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O leite ovino, mesmo no caso de raças especializadas, apresenta sazonalidade de produção e baixa produtividade por fêmea. Em função disso, o objetivo do presente estudo foi verificar a possibilidade de conservação do leite fresco, por um período de sete dias, sob refrigeração e congelamento, verificando a influência dos tratamentos aplicados, e dos meses do ano, sobre as características físico-químicas do produto. A composição química, incluindo gordura, proteína, lactose e sólidos totais, não sofreu alterações com o resfriamento e congelamento do leite, contudo os teores de proteína e lactose variaram durante os meses do ano. O percentual médio de gordura, proteína, lactose e sólidos totais foi de 8,10±1,30, 5,22±0,37, 4,43±0,23 e 19,34±1,54, respectivamente. A densidade, o pH, a acidez titulável e as provas de estabilidade ao álcool e ao calor sofreram influência significativa dos tratamentos aplicados (P

O plasma rico em plaquetas (PRP) é um produto biológico utilizado na promoção de melhor reparo tecidual, por meio dos fatores de crescimento presentes em sua composição. O objetivo do presente trabalho foi comparar a viabilidade da criopreservação das plaquetas de muares e equinos e a influência de dois anticoagulantes citrato dextrose (ACD) e citrato de sódio (CS). Foram utilizados oito animais de cada espécie, com duas replicações cada. O PRP foi obtido em uma centrifugação única de 131g, durante oito minutos. As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido após serem submetidas à curva de resfriamento controlado. Foi utilizado uma solução de DMSO a 3% em glicose como criopreservante. As análises foram feitas em aparelho hematológico e na câmara de Neubauer; a avaliação morfológica foi feita em microscopia óptica de contraste de fases. A concentração plaquetária do PRP em relação ao sangue total foi de 1,42 vezes para equinos e 2,00 vezes para muares, em ACD; e 1,39 vezes para equinos e 2,69 vezes para muares utilizando-se o CS. O protocolo utilizado foi mais efetivo em concentrar as plaquetas de muares do que de equinos, embora a qualidade do PRP congelado tenha sido semelhante nas duas espécies. Constatou-se o aumento das células em estado ativado nas amostras criopreservadas, independente da espécie ou anticoagulante empregado. A contagem de plaquetas em ACD e CS, no sangue total, foi mais fidedigna do que a contagem no EDTA para a produção do PRP. Baseando-se na premissa de que a presença leucocitária é deletéria à qualidade do PRP, o anticoagulante CS mostrou-se mais eficiente na redução de leucócitos totais em relação ao ACD, em ambas as espécies. Por não haver diferenças significativas entre a qualidade do PRP criopreservado obtido entre os diferentes anticoagulantes empregados (principalmente em parâmetros morfológicos plaquetários), sugere-se o CS como melhor anticoagulante na obtenção do PRP em equinos e muares. Aplicações clínicas são necessárias para validar os efeitos biológicos do PRP, fresco e criopreservado, especialmente em muares, que mostraram particularidades hematológicas em relação aos equinos. Platelet-Rich Plasma (PRP) is a biological product often used to promote tissue repair, due to its composition of growth factors. The aim of this study was to compare the viability of platelet cryopreservation on two species, horses and mules, and the influence of two different anticoagulants dextrose citrate (ACD) and sodium citrate (SC). Eight animals of each species were used, with two replicas each. PRP was obtained after single centrifugation at 131 g in eight minutes. Samples were frozen in liquid nitrogen after exposure to a controlled cooling rate. A solution of glucose and 3% DMSO was used as a cryoprotectant. Blood analysis were performed on hematologic analyzer, Neubauer chamber and morphology was evaluated through optical microscopy of phase inversion. Platelet concentration on PRP when compared to total blood samples were 1,42 times in horses and 2,00 in mules, using ACD; and 1,39 times in horses and 2,69 times in mules using SC. The protocol was more efficient in concentrating mules platelets when compared to horses, although both species cryopreservation had similar quality. There was a significant increase of cells in activated status after cryopreservation, despite the species or anticoagulant employed. Platelet count on ACD and SC, on total blood, was more truthful in ACD and SC when compared to EDTA, in order to establish PRP parameters. Based upon the negative effects of leukocytes on PRP, SC was more efficient in reducing total leukocyte count when compared to ACD on both species. Due to the fact that there were no significant differences between cryopreserved PRP and the anticoagulants employed (especially regarding morphology parameters of platelets), it is suggested that SC was a better anticoagulant to obtain PRP on both mules and horses. Clinical trials should be performed, especially in mules, due to its hematological distinctive features when compared to horses.

O presente estudo foi conduzido no município de Lagoa Dourada, Estado de Minas Gerais, entre os meses de Dezembro de 2013 à Março de 2014. Pretendeu-se com este estudo propor, produzir e utilizar um novo diluidor para o congelamento do sêmen de jumentos, como um dos componentes de um novo protocolo de congelamento. Avaliou-se ainda, as taxas de gestação de éguas inseminadas após a detecção de uma ovulação induzida pela hCG, submetidas à controles foliculares a cada 8 horas a partir da aplicação da droga, na presença de um folículo acima de 30-35mm e edema uterino 2. Foram utilizados dois jumentos da raça Pêga como doadores de sêmen. Após a coleta, o sêmen foi submetido a um protocolo de congelamento, utilizando dois diluidores, sendo eles: o diluidor de leite em pó desnatado-glicose (LPDG)- gema de ovo- etilenoglicol (Jepsen, 2010) e o diluidor PIVO-2013. As éguas foram inseminadas após a detecção da ovulação, com uma concentração de 1x 10 espermatozoides móveis pré - congelamento/dose inseminante de 5mL, sendo o sêmen depositado no corpo do útero, por via intravaginal profunda. Em virtude das variações observadas após o descongelamento do sêmen, quanto à motilidade (30,00 ± 0,00 33,89 ± 0,73%) e vigor (3,71 ± 0,07 4,17 ± 0,14), utilizou-se concentrações de 300,00 x 106 a 338,89 ± 106 espermatozoides móveis/ dose inseminante, no momento das inseminações. As taxas de gestação obtidas foram de 23,81% (5/21) e 55,56% (10/18), respectivamente, para os diluidores LPDG e PIVO-2013 (p

O objetivo deste estudo foi correlacionar as alterações morfológicas e morfométricas de oócitos humanos antes e após a vitrificação. Também, avaliar se as características morfométricas de oócitos pré-vitrificação estão relacionadas à sobrevivência dessas células para criopreservação e verificar se as características morfométricas após o descongelamento de oócitos estão relacionadas à ocorrência de fertilização, após a ICSI. PACIENTES E MÉTODOS: os voluntários envolvidos neste estudo foram pacientes do Laboratório de Reprodução Humana Professor Aroldo Fernando Camargos do Hospital das Clínicas - UFMG, que foram submetidos à indução da ovulação para reprodução assistida. O estudo incluiu 28 pacientes e 71 oócitos vitrificados. Os oócitos foram identificados na placa de cultura usando-se lupa estereoscópica. Os oócitos foram deixados numa incubadora de CO2 durante pelo menos uma hora, fotografados para avaliação morfológica e morfométrica e vitrificados individualmente, seguindo o protocolo da Irvine Scientific. Medições e avaliações de oócitos, zigotos e embriões nos segundo e terceiro dias de cultura foram realizadas utilizando-se software Cronus TM. As seguintes características morfológicas dos oócitos foram avaliados: grânulos citoplasmáticos, a fragmentação do corpo polar, inclusões citoplasmáticas e vacúolos. RESULTADOS: não houve correlação entre as características morfológicas e morfométricas dos 71 oócitos avaliados antes de vitrificação. Os diâmetros dos oócitos e as medidas do espaço perivitelino (EPV), zona pelúcida (ZP) e corpúsculo polar (CP) foram semelhantes nos oócitos classificados como morfologia ótima (n=40) e naqueles com morfologia alterada (n=31). De 49 oócitos descongelados, 22 haviam degenerado e 27 ficaram preservados, incluindo 20 com ótima morfologia e sete com morfologia abaixo do ideal. Enquanto o diâmetro do oócito, as medidas do EPV e ZP foram semelhantes nos oócitos descongelados e com a morfologia ótima e de qualidade inferior, o último grupo mostrou significativa redução da medida de CP (11,8 [10,5- 13,0] Nm versus 13,2 [12,2-15,3] Nm P=0,013). Os parâmetros morfométricos de oócitos frescos não foram preditivos de sobrevivência do oócito para vitrificação e descongelamento. Dos 27 oócitos que sobreviveram ao processo de criopreservação e submetidos à ICSI, 13 foram fertilizados. Os diâmetros de oócitos após o descongelamento foram menores nos oócitos fertilizados (76,0 [73,0-78,3] Nm), em comparação com aqueles que não fertilizaram (80,5 [73,9- 82,6] Nm, P=0,043). Este último grupo também apresentou EPV menor. CONCLUSÃO: as características morfológicas e morfométricas de oócitos frescos não estão relacionadas com a sua resistência à vitrificação. No entanto, após o descongelamento, a falha da fertilização está associada a oócitos de diâmetro maior e EPV menores. The aim of this study was to correlate oocyte morphological and morphometric changes before and after vitrification, to evaluate if the morphometric characteristics of oocytes pre-vitrification are related to the survival of these cells to cryopreservation and to verify whether the morphometric characteristics after thawing of oocytes are related to the occurrence of fertilization after ICSI. PATIENTS AND METHODS: The volunteers involved in this study were patients admitted to the Professor Aroldo Fernando Camargos Laboratory of Human Reproduction at Hospital das Clínicas UFMG who underwent ovulation induction for assisted reproduction. The investigation included 28 patients and 71 vitrified oocytes. Oocytes were identified in the culture dish using magnifying stereomicroscope. The oocytes were left in a CO2 incubator for at least 1 hour, photographed for morphological and morphometric evaluations and then vitrified individually following the protocol of Irvine Scientific. Measurements and ratings of oocytes, zygotes and embryos in the second and third days of culture were performed using Cronus Software TM. The following morphological features of oocytes were assessed: cytoplasmic granules, polar body fragmentation, cytoplasmic inclusions and vacuoles. RESULTS: There was no correlation between morphological and morphometric characteristics of the 71 evaluated oocytes before vitrification. The oocyte diameters and the measurements of perivitelline space (PS), zona pellucida (ZP) and polar body (PB) were similar in oocytes classified as optimal morphology (N=40) and those with altered morphology (N=31). Out of 49 thawed oocytes, 22 had degenerated and 27 were preserved, including 20 with optimal morphology and 7 with suboptimal morphology. While the oocyte diameter, the PS and ZP measurements were similar in thawed oocytes with optimal and suboptimal morphology, the latter group showed a significant reduction of the measure of PB (11.8 [10.5 to 13.0] m versus 13.2 [12.2 to 15.3] m P=0.013). The morphometric parameters of fresh oocytes were not predictive of oocyte survival to vitrification and thawing. Of the 27 oocytes that survived the cryopreservation process and underwent ICSI, 13 were fertilized. The diameters of oocytes after thawing were lower in the fertilized oocytes (76.0 [73.0 to 78.3] m) compared to those not fertilized (80.5 [73.9 to 82.6] m, P=0.043). The latter group also had shorter PS. CONCLUSION: The morphologic and morphometric characteristics of fresh oocytes are not related to their resistance to vitrification. However, after thawing, fertilization failure is associated with larger oocyte diameter and shorter PS.

O processo de congelamento / descongelamento causa graves modificações estruturais e funcionais em amostras de espermatozóides (SPZ). A presença de glicose e proteínas no plasma seminal é importante para correção destes danos. Vários testes já foram propostos para predizer a criossobrevivência de SPZ, porém os métodos atuais são dispendiosos e requerem maior tempo para serem realizados. O objetivo deste estudo foi correlacionar o valor das dosagens seminais de glicose e proteínas pré-congelamento através de fitas reagentes e sua relação com as taxas de criossobrevivência de SPZ. As amostras seminais foram analisadas quanto aos parâmetros do espermograma preconizados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e foram dosadas as concentrações de glicose (fitas reagentes de glicosímetro) e proteínas (fitas reagentes de urianálise). Cada amostra foi então criopreservada (meio Tyb-G= Test Yolk Buffer with Gentamicine and 12% glycerol / N2=nitrogênio líquido). Após descongelamento (37°C / 10 minutos), a vitalidade e motilidade dos SPZ foram avaliadas. Nas amostras com maior concentração de proteínas (20g/dL, +++) a taxa de recuperação de espermatozóides vivos foi na mediana 74% (intervalo inter-quartil 55-98%) e nas amostras com menor concentração de proteínas (1g/dL, -/+) a mesma taxa ficou em 42% (26-73%, p

A recuperação de espermatozóides (SPZ) após criopreservação é bastante variável devido à imprevisibilidade dos efeitos deletérios causados pelo processo de congelamento e descongelamento. O objetivo do estudo foi avaliar o valor preditivo das dosagens seminais de hormônio anti-Mulleriano (AMH) e Inibina B para recuperação espermática (sobrevivência e preservação da motilidade) após criopreservação. As amostras seminais foram analisadas quanto à concentração (contagem em câmara de Neubauer), motilidade (microscopia ótica) e vitalidade (teste da eosina) dos SPZ. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas: uma para as dosagens hormonais (ELISA=Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) no plasma seminal e outra para criopreservação (meio Tyb-G=Test Yolk Buffer with Gentamicine and 12% Glycerol / N2=nitrogênio líquido). Após descongelamento (37°C / 10 minutos), a vitalidade e a motilidade dosSPZ foi novamente avaliada através das mesmas técnicas. As taxas de preservação da motilidade e de sobrevivência espermática foram comparadas com as dosagens de AMH e Inibina B no líquido seminal, em três diferentes grupos da população: Doador, Normal e Anormal. As análises foram realizadas em duplo cego. Não houve correlação entre as dosagens seminais de AMH e Inibina B e as taxas de motilidade e sobrevivência nos três grupos. Portanto, as dosagens seminais de AMH e inibina B não predizem as taxas de recuperação espermática. The rate of total sperm retrieval after cryopreservation is very variable due to difficulty in predicting injury caused by the freezing and thawing process. The aim of the study was to evaluate the predictive value of seminal levels of Inhibin B and Anti Mullerian hormone with regards to survival and spermatic motility after cryopreservation. The seminal samples were analyzed for morphology using Kruger criteria, concentration (Neubauer counting chamber), motility (optical microscopy) and vitality. Each sample was divided into two aliquots of which one was analyzed immediately and the second underwent cryopreservation (Tyb-G) and thawing. In both aliquots seminal serum was analyzed by Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) for hormone levels, and sperm vitality and motility were assessed using the techniques listed above. The cryopreservation survivalrate and motility maintenance rate were compared with seminal fluid levels of Inhibin B and AMH in three groups: Donor, Normal and Abnormal. Analysis was double blinded. No correlation was found between seminal serum levels of Inhibin B and AMH and CSR or MPR. Therefore, these hormones do not appear to have value in predicting sperm retrieval after cryopreservation.

A qualidade espermática de amostras criopreservadas ainda é considerada insatisfatória devido à baixa taxa de recuperação de espermatozoides viáveis após os processos de congelamento e descongelamento. Na tentativa de melhorar a qualidade do sêmen humano criopreservado, o presente estudo teve como objetivo comparar duas técnicas de descongelamento em amostras de homens normozoospérmicos. Cada amostra seminal, após análise inicial da motilidade (microscopia ótica), da concentração (contagem em câmara de Neubauer), da morfologia estrita (critério de Kruger) e da integridade funcional das membranas (teste hiposmótico), foi dividida em duas alíquotas iguais de 0,5 mL cada, que foram congeladas em meio de criopreservação Test Yolk Buffer com Glicerol (TYB-G). Uma amostra foi descongelada em temperatura ambiente por 25 minutos (descongelamento 1) e a outra em banho-maria a 75°C por 20 segundos, seguido por imersão em banho-maria a 37°C por três minutos (descongelamento 2). Após o descongelamento, os seguintes parâmetros foram avaliados e comparados entre as duas amostras: motilidade, morfologia estrita e integridade funcional das membranas. Os resultados foram expressos como média + desvio-padrão paravariáveis paramétricas e analisadas pelo teste t de Student. Os dados com variáveis não-paramétricas e não-pareadas foram expressos como mediana (intervalo interquartil) e analisados pelo teste de Mann-Whitney. O nível de significância foi estabelecido como p

Com o objetivo de avaliar o efeito do congelamento e estocagem à -18 ºC de carne bovina (m. Longissimus dorsi), foram avaliados seis pares de contrafilé (doze amostras) provenientes de seis bovinos machos castrados, com idade estimada de dois anos, sendo identificados como animais intermediários, e todas as amostras apresentando um pH final na faixa de 5,4 a 5,9. As amostras foram preparadas em diferentes formas (moída, bife e porção de 1,5kg) e mantidas por 30, 60 e 120 dias sob estocagem a -18 ºC, sendo avaliado no total 144 sub-amostras. Foi determinada a composição centesimal, pH, capacidade de retenção de água, perdas de peso, maciez e quantificação da oxidação lipídica. Não houve efeito dos tempos de estocagem ou das formas para os parâmetros pH, composição centesimal, perda de suco e maciez. A carne moída apresentou maior (P

A criopreservação de sêmen oferece grandes vantagens para os programas de reprodução eqüina, promovendo ganho genético. No entanto, a criopreservação reduz a qualidade espermática devido principalmente a alterações das membranas espermáticas semelhante às que ocorrem durante a capacitação espermática. A utilização de proteínas do plasma seminal no processo de criopreservação poderia minimizar os efeitos deletérios sobre o espermatozóide.Principalmente, dos efeitos resultantes da ação do processo de criopreservação tornando-se de grande valia para o melhoramento da qualidade do espermatozóide eqüino resfriado e póscongelamento. Deste modo, os objetivos deste trabalho foram: Identificar procedimentos preventivos para os efeitos deletérios da criopreservação, investigar a eficácia da técnica de cromatografia de exclusão molecular no estudo de proteínas do plasma seminal de mamíferos, isolar e identificar a presença de inibidores de serino proteases no plasma seminal eqüino, explorar comparativamente os inibidores naturais e sintéticos de serino protease quanto á sua atividade inibitória no mecanismo enzimático da serino protease (tripsina-bovina), introduzir inibidores naturais e sintéticos de serino proteases no meio diluidor de congelamento e resfriamento do sêmen eqüino, avaliar as qualidades morfométricas do espermatozóide eqüino através da citrometria de fluxo e comparar a eficiência do Azul de Tripan e do Iodeto de Propídio na avaliação da integridade física do espermatozóide eqüino através da citrometria de fluxo. Foram realizados três experimentos distintos. O primeiro destes experimentos testou a aplicação da técnica de cromatografia de exclusão molecular na identificação das proteínas do plasma seminal de três diferentes espécies animais: eqüina canina; caprina. Encontraram-se evidências de a cromatografia de exclusão molecular seja um procedimento satisfatório para identificação das proteínas do plasma seminal. O segundo experimento isolou, identificou e avaliou o inibidor de serino protease presente no plasma seminal eqüino e seu potencial de inibição. Também explorou comparativamente os inibidores naturais e sintéticos de serino protease quanto á sua atividade inibitória, avaliou a correlação entre concentração total de proteína e de inibidor de serino protease do plasma seminal com a maturidade sexual dos garanhões. Foram identificadas proteínas ativas com uma massa de molecular de 6.3-7.0 kDa usando espectrometria de massa. Os garanhões mais velhos mostraram uma redução na concentração total de proteína do plasma seminal, mas mantiveram a concentração dos inibidores de serino proteinase com diferença não significativa entre as médias. Também foram encontrados diferentes isoformas do inibidor de serino proteinase no sêmen de todos os garanhões. O terceiro experimento verificou o efeito da adição dos inibidores de serino protease ao meio de resfriamento e de congelamento do sêmen eqüino. Não houve diferença significativa entre o controle e os grupos tratados quanto à porcentagem de espermatozóide com motilidade progressiva, membrana plasmática funcional, integridade de membrana plasmática, acrossoma intacto e fragmentação de DNA. Não foi observada diferença significativa entre o grupo controle e os grupos tratados, depois da indução da reação de acrossômica com Cálcio Ionóforo A23187, sugerindo que os inibidores de serino protease não bloquearam a capacitação e reação acrossômica. Foi possível comprovar a eficácia dos dois cromóforos Azul de Tripan e Iodeto de Propídio na avaliação da integridade física do espermatozóide eqüino por meio de citometria de fluxo. A utilização de um corante com um valor mais baixo como o Azul de Tripan torna-se de grande valia aos estudos da avaliação do espermatozóide eqüino, proporcionando uma redução do custo da técnica na citometria de fluxo. A técnica de cromatografia de exclusão molecular apresentou pontos importantes para purificação de proteínas do plasma seminal de mamíferos; foi possível isolar e identificar a presença de inibidores de serino proteases no plasma seminal eqüino, além de se observar que esses apresentam isoforma; o potencial de inibição dos inibidores naturais de serino proteases é similar ao dos inibidores sintéticos. Contudo, não foram encontradas diferenças significativas entre o controle e os grupos experimentais quanto à ação dos inibidores na melhoria da qualidade do espermatozóide eqüino criopreservado. Recomendam-se novos estudos sobre a formação das isoformas, os mecanismos de interação do peptídeo com as células espermáticas, determinação do N-terminal e a adição de doses maiores do inibidor de serino protease em meios contendo diferentes crioprotetores Semen cryopreservation offers great advantages to equine reproduction programs by bringing genetic gain to them. Cryopreservation, however, reduces the quality of sperms due mainly to changes in sperm membranes similar to those which occur during sperm capacitation. Using seminal plasma proteins in the cryopreservation process may minimize deleterious effects on spermatozoa resulting from the action of cryopreservation process, making it valuable to improve the quality of equine spermatozoa both frozen and post-freezing. Thus, the purposes of this work were: identifying preventive procedures of deleterious effects from cryopreservation, investigating the effectiveness of molecular exclusion chromatography in the study of seminal plasma proteins in mammals, isolating and identifying the presence of serine protease inhibitors in equine seminal plasma, exploring comparatively natural and synthetic serine protease inhibitors as for their inhibiting activity in serine protease (bovine trypsin) enzymatic mechanism, introducing natural and synthetic inhibitors of serine protease in a diluting medium to freeze and thaw equine semen, assessing equine spermatozoa morphometric qualities with flow cytometry and comparing the effectiveness of trypan blue and propidium iodide when assessing equine spermatozoa physical integrity with flow cytometry. Three distinct experiments have been performed. The first of these experiments tested the technical application of molecular exclusion chromatography to identify seminal plasma proteins from three different animal species: equine, canine and caprine. According to evidence, molecular exclusion chromatography has been found to be an effective procedure to identify seminal plasma proteins. The second experiment has isolated, identified and evaluated serine protease inhibitor which is present in equine seminal plasma and its inhibiting potential. It has also explored comparatively natural and synthetic serine protease inhibitors as for their inhibiting activity, assessed the correlation between total protein concentration and serine protease inhibitor concentration of seminal plasma with sexual maturity in stallions. Active proteins have been identified to have a molecular mass of 6.3-7.0 kDa using mass spectrometry. Older stallions have shown a reduced total protein concentration of seminal plasma, but have maintained the concentration of serine protease inhibitors with a significant difference between means. Different serine protease inhibitor isoforms have been found in the semen of all stallions. The third experiment has verified the effect of adding serine protease inhibitors to the freezing and thaw medium of equine semen. There was no significant difference between control and treated groups as for the percentage of spermatozoa with progressive motility, functional plasma membrane, plasma membrane integrity, and intact acrosome and DNA fragmentation. No significant difference has been observed between control and treated groups, after inducing acrosome reaction with ionophore calcium A23187, suggesting that serine protease inhibitors do not block acrosome capacitation and reaction. It enabled comparing the effectiveness of two cromophores, Trypan blue and propidium iodide when assessing equine spermatozoa physical integrity by means of flow cytometry. The use of a staining with a lower value than Trypan blue has become very valuable in studies assessing equine spermatozoa, producing a cost reduction in the flow cytometry technique. The chromatography technique of molecular exclusion has presented important points to purify mammals seminal plasma proteins; making it possible to isolate and identify the presence of serine protease inhibitors in equine seminal plasma, in addition to noting that they present isoforms. The potential to naturally inhibit serine proteases is similar to that of synthetic inhibitors. Nevertheless, mo significant difference has been observed between control and experimental groups as for the action of inhibitors on improving the quality of cryopreserved equine spermatozoa. Further studies on isoform generation, peptide interactive mechanisms with sperm cells, determining N-terminal and adding larger doses of serine protease inhibitor in media containing different cryoprotectants are recommended