shown the involvement of PAR-2 in the recruitment and activation of leukocytes, however, although there are few studies in the literature showing the presence and activation of PAR-2 in eosinophils, the mechanisms involved in molecular signaling triggered by activation of this receptor by their respective agonists are not well understood. Our objective was to evaluate the role of PAR-2 in the control of eosinophil recruitment in experimental pleurisy, as well as the participation of mast cell tryptase and its importance in inhibiting this phenomenon. The experimental protocols were approved by the animal ethics committee (CEUA / UFMG, 193/2012). After the treatment protocol, mice were sacrificed in a CO2 chamber, and pleural lavage was collected for further analysis in the proper times. One-Way ANOVA followed by Newman-Keuls post-test was used for analysis of cell migration and Student's t test for analysis of western blotting. Intrapleural (i.pl.) injection in naive BALB/c mice with selective agonist of PAR-2 SLIGRL-NH2 (30 g), or mast cell tryptase (300 ng) or ovalbumin (OVA; 1 g) in animals previously sensitized to this antigen, induced eosinophil recruitment into the pleural cavity of these animals. Thus, mice were injected i.pl. with selective antagonist of PAR-2 ENMD1068 (3 g) 15 minutes before the i.pl. injection OVA (1g) in mice immunized; or with mast cell tryptase (300 ng) and eotaxin-1 (100 ng) in naive mice to study the role of the PAR-2 in the recruitment of eosinophils. The ENMD1068 inhibited eosinophilia induced by OVA (97%), by tryptase (87%), and also by eotaxin-1 (61%), suggesting the involvement of PAR-2 activation in the recruitment of eosinophils induced by these stimuli. Otherwise, in mice treated with tryptase (300 ng) we evaluated receptor expression 4, 8, 24 and 48 hours after stimulation i.pl., using western blotting. The results demonstrated increased receptor expression 24 and 48 hours after treatment compared to their respective controls in leukocytes obtained pleural lavage. Furthermore, immuno-histochemical tests have demonstrated co-localization of the receptor PAR-2 in the membrane and cytoplasm of eosinophils and mononuclear cells 24 and 48 hours after i.pl. challenge with tryptase. Once demonstrated the involvement of PAR-2 in eosinophil recruitment induced by tryptase we evaluated the importance of endogenous tryptase to the recruitment of eosinophils in the pleurisy model, and the pre-treatment with APC366 (5 mg/kg), a selective inhibitor of tryptase, decreased the recruitment of eosinophils induced by SLIGRL-NH2 (30 g) and eotaxin-1 (100 ng). In conclusion, our results suggest a role of PAR-2 activation in the control of eosinophils recruitment and thus in the development of the inflammatory response in the pleural cavity. The present study contributes to the understanding of the mechanisms involved in eosinophilia, suggesting the blockage of PAR-2 as a new therapeutic strategy for its control. Financial support: CNPq/CAPES/ FAPEMIG.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Eosinófilos são células efetoras que desempenham um papel importante na fisiopatologia de doenças alérgicas. Eosinófilos são fontes cruciais de proteínas citotóxicas, mediadores lipídicos e citocinas, que podem contribuir para a gravidade da doença. O acúmulo de eosinófilos no tecido depende não somente do número de células a serem recrutadas, mas também, do número de células que deixam o tecido. Assim, um defeito na remoção destas células está associado com o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas. Investigamos no presente trabalho o papel desempenhado pelas espécies reativas de oxigênio na resolução inflamatória no modelo de pleurisia alérgica e asma. Para indução da resposta inflamatória, administramos ovalbumina com adjuvante hidróxido de alúminio em camundongos sensibilizados previamente com esse mesmo antígeno. Observou-se um acúmulo inicial de neutrófilos com 12 horas e um aumento de eosinófilos a partir de 24 horas da indução da pleurisia alérgica e asma. A resolução da resposta inflamatória eosinofilica iniciou-se com 48 horas e foi substancialmente resolvida após 72 horas do desafio antigênico. A administração de SOD e H2O2 resolveu a inflamação eosinofílica. Além disso, a resolução da inflamação induzida pelo tratamento com SOD e H2O2 foi acompanhada por um aumento de eosinófilos em apoptose. A produção de ROS em camundongos gp91phox-/- foi significativamente menor quando comparada aos camundongos selvagens e ocorreu um atraso na resolução da resposta inflamatória. Além disso, a inibição da produção de ROS pela NADPH oxidase através do tratamento com apocinina prolongou a resposta inflamatória no modelo de asma. Houve um atraso na resolução eosinofílica em camundongos gp91phox-/- mas não em camundongos iNOS-/-. Interessantemente, a produção de ROS foi significativamente menor em camundongos gp91phox-/- e a inibição da produção de ROS pela apocinina prolongou a resposta inflamatória no modelo de asma. Nossos resultados sugerem que a administração exógena ou a geração endógena de H2O2, pode induzir a resolução da inflamação in vivo em modelos de resposta inflamatória alérgica através da indução de apoptose nos eosinófilos. Esses resultados podem ser relevantes como futuras estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças inflamatórias que se tornam crônicas devido a não resolução eosinofílica. Eosinophils are effector cells that play an important role in the pathophysiology of allergic disease. In allergic diseases, such as asthma, eosinophils are a crucial source of cytotoxic proteins, lipid mediators, oxygen metabolites, and cytokines, which may contribute to the severity of disease. The accumulation of eosinophil in tissue depends not only on the number of cells being recruited at any particular time, but also on the number of cells that are cleared or leave the tissue. Thus, defective removal of these cells plays an important role in the initiation and propagation of chronic inflammatory diseases. Here we investigated the role of ROS in the resolution of the inflammatory response after induction of asthma and allergic pleurisy in mice. Previous studies have demonstrated the role of ROS as pro-inflammatory mediators but the role of ROS in the resolution phase is poorly understood. For induction of the inflammatory response to ovalbumin adjuvant aluminum hydroxide in mice previously sensitized with the same antigen. There was an initial accumulation of neutrophils at 12 hours and an increase of eosinophils after 24 hours of pleurisy and asthma induction. The resolution of the eosinophilic inflammatory response was initiated with 48 hours and was substantially resolved after 72 hours of antigenic challenge. Administration of H2O2 or SOD resolved eosinophilic inflammation. In addition, the resolution of inflammation induced by SOD or H2O2 was accompanied by an increase in the number of apoptotic eosinophils. Furthermore, eosinophil resolution was delayed in gp91phox-/- mice but not in iNOS-/- mice. Interestingly, ROS production was diminished in gp91phox-/- mice. Moreover, the inhibition of ROS production by apocinin prolonged inflammatory response in asthma model. Our findings indicate that levels of H2O2 increase during eosinophil influx and are necessary for the resolution of allergic inflammation in vivo by induce apoptosis of eosinophils. These results may be relevant as future therapeutic strategies for the treatment of inflammatory diseases that may to become chronic due to lack of resolution.

Justificação: O câncer é uma ameaça grave à saúde e é a segunda causa de morte no Brasil, sendo necessário investigar possíveis fatores causais da doença, entre eles os ambientais, os relacionados ao estilo de vida e os biológicos, incluindo o papel do sistema imunitário. Vários estudos sugeriram associação inversa entre alergia e câncer, outros não encontraram relação entre essas entidades e alguns autores mostraram aumento do risco de câncer em pacientes alérgicos. Os achados conflitantes em estudos prévios são devidos, em parte, ao método utilizado, tais como diferentes definições e medidas para atopia, além de variações no controle dos fatores de confusão, como tabagismo e obesidade. Cabe ressaltar que a maioria das pesquisas foi realizada em vários países e com métodos diversos. Objetivos: Verificar se existe relação entre alguns tipos de câncer e alergia; investigar se há diferença, entre indivíduos com câncer e sem câncer em relação a alergia. Métodos: Estudo caso-controle realizado no Hospital Alberto Cavalcanti da rede FHEMIG no período de 2009 a 2011. Foram incluídos pacientes maiores de 18 anos de ambos os sexos com diagnóstico de câncer, comparados com indivíduos sadios, pareados por sexo e idade. Realizou-se anamnese visando a história de alergia, diagnosticada por médico, bem como hábitos de vida, doenças associadas e uso de medicamentos. Para os pacientes portadores de câncer, foram anotados dados relacionados ao tumor. O teste percutâneo de alergia foi realizado em cada grupo para detecção de hiper-reatividade alérgica a antígenos inaláveis, bacteriano e alimentares habituais em nosso meio. Uma amostra de sangue de cada grupo foi colhida para avaliação quantitativa dos eosinófilos. Resultados: Ambos os grupos foram pareados quanto às variáveis de interesse e ajustaram-se eventuais desvios, por análise multivariada. Relato de alergia ocorreu em 30% dos pacientes no Grupo 2 com câncer e em 53% no Grupo controle (p

A etiopatogênese da polipose nasal ainda não foi esclarecida. Os eosinófilos constituem as principais células do infiltrado inflamatório e estão relacionados com a perpetuação do processo inflamatório na rinossinusite crônica com pólipos nasais. Atualmente, o tratamento dos pólipos nasais enfoca a resolução do processo inflamatório a partir da indução de apoptose. A mitomicina C (MMC) é um agente quimioterápico e tem sido usada na Otorrinolaringologia para evitar a formação de sinéquias e estenose após cirurgias endonasais. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação da MMC no índice apoptótico (IA) de pólipos nasais de pacientes portadores de polipose nasal eosinofílica. Este é um estudo experimental com amostra de biópsia de 15 pacientes com polipose nasal eosinofílica com infiltrado inflamatório igual ou superior a 40%. Cada fragmento foi dividido em dois grupos. No grupo experimental aplicou-se MMC por cinco minutos, na dosagem de 400 !g/mL. Após a aplicação da droga, as culturas foram lavadas com meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI). O grupo-controle foi submetido ao mesmo processo, mas utilizando-se somente meio de cultura RPMI. Os fragmentos contidos nos dois primeiros compartimentos, controle e experimento, foram imediatamente submetidos ao preparo para histopatologia. O outro par de amostra, contendo controle e experimento, foi incubado em meio RPMI por 12 horas em estufa a 370C e 5% de dióxido de carbono (CO2). Ao final de 12 horas, os fragmentos foram retirado para exame histopatológico. O índice apoptótico foi determinado pela morfometria na coloração hematoxilina-eosina (HE) e pela reação de terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). A comparação dos dois grupos, controle e experimento, demonstrou diferença estatisticamente significativa (p< 0,001) no índice apoptótico das culturas incubadas por 12 horas. Houve correlação entre o IA avaliado pela morfometria e o IA avaliado pela reação de TUNEL. Concluiu-se que a MMC atua sobre os pólipos nasais eosinofílicos aumentando o índice apoptótico em eosinófilos in vitro. The etiopathogenesis of nasal polyps still is to be clarified. Eosinophils are possibly the most important inflammatory cells in the pathogenesis of rhinossinusitis with nasal polyposis. The treatment of nasal polyps involves an important role for apoptosis in the removal of inflammatory cells and resolution of inflammatory processes. Mitomycin C(MMC) is a chemotherapeutic agent and has been used in otorhinolaryngology to reduce stenosis and scar formation after surgery. The aim of this study was to evaluate the MMC action in apoptotic index (AI) in nasal polyps from eosinophilic nasal poliposis patients. This is a comparative and auto-matched experimental study with 15 in vitro fragment biopsies cultures from nasal polyps with eosinophilic infiltration percentage equal or superior to 40%. Each fragment was divided in two groups. The polyps fragments from the two groups were cultured at 370 C in 5% CO2 was stored for study at zero and twelve hours. The culture from the group test was treated with 400 !g/ml MMC concentration for 5 minutes. The AI was determined by histopathology by staining each cultured specimen with hematoxylin and eosin(HE) and by analysis of apoptotic DNA fragmentation (nick end labeling technic).Comparing the two groups, with and without MMC treatment, there was a statistic significance difference (p

Durante a infecção por Strongyloides venezuelensis em camundongos, assim como outros nematódeos intestinais, a participação de eosinófilos no mecanismo de proteção bem como na imunopatologia ainda é bastante controversa. Trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa demonstram que o eosinófilo é uma célula importante no processo de eliminação do S. venezuelensis em casos de infecção primária pelo parasito. Porém, sabe-se que os mecanismos protetores que atuam em animais previamente expostos ao parasito atuam principalmente sobre as larvas migrantes e podem diferenciar da resposta efetora em infecções primárias. Outro fato importante é que a maioria dos resultados obtidos em experimentos laboratoriais é controversa, uma vez que protocolos experimentais geralmente utilizam a exposição do hospedeiro a uma carga parasitária muito elevada, que geralmente não acontece em processos naturais. No intuito de esclarecer a diferença de resposta imunológica e o papel do eosinófilo na resposta imune induzida por diferentes formas de exposição primária ao parasito este trabalho experimental utilizou três diferentes linhagens de camundongos: animais heterogênicos da linhagem Swiss, animais isogênicos da linhagem Balb/c e animais Balb/c dblGATA, deficientes na maturação de eosinófilos. Em cada linhagem os camundongos foram divididos em quatro grupos experimentais. Sendo que um grupo foi mantido não infectado, outro sofreu apenas uma infecção, o outro foi exposto à infecção primária com alta carga parasitária seguida de infecção secundária e o último foi exposto a várias infecções com baixo número de larvas infectantes antes do desafio com Strongyloides venezuelensis. A avaliação comparativa da infecção foi realizada através da quantificação de formas evolutivas de S. venezuelensis recuperadas do pulmão, intestino, e fezes dos camundongos. Parâmetros imunológicos, como análise do infiltrado celular nos parênquimas pulmonar e intestinal, da resposta sorológica pela técnica de ELISA, e análise da presença de citocinas do perfil Th-2 no parênquima pulmonar também foram comparativamente analisados. Os dados mostram que animais submetidos às múltiplas infecções com baixa dose parasitária eliminam as larvas da infecção desafio mais precocemente que os previamente expostos a uma alta carga parasitária. A eliminação das larvas foi associada à produção de anticorpos específicos e eosinofilia tecidual. Estudo detalhado em animais isogênicos revelou que nos animais previamente expostos ao parasito houve aumento precoce de IgG1 e IgM parasito-reativa e aumento nos níveis de IgE total, não sendo detectado aumento de reatividade de IgG2a nos animais re-infectados ou nos animais submetidos múltiplas infecções. Apesar do perfil Th-2 da resposta observada nos animais previamente expostos ao parasito e da intensa infiltração de eosinófilos na pele e pulmão destes animais, a proteção conferida aos hospedeiros durante o processo de re-infecção, nas diferentes formas de exposição primária ao parasito, não foi alterado na ausência de eosinófilos. Este resultado indica que o eosinófilo não é essencial para eliminação das larvas de S. venezuelensis em animais previamente expostos ao parasito.

Durante a infecção de Strongyloides venezuelensis, assim como outros nematódeos intestinais com migrações sistêmicas, a participação de eosinófilos no mecanismo de proteção bem como na imunopatologia é bastante controversa. Trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a infecção primária por S. venezuelensis induz inflamação eosinofílica pulmonar e intestinal que coincide com indução de hiperreatividade brônquica e eliminação dos vermes. Foram utilizados camundongos com deleção no sítio de alta afinidade do promotor GATA-1 (camundongos dblGATA), que afeta exclusivamente a diferenciação de eosinófilos, com o objetivo de avaliar diretamente a participação destas células na resposta protetora e nas alterações funcionais detectadas em camundongos infectados por S. venezuelensis. A infecção experimental nestes animais revelou que a ausência de eosinófilos resultou em aumento de carga parasitária e retardo na eliminação dos vermes intestinais em comparação com o observado em camundongos não deficientes. Análises histopatólogicas do pulmão e intestino dos animais infectados juntamente com a quantificação da atividade enzimática (EPO e MPO) confirmaram a ausência de infiltração eosinofílica tecidual bem como revelaram uma redução de neutrófilos em camundongos dblGATA infectados, apesar dos neutrófilos serem normalmente produzidos na medula óssea destes camundongos. A ausência de eosinófilos e redução de neutrófilos podem ser diretamente responsáveis pelo aumento da carga parasitária detectada em camundongos dblGATA. Além disso, animais dblGATA infectados também mostraram um retardo na produção de citocinas de perfil TH2, como IL-5 e IL-4, comparado com os animais Balb/c não deficientes, sugerindo que além da participação direta na destruição de larvas de S. venezuelensis, a eosinofilia pode participar na indução da resposta imunológica protetora, apesar de não ser essencial para o seu estabelecimento. Neste mesmo modelo experimental foi verificado que a ausência de eosinófilos não modificou a cinética ou a intensidade das alterações funcionais induzidas no pulmão (hiperreatividade brônquica) ou no intestino (aumento da contratilidade intestinal) durante a infecção por S. venezuelensis em camundongos. Os resultados indicam a participação de eosinófilos na resposta imunoprotetora, mas não na imunopatologia, desenvolvida em camundongos durante a infecção primária por S. venezuelensis.

Eosinófilos são células pró-inflamatórias multifuncionais, que participam de diversos processos inflamatórios, incluindo disfunções gastrintestinais. O seu papel na colite ulcerativa, no entanto, ainda é desconhecido. Neste trabalho, avaliamos a participação do eosinófilo usando camundongos deficientes de eosinófilos (ÄdblGATA-1), utilizando o modelo de colite experimental induzida por Sulfato de Sódio Dextrana (DSS). A colite experimental induzida nos animais wild-type (WT) foi acompanhada de 100% de mortalidade, ao contrário dos animais deficientes de eosinófilos, que não morreram. Além disso, um grande acúmulo de eosinófilos foi observado no cólon intestinal dos animais WT com colite, detectado nas análises histopatológicas e no ensaio da atividade enzimática da peroxidase eosinofílica. O acúmulo de neutrófilos também estava aumentado, porém este aumento foi observado somente nos animais WT com DSS. Foi percebido uma elevação nos níveis das quimiocinas: Eotaxina/CCL11, KC/CXCL1-3 e MIP-1á/CCL3 estava aumentado nos animais WT com colite, quando comparados aos animais controle. No entanto, nos animais ÄdblGATA-1, essas quimiocinas não apresentaram diferenças significativas, tanto no grupo com colite quanto no controle. Deste modo, podemos sugerir um importante papel dos eosinófilos no desenvolvimento de disfunções gastrintestinais no modelo experimental de colite ulcerativa, evidenciado pelo aumento da morbidade e mortalidade dos animais. Eosinophils are multifunctional pro-inflammatory leukocytes implicated in the pathogenesis of numerous inflammatory processes, including gastrointestinal disorders, but its precise role in the development of Ulcerative colitis is unknown. The present study was conducted to determine this role by using a mouse model of eosinophil lineage ablation (ÄdblGATA-1) and we choose oral administration of dextran sulfate sodium (DSS) to induce colitis. All WT mice died after DSS-induced colitis has been installed, while eosinophil deficient mice did not. Furthermore, eosinophil lineage ablation in mice has a protective effect in dextran sulfate sodium- induced colitis. Eosinophil accumulation was higher in WT mice with colitis than in ÄdblGATA-1 mice, as assessed by histopathological analysis and eosinophil peroxidase activity, even with high IL-5 levels in the latter group. Neutrophils accumulation was also significantly increased only in WT-treated with DSS. Furthermore, Eotaxin/CCL11, KC/CXCL1-3 and MIP-1á/CCL3 chemokines were increased in WT mice, compared to controls. However, theses chemokines showed no significant differences in ÄdblGATA-1 with colitis and controls. Thus, we suggest that eosinophils are critical in the development of gastrointestinal dysfunction, and mortality increase of mice submitted to experimental ulcerative colitis.