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A reação do ácido carbônico (H2CO3), proveniente da dissolução do dióxido de carbono (CO2) atmosférico, com os álcalis originários da hidratação do cimento Portland é a principal causa da redução do pH do líquido intersticial presente nos poros dos compósitos de matriz cimentícia. A velocidade de avanço da frente de carbonatação está condicionada a fatores que estão diretamente relacionados à sua composição, às condições de exposição e às características de sua microestrutura. O sistema de distribuição de poros dos compósitos de cimento Portland, por sua vez, é fortemente influenciado pelos parâmetros de dosagem, dentre os quais, dá-se destaque ao uso de aditivos e à relação água/cimento utilizada. Neste contexto, o presente trabalho buscou verificar os efeitos de dois aditivos redutores de permeabilidade por cristalização capilar dosados em duas diferentes relações água/cimento e acompanhar a variação do potencial hidrogeniônico (pH) de corpos de prova (CPs) cilíndricos e prismáticos de argamassa com dimensão padrão de (5 x 10) cm, preparados a partir de seis traços distintos e acondicionados em câmara de carbonatação, com condições controladas de umidade, temperatura e concentração de CO2. Para tal, foi realizado o monitoramento do avanço da frente de carbonatação utilizando-se, como indicador, uma solução de fenolftaleína preparada conforme os padrões da norma ISO 1920-12 (2015), paralelamente à medição da variação do pH na superfície do compósito cimentício, utilizando-se equipamento específico para este fim. Para avaliar as alterações na microestrutura de poros da matriz cimentícia do material, um corpo de prova na dimensão (2 x 4) cm, de cada um dos seis traços estudados, foi ensaiado aos 56 dias de carbonatação acelerada, por meio da técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Comprovou-se que o uso do equipamento para leitura de pH permite um monitoramento eficiente da variação do pH em função do tempo de carbonatação, tornando-se possível detectar a redução de alcalinidade em regiões não assinaladas pelo indicador de fenolftaleína, pelo fato dos valores de pH apresentarem-se acima da faixa de viragem da solução aspergida. A partir das imagens obtidas no ensaio de MEV foi possível visualizar a densificação do material presente na borda e na camada mais central dos CPs. Os resultados obtidos acusaram grande variação na velocidade de avanço da frente de carbonatação acompanhada da redução do pH dos CPs, em função do aditivo e da relação água/cimento utilizada na mistura, bem como da geometria estabelecida para o CP. Tais resultados mostraram relação direta entre a velocidade do avanço da frente de carbonatação e as características da microestrutura de cada um dos traços ensaiados The reaction of carbonic acid (H2CO3), released during dissolution of atmospheric carbon dioxide (CO2), with alkalis derived from hydration of Portland cement is the main cause of pH reduction in interstitial liquids existing within pores of cement-matrix composites. The forward speed of the carbonation front depends on factors that are directly related to its composition, exposure conditions, and microstructural characteristics. The system of pore distribution in Portland cement composites, in turn, is strongly influenced by dosing parameters. Among these dosing parameters, the use of additives and water/cement ratios bear great significance. The proposed work was, therefore, sought to verify the effects of two additives, of the capillary crystallization permeability reducer type, measured in two different water/cement ratios in order to monitor the hydrogenionic potential (pH) variation of cylindrical and prismatic mortar specimens (CPs). These specimens measured 5 × 10 cm each, were prepared using six different traits, and subsequently conditioned in carbonation chambers under controlled conditions of humidity, temperature, and CO2 concentration. The forward speed of the carbonation front was monitored using, as indicator, a phenolphthalein solution prepared in accordance with ISO 1920-12 (2015) standards. Simultaneously, we measured surface pH variation of the cement composite by means of equipment specific to this purpose. In order to evaluate changes in the pore microstructure of the cementitious material matrix, we tested a 2 × 4 cm specimen, extracted from each of the six traits investigated, which were maintained under 56 days of accelerated carbonation, using the scanning electron microscopy (SEM) technique. Results of these tests demonstrated that use of the above equipment for pH determination facilitates efficient monitoring of pH variation as a function of carbonation time. This also helped facilitate the tracking of alkalinity reduction in regions not disclosed by the phenolphthalein indicator, since the pH values exceeded the turning range of the sprayed solution. From images obtained via SEM, it was possible to envision the densification of the material present on the edge and in the most central layer of CPs. The results helped disclose great variation in the forward speed of the carbonation front, along with pH reduction of CPs, as a function of the additive and of the water/cement ratio used when preparing the mixture, as well as the geometry established for CP. Thus, a direct relationship between the forward speed of the carbonation front and microstructural properties of each tested trait was revealed

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Outra Agência Naftaleno é um composto tóxico bastante estudado dentre os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e sua degradação pela bactéria Pseudomonas putida G7 tem sido o foco de diversas pesquisas. Nesse organismo, as enzimas NahK (4- xalocrotonato descarboxilase, 28,4 kDa) e NahL (vinilpiruvato hidratase, 27,9 kDa) pertencem à via inferior de degradação do naftaleno e ocorrem in vivo como um complexo que catalisa uma interessante sequência de reações utilizando um Intermediário instável, levantando uma série de questões mecânicas e estruturais. Nosso objetivo foi caracterizar cinética e estruturalmente as enzimas NahK, NahL e seu complexo. Os genes nahK e nahL foram subclonados separadamente no vetor pET28a-TEV, e também subclonados juntos no vetor pETDuet-1 para coexpressão em Escherichia coli BL21(DE3). NahK e seu complexo com NahL foram purificados por cromatografia de afinidade ao níquel e por gel filtração. As amostras proteicas foram analisadas por Espalhamento de Luz Dinâmico, Dicroísmo Circular, e seus parâmetros cinéticos foram obtidos. O complexo também foi analisado por Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo. Amostras de NahK e do complexo, em sua forma apo ou ligada a análogos de substrato, foram cristalizadas e dados de Difração de Raios-X foram coletados. NahK, tanto em forma isolada quanto complexada, e NahL exibem valores de kcat/KM próximos de 107 M-1s-1. As estruturas cristalinas de NahK em sua forma apo, ligada a Mg2+ e a análogos de substrato permitiram propor um mecanismo de reação envolvendo um domínio tampa. Resultados de SAXS mostram que o complexo se comporta como uma partícula de 275 kDa, e sua estrutura cristalina sugeriu uma montagem com 10 subunidades. NahK e NahL exibem as cavidades de seus respectivos sítios-ativos uma para a outra em uma estrutura quaternária grande, elegante e funcional. Juntas, essas enzimas realizam importantes passos na degradação do naftaleno em P. putida G7. Este trabalho provê um profundo conhecimento estrutural e funcional desse interessante complexo proteico. Naphthalene is a toxic and well-studied polycyclic aromatic hydrocarbon. Its degradation by the bacterium Pseudomonas putida G7 is the focus of numerous studies. In this organism, the enzymes NahK (4-oxalocrotonate decarboxylase, 28.4 kDa) and NahL (vinylpyruvate hydratase, 27.9 kDa) belong to the lower pathway of naphthalene degradation. They exist in vivo as a protein complex, catalyzing an interesting sequence of reactions with an unstable intermediate that raises a number of mechanistic and structural questions. Our aim was to characterize kinetically and structurally the enzymes NahK, NahL and their complex. The nahK and nahL genes were subcloned separately into pET28a-TEV vector for expression, and also subcloned together into pETDuet-1 vector for co-expression in Escherichia coli BL21(DE3) cells. NahK and its complex with NahL were purified by Immobilized Metal Ion Affinity and Size-Exclusion Chromatographies. The protein samples were analyzed by Dynamic Light Scattering, Circular Dichroism, and the steady-state kinetic parameters for their natural substrates were obtained. The NahK/NahL complex was also analyzed by Small-Angle X-Ray Scattering. NahK and NahK/NahL samples in their apo or ligated forms with different substrate analogues were crystallized and X-Ray Diffraction data were collected. NahK expressed alone and co-expressed with NahL was purified to homogeneity and both enzymes shown a kcat/KM values up to 107 M-1s-1. The crystalline structures of NahK in apo and ligated forms with Mg2+ and substrate analogues allowed the proposition of a reaction mechanism involving a lid domain. SAXS measurements suggested a particle of 275 kDa for the NahK/NahL complex, and the crystalline structure of this complex suggested a heterodecamer assembly. NahK and NahL face their active site cavities to each other in a large, elegant and functional quaternary structure. Together, these enzymes perform important steps during naphthalene degradation in P. putida G7. This work provided a deep structural and functional knowledge of this interesting protein complex.

A redução da disponibilidade de água tem-se agravado ao longo dos últimos anos aumentando assim, a necessidade de minimizar seu consumo, recuperando águas de processo para reutilizá-las nas indústrias. Visando a recuperação da água, as técnicas cristalização evaporativa, cristalização eutética por congelamento e precipitação foram utilizadas para tratamento do concentrado proveniente de unidade piloto de eletrodiálise reversa. Na cristalização evaporativa, em escala de laboratório, foi possível obter água com qualidade compatível ao reuso em torres de resfriamento e caldeiras. Neste estudo, o tratamento do concentrado salino da eletrodiálise por meio da cristalização evaporativa, possibilitou a remoção de uma mistura de sais (sulfato de cálcio, sulfato de bário e carbonato de cálcio), principais responsáveis por incrustações também identificadas durante o processo, e água recuperada com qualidade compatível aos limites máximos exigidos para o reuso em torres de resfriamento e caldeiras (8mg/L de CaCO3, 1,6mg/L de Ca, 0,04mg/L de Mg, cloreto de 6mg/L, sulfato menor que 10mg/L e sólidos totais dissolvidos de 23mg/L). Com isso, pode-se obter uma redução do volume de efluente comumente disposto em lagoas e, além disso, o resíduo sólido produzido foi indicado à Resíduo Não-Perigoso Classe IIA, não inerte, segundo a NBR 10004, mas ainda dependente de classificação final. Foram identificados possíveis problemas como incrustação de carbonatos e sulfatos nas paredes do cristalizador, além da formação de espuma durante a cristalização. Estas ocorrências indesejáveis podem ser esperadas no funcionamento em escala piloto, e sugerem estudos de remoção prévia destes compostos. Foi estudado o efeito da contaminação de compostos orgânicos solúveis em água, tal como o fenol, durante a cristalização eutética por congelamento de uma solução sintética com características do concentrado da eletrodiálise reversa. A presença do fenol promoveu o crescimento dos cristais e alterou suavemente a dissolução e a temperatura eutética de congelamento do sulfato de sódio. Também, foram avaliados os desempenhos da cristalização eutética por congelamento e precipitação como alternativas para o pré-tratamento do concentrado da eletrodiálise reversa. Apesar de a cristalização eutética por congelamento consumir menos energia do que a evaporativa, seu desempenho foi comprometido pela dificuldade de separação dos sólidos formados e ocasionou a recuperação de água sem pureza mínima necessária ao reuso. Entretanto, mostrou-se promissora na separação simultânea dos sais sulfato de cálcio e sulfato de sódio. Na precipitação alcalina, foram estudados dois alcalinizantes, NaOH e Ca(OH)2. O melhor desempenho foi obtido na adição de 400mg/L de NaOH, condição que promoveu a remoção total de cálcio e magnésio na forma de carbonato de cálcio, carbonato de cálcio e magnésio e hidróxido de magnésio. The decrease of water availability in the last years has motivated researchers to investigate alternative ways to reduce water consumption and improve reuse of water in many industries. The main objective of this work was to understand the influence of commonly used treatment techniques on the purification of industrial saline waste and also to identify a suitable technique to recover pure water that meets standard requirements for reuse. Evaporative crystallization technique was used to recover water from electrodialysis reverse saline concentrate, at laboratory scale. This technique was able to selectively remove the main salts responsible for scaling. However, these were recovered as a mixed salt of calcium sulfate, barium sulfate and calcium carbonate. The quality of the water obtained was suitable for reuse on cooling towers and boilers with a typical composition of 8mg/L of CaCO3, 1.6mg/L of Ca, 0.04mg/L of Mg, 6mg/L of Cl-, less than 10mg/L of SO42- and 23mg/L of total solids dissolved. Thus, the technique significantly eliminated the volumes of wastewater to be discharged. However the solid residue produced is still classified as not dangerous waste based on the Brazilian standard NBR10004 requirement. This study also identified incrustations in the reactor and foam formation, which are some of the main problems associated with the presence of carbonated and sulphates solids during crystallization. Further investigations should be carried out to address these undesirable implications for pilot plant operations. The effect of phenol as a water soluble organic contaminant in the saline wastewater was also studied using eutectic freeze crystallization. A synthetic solution of composition similar to that of the electrodialysis concentrate was used. Although the presence of phenol significantly improved the crystal growth of sodium sulphate only slight changes on its dissolution and eutectic temperature were noted. Eutectic Freezing Crystallization and Alkaline precipitation were investigated as potential pre-treatment methods for electrodialysis reverse concentrate. Though eutectic freeze crystallization presented lower energy consumption than evaporative crystallization, the separation of solids was very poor resulting in a water stream that does not meet the reuse requirement. However, eutectic freezing crystallization presented to be more efficient in simultaneous solid separation of calcium sulphate and sodium sulphate. In alkaline precipitation experiments, sodium hydroxide and calcium hydroxide were studied. Complete removal of calcium and magnesium ions was achieved through precipitating saline concentrate with 400g/L sodium hydroxide. The main precipitated solids were characterized as calcium and magnesium carbonate, calcium carbonate and magnesium hydroxide.

Os fertilizantes químicos, tais como, cloreto de potássio (KCl), sulfato de potássio (K2SO4), fosfato monoamônio (MAP ou NH4H2PO4), fosfato diâmonio (DAP ou (NH4)2HPO4) e nitrato de amônio (NH4NO3), além dos produtos químicos, soda cáustica (NaOH) e carbonato de sódio (Na2CO3), são produzidos a partir de soluções eletrolíticas ou salmouras contendo altas concentrações de sais dissolvidos. Alguns dos produtos mencionados são obtidos por cristalização fracionada, processo onde os sais são separados como fases sólidas com alta pureza (>90%) a partir da evaporação do solvente presente nas soluções eletrolíticas ou salmouras multicomponentes. Devido à grande demanda mundial por esses produtos, há necessidade de que haja um bom conhecimento dos modelos termodinâmicos usados para estimar as composições dos sais e das salmouras obtidas por cristalização fracionada de soluções eletrolíticas ou salmouras multicomponentes. O modelo de Pitzer e Harvie foi usado para determinar as composições dos sais cristalizados após diferentes quantidades de solvente, presentes em uma salmoura multicomponente NaCl-KCl-MgCl2-CaCl2-H2O a 20ºC, serem evaporadas. A temperatura de 20ºC foi usada pelo fato de ser a temperatura média das salmouras multicomponentes processadas nas piscinas de evaporação solar usadas nos depósitos salinos localizados no norte da América do Sul, em especial no Salar de Atacama no Chile. O modelo de Pitzer e Harvie foi validado por meio da comparação com os dados da literatura dos sistemas binários NaCl-H2O, KCl-H2O e MgCl2-H2O e do sistema ternário KCl-MgCl2-H2O a 20ºC, mostrando-se adequado para ser usado para estimativa das solubilidades dos sais nesses sistemas binários e ternário. Os diagramas de fases para soluções com elevada força iônica foram construídos a partir dos dados experimentais de ensaios realizados com polpas sintéticas e salmoura natural, representantes do sistema multicomponente NaCl-KCl-MgCl2-CaCl2-H2O a 20ºC em estudo. Os resultados obtidos nos experimentos realizados com polpas sintéticas e nos ensaios de evaporação forçada da salmoura natural e os valores calculados pelos modelos de Pitzer e Harvie não apresentaram diferenças significativas, indicando que o modelo pode ser usado para estimar as composições químicas dos sais obtidos durante a cristalização fracionada de uma salmoura multicomponente: NaCl-KCl-MgCl2-CaCl2-H2O. O modelo de Pitzer e Harvie é uma importante ferramenta para a determinação do balanço de massa em piscinas de evaporação solar, usadas para recuperação de cloreto de potássio por cristalização fracionada de salmoura contendo vários sais dissolvidos em água, entre eles NaCl, KCl, MgCl2 e CaCl2. Chemical fertilizers, such as, potassium chloride (KCl), potassium sulphate (K2SO4), monoammonium phosphate (MAP or NH4H2PO4), diammonium phosphate (DAP or (NH4)2HPO4) and ammonium nitrate (NH4NO3), and other chemical products (for instance sodium hydroxide (NaOH) and soda ash (Na2CO3)), are produced from electrolyte solutions or brines with a high content of soluble salts. Some of the products mentioned above are manufactured by fractional crystallization, process where several salts are separated as solid phases with a high degree of purity (>90%) by evaporation of water present in the composition of multicomponent electrolyte solutions or brines. Due to the high world demand for the products, it is necessary to have a good knowledge about the thermodynamic models used to estimate the compositions of salts and brines obtained by fractional crystallization of multicomponent electrolyte solutions or brines. The Pitzer e Harvie´s model was used to calculate the composition of crystallized salts after remove water from multicomponent electrolyte solutions or brines representing the quinary system NaCl-KCl-MgCl2-CaCl2-H2O at 293K. The temperature of 293K represents the medium brine temperature in saline deposits located in South America, especially in Salar de Atacama in Chile. Initially, the mineral solubilities of binary systems (NaCl-H2O, KCl-H2O and MgCl2- H2O) and ternary system (KCl-MgCl2-H2O) were calculated at 293K and compared with literature data. The results show that Pitzer and Harvie´s model represents well the binary and ternary systems. The phase diagrams of solutions with high ionic strength were also plotted against the experimental data from tests with synthetic pulps and a natural brine representative of quinary system NaCl-KCl-MgCl2-CaCl2-H2O at 293K. The tests with synthetic and natural brines, containing the salts NaCl, KCl, MgCl2 and CaCl2, were performed and compared to the model. The results show that the Pitzer e Harvie´s model can be used to estimate the chemical composition of the salts produced during fractional crystallization of solutions containing NaCl, KCl, MgCl2 and CaCl2. The model can be used to do a material balance in the solar pond with the objective to recover potassium chloride by fractional crystallization of a natural brine containing several salts dissolved, for instance, NaCl, KCl, MgCl2 and CaCl2.

A água é um insumo fundamental em uma expressiva maioria das indústrias e sua utilização correta é fundamental para a minimização dos impactos ambientais. A redução dos volumes captados pode ser obtida melhorando-se o processo de tratamento dos efluentes industriais, incrementando o reúso da água e de outros insumos de valor agregado para o processo. Na Refinaria Gabriel Passos, pertencente à Petrobras, são gerados efluentes dos quais é possível recuperar 68% da água por tratamentos convencionais. A adoção de processos complementares de tratamento dos efluentes por eletrodiálise viabiliza aumentar este valor em mais 14% elevando-se para 82% o percentual de água recuperada. Visando um reúso mínimo da água, está em processo de estudo e avaliação a inclusão de uma etapa de cristalização após a etapa de eletrodiálise, objetivando recuperar os 18% restantes, possibilitando-se assim alcançar o mínimo reúso da água na refinaria. O efluente tratado pela cristalização consiste em uma solução aquosa com 0,5% de sais inorgânicos que alimenta uma unidade piloto de cristalização. O presente trabalho consistiu no desenvolvimento de um modelo dinâmico para o cristalizador por evaporação a vácuo contínuo com recirculação forçada existente nessa unidade piloto, obtido a partir dos balanços populacional, de massa e energia. As simulações foram realizadas utilizando-se o software Matlab para resolução simultânea das equações diferenciais. Em laboratório, ensaios de cristalização por evaporação em batelada foram realizados e as condições experimentais utilizadas no modelo para comparação dos resultados e ajustes dos parâmetros cinéticos. A simulação da cristalização na unidade piloto foi desenvolvida com base nos fluxogramas, balanços teóricos de massa e energia e análises do efluente. Os efeitos causados em decorrência das variações na taxa e concentração de alimentação e na taxa de recirculação foram simulados e analisados. Na simulação foi possível visualizar a influência de diversas variáveis na estabilização da unidade piloto, tais como a variabilidade da concentração de sais presente na alimentação, a vazão de purga e o controle de temperatura da recirculação. Water is an essential component in most industrial process and its responsible and correct use is important in order to minimize environmental impacts. Reduction in water consumption may be achieved by improving industrial effluent treatment processes, allowing water and other valuable raw materials to be recycled and reused. In Gabriel Passos oil refinery, owned and operated by Petrobras, a recovery up to 68% of water by conventional methods has been practiced. Effluent treatment by electrodialysis raises that number by 14% totaling 82% of water recovery. Aiming at a maximum water recovery, studies have been conducted to implement a crystallization stage, thus allowing the remaining 18% of remaining water to be recovered. The effluent treated by crystallization consists of an aqueous solution with 0.5% of inorganic salts that feed a crystallization pilot plant. This work consisted in the development of a dynamic model for the crystallizer by continuous vacuum evaporation with forced recirculation, present in the pilot plant, from the population mass and energy balances. The simulation was developed using Matlab software for simultaneously solve the differential equations. Laboratory tests using a batch evaporative crystallizer and simulation were carried out simultaneously in order to compare the results and to adjust the kinetic parameters. The pilot plant simulation was developed according the crystallization unit flowchart, theoretical mass and energy balances as well as the effluent chemical composition. The effects in crystal properties caused by variations in feed rate, feed concentration and recycle rate were simulated and discussed. From the simulation results, it was possible to understand how the variability of the feed concentration, the purge flow and temperature control recirculation affect the stabilization of the pilot plant.

COITINHO, J. B. Caracterização estrutural da forma recombinante da proteína Pb27 de Paracoccidioides brasiliensis. 2009. Dissertação (Mestrado) - Departamento de Bioquímica e Imunologia. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, 2009. Paracoccidioidomicose (PCM) é uma das mais importantes micoses sistêmicas do Brasil. O agente etiológico da doença é o fungo termo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A infecção causa lesões nos pulmões e pode disseminar para outros órgãos e tecidos. No entanto, ainda não existe um protocolo específico de controle da doença nem diagnóstico padronizado ou protocolo de tratamento. O antígeno recombinante de 27k-Da (Pb27r) tem sido utilizado com alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico da PCM, mas sua função biológica no fungo é desconhecida. Além disso, nenhuma outra proteína similar foi descrita nos bancos de dados. O gene para a Pb27 foi inicialmente clonado em nosso laboratório no vetor de expressão fusionado à GST, mas as tentativas de cristalizar a proteína purificada falharam e construções diferentes foram preparadas. O gene para a Pb27 foi subclonadono vetor de expressão pET-DEST42 com cauda de histidinas C-terminal.Pb27r-CHis foi expressa em E. coli BL21 e purificada utilizando cromatografia de afinidade. Para confirmar a expressão da proteína, foi realizado um Western blot utilizando soro de camundongos anti-Pb27. Ensaios de cristalização da Pb27r-CHis foram inicialmente realizados através de kits de cristalização utilizando a técnica de difusão de vapor, mas nenhum cristal de proteína foi observado. Outras 544 condições foram testadas automaticamente, mas novamente, cristais não se formaram. Nesse meio tempo, o gene da Pb27 foi subclonado em outro vetor de expressão (pDEST 17) com cauda de histidina N-terminal (Pb27r-NHis). Essa proteína foi expressa e purificada seguindo omesmo protocolo para a Pb27r-CHis, mas, novamente, nenhum cristal foi observado. Os resultados dos experimentos de espalhamento dinâmico da luz (DLS) e dicroísmo circular (CD) indicaram que as duas proteínas, apesar de parcialmente polidispersas em solução, apresentavam-se estruturadas, com cerca de 40 % de -hélices. Na tentativa de facilitar a formação de cristais pela minimização da entropia de superfície da proteína Pb27r, foi realizada mutação sítio dirigida para trocar dois resíduos teoricamente de superfície, K e E por duas A. Essa proteína (Pb27r-mut) foi clonada no vetor pDEST 17 mas se tornou insolúvel. Para remover regiões protéicas mais flexíveis que dificultam aformação de cristais, as proteínas Pb27r-CHis e Pb27r-NHis foram submetidas à proteólise limitada com tripsina. Uma região de aproximadamente 25 kDa se manteve constante nas duas construções quando analisadas por SDS-PAGE e MALDI-MS. Como até o momento, todas as tentativas de cristalizar a Pb27 recombinante não foram bem sucedidas, tentavas de cristalização da proteína nativa através de sua purificação por afinidade utilizando anticorpos anti-Pb27 obtidos da imunização de coelho serão realizadas. O estudo da estruturatridimensional desta proteína permitirá um entendimento mais detalhado desta molécula, tal como a localização de seus epitopos e seu dobramento. Além disso, a informação estrutural dessa proteína provavelmente ajudaria a identificar sua função no fungo P. brasiliensis. COITINHO, J. B. Structural characterization of recombinant form of theprotein Pb27 from Paracoccidioides brasiliensis. 2009. Dissertation(Masters). Departamento de Bioquímica e Imunologia. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, 2009. Paracoccidiodomycosis (PCM) is one of the most important systemic mycoses in Brazil. The etiologic agent of the disease is the thermal dimorphic fungusParacoccidioides brasiliensis. The infection causes lesions in the lungs and can disseminate to other organs and tissues. So far, there is no specific control program, standardized diagnostic or treatment protocol for this disease. The recombinant 27-kDa antigen (Pb27r) has been used with high sensibility and specificity in the diagnosis of PCM but its biological function in the fungus is unknown. Besides, no other similar protein has been described so far in databases. The gene of Pb27 was initially cloned in our laboratory into the expression vector pGEX with a GST-tag, but the attempts to crystallize the purified protein were unsuccessful and different constructs have been prepared. The gene was subcloned into the expression vector pET-DEST42 with a His-tagat the C-terminus. Pb27r-CHis was expressed in E. coli BL21 and purified using a metal-affinity chromatography. To confirm the Pb27r expression, a Western blot using mouse anti-Pb27 serum was performed. Crystallization of Pb27r-CHis was initially performed with commercially available sparse-matrix screens using the hanging-drop vapour diffusion technique. So far, no protein crystals have been observed and others 544 conditions were tested automatically, but nocrystals were formed again. In the mean time, the Pb27 gene was alsosubcloned into another expression vector (pDEST 17) with an N-terminal Histag (Pb27r-NHis). This protein was expressed and purified using the same protocol for Pb27r-CHis but the initial crystallization attempts did not produce crystals. The results of the experiments of dynamic light scattering (DLS) and circular dichroism (CD) showed that the proteins, although partially polydisperses in solution, were structured, with about 40% of -helix. In an attempt to facilitate the formation of crystals by minimizing the entropy of the Pb27r surface, site directed mutation was held to exchange two theoretically surface residues, E and K for two A. This protein (Pb27r-mut) was cloned in the vector pDEST 17 but became insoluble. To remove more flexible protein regions that hinder the formation of crystals, the proteins Pb27r-CHis and Pb27r-NHis were subjected to limited proteolysis with trypsin. A region of approximately 25 kDa remained constant in the two constructs when analyzed by SDS-PAGE and MALDI-MS. As so far, all attempts to crystallize therecombinant Pb27 failed, the crystallization of the native protein through its affinity purification by using anti-Pb27 antibodies obtained from theimmunization of rabbits will be performed. The study of the three-dimensional structure of this protein will enable a more detailed understanding of this molecule, such as the location of their epitopes and its folding. Besides, structural information about this protein could probably help to identify its biological function on P. brasiliensis.