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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A tolerância imunológica é um dos fenômenos pelos quais o organismo consegue tolerar autoantígenos ao invés de reagir de forma inflamatória contra eles. A tolerância oral (TO) é um mecanismo análogo à autotolerância e é definida como a supressão de respostas imunes humorais e celulares contra antígenos específicos, gerada pela administração prévia desses antígenos por via oral. A TO tem um grande potencial terapêutico para doenças inflamatórias intestinais, hipersensibilidades alimentares e doenças autoimunes, porém ainda existem algumas dificuldades para sua implementação na prática clínica tais como doses ideiais e redução da sua eficácia após a sensibilização. Para resolver essas dificuldades, é importante encontrarmos protocolos otimizados para potencializarmos a indução de TO pela ação de agentes adjuvantes como a Lactococcus lactis. O efeito adjuvante da L. lactis NCDO2118 na inibição de doenças inflamatórias tem sido estudado em alguns modelos pelo nosso grupo de pesquisa e por colaboradores, como encefalomielite autoimune experimental (EAE), artrite, colite e mesmo na inflamação induzida pela infecção por Leishmania quando esta bactéria é administrada juntamente com a proteína HSP65 e em modelo de GVHD quando ela é administrada juntamente com um aloantígeno. O objetivo do presente estudo foi avaliar os componentes da L.lactis envolvidos no efeito adjuvante da administração de L. lactis associada à ovalbumina (OVA) na indução de tolerância oral em camundongos C57BL/6. Usamos um protocolo subotimo de TO. Camundongos que ingeriram OVA associada à L. lactis NCDO2118 por via oral apresentaram níveis mais baixos de IgG1 e IgE anti-OVA no soro; frequência aumentada de células dendríticas tolerogênicas (CD11c+CD11b-CD103+), de macrófagos residentes CX3CR1+, de células Treg (CD4+LAP+) e de ILC2 na mucosa intestinal e nos linfonodos mesentéricos (MLNs) proximais. Observamos alteração no perfil da microbiota e de seus metabólitos produzidos no lumen intestinal, principalmente um aumento na produção de lactato, um ácido orgânico produzido em grande quantidade pela L. lactis. Sinergicamente houve um aumento na expressão de receptores de lactato no intestino, tais como GPR31 e principalmente GPR81 que, quando inibido por seu antagonista, gerou perda da TO. Em modelo de alergia alimentar à OVA, a L. lactis reduziu o número de eosinófilos melhorando parâmetros inflamatórios da doença. Concluímos que a L. lactis NCDO2118 desencadeou modulação da microbiota intestinal e mecanismos imunes inatos que melhoram a indução de TO a OVA, o que a torna essa bactéria um excelente adjuvante desse fenômeno.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O reparo de lesões na pele depende de interações entre vários tipos de células que resultam em inflamação local e ativação, migração e proliferação de queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais e leucócitos. Através da tolerância oral, fenômeno imunológico que ocorre após a ingestão de proteínas, é possível inibir a produção de anticorpos e a reduzir a inflamação. Trabalhos anteriores mostraram que uma injeção intraperitoneal de proteínas previamente ingeridas em adjuvante, minutos antes de uma lesão na pele de camundongos, reduz a inflamação e melhora a cicatrização. O objetivo deste trabalho foi avaliar se outras duas vias de aplicação - a injeção por via subcutânea (s.c.) e a aplicação tópica - de proteínas previamente ingeridas também melhoram a cicatrização de feridas. Utilizamos duas proteínas: Zeina, que está presente na ração dos camundongos; Ovalbumina, que foi adicionada à água dos camundongos e oferecida por 3 dias consecutivos, antes das lesões na pele. Duas lesões excisionais foram realizadas na pele do dorso de camundongos C57BL/6 machos, com 8 semanas de idade, utilizando um punch dermatológico de 6 mm, sob anestesia. A aplicação s.c. foi feita uma única vez na base da cauda, minutos antes das lesões na pele. O tratamento tópico foi aplicado nas feridas durante sete dias consecutivos. Grupos controle não tolerantes receberam aplicações parenterais de Ovalbumina ou veículo. A cicatrização das feridas foi analisada macroscopicamente e microscopicamente após coloração com H&E, Azul de toluidina ou Alcian Blue-Safranina, Tricrômico de Masson, Picrosirus Red e Resorcina-Fucsina de Weigert. A quantidade e distribuição de leucócitos (CD45), macrófagos (F4/80), linfócitos T (CD3), miofibroblastos (α-SMA) e Vimentina foi investigada no leito da lesão, por imunofluorescência. Análises macroscópicas mostraram menos inflamação e cicatriz mais suave nos animais que receberam aplicação de proteínas toleradas. Análises microscópicas no dia 7 após a lesão mostraram menor infiltrado inflamatório nos grupos que receberam aplicação de proteínas toleradas. Aos 40 e 60 dias após a lesão, a organização da matriz extracelular na neoderme dos grupos que receberam aplicação de proteínas toleradas estava mais semelhante à da pele intacta. Concluímos que a aplicação de proteínas toleradas diminui a inflamação e melhora a cicatrização de lesões cutâneas independentemente da via de aplicação. Skin wound healing depends on interactions between many types of cells that result in local inflammation and activation, migration and proliferation of keratinocytes, fibroblasts, endothelial cells and leukocytes. Through oral tolerance, an immunological phenomenon that occurs after protein intake, it is possible to inhibit the production of antibodies and reduce inflammation. Previous works have shown that an intraperitoneal injection of orallytolerated proteins plus adjuvant, minutes before skin injuries in mice, reduces inflammation and improves wound healing. Herein we evaluated whether two other routes of application - subcutaneous injection (s.c.) and topical application - of previously ingested proteins also improve wound healing. We used two different proteins: Zein that is a regular component of mice chow; and Ovalbumin that was added in the water offered to the mice for 3 consecutive days, before skin lesions. Two excisional lesions on the dorsal skin were performed in 8-week-old male C57Bl/6 mice with a 6 mm dermatological punch, under anesthesia. One s.c. application of the previously ingested proteins, in adjuvant, was made at the base of the tail, minutes before the lesions. Topical treatment with the previously ingested proteins, without adjuvant, was applied to the wounds for seven consecutive days. Non-tolerant control groups received treatment with the previously ingested proteins or vehicle. Wound healing was analyzed macroscopically and microscopically after staining with H&E, toluidine blue, Alcian Blue-Safranin, Masson's Trichrome, Picrosirus Red and Weigert's Resorcin-Fuchsin. The amount and distribution of leukocytes (CD45), macrophages (F4 / 80), T lymphocytes (CD3), myofibroblasts (α-SMA) and Vimentin was investigated in the wound bed by immunofluorescence. Macroscopic analyzes showed less inflammation and scarless healing in animals that received application of the tolerated proteins. Microscopic analyzes on day 7 after the injuries showed reduced inflammatory infiltrate in the groups that received application of tolerated proteins. At 40 and 60 days after the injuries, the organization of the extracellular matrix in neodermis of the groups that received application of tolerated proteins was more similar to that of intact skin. We conclude that the application of tolerated proteins decreases inflammation and improves the healing of skin lesions regardless of the route of application.

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune sistêmica em que a inflamação das articulações determina a sua destruição e perda da mobilidade. Não há prevenção ou cura para a artrite reumatoide, e o tratamento baseia-se em anti-inflamatórios e analgésicos, restrito ao controle dos sintomas. A perda de tolerância na doença autoimune pode ser restaurada por ingestão do antígeno. Este processo induz tolerância oral, e os seus efeitos terapêuticos são bem estabelecida em modelos experimentais e clínicos. No entanto, a ingestão contínua de antígeno purificado nem sempre é viável. A Hsp65 é uma chaperonina essencial ne dobramento de proteínas e adaptação ao estresse celular. Ela também é uma potente reguladora da resposta imune e do processo inflamatório. Para a entrega direta de Hsp65 na mucosa, nós usamos uma linhagem recombinante de Lactococcus lactis que secreta Hsp65 de Mycobacterium leprae. Demonstramos que a terapia oral com Hsp65 inibiu a Artrite Induzida por Colágeno e um modelo agudo de artrite em camundongos. Este efeito preventivo incluiu a inibição do edema da pata, a inflamação das articulações. Ele esteve também associado à redução dos níveis de citocinas inflamatórias e de anticorpos patogénicos, assim como ao aumento de linfócitos B e T reguladores Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease in which inflammation of the joints determines its destruction and loss of mobility. There is no prevention or cure for RA, and the treatment is based on conventional anti-inflammatory, analgesic drugs restricted to symptoms control. The loss of tolerance resulting in pathogenic autoimmunity can be restored by ingestion of the target antigen. This procedure induces oral tolerance, and their therapeutic effects are well established in experimental models and clinical trials. However, the continuous intake of purified antigen is not always feasible as an alternative therapy. Hsp65 is a chaperonin essential to protein folding and response to cellular stress. The Hsp65 is also a known regulator of the immune response and inflammatory process. For direct delivery of Hsp65 to the mucosa, a recombinant Lactococcus lactis was constructed in a way to produce and secret Mycobacterium leprae Hsp65. The present study has shown that the therapy with Lactococcus lactis prevented a Collagen Induced Arthritis and a model of acute arthritis in mice. This preventive effect included inhibition of paw edema and joint inflammation associated with reduced levels of inflammatory cytokines and pathogenic autoantibodies and augmented numbers of regulatory B and T lymphocytes

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior No início do século XX observou-se que cobaias que haviam se alimentado com ração contendo milho reagiam menos imunologicamente às proteínas do milho, como a zeína, quando comparadas com cobaias não alimentadas com milho. Atualmente, sabemos que a absorção de proteínas intactas ou parcialmente digeridas através da mucosa intestinal é uma ocorrência comum após as refeições. Estas proteínas interferem na atividade do sistema imune e um resultado usual destas interferências é a tolerância oral, um fenômeno que consiste na diminuição de respostas imunes para proteínas previamente contactadas por via oral. Desde os primeiros relatos sobre a influência de proteínas da dieta sobre a atividade imunológica várias proteínas vegetais e animais foram utilizadas em estudos sobre a tolerância oral, tais como a ovalbumina de galinha (OVA), a gamablobulina bovina (BGG) e hemocianina de animais marinhos (KLH). Uma vez que estas proteínas animais não fazem parte da dieta usual dos camundongos, elas são introduzidas na ração ou diluídas em água para a indução de tolerância oral. Animais que ingerem OVA antes da imunização com OVA+Al(OH)3 (um adjuvante) formam menos anticorpos para OVA do que os que não ingeriram a mesma; mas a ingestão de OVA não interfere na imunização com outra proteína. Curiosamente, se durante a imunização com esta segunda proteína for realizada também uma imunização com a proteína tolerada, a formação de anticorpos para esta proteína “não-tolerada” é também diminuída. Também, a tentativa de imunização de animais tolerantes com o antígeno tolerado em adjuvante inibe reações inflamatórias, como as desencadeadas por injeção de carragenina no coxim plantar de camundongos. Estes efeitos desencadeados pela injeção do antígeno tolerado são denominados "efeitos indiretos da tolerância oral”. Nosso grupo de pesquisa mostrou que os efeitos indiretos da injeção de OVA em camundongos tolerantes a OVA inibem a inflamação após lesões na pele de camundongos e, como resultado, forma-se uma cicatriz menor. Neste trabalho, mostramos que a injeção i.p. de zeína em adjuvante Al(OH)3 diminui o infiltrado inflamatório, reduz a área do tecido de granulação e reduz a cicatriz em lesões na pele de camundongos saudáveis e diabéticos. Os efeitos indiretos modificaram também a cicatrização em curso, quando a proteína tolerada foi injetada 6 horas após a lesão. Além disso, verificamos que os efeitos indiretos da tolerância oral pela injeção de zeína aumentaram a expressão de TGF- β3 no leito da ferida. Estes resultados indicam que a injeção parenteral de proteínas toleradas pode ser explorada como uma possibilidade de tratar lesões cutâneas em condições onde a cicatrização é mais difícil de ocorrer At the beginning of the twentieth century it was observed that animals that had been fed with animal chow that contained corn proteins did not react immunologically to zein. Today we know that the absorption of intact or partially digested proteins through intestinal mucosa is a common occurrence after meals. These proteins interfere with the activity of the immune system and a common result of these interferences is oral tolerance. The first reports on the influence of dietary proteins on the immune activity were made with plant and animal proteins but most studies on oral tolerance have been made using animal-derived proteins. Animal proteins, such as ovalbumin (OVA) is not a regular diet component of mice and, for oral tolerance induction, it has to be introduced in their drinking water. Mice that drink a solution containing OVA before immunization with OVA+Al(OH)3 form less antibodies than those animals that do not receive OVA. However the ingestion of OVA does not interfere with immunization to other proteins, except when during the immunization with the second protein the tolerated protein is also given, a phenomenon named "indirect effects of oral tolerance". Indirect effects of oral tolerance to OVA also inhibit inflammatory reactions, such as those triggered by carrageenan and improves skin wound healing in mice. In here we show that, the indirect effects of oral tolerance triggered by intraperitoneal injection of zein minutes before a skin wound in both health and diabetic mice reduce the inflammatory infiltrate and improve the healing of cutaneous wound. Mice that have received i.p. injection of zein+Al(OH)3 before cutaneuos wound had reduced scar. Moreover, we show that indirect effects of oral tolerance can improve the healing of a lesion already in process or in conditions where the healing process is more difficult to occur as in diabeties. The indirect effects of oral tolerance triggered by i.p. injection of zein increased the level of TGF-β3 in the wound bed. These results indicate that parenteral injection of tolerated proteins may be explored as a possibility to treat skin ulcers in cases where cutaneous wound healing is more difficult to occur.

A Tolerância Oral é tradicionalmente definida pela inibição da reatividade imune específica contra proteínas previamente ingeridas, devido a um decréscimo da atividade linfocitária. Pouca atenção tem sido dada à atividade imunológica sistêmica global em animais tolerantes orais. Por atividade imunológica global, entendemos a ativação concomitante de clones de linfócitos não específicos ao antígeno em questão, além dos clones antígeno-específicos. Paradoxalmente, nós observamos que a inibição da reatividade específica coexiste com um aumento da atividade global de linfócitos. Camundongos C57BL/6 tolerantes a ovalbumina apresentaram a supressão característica das respostas de anticorpos séricos específicos para todas as classes de Imunoglobulinas avaliadas: IgG1, IgE, IgM e IgA. Entretanto, o nível de IgM total sérica estava mais aumentado em animais tolerantes do que em imunizados. Os níveis de IgA total sérica estavam aumentados em ambos os grupos. Por consequência, animais tolerantes possuíam números elevados de células secretoras de imunoglobulinas (CSI) no baço e na medula óssea. No baço de animais tolerantes prevaleceu CSI produzindo IgA e IgM enquanto que na medula óssea predominam CSI produzindo IgG e IgM. Animais imunizados mostraram maior número de CSI secretando IgG no baço. Apesar de possuírem o mesmo número e frequência de linfócitos T ativados e reguladores no baço após a imunização secundária, animais tolerantes exibiram uma cinética particular de aparecimento dessas células após a imunização primária. Camundongos tolerantes mostraram uma expansão precoce de células T efetoras/memória CD4+CD44high um dia após a imunização, enquanto que animais imunizados tiveram esta população aumentada após o quarto dia. Similarmente, células T reguladoras CD4+Foxp3+ aparecem antes no baço de animais tolerantes, no segundo dia da cinética. Estas células expandem tardiamente em animais imunizados, porém alcançam uma frequência e número maior do que a de animais tolerantes após 7 dias. Digno de nota é o aumento no número de células T CD4+CD69+ (recém ativadas) e CD4+CD25+LAP+ (reguladoras) no baço de animais tolerantes mesmo antes da imunização parenteral, sete dias após a administração oral do antígeno. Neste período, animais tolerantes também possuem uma expressão aumentada de citocinas reguladoras (TGF- e IL- 10) e uma expressão transitória de citocinas efetoras (IL-2 e IFN-). Assim, concluímos que os fenômenos imunológicos subjacentes à tolerância oral vão além da inibição da reatividade específica, envolvendo uma ativação linfocitária mais distribuída e uma rápida mobilização de linfócitos ativados e reguladores. Oral tolerance is traditionally understood as a reduction of specific immune responsiveness to ingested proteins due to lymphocyte activity decrease. Few attention has been given to systemic immunological activity in orally tolerant organisms. Paradoxically, we found that specific lymphocyte activity inhibition was parallel to an increased global lymphocyte activity. C57BL/6 mice rendered orally tolerant to ovalbumin showed the characteristic suppression of antigen specific antibody responses in all serum immunoglobulin classes analyzed: IgG1, IgE, IgM and IgA. Nevertheless, these mice presented total IgA levels similar to immunized mice and higher levels of total IgM in serum. Accordingly, orally tolerant mice had higher number of immunoglobulin secreting cells (ISC) in spleen and bone marrow. Moreover, tolerant mice Ig-secreting cells in spleen were mainly IgM and IgA producers, whereas immunized mice had mostly IgG-secreting cells. Despite having the same number of regulatory and activated T cells in spleen after booster immunization, tolerant animals exhibit a different cells appearance kinetics in the spleen after the primary intraperitoneal immunization with antigen and adjuvant. Tolerant mice showed an earlier expansion of CD4+CD44high effector/memory T cell as soon as one day after immunization while immunized mice had these cells expanded at the fourth day. Similarly, CD4+Foxp3+ regulatory T cells appeared sooner in tolerant mice, two days after immunization. Immunized mice showed a CD4+Foxp3+ Treg cells expansion delay, achieving higher cells frequencies and numbers 7 days after immunization. Importantly, orally tolerant mice presented higher numbers of CD4+CD69+ T cells and CD4+CD25+LAP+ regulatory T cells in spleen even before parenteral immunization. Also, at this time tolerant animals showed a higher expression of regulatory cytokines (TGF- and IL-10) and a transient expression of lymphocyte activation cytokines (IL-2 and IFN-). Thus, over inhibiting specific responsiveness, orally-tolerant mice display an early and widespread mobilization of activated and regulatory lymphocytes.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais No início do século XX observou-se que certos materiais associados ao antígeno, como o hidróxido de alumínio (Al(OH)3) atuavam como adjuvantes aumentando muito a produção de anticorpos. Por outro lado, também no início do século XX observou-se que cobaias que haviam se alimentado com ração contendo milho não reagiam imunologicamente às proteínas do milho, como a zeína, como faziam as outras cobaias que não tinham sido alimentadas com milho. Atualmente sabemos que a absorção de proteínas intactas ou parcialmente digeridas através da mucosa intestinal é uma ocorrência comum após as refeições. Estas proteínas interferem na atividade do sistema imune e um resultado usual destas interferências é a tolerância oral, um fenômeno que consiste na diminuição de respostas imunes para proteínas previamente contactadas por via oral. Os primeiros relatos sobre a influência de proteínas da dieta sobre a atividade imunológica foram feitos com proteínas vegetais e animais mas a maioria dos estudos sobre a tolerância oral têm sido feitos usando proteínas derivadas de animais, como ovalbumina (OVA), gamablobulina bovina (BGG) e hemocianina (KLH). Uma vez que estas proteínas animais não fazem parte da dieta usual dos camundongos, elas são introduzidas na ração ou diluidas na água para a indução de tolerância oral. Desta forma sabemos que os animais que ingerem OVA antes da imunização com OVA+Al(OH)3 formam menos anticorpos para OVA do que os que não ingerem OVA. Mas a ingestão de OVA não interfere na imunização com outra proteína, a não ser que durante a imunização com esta segunda proteína seja dada também uma imunização com a proteína tolerada. Esta última observação tem sido objeto de estudo do nosso grupo há alguns anos após mostrarmos que a imunização de animais tolerantes com o antígeno tolerado em adjuvante inibe respostas imunes para antígenos não relacionados e que inibe também reações inflamatórias, como as desencadeadas por carragenina. Este fenômeno desencadeado pela injeção do antígeno tolerado foi denominado "efeitos indiretos da tolerância oral”. Mostramos que os efeitos indiretos da injeção de OVA em camundongos tolerantes a OVA inibem a inflamação após lesões na pele de camundongos resultando numa menor cicatriz. Avaliamos os efeitos indiretos da tolerância oral sobre as lesões cutâneas e elas também ocorrem com uma proteína presente na dieta usual dos camundongos. Usamos a zeína, proteína que faz parte da composição da ração dos camundongos, e os modelos de lesão incisional e excisional na pele. Os efeitos indiretos da imunização parenteral com uma proteína tolerada (Zeína do milho): reduzem o infiltrado inflamatório na área da lesão incisional e excisional nos dias 5, 7 e 40 respectivamente, melhora o reparo e reduz a cicatriz formada pela deposição de uma matriz extracelular de estrutura mais similar à pele normal. A imunização secundária com uma proteína tolerada sem adjuvante e concomitante com a lesão na pele de camundongos, não diminui o infiltrado inflamatório e a área do tecido de granulação, analisando histologicamente a pele no dia 5 após a lesão Early in the twentieth century it was observed that certain materials associated with the antigen, such as aluminum hydroxide (Al (OH) 3) served as adjuvant greatly increased the production of antibodies. On the other hand, also in the early twentieth century it was observed that mice that had been fed with feed containing corn not respond immunologically to protein of maize, such as zein, as did other specimens which had not been fed corn. Today we know that the absorption of intact proteins or partially digested by intestinal mucosa is a common occurrence after meals. These proteins interfere with the activity of the immune system and a result of these interferences is usual oral tolerance, a phenomenon consisting in reducing immune responses to proteins previously contacted orally. The first reports on the influence of dietary proteins on the immune activity were made with plant and animal proteins but most studies of oral tolerance have been made using animal-derived proteins such as ovalbumin (OVA), bovine gamablobulina (BGG) and keyhole limpet hemocyanin (KLH). Since these proteins are not part of animals usual diet of mice, they are introduced in the feed or diluted in water for oral tolerance induction. Thus we know that animals ingest OVA before immunization with OVA + Al (OH) 3 OVA antibodies to form less than that do not ingest OVA. However the ingestion of OVA immunization does not interfere with other proteins, except that during the immunization with this second protein is also given one immunization with the protein tolerated. This last observation has been studied by our group a few years show that immunization of tolerant animals with antigen in adjuvant tolerated inhibits immune responses to unrelated antigens and also inhibits inflammatory reactions, such as those triggered by carrageenan. This phenomenon triggered by injection of tolerated antigen has been termed "indirect effects of oral tolerance." We show that the indirect effects of injection of OVA in OVA-tolerant mice inhibit inflammation after skin lesions in mice resulting in less scarring. Evaluate the indirect effects Oral tolerance on the cutaneous lesions and they also occur with a protein present in the usual diet of mice. We zein, forming part of protein composition of the feed of the mice and model incision and excision of the skin. The indirect effects of parenteral immunization with a tolerated protein (zein from corn) reduces the inflammatory infiltrate in the area of incision and excision on days 5, 7 and 40 respectively, improves the repair and reduces the scar formed by deposition of an extracellular matrix structure more similar to normal skin. The secondary immunization with a protein tolerated without adjuvant and concomitant damage to the skin of mice, did not reduce the inflammatory infiltrate and the area of granulation tissue histologically analyzing the skin at days after injury.

A tolerância oral é caracterizada por uma redução da reatividade imunológica específica a uma proteína previamente administrada por via oral. A exposição parenteral a antígenos para os quais a tolerância oral foi previamente induzida afeta (inibe) atividades imunológicas ligadas a antígenos não relacionados, fenômeno que denominamos efeitos indiretos da tolerância oral. Investigamos a possibilidade de transferir a tolerância oral e seus efeitos indiretos para receptores singênicos imunocompetentes por transfusão de células do baço e soro de doadores tolerantes. Investigamos também se os efeitos indiretos da tolerância oral interferem no processo de rejeição de enxertos alogênicos. A transferência adotiva da tolerância oral e de seus efeitos indiretos é mais facilmente observada quando avaliamos a reação de DTH em receptores C57BL/6 e BALB/c. Camundongos BALB/c são mais susceptíveis à transferência adotiva destes fenômenos quando analisamos a produção de anticorpos específicos. Em receptores com o sistema imune intacto, existe uma barreira (barreira singênica) que dificulta a implantação funcional das células transferidas, interferindo em suas atividades imunológicas específicas. Entretanto, a transferência de diferentes componentes do sistema imune é capaz de suplantar essa barreira, demonstrando a importância de interações entre componentes celulares e moleculares para o estabelecimento dos fenômenos aqui estudados. Os efeitos indiretos da tolerância oral parecem retardar a rejeição de enxertos de pele alogênicos, demonstrando seu caráter sistêmico. Fenômenos como a barreira singênica e os efeitos indiretos da tolerância oral são melhor entendidos em modelos que descrevam a interdependência dos componentes do sistema imune. Oral tolerance is characterized by a reduction in specific immunological activities to a protein previously given by oral route. Parenteral exposure to antigens to which oral tolerance had been previously induced affects (inhibits) immunological activities connected to unrelated antigens, a phenomenon we have called indirect effects of oral tolerance. Herein, we investigated the possibility of adoptively transferring oral tolerance and its indirect effects to immunocompetent syngeneic recipients by the transfusion of spleen cells and serum from tolerant donors. We also investigated if the indirect effects of oral tolerance interfere in the rejection of allografts. The adoptive transfer of oral tolerance and its indirect effects is more easily demonstrated when we evaluated DTH reaction in C57BL/6 and BALB/c recipient mice. BALB/c mice are more susceptible to the adoptive transfer of these phenomena when we evaluate specific antibody production. In recipients with an intact immune system, there is a barrier (syngeneic barrier) that impairs the functional implantation of transferred cells, interfering with their specific immunological activities. However, the transfer of different immune system components is able to bypass this barrier, demonstrating the importance of interactions between molecular and cellular components to the establishment of the phenomena studied herein. The indirect effects of oral tolerance seem to delay the rejection of skin allografts, demonstrating its systemic character. Phenomena such as the syngeneic barrier and the indirect effects of oral tolerance will better understood in models that describe the interdependence among the components of the immune system.

O óxido nítrico (NO) constitui uma das mais importantes moléculas biossintetizadas e participa como mediador em diversos processos biológicos. A determinação laboratorial do NO representa um desafio devido, principalmente, à sua ínfima meia-vida e concentração em amostras biológicas. Recentemente, a citometria de fluxo foi proposta como método para determinação de NO intracelular, utilizando-se o diacetato de 4,5-diaminofluoresceína (DAF-2DA). Evidências crescentes sugerem um papel do NO resultante da NO-sintase induzível (iNOS) como mediador do processo de rejeição a enxertos. O transplante renal é o tratamento de escolha para pacientes que se encontram no estágio final da doença renal e a nefropatia crônica do enxerto (NCE) constitui a causa mais importante de perda do rim transplantado. Neste estudo, foi otimizado o protocolo para determinação de NO intracelular em monócitos e neutrófilos circulantes por citometria de fluxo e foi determinado o perfil de produção desse composto em pacientes transplantados renais com NCE (n=11) e indivíduos saudáveis (n=10). Não foi observada diferença na produção de NO, comparando-se os dois grupos. A produção de NO em monócitos e neutrófilos circulantes em pacientes com NCE provavelmente encontra-se suprimida devido à ação de imunossupressores. Nitric oxide (NO) is one of the most important biosynthesized molecules and participates as a mediator in various biological processes. The laboratorial determination of NO represents a challenge principally because of its unreliable half-life and concentration in biological samples. Recently, flow cytometry was proposed as a method for the determination of intracellular NO with 4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA). Increasing evidence suggests a role for the NO resulting from inducible NO synthase (iNOS) as a mediator in the graft rejection process. Renal transplant is the treatment of choice for patients that are in the final stage of kidney disease and the chronic nephropathy of the graft is the most important cause of loss of a transplanted kidney. In the present study, the protocol for the determination of intracellular NO in monocytes and circulating neutrophils by flow cytometry was optimized, and the profile for the production of this compound in kidney-transplanted individuals with chronic nephropathy of the graft (n=11) and healthy individuals (n=10) was determined. No difference in the production of NO was observed in the two groups. The production of NO in monocytes and circulating neutrophils in patients with chronic nephropathy of the graft is probably suppressed as a result of the action of immunosuppressors.

A exposição parenteral a antígenos para os quais a tolerância oral foi previamente induzida afeta (inibe) atividades imunológicas ligadas a antígenos não relacionados, fenômeno que denominamos efeitos indiretos da tolerância oral (Carvalho, et al., 1994). Investigamos a possibilidade de transferir a tolerância oral e seus efeitos indiretos para receptores singênicos normais ou previamente irradiados por transfusão de células do baço. Tanto a tolerância oral, quanto seus efeitos indiretos, foram transferidos apenas para receptores irradiados, sendo que os efeitos indiretos requisitaram um maior número de células, o que sugere o envolvimento de um maior número de interações celulares nos efeitos indiretos. Em receptores não-irradiados existe uma barreira (barreira singênica) que impede a implantação funcional das células transferidas, interferindo em suas atividades imunológicas específicas. O padrão de distribuição das células transferidas em diferentes órgãos linfóides foi estudado por marcação com CFSE. Nos receptores irradiados, a porcentagem de células marcadas era maior em todos os órgãos estudados, independentemente se provindas de doadores tolerantes ou não-tolerantes. Entretanto, o número absoluto tende a ser um pouco maior nos receptores não irradiados. Animais receptores de células de doadores não-tolerantes, no terceiro dia após a transferência, apresentaram uma redução, tanto na porcentagem quanto no número absoluto de células marcadas com CFSE, quando comparados com os receptores de células de doadores tolerantes. Isto sugere que há diferenças na dinâmica de decaimento das células transferidas de doadores tolerantes ou não-tolerantes. Fenômenos como a barreira singênica e os efeitos indiretos da tolerância oral talvez sejam melhor entendidos em modelos que descrevam a interdependência dos componentes do sistema imune. Parenteral exposure to antigens to which oral tolerance had been previously induced affects (inhibits) immunological activities connected to unrelated antigens, a phenomenon we have called indirect effects of oral tolerance (Carvalho, et al., 1994). Herein, we investigated the possibility of adoptively transferring oral tolerance and its indirect effects to normal or previously irradiated syngeneic recipients, by spleen cells. Both oral tolerance and its indirect effects were transferred only to irradiated recipients and a larger number of cells was necessary for the transfer of the indirect effects, which suggests the participation of more complex cellular interactions in these effects. In nonirradiated recipients, there is a barrier (syngeneic barrier) that impairs the functional implantation of transferred cells, interfering with their specific immunological activities. We also studied the distribution patterns of transferred cells in different lymphoid organs from recipient mice, by CFSE labeling. In irradiated recipients, independently of the origin of transferred cells, the percentage of labeled cells was higher, in every studied organ. However, the absolute number was a little higher in nonirradiated recipients. Recipients of cells from nontolerant donors displayed a decrease, both in the percentage and in the absolute number of CFSE labeled cells on the third day after cell transference, as compared to recipients of cells from tolerant donors. This suggests different dynamics of decay of adoptively transferred cells from tolerant or non-tolerant donors. Phenomena such as the syngeneic barrier and the indirect effects of oral tolerance will be better understood in models that describe the interdependence among the components of the immune system.

A maioria dos contatos naturais com antígenos ocorre pela mucosa do trato gastrointestinal. Esses contantos resultam normalmente no desenvolvimento de um estado de hipo-reatividade sistêmica a esses antígenos chamado de tolerância oral. A tolerância oral depende de mecanismos regulatórios desencadeados no microambiente da mucosa intestinal e perturbações inflamatórias nesse local podem interferir no seu estabelecimento. Nesse estudo, desenvolvemos dois modelos experimentais de patologias inflamatórias da mucosa adjacente ao intestino delgado: gastrite e colite induzidas pela administração aguda de álcool. Embora induzidas em duas raças diferentes de camundongos, C57BL/6 e BALB/c, ambas as doenças caracterizam-se por um infiltrado de células mono e polimorfonucleares na mucosa e pela produção local de citocinas também de um padrão misto: IL-4 e IFN-y. Nesses modelos, ocorrem perturbações no balanço de citocinas não somente no local mas em toda a mucosa intestinal sendo IL-4 a principal citocina afetada. Os animais com gastrite ou com colite tomam-se refratários à indução de tolerância oral. Os efeitos imunológicos do álcool foram estudados em mais detalhe no modelo de gastrite. Embora o álcool seja rapidamente metabolizado, várias alterações funcionais locais e sistêmicas são detectáveis nos animais com gastrite, tais como redução da atividade proteolítica e da produção de muco e de IgA secretária no estômago, anemia e leucopenia. Nesse modelo, mostramos também várias evidências de que a administração oral de álcool induz uma inflamação com características alérgicas e com repercussões sistêmicas importantes no sistema imune. Ocorre um aumento da procução de IL-4 no estômago e no baço assim como um aumento nos níveis séricos totais de IgE nos animais com gastrite. A administração oral de Ovalbumina (Ova) nesses animais induz aumento da permeabilidade vascular e do recrutamento de eosinófilos na mucosa do estômago além de desencadear uma sensibilização que aumenta os níveis de IgG 1 e IgE após a imunização parenteral. Esses animais sensibilizados apresentam aversão à ingestão de uma solução contendo Ova. Além disto, a reação de DTH desencadeada nos animais com gastrite é marcada pela presença de eosinófilos e se assemelha, nas características histológicas e na cinética, à fase tardia da hipersensibilidade imediata. Essas alterações inflamatórias juntamente com o comprometimento de mecanismos locais e sistêmicos de imuno-regulação, como a redução na produção de IL-10 por células do baço, podem ser responsáveis pelos distúrbios marcantes observados na indução de tolerância. Camundongos com gastrite são refratários à indução de tolerância por via oral e por via endovenosa para Ova. Camundongos geneticamente selecionados para a susceptibilidade à tolerância oral também se tornam refratários após o tratamento oral com álcool e o mesmo tratamento é capaz de eliminar a tolerância oral já estabelecida para uma proteína da dieta de camundongos C57BL/6, a caseína. Observamos também que o clareamento da Ova injetada por via subcutânea está comprometido nos animais com gastrite. A análise da atividade de macrófagos nesses animais mostrou uma redução significativa no tempo e na eficiência da fagocitose até 30 dias depois da última administração de álcool ainda que atividades efetoras como a produção de ll..,-6 e NO estejam alteradas apenas por um breve período pós-tratamento. Como a apresentação de antígenos é um evento importante na ativação de linfócitos T, essa pode ser uma das alterações relacionadas à interferência na indução de tolerância no modelo apresentado. Em conclusão, esse estudo descreve dois modelos inéditos de patologias inflamatórias da mucosa do trato gastrointestinal e mostra que a administração aguda de álcool pode ter efeitos inflamatórios locais e sistêmicos assim como pode comprometer o estabelecimento da tolerância a antígenos naturais como aqueles presentes na dieta. The majority of natural contacts with antigens take place through the mucosa of the gastrointestinal tract. Usually, these contacts result in a state of systemic immunological hyporesponsiveness to the antigen named oral tolerance. Oral tolerance depends on regulatory mechanisms that are triggered in the microenvironment of the gut mucosa and local inflammatory disturbances may compromise its development. In this study, we report two novel experimental models of inflammatory pathologies in the mucosa adjacent to the small intestine, both induced by topic administration of alcohol: gastritis and colitis. Although they are induced in two different strains of mice, C57BL/6 and BALB/c respectively, both diseases are characterized by an inflammatory infiltrate of mono and polimorphonuclear cells and by the local production of a mixed profile of cytokines with the presence of IL-4 and IFN-y. In these experimental models, disturbances in the balance of cytokines occur not only locally but throughout the intestinal mucosa. IL-4 is the most affected cytokine. Animais with either gastritis or colitis are refractory to oral tolerance induction. The immunological effects of alcohol administration were studied in more detail in the gastritis model. Although alcohol is promptly metabolized, several local and systernic functional alterations can be detected in these mice, such as reduction in the proteolytic activity, in the production of mucus and secretory IgA in the stomach, anemia and leukopenia. In these animais, we also demonstrate that alcohol administration induces an allergic-type inflammatory response. There is an increase in the production of IL-4, both in the stomach and in the spleen, as well as a rise in the leveis of serum IgE in mice with gastritis. Oral administration of ovalbumin (Ova) to these animais induces an increase in local vascular permeability and in the recruitment of eosinophils to the stomach. It also primes the animais augmenting the serum leveis of specific IgG 1 and IgE antibodies after parenteral immunization. Interestingly, sensitized mice show aversion to the intake of a sweetened Ovacontaining solution. In addition, DTH reaction triggered in mice with gastritis is marked by the presence of eosinophils and it resembles, in the histology and in the kinetics, the late phase of the hypersensitivity type 1 reaction. Such inflammatory alterations along with disturbances in the systemic and local immunoregulatory mechanisms, such as IL- 1 O production by spleen cells, may be related to the interference in oral tolerance induction. Mice with gastritis are refractory to tolerance induction by oral and intravenous routes. Mice genetically selected for susceptibility to oral tolerance induction to Ova become refractory after alcohol treatment and oral tolerance already stablished to a dietary protein, casein, can be disrupted by oral administration of alcohol. We also observed that the clearance of subcutaneously injected Ovais impaired in mice with gastritis. Analysis of macrophage activity in these mice shows a significant reduction in the time and efficiency of phagocytosis as long as 30 days after alcohol treatment although effector functions, such as ll..,-6 and NO production are only affected shortly after treatment. Since antigen presentation is an important event on the activation of T lymphocytes, it might be one of the alterations related to oral tolerance abrogation in this model. In conclusion, the present study describes two novel models of inflammatory pathologies of the mucosa of the gastrointestinal tract and shows that short-term alcohol administration have local and systemic immunological effects and it may compromise the development of oral tolerance to natural antigens such as dietary proteins.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Tolerância oral é definida como um estado de hipo-reactividade sistémica frente a um antigénio que foi previamente administrado por via oral. Muitos fatores afetam a indução de tolerância oral, alguns deles relacionados com o antígeno, alguns relacionada com o animal. A idade do animal é um dos fatores mais importantes que afetam a indução de tolerância oral como o envelhecimento, que induz muitas alterações na resposta imune. A tolerância oral é mantida durante um longo período de tempo. Nosso estudo mostrou que tanto a tolerância oral, bem como a reatividade imune é mantida até um ano e meio e que essa manutenção pode ser visto em muitos aspectos da resposta imune em camundongos idosos que tiveram contato prévio com o antígeno quando jovem. Observou-se a manutenção da tolerância oral por meio da resposta humoral, após vários desafios com a Ova (p