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O aumento da incidência da doença huanglonbing (HLB) nos pomares brasileiros tem contribuído significativamente para o aumento do custo de produção de laranja no Brasil, devido à suscetibilidade de todas as variedades cultivadas. O HLB é associado às bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus, transmitidas pelos psilídeos Diaphorina citri e Trioza erytreae. No Brasil, o inseto vetor responsável pela rápida disseminação da doença é o psilídeo Diaphorina citri. Os principais métodos de controle do HLB são a eliminação de plantas sintomáticas, uso de mudas sadias e controle do vetor. O uso de plantas geneticamente modificadas pode ser uma alternativa ao uso excessivo de inseticidas para controle do inseto vetor. Sendo assim, pode-se adotar uma nova tecnologia que se baseia no uso de RNAs de interferência (RNAi) para o silenciamento de genes específicos do inseto vetor. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do silenciamento dos genes calreticulina (DcCRT), lacase (DcLAC) e Snf7 (DcSNF7) de Diaphorina citri por RNA de interferência via alimentação em folhas destacadas de Murraya paniculata que absorveram solução contendo dsRNA de silenciamento. A princípio, foi avaliada a expressão dos genes candidatos em diferentes estádios fenológicos dos insetos. Em seguida, foram realizados bioensaios de sobrevivência e silenciamento, com as doses 0, 5, 25 e 50µg de dsRNA. A sobrevivência dos insetos foi avaliada ao longo de 144 horas, enquanto que os insetos utilizados na análise de expressão gênica foram coletados 12, 24, 48, 72 e 96h após o início da alimentação. Para os genes DcCRT, relacionado à quelatização de íons cálcio, e DcLAC, relacionado à gelificação oxidativa do estilete, ambos envolvidos no processo alimentar do inseto, também foi observado o efeito das doses de dsRNA na quantidade de alimento ingerido, 120h após o início da alimentação. Além disso, também foi realizado bioensaio com dsRNA Cy3-labbled, para verificar a distribuição do dsRNA absorvido. A expressão dos genes candidatos, de modo geral, se manteve uniforme ao longo dos estádios de desenvolvimento dos insetos, exceto para o gene DcLAC que apresentou maior expressão em adultos recém emergidos do que nos demais estádios avaliados. Nos bioensaios com dsRNA de silenciamento, observou-se fenótipo letal apenas com o silenciamento do gene DcSnf7, 144 horas após o início da alimentação. Durante o período avaliado, foi constatada redução na expressão gênica apenas de DcCRT, após 12h de alimentação e DcLAC após 96h de alimentação com seus respectivos dsRNA de silenciamento. Além disso, a dose de 5µg de dsRNA foi suficiente para causar tal efeito de silenciamento gênico. No bioensaio para quantificação da alimentação, observou- se redução na excreção de aminoácidos nos insetos alimentados com 5µg de dsRNA, em ambos os genes candidatos (DcCRT e DcLAC) 120h após o início da alimentação. Adicionalmente, a análise de distribuição de dsRNA pela folha mostrou que há absorção do dsRNA pela folha destacada, permitindo a alimentação pelo inseto. Dessa forma, conclui-se que os genes estudados apresentam potencial para o controle do psilídeo Diaphorina citri, via silenciamento gênico por RNAi. The increase in the incidence of huanglonbing disease (HLB) in Brazilian orchards has contributed to increase of orange production costs in Brazil, due to the susceptibility of all cultivated variety of orange. HLB is associated with the Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus and Candidatus Liberibacter americanus bacteria, transmitted by the psyllids Diaphorina citri and Trioza erytreae. In Brazil, the insect vector responsible for the rapid spread of the disease is Diaphorina citri. The most important methods of HLB control are the elimination of symptomatic plants, the use of healthy nursery trees, and vector control. The use of genetically modified plants may be an alternative to the excessive use of insecticides to control the insect vector. Therefore, a new technology based on using RNAs of interference (RNAi), for silencing specific genes of the insect vector can be used. Thus, the aim of this work was to evaluate the effect of silencing calreticulin (DcCRT), laccase (DcLAC) and Snf7 (DcSNF7) genes in Diaphorina citri by interference RNA through feeding in leaves of Murraya paniculata that absorbed a solution containing dsRNA of silencing. At first, the expression of the candidate genes in different phenological stages of the insects was evaluated. Survival and silencing bioassays were then performed at doses of 0, 5, 25 and 50 µg of dsRNA. Insect survival was evaluated over 144 hours, while the insects used in gene expression analysis were collected 12, 24, 48, 72 and 96 hours after feeding. For the DcCRT genes, associated to the calcium ion chelation, and DcLAC, related to the oxidative gelling of the stylet, both involved in the insect feed process, the effect of the doses of dsRNA on the amount of food ingested, 120h after the beginning of feeding was observed. In addition, a bioassay with Cy3-labbled dsRNA was also performed to verify the distribution of absorbed dsRNA. The expression of the candidate genes generally remained uniform throughout the stages of insect development, except for the DcLAC gene that showed greater expression in newly emerged adults than in the other evaluated stages. In the bioassays with dsRNA for gene silencing, a lethal phenotype was observed only with the silencing of the DcSnf7 gene, 144 hours after the beginning of feeding. During the evaluated period, there was a reduction in the gene expression only of DcCRT, after 12h of feed and DcLAC after 96h of feeding with their respective silencing dsRNA. Additionally, the dose of 5µg of dsRNA was enough to cause this gene silencing effect. In the bioassay for feeding quantification, a reduction in amino acid excretion was observed in insects fed with 5 µg of dsRNA, in both candidate genes (DcCRT and DcLAC) 120 h after the beginning of feeding. In addition, the analysis of dsRNA distribution by the leaf showed that there is absorption of the dsRNA by the detached leaf, allowing feeding by the insect. Thus, we conclude that the genes studied have potential for the control of the psyllid Diaphorina citri, through gene silencing mediated by RNAi.

Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopment disorder characterized by impairment in communication skills, behavior and social interactions that affects around 1-2% worldwide. To date the etiology of ASD has not yet been fully understood, but in the last 18 years many advances have been made to understand the genetic component related to the development of the clinical phenotype. With the advent of genomic scan analysis such as chromosome analysis by microarray and whole exome sequencing (WHE) many advances have been made to understand the pathophysiology of the disease. About 10-15% of the cases can be explained by large losses or gains (deletions or duplications greater than 1000 base pairs) of the genetic material, which generally involve the disruption of one or more genes. Next generation sequencing methodologies were fundamental in the description of point mutations and small insertions and deletions associated with ASD. The WES has allowed many discoveries to be made about new candidate genes and mechanisms for the development of the disease. It is now claimed that de novo (non-inherited) and likely gene disruptive mutations, such as loss-of-function and non-synonymous changes with high prediction of damage by computational tools, in genes related to neurodevelopment are a major contributor to the disease mechanism. However, these mutations, in addition to not explaining the majority of cases, are rarely recurrent in the population, which makes it difficult to establish a definitive molecular diagnosis for most patients. WES is already a practice in clinical genetics laboratories and demonstrates high effectiveness for diseases that follow a Mendelian pattern of inheritance, and have an established genetic cause. In clinical practice WES is requested for cases of ASD, despite having different modes of inheritance and having more than 1,000 genes associated with the disease. Due to these characteristics the analysis of WES for ASD is a major challenge for the clinical laboratory. This study proposes the construction of a computerized WES analysis routine that can test different candidate genes for their sensitivity and specificity for the detection of affected individuals. The proposed approach consists in the counting of variants separated by their possible protein damage and population frequency for each individual from affected and control groups, this study analyzed 168 WES, being 49 with ASD and 119 controls. After counting formulation, these values are subjected to a sequence of statistical tests, seeking a significant difference in the amount of mutations of all the variants alone, loss-of-function or damaging missense mutations, and the application of models of multivariate analysis such as: logistic regression, decision tree, neural network, vector support machine and principal component analysis for the elaboration of more complex models for disease development. A total of 21 lists of genes were tested, of which 19 presented at least one significant result, and the analysis of variants alone was the one that obtained the largest number of significant events. From apparently protective variants (higher number in the control group), such as the missense variants in RAS/MAPK pathway as variants of stopgain with population frequency above 0.05 in chromatin genes in greater number in individuals with ASD. None of the multivariate analysis models had significant discrimination results between the two groups. Due to the small sample size, the results of this study should be interpreted with limitations, and it is necessary to replicate these scenarios in other databases. However, these findings suggest that different types and frequencies of variants may have distinct contributions to disease development depending on the genes analyzed, rather than complex relationships between variants of the same gene list O transtorno do espectro autista (TEA) é um distúrbio do neurodesenvolvimento caracterizado por uma incapacidade de comunicação comportamento e interações sociais que afeta em torno de 1-2% da população mundial. Até o momento a etiologia do TEA ainda não é totalmente compreendida, mas nos últimos 18 anos muitos avanços foram feitos para entender o componente genético relacionado ao desenvolvimento do quadro clínico. Com o advento das análises de varredura genômica como a análise cromossômica por microarray e o sequenciamento completo de exoma (SCE) muitos avanços foram feitos para a compreensão da fisiopatologia da doença. Em torno de 10-15% dos casos podem ser explicados por grandes perdas ou ganhos (deleções ou duplicações superiores a 1000 pares de bases) do material genético, que geralmente envolvem a disrupção de um ou mais genes. As metodologias de sequenciamento de nova geração foram fundamentais para a descrição das mutações de ponto e pequenas inserções e deleções associadas ao TEA. O SCE permitiu que muitas descobertas fossem feitas sobre novos genes candidatos e mecanismos para o desenvolvimento da doença. Atualmente afirma-se que as alterações de novo (não herdadas) e de maior probabilidade de ruptura gênica, como as mutações de perda-de-função e as alterações não-sinônimas com alta predição de dano por ferramentas computacionais, em genes de susceptibilidade a doenças do neurodesenvolvimento sejam um grande contribuidor para o mecanismo da doença. Entretanto essas mutações, além de não explicar a totalidade dos casos raramente são recorrentes na população, o que dificulta o estabelecimento de um diagnóstico molecular definitivo para a maioria dos pacientes. O SCE já é uma prática nos laboratórios clínicos de genética e demonstra uma alta efetividade para as doenças que seguem um padrão de herança mendeliano, e têm uma causa genética estabelecida. Na prática clínica o SCE é solicitado para os casos de TEA, apesar de ter diferentes modos de herança e terem mais de 1,000 genes associados à doença. Devido a estas características o SCE para os casos de TEA são um grande desafio para o laboratório clínico. Este estudo propõem a construção de uma rotina computacional de análise do SCE que possa testar diferentes genes candidatos quanto à sua sensibilidade e especificidade para a detecção dos indivíduos afetados. A abordagem proposta é a contagem de variantes separadas por seu possível dano à proteína e frequência populacional para cada indivíduo de grupos afetado e controle em 168 indivíduos com SCE, sendo 49 com TEA e 119 controles. Após a formulação da contagem esses valores são submetidos a uma sequência de testes estatísticos, buscando diferença significativa em quantidade de mutações de todas as variantes isoladamente, das mutações de perda-de-função, ou não-sinônimas danosas como um conjunto e a aplicação de modelos de análise multivariada como: regressão logística, árvore de decisão, rede neural, máquinas de suporte de vetor e análise de componente principal para a elaboração de modelos mais complexos para o desenvolvimento na doença. Ao todo foram testadas 21 listas de genes, destas, 19 apresentaram ao menos um resultado significativo, sendo a análise de variantes isoladamente a que obteve maior número de eventos significativos. Desde variantes aparentemente protetoras (maior número no grupo controle), como as variantes não-sinônimas em via de RAS/MAPK quanto variantes de perda de códon de parada com frequência populacional acima de 0.05 em genes de cromatina em maior número nos indivíduos com TEA. Nenhum dos modelos de análise multivariada obteve resultados significativos na discriminação entre os dois grupos. Devido ao pequeno número amostral os resultados deste estudo devem ser interpretados com limitações, sendo necessária a replicação deste cenário em outros bancos de dados. Entretanto, estes achados sugerem que diferentes tipos e frequências de variantes podem ter contribuições distintas para o desenvolvimento da doença a depender dos genes analisados, mais de que relações complexas entre as variantes de uma mesma lista de genes

A osteoporose é uma doença de alta prevalência na população geral, e a ocorrência de fraturas se associa a grande morbi-mortalidade e impacto econômico. Na maioria dos indivíduos afetados, a osteoporose tem etiologia multifatorial, com herdabilidade estimada entre 50 e 85%, atribuível a um conjunto de variantes genéticas de pequeno efeito individual. Raramente, há casos de osteoporose associada a síndromes monogênicas, decorrentes de defeitos genéticos de grande impacto. Postula-se que indivíduos com quadros extremos de osteoporose não sindrômica possam ter causa genética mono- ou oligogênica, atribuível a variantes de impacto intermediário sobre o fenótipo, ainda pouco reconhecidas. Nos últimos anos, o avanço das tecnologias de sequenciamento permitiu o reconhecimento de novos genes associados à fragilidade óssea e atualmente possibilita a análise simultânea de múltiplos genes. Neste contexto, os objetivos deste projeto de pesquisa foram: 1) buscar genes candidatos para fragilidade óssea previamente associados a doenças Mendelianas com alto impacto na resistência óssea, fenótipos extremos de osteoporose e estudos de associação genética em escala genômica (GWAS) para osteoporose; e 2) pesquisar a presença de variantes alélicas patogênicas nestes genes candidatos em indivíduos com osteoporose grave, familiar ou idiopática. A partir de revisão sistemática, 128 genes candidatos foram selecionados para compor um painel de sequenciamento paralelo em larga escala. O sequenciamento incluiu todos os éxons e 25 pares de bases das junções íntron-éxon. Foram consideradas variantes genéticas de interesse aquelas raras (frequência alélica < 1%) e com predição de alto impacto sobre a proteína codificada. Trinta e sete indivíduos (7 famílias e 21 casos isolados) foram selecionados seguindo critérios clínicos, laboratoriais e densitométricos restritivos, excluindo-se pacientes com causas secundárias de osteoporose. A coorte foi composta por homens em 54%, a mediana de idade ao diagnóstico foi 44 anos e 86% tinham histórico de fratura. Dentre os 28 casos índices, foram identificadas 33 variantes de interesse. Após análise de segregação familiar, foi possível excluir patogenicidade de cinco destas variantes, restando 28 variantes potencialmente patogênicas, presentes em 71% da coorte. Todas as variantes foram encontradas em heterozigose, sendo 26 variantes de ponto não-sinônimas, uma deleção de 9 pares de bases, e uma grande deleção envolvendo o único éxon codificador do gene candidato GPR68. Foi encontrada uma associação de variantes em genes diferentes em 21% da coorte, incluindo uma mulher jovem com osteoporose grave e variantes em WNT1, PLS3 e NOTCH2. A análise de segregação familiar neste caso sugeriu um efeito patogênico aditivo das variantes. Vinte e cinco porcento das variantes potencialmente patogênicas foram identificadas em genes candidatos bem estabelecidos (WNT1, PLS3, COL1A1, COL1A2), e 57% se localizam em novos genes candidatos identificados inicialmente por GWAS, como NBR1 e GPR68, também associados à alteração da remodelação óssea em modelos animais. Os resultados deste trabalho dão relevância a novos genes na fisiologia da resistência óssea e indicam um papel proeminente de interações digênicas/oligogênicas em casos de osteoporose grave, familiar ou idiopática. O reconhecimento de novas vias associadas à fragilidade óssea pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos, e a identificação de variantes patogênicas associadas à osteoporose pode, futuramente, permitir um manejo clínico personalizado de pacientes e seus familiares Osteoporosis is a highly prevalent disorder resulting in fragility fractures and incurring in great morbi-mortality and economic burden. In most cases, osteoporosis has a multifactorial etiology, with an estimated heritability of 50-85% attributable to a combination of several low-impact genetic variants. Rarely, cases of syndromic osteoporosis due to high-impact genetic defects are seen. It is therefore hypothesized that severe/idiopathic cases of otherwise inconspicuous osteoporosis may have a monoor oligogenic etiology due to genetic variants with an intermediate effect. During the past years, advances in molecular sequencing have revealed novel candidate genes for bone fragility, and have enabled simultaneous sequencing of multiple genes. In this context, the objectives of this research project were: 1) to identify candidate genes for bone fragility, as previously reported in association to Mendelian disorders with high impact on bone resistance, idiopathic or familial osteoporosis, and genome-wide association studies (GWAS) for bone mineral density and fragility fractures; and 2) to perform molecular analysis of these candidate genes in patients with severe, familial or idiopathic osteoporosis. Through a systematic review, 128 candidate genes were identified and included in a panel for massively parallel sequencing. Coding regions and 25-bp boundaries were captured and sequenced. Rare variants (allele frequency < 1%), with a predicted high impact on protein function were initially selected as variants of interest. Thirty-seven subjects (21 sporadic cases and 7 families) were included according to stringent criteria based on clinical and densitometric evaluation, excluding individuals with secondary osteoporosis. Males represented 54% of the cohort, median age at diagnosis was 44 years, and 84% of subjects had a history of fractures. Thirtythree variants of interest were identified initially. After familial segregation analysis, 5 variants were considered as benign in regard to bone fragility, resulting in 28 potentially pathogenic variants, all heterozygous, present in 71% of the cohort. Of these variants, 26 were nonsynonymous, there was one 9-bp deletion and one large deletion involving the only coding exon of candidate gene GPR68. An association of two or more variants in different genes was present in 21% of the cohort, including a young woman with severe osteoporosis and variants in WNT1, PLS3 and NOTCH2. Familial segregation in this case suggested an additive pathogenic effect of these variants. Twenty-five percent of potentially pathogenic variants were identified in well-established candidate genes (WNT1, PLS3, COL1A1, COL1A2), and 57% located to novel candidate genes initially identified by GWAS, such as NBR1 and GPR68, which have been previously associated to changes in bone remodeling in mouse models. These results support the involvement of GWAS genes in the pathophysyiology of osteoporosis, and indicate a prominent role for digenic/oligogenic interactions in cases of severe, familial or idiopathic osteoporosis. Recognition of new molecular pathways in the determination of bone fragility may lead to the development of new drugs, and the identification of pathogenic variants associated to osteoporosis may allow individualized clinical management of patients and their relatives

The exhaustion of oil fields together with the undesirable effects of its use has turned sugarcane into an attractive crop for the biofuel market, increasing its economic and environmental importance. The position of Brazil as the world\'s major sugarcane producer and the need to expand the planted area to soil with less favorable conditions makes the study of drought, one of the abiotic stresses affecting the most of this crop yield, essential for the future of Brazil as the main exporter of this commodity. This work has the aim of providing a comprehensive analysis of sugarcane drought responses in the physiological and molecular levels. In order to do that we followed four strategies. First, we performed the analysis of physiology and transcriptome (microarray) of drought stressed sugarcane plants in three time points (4 days of stress, 6 days of stress and re-watering) of a greenhouse experiment. The plant material analyzed was leaves and roots. Second, aiming to identify different genes and new patterns of expression it was done the analysis of RNA-Seq from the most discrepant condition, from both leaves and roots, found by the microarray, third, we performed the analysis of a drought progression experiment through physiology and qRT-PCR of selected candidate genes and forth we built co-expression networks to detect interesting patterns. Physiology analysis showed that plants were under moderate to severe water stress with decreases of up to 97% in photosynthesis. Microarray data indentified 7,867 unique SAS with a fold change of more than 2 or less that 0.5, and 575 unique SAS differentially expressed. The analysis of the identified sequences allowed the observation that in leaves after 4 days of stress, the plant is mostly transducing the signal from the environment, while after 6 days and after rehydration there is a more functional response of the plant, with re-watering leading the metabolism back to homeostase. In the case of roots, it was observed a similar response, however roots take longer to go back to the initial condition, since several genes are still being down-regulated even after re-watering. There are also pathways presenting an opposite pattern in the analyzed tissues, being activated in one tissue but repressed in the other, such as Phenylpropanoid Biosynthesis pathway. Furthermore, while in leaves there is a restriction on photosynthesis, on roots it seems to be a restriction on growth. RNA-Seq de novo assembly showed 28,240 differentially expressed features in leaves and 7,435 in roots, while using the reference genome (unpublished data) it was possible to identify 38,317 differentially expressed genes in leaves and 7,649 in roots, and the analysis of KEGG pathways indicate that ABA has a major role in both leaves and roots responses to drought, but in leaves there is an interplay of phytohormones. Drought progression experiment confirms the results obtained from microarray and shows that when stress is extreme, gene expression starts to decrease, suggesting the plant might be entering in senescence. Co-expression analysis allowed the determination of three modules correlated with physiological parameters altered during water stress, and lead to the identification of some possible hub genes that may be important for sugarcane responses to drought. Furthermore, it was possible to identify genes that through both co-expression and qRT-PCR analysis had similar patterns of expression. Altogether, these results give us a comprehensive view of the alterations in sugarcane responses to water stress and helped us gain insight for defining better suited candidate genes for plant breeding. A exaustão dos combustíveis fósseis juntamente com os efeitos não desejáveis de seu uso, tonaram a cana-de-açúcar uma cultura atrativa para o mercado de biocombustíveis, aumentando a sua importância econômica e ambiental. A posição do Brasil como o principal produtor de cana-de-açúcar e a necessidade de expandir a área plantada para regiões com condições menos favoráveis, tornam o estudo da seca, um dos principais estresses abióticos que afetam a produtividade da cultura, essencial para o futuro do Brasil como o principal exportador dessa comoditie. Este trabalho tem o objetivo de fornecer uma análise global das respostas da cana-de-açúcar à seca, tanto em nível fisiológico quanto molecular. Para isso, foram seguidas quatro estratégias. Primeiro foi realizada uma análise da fisiologia e do transcriptoma (microarranjo) de plantas de cana-de-açúcar cultivadas em casa de vegetação e estressadas por três períodos diferentes (4 dias de estresse, 6 dias de estresse e reidratação). Os tecidos analisados foram folha e raiz. Segundo, com o objetivo de identificar diferentes genes e novos padrões de expressão, foi realizada a análise de RNA-Seq em tecidos de folha e raiz utilizando a condição mais discrepante identificada pelo microarray; terceiro, foi feita a análise de um experimento de progressão da seca por meio da fisiologia e qRT-PCR usando genes candidatos selecionados. A quarta estratégia foi a construção de redes de co-expressão objetivando detectar módulos de genes relacionados à resposta a seca. As análises de fisiologia mostraram que as plantas estavam sob estresse moderado a severo com diminuição de até 97% na fotossíntese. Os dados de microarray levaram à identificação de 7.867 SAS únicos com diferença de razão de expressão maior que 2 ou menor que 0,5, e 575 SAS únicos diferencialmente expressos. A análise das sequencias identificadas permitiu a observação de que em folhas, depois de 4 dias de estresse, há basicamente a transdução dos sinais obtidos a partir do ambiente, enquanto depois de 6 dias e após a reidratação há uma resposta mais funcional da planta, com a última conduzindo o metabolismo de volta à homeostase. No caso das raízes foi observado uma resposta similar, porém, as raízes demoram mais tempo para voltar à condição inicial, de forma diversos genes continuam reprimidos mesmo após a reidratação. Há ainda rotas metabólicas, como o Biosíntese de Fenilpropanoides, que apresentam perfis opostos nos tecidos analisados, sendo ativada em um e reprimida no outro. Além disso, enquanto em folhas há uma restrição na fotossíntese, em raízes parece existir uma restrição no crescimento. A análise de novo do RNA-Seq mostrou 28.240 \"features\" diferencialmente expressos em folhas e 7.435 em raízes, enquanto a utilização do genoma de referência (dados não publicados) identificou 38.317 genes diferencialmente expressos em folha e 7.649 em raiz, sendo que a análise das rotas do KEGG indicam que o ABA tem um papel principal nas respostas à seca em ambos os tecidos, no entanto em folhas existe uma interação entre fitohormônios. O experimento de progressão da seca confirma os resultados obtidos a partir do microarranjo e mostram que quando o estresse é severo, a expressão gênica começa à diminuir, sugerindo que a planta pode estar entrando em senescência. As análises de coexpressão permitiram a determinação de três módulos correlacionados com parâmetros de fisiologia alterados durante o estresse hídrico, e conduziram à identificação de alguns genes centrais que podem ser importantes para as respostas da cana à seca. Além disso, foi possível identificar genes que tanto pela análise de co-expressão quanto pelo qRT-PCR apresentam padrões similar de expressão. Juntos, esses resultados forneceram uma visão global das alterações que ocorrem na cana-de-açúcar em resposta ao estresse hídrico e ajudaram a obter conhecimento para seleção de genes candidatos adequados para o melhoramento genético de plantas.

Os distúrbios do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal são doenças genéticas heterogêneas. Os testes genéticos que utilizam o sequenciamento de genes candidatos pelo método de Sanger é efetivo para o diagnóstico etiológico em menos de 40% desses pacientes. O sequenciamento de nova geração é uma ferramenta eficaz no diagnóstico de pacientes com DDSs. No presente estudo, utilizamos o sequenciamento exômico paralelo em larga escala (SEPLE) para identificar variantes alélicas potencialmente causadoras dos DDSs. Pacientes com síndrome de regressão testicular embrionária (SRTE) familial, membros de duas famílias brasileiras não relacionadas (família 1: dois irmãos afetados e pais não afetados e família 2: indivíduo índice, irmã não afetada e sobrinho afetado, filho da irmã do índice) foram selecionados inicialmente. Estes pacientes apresentavam micropenis, testículos ausentes ou disgenéticos e ausência de útero. O DNA genômico foi extraído de leucócitos de sangue periférico e o SEPLE foi realizado usando a plataforma Illumina-HiSeq-2500. Uma nova variante em heterozigose, c.923C > T, (p.Arg308Gln), no DHX37 foi identificada em todos os membros afetados das duas famílias brasileiras. O sequenciamento por Sanger confirmou a presença da variante em todos os afetados, no pai não afetado da F1 e na mãe não afetada do F2. A presença de efeito fundador da variante nestas duas famílias foi excluído, através da análise de 29 marcadores localizados no cromossomo 12q. Trinta e cinco pacientes com 46, XY DDS por anormalidades do desenvolvimento gonadal (6 com SRTE e 29 com disgenesia gonadal) esporádicos foram incluídos na pesquisa de variantes no DHX37 por Sanger ou por painel de genes candidatos (Plataforma Illumina-HiSeq-2500). As variantes c.923C > T, (p.Arg308Gln) em heterozigose e a variante c.451G > A, (p.Arg151Trp) em homozigose foram identificadas no DHX37 em dois pacientes com SRTE esporádicos. As variantes c.142C > T (p.Ala48Thr) e c.2020G > A (p.Arg674Trp) foram identificadas em heterozigose em dois pacientes esporádicos com disgenesia gonadal (DG). De acordo com o American College of Medical Genetics e Genomics guideline (ACMG), as variantes foram classificadas como provavelmente patogênicas (p.Arg308Gln e p.Arg674Trp), variante de significância clínica incerta (p.Arg151Trp) e variante benigna (p.Ala48Thr). Três variantes identificadas no DHX37 eram causadoras de doença em mais de três das ferramentas de previsão in silico utilizadas. Nenhuma das novas variantes no DHX37 foi encontrada nas bases de dados da população disponíveis (EXAC, 1000GENOME, ESP6500, gnomAD e abraOM) com uma frequência maior do que 0,01%. O padrão de metilação da região promotora do DHX37 dos membros afetados e não afetados das famílias 1 e 2 e controles femininos e masculino foi analisado utilizando o ensaio Infinium Methylation EPIC BeadChip (Illumina). Um sítio CpG hipometilado na região promotora do DHX37 foi observado apenas no pai da F1 quando comparado com as amostras dos filhos afetados, membros da F2 e controles. A análise imuno-histoquímica do padrão de expressão da proteína DHX37 foi realizada em amostras de testículos de oito indivíduos com diferentes idades cronológicas. Esta analise revelou que no tecido testicular de recém-nascidos, indivíduos em idade puberal e adultos, o DHX37 estava expresso em células germinativas em diferentes estágios de maturação (presentes nas espermatogonias, espermatócitos e espermátides e ausente nos espermatozoides). Este achado sugere que a proteína DHX37 pode ter um papel no processo de desenvolvimento das células germinativas. O DHX37 (12q24.31) codifica uma proteína DEAH (Asp-Glu-Ala-His) que pertence às famílias RNA helicases cujos membros estão envolvidos em quase todos os processos relacionados ao RNA, bem como ao controle do crescimento, proliferação e processos de diferenciação celular. Pacientes descritos com deleções na região 12q24.31, que contém o DHX37, apresentavam características sindrômicas e anormalidades genitais, como hipospadias ou micropenis. A presença de anormalidades genitais nestes pacientes reforça a hipótese de que o DHX37 está envolvido na etiologia dos DDSs 46,XY. Em conclusão, identificamos fortes evidências de um novo gene, o DHX37, envolvido no processo de desenvolvimento e manutenção das gônadas masculinas. Estudos complementares serão necessários para esclarecer o papel exato do DHX37 nas redes reguladoras de genes que controlam o desenvolvimento sexual humano 46,XY disorders of sex development (DSD) associated with abnormalities of gonadal development are heterogeneous genetic diseases. Genetics testing using Sanger sequencing of candidate genes is effective for diagnosis in less than 40% of these patients. Next-generation sequencing has been a powerful genetic diagnostic tool in the investigation of DSD patients. In the present study, we used the whole exome sequencing (WES) to identify potentially DSD-causing allelic variants. Patients with familial embryonic testicular regression syndrome (ETRS) of two non-related Brazilian families (Family 1 (F1)- two affected brothers and the unaffected parents; Family 2 (F2)- index patient, his unaffected sister and an affected nephew, the son of the index\'s sister) were initially selected. The patients had micropenis, absent or dysgenetic testes and no uterus. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leucocytes and WES was performed using the Illumina-HiSeq-2500 platform. A novel heterozygous variant, c.923C > T, (p.Arg308Gln), in the DHX37 gene was identified in all affected members of the two Brazilian families and in F1\'s father. Sanger sequencing confirmed the presence of the variant in the all of the affected members and in F1\'s father and in F2\'s mother. The presence of a founder effect in these families was investigated using 29 markers located on chromosome 12q and was ruled out. Thirty-five additional patients with sporadic 46,XY DSD associated with abnormalities of gonadal development (6 with ETRS and 29 with gonadal dysgenesis) were screened for variants in this novel candidate gene using Sanger or NGS-based targeted sequencing panel of DSD candidate genes (Illumina-HiSeq-2500 platform). The heterozygous variant c.923C > T (p.Arg308Gln) and the homozygous variant c.451G>A, (p.Arg151Trp) in the DHX37 were identified in two sporadic SRTE patients. The heterozygous variants c.142C > T (p.Ala48Thr) and c.2020G > A (p.Arg674Trp) were identified in two sporadic 46,XY gonadal dysgenesis (GD) patients. According to the American College of Medical Genetics and Genomics guidelines (ACMG) the variants were classified as likely pathogenic (p.Arg308Gln, p.Arg674Trp), variant of uncertain clinical significance (p.Arg151Trp and) and benign variant (p.Ala48Thr); and all three of them were disease causing in more than three of the in silico prediction tools used. None of the novel DHX37 variants identified were found in the available population databases (EXAC, 1000GENOME, ESP6500, gnomAD and abraOM) in more than 0.01%. Segregation analysis of DHX37 allelic variants was performed in 5 families and resulted in the autosomal dominant with incomplete penetrance and recessive inheritance patterns. DNA methylation pattern of the DHX37 promotor region of F1 and F2\'s affected and unaffected members and gender-matched controls was analyzed using the Infinium Methylation EPIC BeadChip (Illumina). One hypomethylated CpG site in the promoter region of the DHX37 was only observed in F1\'s father compared with the affected siblings, F2\'s members and controls. Immunohistochemical analysis of DHX37 protein expression pattern was performed on testis samples of eight individuals with different chronological ages. This analysis revealed that in the testicular tissue of newborns, pubertal and adults, the DHX37 was expressed in different stages of germ cells maturation (present in spermatogonia, spermatocytes and spermatids and absent in spermatozoa). This finding suggests that DHX37 protein might have a role in the process of germ-cells development. The DHX37 (12q24.31) encodes a DEAH (AspGlu- Ala-His) protein of the RNA helicase families, whose members are involved in almost all RNA-related process such as the control of cell growth, proliferation and differentiation processes. Previously described patients with 12q 24.31 deletions, which contains DHX37, showed syndromic features and genital abnormalities as hypospadias or micropenis. This phenotype reinforces the hypothesis that DHX37 is involved in the etiology of disorders in male sex development. In conclusion, a novel gene, the DHX37, involved in the process of development and maintenance of male gonads was identified. Further studies will be necessary to clarify the exact role of the DHX37 in the gene regulatory networks controlling human sex development

Austropuccinia psidii (sin Puccinia psidii) é um fungo biotrófico que infecta diversos gêneros de mirtáceas. É uma ferrugem (Puccinialles) nativa da América do Sul que apresenta ampla distribuição e rápida dispersão geográfica, alcançando atualmente a Austrália, centro de diversidade das mirtáceas. Este patógeno tem alarmado a comunidade científica devido à vasta capacidade de dispersão e por causar perdas econômicas consideráveis em culturas de interesse comercial, com destaque na eucaliptocultura. Apesar de sua importância, estudos relacionados ao patossistema A. psidii - Eucalyptus ainda são incipientes, sendo que o entendimento das bases moleculares envolvidas na interação planta-patógeno é essencial para adoção de medidas de controle eficazes e duradouras. Atualmente, a busca por candidatos a efetores tem crescido consideravelmente, pois são moléculas capazes de alterar a fisiologia do hospedeiro, suprimindo ou ativando os mecanismos de defesa. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi identificar in silico genes candidatos a efetores e validá-los por meio de análise de expressão por RT-qPCR. Para predição dos genes candidatos a efetores foi utilizado o genoma parcial de A. psidii e uma pipeline específica, baseada em diversos parâmetros, tais como: presença do peptídeo sinal, ausência de domínio transmembrana e superfície de ancoragem e pequeno tamanho. Foram identificados 2.886 candidatos, dos quais 13% apresentaram similaridade com Puccinialles. As categorias mais importantes de localização subcelular preditas foram apoplasto (87,3%), cloroplasto (7%) e núcleo (4,1%). Oito candidatos foram selecionados para análise de expressão após mineração em dados de RNA-seq. Os ensaios foram realizados in vitro com uredósporos de duas populações distintas de A. psidii, uma proveniente de eucalipto (MF-1) e outra de S. jambos (GM-J1) e as amostras foram coletadas em 6, 12 e 24 horas após inoculação (h.a.i). O perfil de expressão dos candidatos variou entre os tempos investigados, sendo que dois candidatos mostraram altos valores de expressão em todos os tempos, ao passo que quatro foram mais expressos nos tempos iniciais (6 e 12 h.a.i). Os tempos iniciais correspondem às fases de germinação e pré-penetração, fortalecendo a predição desses quatro candidatos como apoplásticos. Foi observado um perfil diferencial de expressão entre as duas populações do patógeno, o que sugere uma provável modulação pelo hospedeiro de origem na expressão dos candidatos a efetores, fato ainda pouco abordado na literatura e que deve ser melhor investigado. Embora o trabalho tenha sido realizado in vitro, foi possível selecionar potenciais candidatos para continuidade dos estudos, incluindo a validação in planta e caracterização funcional. Os dados são relevantes em vista a escassez de informações biológicas desse patossistema e fornecem uma visão inicial de como esses efetores atuam na interação planta-patógeno. Austropuccinia psidii (sin Puccinia psidii) is a biotrophic fungus that infects several genera of Myrtaceae. It is a rust (Puccinialles) native from South America that displays a broad distribution after have shown a quick geographic dispersion, being currently present even in Australia, which is Myrtaceae\'s diversity center. This pathogen has alarmed the scientific community due to its wide dispersion ability and because of considerable economic losses occurring in crops of commercial interest, especially eucalyptus cultures. Despite its importance, studies related to A. psidii-Eucalyptus pathosystem are still incipient and the understanding of the molecular basis involved in the plant-pathogen interaction is essential to develop effective and durable control mechanisms. Currently, the search for effector candidates has increased considerably since they are molecules that alter the host physiology, suppressing or activating the defense mechanisms. In this study, we aimed to identify in silico effectors candidate genes and also to validate them by expression analysis (RT-qPCR). To predict the effector candidate genes, we used the partial genome of A. psidii and a specific pipeline based on several parameters, such as small size, presence of signal peptide, absence of transmembrane domain and anchorage surface. A total of 2,886 candidates were identified, from which 13% are similar to Puccinialles. The most important categories of predicted subcellular localization were apoplast (87,3%), chloroplast (7%) e nucleus (4,1%). Eight candidates were selected for expression analysis after mining in RNA-seq data. The in vitro assays were carried out with uredospores from two distinct populations of A. psidii: one from eucalyptus (MF-1) and other from S. jambos (GM-J1); the samples were collected 6, 12 and 24 hours after inoculation (h.a.i). The expression profile of the candidates was distinct among the times investigated. The results showed that two candidates had high expression values in all times evaluated, while four were more expressed at 6 and 12 h.a.i. These times correspond to the germination and pre-penetration phases, corroborating with the prediction of these four candidates as apoplastics. A differential expression profile was found between the two pathogen populations, suggesting a probable modulation by the origin host in the expression of effectors candidates, what has not been extensively investigated and discussed in the literature on the topic. Although this study has been performed in vitro, it was possible to select potential candidates for further investigations, including in plant validation and functional characterization. The data presented here are relevant considering the scarcity of biological information about this pathosystem, besides providing an initial insight on how these effectors act in the plant-pathogen interaction.

O transtorno do espectro autista (ASD, do inglês, autism spectrum disorder) é uma condição neuropsiquiátrica de início precoce, caracterizado por déficit do uso da comunicação para socialização e padrões de comportamentos restritos e repetitivos. A herdabilidade do ASD tem sido estimada em 50-90%. O ASD pode se apresentar como uma condição sindrômica, considerando, nesses casos, síndromes genéticas, como a distrofia muscular de Duchenne (DMD), e como uma condição não sindrômica. Além disso, o ASD apresenta uma grande heterogeneidade genética e centenas de genes têm sido relatados como candidatos. As variantes com alta patogenicidade para o ASD são mais comumente raras, de novo e levam ao truncamento da proteína. A função da maioria dos genes candidatos para o ASD ainda é desconhecida e pode explorá-la pode trazer grande conhecimento sobre essa condição. O estudo genômico de casos familiais de ASD pode facilitar a identificação de fatores genéticos possivelmente patogênicos para o ASD, uma vez que esses casos podem estar enriquecidos de fatores genéticos e têm sido pouco explorados. Então, uma estratégia para identificar e validar genes candidatos para o ASD é investigar variantes que levam ao truncamento das proteínas nos casos familiais de ASD. Além disso, entender as alterações dos processos moleculares e celulares desregulados pelos genes candidatos para o ASD pode nos ajudar a compreender melhor a relevância desses genes na manutenção da homeostasia do sistema nervoso central e, também, como esses genes podem causar o fenótipo do ASD. Dessa forma, primeiramente, nós investigamos variantes exômicas raras de perda de função (rLoF, do inglês, rare loss-of-function) (MAF

Há grande preocupação por parte da população com o consumo de gorduras saturadas, e a carne bovina é geralmente tida como importante fonte da mesma. A gordura intramuscular não pode ser separada da carne para o consumo, por isso a manipulação do perfil de ácidos graxos da carne (AG's) se torna de suma importância para se obter uma carne bovina com riscos reduzidos a saúde humana. Este estudo teve como objetivo identificar regiões que influenciam na composição de AG's da carne de bovinos Nelore.para isso foi realizado análise de perfil de ácidos graxos para quantificação de ácido esteárico (C18:0), ácido palmítico (C16:0), ácido linoleico (C:18:2; 9,12 ω6), ácido linoleico conjugado (CLA) (C18:2; c9, t11), ácido linolênico (C18:3; 9,12,15 ω3), ácido oleico (C18:1; 9 ω9), do músculo Longissimus dorsi de 929 animais, que foram genotipados com o chip de alta densidade (Illumina SNP800 BeadChip).para a realização do estudo de associação ampla de genoma (GWAS), para a identificação de regiões associadas às características de interesse , e posterior identificação de genes candidatos posicionais. Para isto foram utilizados 929 bovinos da raça Nelore para a genotipagem com chip de 770K, amostras do músculo Longissimus dorsi foram coletadas para análise do perfil de AG's. Foram encontradas 148 regiões que explicam mais do que 0,04% da composição dos seis AG's avaliados. As regiões explicam em porcentagem da variação fenotípica: 1,24% para C18:0, 1,01% para C16:0, 2,31% para:18:2;, 1,34% para CLA C18:2;, 1,74% para C18:3, 1,83% para C18:1. Foram encontrados no presente estudo, 85 QTL's descritos na literatura relacionados a outras raças. Um total de 107 genes candidatos posicionais foram encontrados no presente estudo relacionados ao metabolismo de AG's. Os resultados deste estudo ajudam a elucidar as regiões que influenciam o perfil de AG da carne possibilitando sua utilização em programas de seleção assistida, com impacto a saúde humana There is great concern among the population with the consumption of saturated fats, and beef is generally viewed as an important source of it. Intramuscular fat can not be separated from meat for consumption, so the handling of the meat fatty acid profile (AG's) becomes extremely important to obtain a beef with reduced risks to human health. This study aimed to identify regions that influence the AG's composition of Nelore meat there for was accomplished profile analysis of fatty acids for quantification of stearic acid (C18: 0), palmitic acid (C16: 0), linoleic acid (C: 18: 2; 9.12 - ω6), conjugated linoleic acid (CLA) (C18: 2; c9, t11), linolenic acid (C18: 3; 9,12,15 - ω3), oleic acid (C18 1; 9 ω9), of Longissimus dorsi of 929 animals genotyped with high density chip (Illumina BeadChip SNP800) for the realization of wide genome association study (GWAS), for identify regions associated with characteristics of interest, and subsequent identification of positional candidate genes. 929 Nelore bulls were genotyped with 770K chip, muscle Longissimus dorsi samples were collected for analysis of the AG's profile. 148 regions able to explaining more than 0.04% of the composition of the six AG's evaluated. The regions account for a percentage of the phenotypic variation: 1.24% for C18:0, 1.01% for C16:0, 2.31% for 18:2 ;, 1.34% CLA C18:2; 1 74% of C18: 3, 1.83% for C18:1. Were found in this study, 85 QTL described in the literature related to other breeds. A total of 107 positional candidate genes were foundin this study associated with fatty acids metabolism. The results of this study help to elucidate the regions that influence the AG profile of the meat allowing their use in assisted selection programs, impacting human health

Este trabalho teve o objetivo de identificar genes candidatos para deficiência mental de herança ligada ao cromossomo X (DMLX). Foram investigadas quatro famílias, nas quais a deficiência mental de causa desconhecida segregava num padrão típico de herança ligada ao X, e 24 irmandades que incluíam pelo menos dois afetados do sexo masculino. O padrão de inativação do cromossomo X foi determinado nas mães dos afetados, pois desvios extremos no padrão de inativação são frequentes em mulheres portadoras de mutações no cromossomo X que causam DMLX. Nas famílias com padrão de herança ligada ao X, a deficiência mental foi mapeada, usando marcadores moleculares do tipo microssatélite, localizados ao longo do cromossomo X. Desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos foram investigados por hibridação genômica comparativa baseada em array (array-CGH). Genes candidatos posicionais que já haviam sido associados a deficiência mental foram sequenciados pelo método de Sanger, em busca de mutações patogênicas. Em três famílias com DMLX, o probando teve seu exoma sequenciado. Nas três famílias com DMLX em que o sequenciamento do exoma foi realizado, foram detectadas mutações missense, levando à substituição de resíduos de aminoácidos conservados, que segregavam com a deficiência mental. Essas mutações foram consideradas como prováveis causas dos fenótipos nessas famílias: c.12378C>G no gene HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase); c.1413C>A no gene SHROOM4 (shroom family member 4) e c.262G>A no gene KIAA2022. As mulheres heterozigóticas quanto a essas mutações apresentaram desvio completo de inativação do cromossomo X (100:0). Mutações de ponto ou interrupção desses genes por rearranjos cromossômicos foram previamente descritas em alguns pacientes com deficiência mental. Em uma família, em que a DMLX estava associada a microcefalia e malformação de Dandy-Walker, uma microduplicação de aproximadamente 300 kb em Xq28 (ChrX :153,578,110-153,880,794;Hg19) foi detectada segregando com a doença. As mulheres heterozigóticas quanto a essa duplicação apresentaram desvios de inativação do X (80:20 e 90:10). Duplicações semelhantes foram anteriormente descritas em três famílias europeias e em um caso esporádico; a malformação de Dandy-Walker foi documentada em alguns desses pacientes. No estudo das 24 irmandades com pelo menos dois indivíduos do sexo masculino apresentando deficiência mental, o padrão de inativação do cromossomo X de suas mães foi determinado. Quatro mulheres (16,7%) apresentaram desvio total de inativação do cromossomo X (100:0), frequência significativamente maior do que a descrita para população geral de mulheres adultas (cerca de 2 %). Considerando que desvios extremos de inativação do cromossomo X são observados em aproximadamente 30% das portadoras de mutações que causam DMLX, concluiu-se que as quatro mães de homens que apresentam deficiência mental eram provavelmente portadores de mutações no cromossomo X, causadoras da deficiência mental em seus filhos. Não foram encontradas microdeleções ou microduplicações no cromossomo X nos probandos das quatro irmandades. This study aimed at identifying candidate genes for X-linked intellectual disability (ID). Four families in which ID of unknown cause segregated as an X-linked trait, and 24 sibships with at least two affected males were investigated. The pattern of X-inactivation was determined in the mothers of affected males, taking into account that extremely skewing of X-inactivation is frequently found in women carrying mutations causative of X-linked intellectual disability (XLID). In the XLID families, ID was mapped by the genotyping of microsatellite markers localized throughout the X chromosome. Cryptic X-chromosome imbalances were investigated by array-based comparative genomic hybridization (a-CGH). Positional candidate genes that had been associated with ID were directly sequenced in the search for causative mutations. In three XLID families, the propositus had their exome sequenced. In three XLID families missense mutations that led to substitutions of conservative aminoacid residues were found that segregated with ID, and were probably causative of the clinical phenotypes: c.12378C>G in HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase) gene; c.1413C>A in the SHROOM4 (shroom family member 4) gene; c.262G>A in the KIAA2022 gene. Heterozygotes for these mutations had completely skewed X-inactivation (100:0 inactivation ratio). Point mutations or disruption of these genes by rearrangement breakpoints have been previously described in a few patients with ID. In one family in which XLID was associated with microcephaly and Dandy-Walker malformation, a duplication of approximately 300 kb at Xq28 (ChrX:153,578,110-153,880,794 - Hg19) was found segregating with the disease. Heterozygotes for this duplication had skewed X-inactivation (80:20 and 90:10 inactivation ratios). Similar duplications have been described in three European families and one sporadic case, Dandy-Walker malformation being documented in some patients. In the study of the 24 sibships with at least two males presenting with ID, the maternal pattern of X-inactivation was determined. Four women (16.7%) showed completely skewing of X-inactivation (100:0 inactivation ratio), a frequency significantly higher than the reported frequency of skewing >= 95% in women from the general population (about 2%). Considering this finding and that extremely skewed X-inactivation have been reported in about 30% of carriers of mutations causing XLID, it was assumed that the four mothers of males presenting with ID were most probably carriers of the mutations causative of ID in their sons. Chromosome X microimbalances were not found in the propositus, in these four sibships.

A presente tese aborda o estudo do metabolismo dos frutos de tomate a partir de três estratégias complementares: i) a identificação de genes candidatos colocalizados com QTL, previamente descritos a partir do perfil metabólico de S. lycopersicum (cv. M82) e linhagens introgredidas de S. pennellii, associados ao conteúdo de metabólitos de interesse industrial e nutricional; ii) a análise estrutural das regiões genômicas portadoras desses genes; e iii) a análise funcional dos genes chaperona DnaJ e sec14 por meio de genética reversa mediante o silenciamento por RNAi. A análise de marcadores moleculares previamente mapeados nas regiões portadoras dos QTL permitiu identificar 127 genes candidatos cujos produtos foram mapeados nas rotas metabólicas correspondentes. Um subgrupo desses genes apresentou diferenças alélicas entre os progenitores da população utilizada para a identificação dos QTL. A análise de microssintenia revelou um alto grau de conservação na estrutura genômica, apresentando polimorfismos nas regiões codificantes e regulatórias, assim como no padrão de inserção de elementos de transposição. Baseado nessas diferenças, análises de expressão e funcionalidade putativa, dois genes foram escolhidos para a análise funcional utilizando a estratégia de RNA de interferência. Os resultados obtidos da avaliação fenotípica das plantas deficientes em chaperona DnaJ permitiram concluir que esta proteína, localizada nos cloroplastos, participa da regulação do metabolismo de açúcares, em particular na síntese de amido, controlando assim, a exportação de fotoassimilados. Já, a caracterização das linhagens silenciadas para o gene sec14, levou a postular que os conteúdos de tocoferol (VTE) nos frutos de tomate, não só dependem da regulação cinética das enzimas envolvidas na sua síntese, mas também da função da proteína do SEC14, não caracterizada em plantas até o momento. Essa proteína estaria envolvida no transporte de VTE entre os diferentes compartimentos do cloroplasto tendo impacto no equilíbrio oxidativo, na estrutura do plastídeo e, consequentemente, na biossíntese desta vitamina. Os resultados obtidos nesta tese reforçam a hipótese que o germoplasma selvagem constituem uma fonte de variabilidade a ser explorada para a identificação de determinantes genéticos que viabilizem novas estratégias de melhoramento de tomate por meio da manipulação do metabolismo central dos frutos. This thesis addresses tomato fruit metabolism analysis by using three complementary approaches: i) the identification of candidate genes co-located with QTL previously described from metabolic profiles of S. lycopersicum (cv. M82) and S. pennellii introgressed lines, associated with industrial and nutritional quality traits; ii) the structural analyses of the genomic regions harboring the identified genes and ; iii) the functional analysis of the chaperone DnaJ and sec14 genes through reverse genetics mediated by iRNA silencing. The analysis of the molecular markers previously mapped onto the QTL-associated regions allowed the identification of 127 candidate genes whose products were mapped in the corresponding metabolic pathways. A subset of these genes showed allelic differences between the parental genotypes used for QTL identification. Based on these differences, together with the expression profile analysis and their putative function, two genes were selected for functional analysis using RNA interference approach. The phenotypic profile of the chaperone DnaJ deficient plants allowed to conclude that this protein, located in chloroplasts, participates in sugar metabolism, in particular, starch synthesis, controlling assimilates partitioning. The characterization of sec14-silenced transgenic lines leads to propose that fruit tocopherol (VTE) contents not only depend on the kinetic regulation of the biosynthesis-involved enzymes, but also on the SEC14 action, not yet characterized in plants. This protein might be involved in VTE transport between the different plastidial compartments thus, affecting oxidative balance, chloroplast structure and, consequently, VTE biosynthesis. All together these results support the hypothesis that wild germoplasm represents a remarkable source of variability to be explore aiming the identification of genetic determinants to develop new breeding approaches for tomato through metabolic engineering.

Os transtornos do espectro autista (TEA) são um grupo de doenças neuropsiquiátricas caracterizadas por um prejuízo na capacidade de comunicação e de interação social e por padrões comportamentais estereotipados. Os TEA são geneticamente heterogêneos o que dificulta a identificação das alterações genéticas que estão contribuindo para estes transtornos. No presente estudo, selecionamos como uma primeira abordagem o estudo de translocações cromossômicas, buscando encontrar genes candidatos para posteriores estudos funcionais. No primeiro caso, uma translocação de novo balanceada envolvendo os cromossomos 2q11 e Xq24, não identificamos nenhum candidato funcional rompido pelos pontos de quebra. Detectamos ainda a presença de uma isodissomia materna do cromossomo 5 nesta paciente. Este resultado sugere que, possivelmente, tanto a translocação cromossômica quanto a isodissomia devem estar contribuindo para a etiologia do TEA nesta paciente, caracterizando este como um caso de efeito poligênico. Já o estudo da translocação de novo balanceada (3,11)(p21,q22) revelou que o gene TRPC6, um canal de cálcio envolvido no desenvolvimento de dendritos e sinapses excitatórias, encontrava-se rompido no cromossomo 11 deste paciente. As análises dos neurônios e células progenitoras neurais deste paciente obtidas através da técnica de reprogramação celular e o estudo global de expressão gênica sugerem fortemente que o rompimento do gene TRPC6 é o fator etiológico do TEA neste caso. Por fim, nós também realizamos um estudo de expressão gênica global de pacientes autistas idiopáticos e verificamos que os genes diferencialmente expressos nestes pacientes estão principalmente envolvidos na regulação da dinâmica do citoesqueleto, indicando que este pode ser o processo biológico comumente afetado nos pacientes autistas. Nosso trabalho mostra que os estudos citogenéticos são importantes para a identificação de genes candidatos para os TEA e reforça a hipótese de que estes transtornos são causados por diferentes variantes genéticas mas que levam ao comprometimento de um processo biológico comum. Acreditamos que o modelo de reprogramação celular contribuirá para o entendimento da implicação de tais processos na etiologia dos TEA. Autism spectrum disorders (ASD) are a group of neurodevelopmental diseases characterized by impairments in social and communicative skills and repetitive behaviors. The investigation of ASD causes is hampered by the genetic heterogeneity of these neurodevelopmental diseases. In the present study, we mapped the breakpoints associated to chromosomal translocations found in two autistic patients as a first screening approach, trying to identify single candidate genes that could be further investigated by functional analysis. In the first case, a de novo balanced translocation involving the chromosomes 2q11 and Xq24, we did not find any functionally known relevant gene disrupted by the breakpoints but, surprisingly, SNP-array data showed that the patient also presents a maternally inherited isodisomy on chromosome 5. In this case, is possible that ASD is caused by the combination of the molecular results caused by the translocation and the UPD on chromosome 5, which would characterize this case as an example of polygenic effects on ASD etiology. On the other hand, the study of a second case, a boy with a de novo balanced translocation (3;11)(p21;q22), revealed that TRPC6, a calcium channel involved in dendritic spine and excitatory synapse formation, was disrupted by the translocation on chromosome 11. Making use of cellular reprogramming to generate neurons and neuronal progenitor cells from this patient and expression analysis, we demonstrated that TRPC6 disruption can respond for the phenotype seen in this patient. Finally, we also performed a genome-wide expression analysis to investigate idiopathic autistic patients and we verified that ASD DEGs are mainly implicated in cytoskeleton dynamics, suggesting that the regulation of this cellular structure can be one of the common mechanisms of ASD etiology. Our work shows that cytogenetic studies are important for the identification of ASD candidate genes and reinforces the hypothesis that these disorders are caused by different genetic variants that are implicated in a common biological process. We believe that cellular reprogramming will contribute for the understanding of the implication of such biological processes in the etiology of ASD.

A complexidade da fisiologia da audição resulta da participação e interação de produtos de grande número de genes, razão pela qual a surdez hereditária exibe enorme heterogeneidade genética. Estudos moleculares nas duas últimas décadas permitiram a identificação de vários genes responsáveis por surdez; entretanto, muitos ainda restam ser identificados. A maioria dos estudos de mapeamento de genes de surdez até então conduzidos privilegiou estratégias que buscavam mutações de ponto. Outros mecanismos mutacionais, como deleções e duplicações, foram pouco investigados. Portanto, a contribuição das CNVs (Copy Number Variations) na surdez hereditária é pouco conhecida. O objetivo desse trabalho foi identificar novos genes que possam ter papel na etiologia da surdez sindrômica ou não-sindrômica por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em pacientes com perda auditiva. Selecionamos 25 genes candidatos (CTTN, FGF3, FGF19, FOXC1, FOXF2, FOXQ1, IMMP2L, KIF5C, LRRN3, MAP1A, MYLK4, PPP3CA, SHANK2, SLC5A7, STRC, TMC1, TMC2, TMC3, TMC4, TMC5, TMC6, TMC7, TMC8, TPCN2 e TUBB2A) para a triagem de microrrearranjos por meio da técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Os genes candidatos foram selecionados a partir de rearranjos detectados em um estudo prévio realizado por meio de array-CGH (array-based Comparative Genomic Hybridization) em indivíduos com surdez sindrômica estudados em nosso laboratório, e também a partir de dados da literatura. Nossa casuística foi composta por 163 indivíduos, dos quais 74 são pacientes com surdez associada a outros sinais (sindrômicos), a maioria casos isolados, e 89 são pacientes com surdez não-sindrômica, propósitos de famílias em que segrega surdez de herança autossômica dominante ou recessiva. Desenhamos uma sonda sintética intragênica de MLPA para cada um dos genes candidatos. Foram detectadas seis deleções em TMC6 (3,7%), seis deleções e uma duplicação em STRC (4,3%) e uma duplicação em IMMP2L (0,6%). A triagem de alterações nesses três genes em 189 indivíduos fenotipicamente normais revelou quatro deleções em TMC6 (2,1%), oito deleções e três duplicações em STRC (5,8%) e três deleções em IMMP2L (1,6%). Todas as alterações em TMC6, tanto nos casos de surdez como nos controles, eram na realidade artefatos devidos a problemas de hibridação da sonda correspondente. No gene STRC, previamente já relacionado à surdez, os rearranjos nos indivíduos afetados devem se tratar de polimorfismos sem efeito fenotípico por serem muito frequentes na população. Contudo, é possível que haja nesses pacientes mutações adicionais que não puderam ser rastreadas e que poderiam contribuir ao fenótipo, em combinação com o rearranjo detectado, como já descrito em um caso da literatura. A duplicação em IMMP2L em uma paciente com surdez não-sindrômica, herdada da mãe igualmente afetada, mostrou-se a mais provavelmente relacionada ao fenótipo, pois o estudo complementar por meio de array-CGH revelou que o rearranjo inclui uma duplicação parcial da porção 3 de outro gene, DOCK4. O produto desse gene possui uma isoforma que se localiza nos estereocílios das células ciliadas e se liga a uma importante proteína relacionada à audição, a harmonina. Portanto, nossa hipótese é a de que a duplicação seja a causa da surdez na família e que DOCK4 seja um novo gene responsável por surdez. A associação de IMMP2L com surdez é menos provável devido ao grande número de CNVs não patogênicas já descritas que incluem partes desse gene. Estudos complementares são necessários para mapear a duplicação com mais precisão. Além disso, o rastreamento de mutações em DOCK4 em outras famílias com surdez pode vir a confirmar o possível papel desse gene na etiologia da surdez. Several genes contribute to the complexity of physiology of hearing. Consequently, hereditary deafness is extremely heterogeneous from the genetic point of view. In the last two decades, several genes responsible for hereditary hearing loss have been identified, but a large number of genes remains to be found, as evidenced by the unexplained cases of inherited deafness. The search for point mutations in candidate genes after mapping based on linkage studies has been the main strategy in the identification of such genes. Other mutation mechanisms, such as deletions and duplications, have been rarely investigated, and the contribution of DNA copy number variants (CNVs) to hearing loss is not well known. This study aimed at identifying novel genes, which might play a role in the etiology of syndromic and non-syndromic deafness, through the search of gene microdeletions and microduplications. We selected 25 candidate genes (CTTN, FGF3, FGF19, FOXC1, FOXF2, FOXQ1, IMMP2L, KIF5C, LRRN3, MAP1A, MYLK4, PPP3CA, SHANK2, SLC5A7, STRC, TMC1, TMC2, TMC3, TMC4, TMC5, TMC6, TMC7, TMC8, TPCN2 and TUBB2A) based on their involvement in microimbalances detected by Array-based Comparative Genomic Hybridization (aCGH) in a previous study of a Brazilian sample of individuals with syndromic hearing loss from our laboratory and others reported in the literature. We studied 163 subjects, 74 of them presenting syndromic deafness, the majority were isolated cases, and 89 being probands of families in which nonsyndromic deafness had an autosomal dominant or recessive mode of inheritance. Gene deletions or duplications were screened by Multiplex Ligant-dependent Probe Amplification (MLPA) using one synthetic intragenic probe designed for each candidate gene. We detected six deletions in TMC6 (3,7%), six deletions and one duplication in STRC (4,3%), and one duplication in IMMP2L (0,6%). The screening of imbalances in these genes in a control sample of 189 hearing individuals revealed four deletions in TMC6 (2,1%), eight deletions and three duplications in STRC (5,8%) and three deletions in IMMP2L (1,6%). The imbalances found in TMC6, both in affected and control individuals, were in fact artifacts due to problems in the hybridization of the corresponding probe. As to the STRC gene, previously related to deafness, the imbalances are more likely to be 4 polymorphisms with no phenotypic effect. However, the possibility remains that additional undetected mutations in affected individuals contribute to their phenotype, in combination with the microrearrangement, as already reported in the literature. The duplication in IMMP2L in a non-syndromic patient, and also present in her affected mother, is most likely causative of deafness, since a complementary study performed with aCGH revealed that the rearrangement included a partial duplication of the 3 end of another gene, DOCK4. An isoform of the DOCK4 protein localizes to the stereocilia in the inner ear and interacts with harmonin, a protein already known to be involved in hearing. We hypothesize that this duplication may be the cause of deafness in the family and, this being the case, DOCK4 appears as a novel deafness gene. The causal association between IMMP2L and deafness is less plausible, because of the large number of reported non-pathogenic CNVs that include parts of this gene. Further studies are required to precisely map this duplication. In addition, the screening of mutations in DOCK4 in other families with hearing impairment is required to evaluate its possible role in the etiology of deafness.

Investigou-se o efeito da leptina exógena e do maior consumo de energia, sobre o padrão da expressão de genes no hipotálamo de novilhas zebuínas; de modo a elucidar o mecanismo de sinalização da leptina no hipotálamo e os genes responsáveis pela obtenção da puberdade. Trinta e seis novilhas não púberes, e com idade entre 18 e 20 meses, foram divididas em três grupos experimentais: baixa energia (BAIXA), alta energia (ALTA), baixa energia com administração de leptina recombinante ovina (BAIXA+LEP), totalizando 56 dias de tratamento. Vinte e quatro novilhas foram abatidas ao apresentar sinais de puberdade, sendo eles: concentração de progesterona no soro superior a 1 ng/mL por duas amostras seguidas e presença de corpo lúteo detectável por ultra-sonografia. O hipotálamo foi colhido e armazenado a -80ºC. As amostras foram submetidas à extração do RNA total, tratadas com DNAse I e submetidas à síntese de cDNA. A quantificação relativa de quatro genes candidatos reconhecidamente envolvidos com a sinalização hipotalâmica da leptina em bovinos: NPY, NPY-Y1, NPY-Y4 e SOCS-3, foi feita através de PCR quantitativo (tempo real). Não houve efeito da administração de leptina sobre a expressão do NPY (P=0,70), ou de seus receptores: NPY-Y1 (P=0,27) e NPY-Y4 (P=0,92) no início da puberdade. A expressão de SOCS-3 foi reduzida (P=0,05) no hipotálamo de novilhas tratadas com leptina, o que sugere menor ação inibitória sobre a leptina. Em novilhas alimentadas com dieta de alta energia, a expressão do NPY-Y1 foi reduzida (P=0,04), o que indica que o hipotálamo estaria menos sensível à ação do NPY, permitindo a entrada precoce em puberdade. Nos demais genes estudados, NPY (P=0,75), NPY-Y4 (P=0,92) e SOCS-3 (P=0,24), a dieta não alterou significativamente suas expressões hipotalâmicas. Estudo mais abrangente do efeito da nutrição e da administração de leptina foi realizado através de hibridização em microarranjos de DNA, objetivando a identificação de possíveis genes candidatos, expressos no hipotálamo, que influenciam na obtenção da puberdade em novilhas Nelore tratadas com leptina ou submetidas à dieta de alta energia. Foram encontrados 78 genes cuja expressão foi alterada pela densidade energética da dieta (P=0,05) no hipotálamo das novilhas Nelore, destes foram selecionados os que apresentaram razões de expressão da ordem de 1,4 ou mais, totalizando 20 genes. Entre esses se destaca o gene da β-arrestina 1 (ARRB1), que foi 1,40 vezes mais expresso (P=0,04) em novilhas submetidas à dieta de alta energia, pois atua na mediação da dessensibilização dos receptores acoplados à proteína-G-(GPCRs)1, como os receptores de NPY. Foram encontrados 134 genes diferencialmente expressos (P=0,05) devido a aplicação de leptina. Dentre os 80 genes que apresentaram razões superiores a 1,4, 18 genes tiveram a expressão reduzida, e 62 tiveram a expressão aumentada pela aplicação de leptina. Destes, alguns estão envolvidos na regulação da sinalização da leptina. O gene SRC foi menos expresso (1,64 vezes; P=0,04) em novilhas tratadas com leptina, o que sugere menor ação inibitória pela SHP-2. A proteína SOCS-2 foi 1,43 vezes (P=0,01) mais expressa no hipotálamo de novilhas tratadas com leptina. Sabe-se que, ao contrário de SOCS-1 e SOCS-3, CIS e SOCS-2 não se ligam, ou inibem, as janus kinases. O STAT-3 foi 2,14 vezes (P=0,03) mais expresso em novilhas tratadas com leptina, e sua ativação possibilita a ligação hipotalâmica da leptina com seu receptor (Ob-Rb). As IGFPB-1 e -2 foram mais expressas no hipotálamo de novilhas tratadas com leptina que em novilhas não tratadas, sendo IGFPB-1 1,78 vezes (P=0,04) mais expressa e IGFPB-2 1,89 vezes (P=0,05). As IGFPBs podem desempenhar função de potencialização da ação do IGF-1, ou exercer ação inibitória. Conclui-se que tanto o consumo de energia quanto a aplicação com leptina influenciaram o padrão de expressão gênica no hipotálamo de novilhas Nelore. A modulação da quantidade do receptor do NPY, NPY-Y1, no hipotálamo pode ser uma via importante pela qual a nutrição afeta o início da puberdade em novilhas. E ainda que estudos mais aprofundados de expressão dos genes encontrados nas hibridizações por microarranjo poderão revelar interações mais concisas entre os genes, a nutrição e a leptina na obtenção da puberdade. It was investigated the effect of exogenous leptin and the high energy intake on gene expression pattern in the hypothalamus of zebuine heifers; in a way to elucidate the mechanism of leptin signaling in hypothalamus and the responsible genes for puberty. Thirty six heifers not in puberty at 18 and 20 months of age were divided in three experimental groups: low energy diet (LOW), high energy diet (HIGH), low energy diet with administration of recombinant ovine leptin (LOW+LEP), totalizing 56 days of treatment. Twenty four heifers were slaughtered when presented the signals of puberty: progesterone serum concentration above 1 ng/mL for two followed weeks and the presence of detectable corpus luteum by ultrasonography. The hypothalamus was collected and stored at -80ºC. Samples were submitted to total RNA extraction, treated with DNAse I and submitted to cDNA synthesis. The relative quantification of four candidate genes admittedly involved with hypothalamic leptin signaling in bovine: NPY, NPY-Y1, NPY-Y4 and SOCS-3, was evaluated through quantitative PCR (real time). There was no effect of leptin administration on NPY expression (P=0.70), or on its receptors: NPY-Y1 (P=0.27) and NPY-Y4 (P=0.92) in the onset of puberty. The expression of SOCS-3 was reduced (P=0.05) in the hypothalamus of heifers treated with leptin, what suggests lower inhibitory action over leptin. In heifers fed high energy diets, the expression of NPY-Y1 was reduced (P=0.04), which indicates that the hypothalamus would be less sensitive to the action of NPY, allowing the precocious onset of puberty. In other studied genes, NPY (P=0.75), NPY-Y4 (P=0.92) and SOCS-3 (P=0.24), the diet did not significantly altered their hypothalamic expressions. A more comprehensive study regarding the effect of nutrition and leptin administration was performed through the hybridization in DNA microarrangements, aiming the identification of possible candidate genes, expressed in hypothalamus that influence in the onset of puberty in Nelore heifers treated with leptin or submitted to high energy diets. It was found 78 genes whose expression was altered by the energy density of the diet (P

Introdução: A síndrome ou seqüência malformativa de Rokitansky-Mayer-Küster-Hauser (SR), de caráter geralmente esporádico, caracteriza-se por aplasia útero-vaginal, freqüentemente associada a anomalias esqueléticas e do trato urinário e a caracteres sexuais secundários, hormônios esteróides e cariótipo normais. A condição é claramente heterogênea, podendo fazer parte de outras seqüências e complexos mais abrangentes. Sua freqüência ao nascimento foi estimada em cerca de 1/5.000 meninas. O banco de dados OMIM (McKusick, 2005) classifica-a como autossômica recessiva e apenas um caso atípico, portador de virilização, foi atribuído a mutação descrita no gene WNT4 (Biason-Laubert e col.., 2004). A vitamina A e seus derivados ativos (ácidos retinóicos ou AR) desempenham papel importante nos processos de diferenciação, proliferação e apoptose celular. Mendelsohn e col. (1994) e Kastner e col. (1997) descreveram malformações congênitas semelhantes afins às da SR em camundongos portadores de mutações nos genes RAR-G e RXR-A dos receptores de AR. A região homóloga em humanos de um desses receptores corresponde exatamente à região descrita por Kucheria e col. (1988) em duas mulheres não aparentadas com agenesia mülleriana e portadoras de translocação (12;14)(q14;q31). Os fatores etiológicos responsáveis pelas anomalias müllerianas são ainda pouco conhecidos, mas o achado freqüente de afetadas com outros defeitos associados (renais, esqueléticos, cardíacos e auditivos) sugere o envolvimento de genes primordiais do desenvolvimento. Materiais e métodos: No total, 43 pacientes (todas com cariótipo 46,XX) e 21 familiares foram todos submetidos a exame clínico e ginecológico e de imagem (ultra-sonografia urogenital e raios-X de coluna) padronizados e à coleta de sangue para estudo cromossômico e molecular. O DNA foi extraído e amplificado por PCR Touch-Down; a triagem das mutações foi realizada em cinco genes (RARG, RXR-A, WNT-4, LHX-1 e KLHL-4) por eletroforese SSCP, dHPLC e de seqüenciamento (MegaBace). Quinze pacientes do total apresentando fenótipo mais grave foram triadas quanto a variações no número de cópias de DNA pela técnica de ~1 Mb array-CGH. As alterações detectadas foram validadas por FISH e MLPA. Foram excluídas alterações no número de cópias previamente descritas em indivíduos normais (DGV). Dois novos genes (LHX-1 e KLHL-4) surgiram como possíveis candidatos após a triagem com array- CGH e foram incluídos aos três genes candidatos previamente existentes. Resultados e conclusão: Trinta e nove pacientes possuíam quadro bastante típico de SR com agenesia útero-vaginal, em 27 delas acompanhado de manifestações extra-genitais como defeitos renais, ósseos, agenesia de ovários e surdez. Quatro pacientes apresentaram defeitos müllerianos isolados (agenesia de vagina) e uma outra era portadora da associação MURCS. A analise molecular por meio das técnicas de SSCP, dHPLC e seqüenciamentode todas as regiões codificados dos cinco genes candidatos permitiu identificar 95 alterações. A comparação com os bancos de dados (http://www.ensembl.org/) determinou que as alterações identificadas correspondem a variações populacionais polimórficas previamente descritas e sem efeito patogênico, uma vez que nenhuma delas altera a seqüência de aminoácidos das proteínas por elas codificadas. Mediante array-CGH foram identificadas, em 5 pacientes, um total de 7 alterações submicroscópicas (deleções e duplicações) comprometendo as regiões 1q21.1, 17q12, 22q11.21, 22q11.22, e Xq21.31. Alguns familiares das afetadas, também portadores dessas alterações, apresentavam manifestações leves, indicando que as alterações apresentam penetrância incompleta e expressividade variável. Nossos resultados afastam a RAR-G, RXR-A, WNT-4 como diretamente envolvidos na patogênese da síndrome de Rokitansky e sugerem a existência de variações no numero de copias de novas regiões cromossômicas como relevantes durante o desenvolvimento mülleriano, indicando especificamente os genes LHX1 e KLHL4 como candidatos. Background: Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) syndrome, comprising utero-vaginal atresia in otherwise phenotypically normal women with a normal karyotype (46,XX), has an incidence of about 1/5,000 among newborn girls. Anomalies of the genital tract range from upper vaginal atresia to total Müllerian agenesis (congenital absence of the Fallopian tubes, uterus, and upper vagina). Patients with müllerian aplasia (MA) often exhibit additional clinical features such as renal, vertebral and cardiac defects. A number of different syndromes have been associated with MA, and in most cases its aetiology remains poorly understood. We studied 43 women with the MRKH defect and 21 relatives presenting associated anomalies. The study included clinical and ultrasonographic examination of the urogenital system, radiographs of the vertebral column and sequencing of three candidate genes named RAR gama, RXR alpha and WNT-4. Fifteen of our patients, with more complex phenotypes (genital, renal, cardiac, and skeletal defects), were screened for DNA copy number changes by 1 Mb whole genome bacterial artificial chromosome (BAC) array based comparative genomic hybridization (CGH). The detected alterations were validated by an independent method and further mapped by high resolution oligo-arrays. Results: All patients had a normal 46,XX karyotype and were also normal to the RAR gama, RXR alpha and WNT-4 genes. Submicroscopic genomic imbalances affecting the 1q21.1, 17q12, 22q11.21, and Xq21.31 chromosome regions were detected in five probands. Presence of the alterations in the normal mother of one patient suggests incomplete penetrance and/or variable expressivity. Conclusion: 5 of the 15 patients were found to have cryptic genomic alterations. The imbalances on 22q11.21 support recent findings by us and others that alterations in this chromosome region may result in impairment of müllerian duct development. The remaining imbalances indicate involvement of previously unknown chromosome regions in MA, and point specifically to LHX1 and KLHL4 as candidate genes.

O Transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) é um transtorno psiquiátrico comum e heterogêneo caracterizado por obsessões (pensamentos, imagens ou impulsos intrusivos e recorrentes) e compulsões (comportamentos ou atos mentais repetitivos realizados para aliviar as obsessões). O TOC tem uma prevalência de 2 a 3% na população geral e apresenta distribuição aproximadamente igual entre os sexos, porém os homens tendem a apresentar os sintomas obsessivo-compulsivos mais precocemente quando comparado com as mulheres. Os estudos de genética epidemiológica têm demonstrado que o fator genético é um importante componente na etiologia do TOC. O principal objetivo desta dissertação foi investigar a influência de alguns genes candidatos na susceptibilidade para o TOC (estudo de genes candidatos) e também qual a influência destes mesmos genes na resposta terapêutica à clomipramina (estudo de farmacogenética). Realizamos o estudo de genes candidatos num total de 215 pacientes e 872 controles. Os loci investigados foram: SLC6A4, HTR1B, HTR2A, SLC6A3, COMT e SLC6A2. Os mesmos polimorfismos foram investigados em uma sub-amostra de 41 pacientes tratados com clomipramina e analisados de acordo com a resposta terapêutica. Foram classificados como respondedores ao tratamento, os pacientes que tiveram uma redução de 40% ou mais na escala YBOCS. Assim, 27 pacientes foram considerados respondedores e 14 nãorespondedores. Diferenças genotípicas e alélicas foram observadas em alguns resultados nos pacientes e controles. Entretanto, nenhuma associação foi observada nas análises para resposta à clomipramina. Os resultados sugerem que alguns polimorfismos estudados podem estar relacionados ao aumento do risco para o TOC, porém, nenhum polimorfismo foi associado à resposta terapêutica à clomipramina. Obsessive-compulsive disorder (OCD) is a common and heterogeneous psychiatric disorder characterized by obsessions (intrusive and recurrent thoughts, images or impulses) and compulsions (repetitive behaviors or mental acts performed to relive obsessions). OCD prevalence range from 2 to 3% in general population and has approximately equal sex distributions, however men tend to have an earlier age at onset of obsessive-compulsive symptoms comparing to women. Epidemiologic studies have demonstrated that genetic factor is an important component in the etiology of OCD. The aim of this study was to investigate participation of some candidate genes in the susceptibility to OCD and also their effects on clomipramine treatment. We performed a candidate gene study in a total of 215 OCD patients and 865 controls. The loci investigated were: SLC6A4, HTR1B, HTR2A, SLC6A3, COMT and SLC6A2. The same polymorphisms were investigated in a sub-sample of 41 patients treated with clomipramine, and analyzed according to therapeutic response. There were considered good responders to the drug those patients who presented a reduction of 40% or more in Y-BOCS scale. According to this, 27 patients were good responders and 14 poor responders. Genotypic and allelic differences were observed in some results for patients and controls. However, no association was observed in the analyses for clomipramine response. Our results suggest that some polymorphisms investigated may be related to the increase of risk to develop OCD, but they are not associated to therapeutic response to clomipramine.

A medicina de precisão trata-se de uma área tem avançado rapidamente nos últimos anos, juntamente com o desenvolvimento de novas tecnologias de diagnóstico e tratamento, levando à minimização de efeitos colaterais relacionados ao tratamento melhoras nos resultados clínicos de forma geral. A pesquisa em farmacogenômica (PGx) desempenha um importante papel na área da medicina de precisão, ao investigar as variantes genéticas que modulam a resposta a fármacos, por meio de alterações em sua farmacocinética (PK) ou farmacodinâmica (PD). A distribuição de variantes de farmacogenes difere consideravelmente entre as populações e o sequenciamento genético completo em populações diversas (WGS, do inglês whole-genome sequencing) desempenha um papel importante como uma abordagem de sequenciamento abrangente para detectar variantes comuns e raras. Objetivo: Os objetivos gerais foram: i) verificar o panorama dos estudos brasileiros na área da PGx, em termos de metodologia de estudo e oportunidades potenciais na área de pesquisa no Brasil, e ii) avaliar a frequência de marcadores farmacogenéticos em idosos da cidade de São Paulo e avaliar a proporção de indivíduos potencialmente em alto risco de interações farmacogenéticas no ano de 2010. Métodos: Na primeira parte do trabalho, foi realizada uma revisão sistemática que buscou estudos brasileiros na área da PGx que analisaram a associação entre fármaco(s) e gene(s) que apresentam interesse especial na área da farmacogenética (VIPs, do inglês Very Important Pharmacogenes); foram incluídos 97 estudos para análise do texto completo. Na segunda parte do trabalho, a ferramenta Stargazer foi utilizada para identificar star alleles de 38 farmacogenes, utilizando o banco de dados de WGS de 1.171 indivíduos não-relacionado do estudo SABE (Estudo de Saúde, Bem-Estar e Envelhecimento). Resultados: Na revisão da literatura, 32 dos 65 VIPs foram analisados por estudos de associação na população brasileira. Noventa e seis eram estudos de genes candidatos e um era GWAS (do inglês, genome-wide association study). Agentes antitrombóticos, fármacos que atuam no sistema nervoso e no sistema cardiovascular foram as classes mais estudadas. Em geral, 68% eram estudos observacionais e 24% eram ensaios clínicos. A análise dos marcadores farmacogenéticos na coorte SABE mostrou que 352 haplótipos ou star alleles únicos foram observados em todos os 38 farmacogenes avaliados. Destes, 255 apresentaram frequência < 0,05 e 199 apresentaram frequência < 0,01; 70,1% dos star alleles foram classificados como tendo perda ou diminuição de função, ou função desconhecida. Para os onze farmacogenes com alto nível de evidência de interação com medicamentos (1A) segundo o Consórcio de Implementação de Farmacogenética Clínica (CPIC, do inglês Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium), verificou-se que mais de 99% dos indivíduos carregavam pelo menos um genótipo de alto risco. Segundo o registro de medicamentos da coorte, 22,5% dos indivíduos que utilizavam um medicamento com nível de evidência do 1A (CPIC) estavam potencialmente em risco de uma interação farmacogenética por possuírem um fenótipo predito que interage com o medicamento em uso. Conclusão: Populações miscigenadas ainda estão sub-representadas em grandes estudos genômicos, e este projeto pode contribuir com dados adicionais de para PGx na população brasileira. The area of precision medicine is growing rapidly with advances in diagnostic and treatment options, leading to improvements in clinical outcomes and minimization of unnecessary side effects. Pharmacogenomics (PGx) plays an important role in precision medicine and deals with the variation of drug response due to genetic factors. Research in the field of PGx aims to identify genetic variants that modulate the response to drugs, through alterations in their pharmacokinetics (PK) or pharmacodynamics (PD). The distribution of PGx variants differs considerably among populations, and whole-genome sequencing (WGS) performed on diverse populations plays a major role as a comprehensive sequencing approach to detect both common and rare variants. Objective: This study evaluated i) the landscape of Brazilian PGx studies in terms of study methodology and potential opportunities in this research area in Brazil, and ii) the frequency PGx markers in a cohort of elderly individuals from the city of São Paulo, and the proportion of individuals at a potential high-risk for PGx interaction in 2010. Methods: In the first part of this research, a systematic review was performed to find Brazilian studies in the area of PGx which analyzed the association between drugs and very important pharmacogenes (VIP); 97 studies were included for full-texts review. In the second part, the tool Stargazer was used to call star alleles from 38 pharmacogenes using data from the Health, Well-Being, and Aging Study (SABE), which includes variants from whole-genome sequences of 1,171 unrelated individuals. Results: In the literature review, 32 out of 65 VIPs were analyzed by association studies in the Brazilian population. Ninety-six were candidate gene studies and one was GWAS. Antithrombotic agents, drugs that act on the nervous system, and the cardiovascular system were the most studied dugs. In general, 68% comprised observational studies and interventional clinical trials accounted for 24%. The analysis of PGx markers in the SABE cohort showed 352 unique star alleles or haplotypes in all 38 pharmacogenes assessed. Among these, 255 and 199 had a frequency < 0.05 and < 0.01, respectively, with decreased/ loss-of-function/ unknown function corresponding to 70.1%. For eleven pharmacogenes with high level of evidence (1A) supporting the association with drugs according to CPIC (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium), more than 99% of the individuals carried at least one high risk genotype. According to cohort medication register from 2010 round of data collection, 22.5% of individuals using CPIC level 1A drugs were potentially at high risk for a pharmacogenetic interaction because they also had a predicted phenotype which interacts with the drug taken. Conclusion: Admixed populations are still underrepresented in large genomic studies, and this project could provide insights to PGx in those populations.

A escoliose idiopática afeta aproximadamente 4% da população e é a causa mais comum de desvios da coluna. Fatores intrínsecos e extrínsecos podem estar associados com o desenvolvimento da escoliose idiopática do adolescente (EIA), incluindo alterações genéticas. Dentre os genes candidatos associados ao desenvolvimento da EIA destaca-se o que codifica a fibrilina-1 (FBN1), uma glicoproteína da matriz extracelular, essencial para a organização das microfibrilas extracelulares em células do músculo esquelético e fibroblastos dérmicos, responsáveis por distúrbios do tecido conjuntivo, como a escoliose. Variantes raras e polimorfismos no gene FBN1 já foram associados com a EIA em populações chinesas e norte americanas. Até então não existiam dados da população brasileira. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o papel potencial do polimorfismo FBN1 rs12916536 no desenvolvimento e gravidade da EIA, além de correlacionar a variação do ângulo de Cobb em relação às características demográficas dos pacientes. Foi realizado um estudo analítico do tipo caso controle, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa institucional. Amostras de DNA de 563 voluntários (185 casos com EIA e 378 controles) foram analisadas usando um ensaio de discriminação alélica TaqMan validado. Um modelo de regressão logística multivariada avaliou a associação entre o polimorfismo FBN1 rs12916536 e EIA, utilizando razões de chance (OR) ajustados com seus respectivos intervalos de confiança (IC) de 95%. Uma análise de regressão linear avaliou a variação do ângulo de Cobb de acordo com a idade e o índice de massa corporal (IMC). No grupo de pacientes com EIA houve predomínio do sexo feminino (12:1), baixo IMC ou normal (90%), 58% apresentavam ângulo de Cobb maior que 45º e 74% eram esqueleticamente maduros (Risser IV-V). A idade foi um fator de risco (4 vezes) para a progressão da curva (0,72° por ano). A frequência alélica do polimorfismo FBN1 rs12916536 A foi de 40% nos controles e 31% nos casos de EIA, sendo estatisticamente diferente entre os dois grupos (P=0,004). Os genótipos FBN1 rs12916536 GA+AA foram associados a um menor risco de suscetibilidade a EIA (OR=0,58; IC95%=0,35-0,98), após ajuste pela idade, sexo e IMC. No entanto, não foram detectadas diferenças significativas na distribuição do polimorfismo com a gravidade da doença (Cobb A polymorphism was 40% in controls and 31% in AIS cases; and this difference was statistically significant (P=0.004). FBN1 rs12916536 GA+AA genotypes were associated with a lower risk of AIS susceptibility (OR = 0.58 and 95% CI = 0.35-0.98), after adjustment for age, sex and BMI. However, no significant differences were detected in polymorphism distribution with the severity of the disease (Cobb

As abelhas Apis mellifera são caracterizadas, principalmente, por sua organização social avançada, na qual as rainhas, operárias e zangões são morfologicamente distintos e desempenham funções especificas na colmeia. A rainha e zangão são responsáveis pela reprodução, enquanto as operárias realizam as demais tarefas de manutenção da colônia e cuidado parental. Apesar de morfologicamente e funcionalmente distintas, rainhas e operárias não diferem geneticamente, sendo a qualidade da dieta fornecida à larva o principal estímulo que promove a diferenciação das suas características morfologicamente distintas. O polifenismo apresentado se deve, em parte, a fatores epigenéticos, como a metilação do DNA e RNAs não codificantes, que afetam e, em consequência, alteram a expressão de genes chave aos processos de diferenciação celular e morte celular programada. Uma das principais características morfológicas distinta entre as castas é o sistema reprodutor, as rainhas plenamente desenvolvem os seus ovários, enquanto os ovários das operárias passam por um processo de morte celular programada, garantindo assim o monopólio reprodutivo das rainhas. Com a proliferação celular dos ovários durante o estágio larval, as rainhas adultas chegam a possuir 200 ovaríolos por ovário, apresentando a capacidade de colocar, aproximadamente, mil ovos por dia. Já as operárias, após o processo de morte celular nos ovários na fase larval, quanto adultas possuem apenas entre 2 e 20 ovaríolos por ovário, o qual é facultativamente inativo. O objetivo deste trabalho foi quantificar os níveis de transcritos de genes candidatos, especialmente epigenéticos, para o desenvolvimento ovariano casta-específico em larvas de rainhas e operárias. Os resultados obtidos mostraram que os níveis de transcritos dos genes lncov1 e Tudor-SN nos ovários larvais de operárias coincidem com a fase expressiva da morte celular programada no estágio L5F3. Já os genes lncov2 e fringe apresentaram picos de expressão na fase anterior (L5F1), mas com direcionalidade oposta, sendo que lncov2 é mais expresso em rainhas, e fringe em operárias. É importante enfatizar que a fase L5F1 marca bem o início da morte celular programada. Interessantemente, lncov2 encontra-se hospedado em um intron de fringe, indicando assim que o lncRNA lncov2 atua como repressor da sua expressão. A expressão do gene Hdac4, a histona desacetilase mais expressa em larvas de abelhas, não foi diferente entre rainhas e operárias, sugerindo que a expressão diferencial observada em amostras do corpo inteiro deve ser oriunda de células de outros tecidos cuja expressão é casta-específica, potencialmente o cérebro e/ou corpo gorduroso. Apesar de experimentos prévios indicarem que o knockdown da DNA metiltransferase 3 (DNMT3) resulta no desenvolvimento de ovários queen-like, o gene não se apresentou como diferencialmente expresso entre as castas, mas o gene Hdac4 apresentou um pico de expressão marcante no início do quinto instar larval. Para outro gene, Anarchy, fator chave para esterilidade em operárias adultas, encontramos que sua expressão em larvas é maior nos ovários de operárias no estágio em que ocorre morte celular programada (L5F3). Também analisamos o gene Krüppel-homolog 1 (Kr-h1), sendo este um fator de transcrição de resposta imediata ao hormônio juvenil, o qual apresenta importante papel no desenvolvimento das castas, promovendo a diferenciação dos ovários nas rainhas, observamos expressão significativa nos ovários de operárias na fase L5F3. Por fim, Egfr, outro gene de interesse quantificado, não apresentou expressão ovariana casta-específica. Com este trabalho identificamos genes potencialmente implicados no desenvolvimento diferencial dos ovários, fornecendo um conjunto de dados para futura validação funcional. Apis mellifera bees are characterized by their advanced social organization, in which queens, workers and drones are morphologically distinct and perform specific functions in the hive. The queen and drone are responsible for reproduction, while the workers carry out the other tasks of colony maintenance, like brood care and foraging. Despite being morphologically and functionally distinct, queens and workers do not differ genetically, but it is the quality of the diet supplied to the larva that promotes the differentiation of their morphologically distinct characteristics. This polyphenism is due, in part, to epigenetic factors, such as DNA methylation and non-coding RNAs, which affect and, consequently, alter the expression of key genes in the processes of cell differentiation and programmed cell death. One of the main morphological characteristics that differs among the castes is the reproductive system: the queens fully develop their ovaries, while a programmed cell death process degrades most of the workers\' ovaries during larval development, thus guaranteeing the queens\' reproductive monopoly. With cell proliferation in the ovaries during the larval stage, the adult queens end up with up to 200 ovarioles per ovary, and they can lay approximately one thousand eggs per day. On the other hand, workers, after the process of cell death in the larval ovaries, have only between 2 and 20 ovarioles left per ovary, and these are facultatively inactive. The aim of this work was to quantify the transcript levels of candidate genes, especially ones encoding epigenetic factors, during the caste-specific ovarian development in queen and worker larvae. The results showed that the transcript levels of the genes lncov1 and Tudor-SN in the larval ovaries of workers coincide with expressive programmed cell death at the L5F3 stage. The lncov2 and fringe genes showed statistically significant expression peaks in the L5F1 stage, which marks the beginning of programmed cell death. However, these genes are expressed with opposite directionality: while lncov2 expression was higher in queens, fringe was significantly higher in workers. Interestingly, lncov2 is hosted in an intron of fringe, indicating a possible repressor action of this lncRNA on fringe. The expression of the Hdac4 gene, the most expressed histone deacetylase in bee larvae, was not different between queens and workers, suggesting that the differential expression observed in whole body samples is likely due to other tissues, whose expression is caste-specific, potentially the brain and/or fat body. Although previous experiments indicated that the knockdown of the DNA methyltransferase 3 (DNMT3) results in the development of queen-like ovaries, the gene was not differentially expressed in the larval ovaries, but like Hdac4 it showed a marked expression peak in the early fifth larval instar. For another gene, Anarchy, which is a key factor for sterility in adult workers, we found that its expression is higher in the ovaries of worker larvae at the stage of programmed cell death (L5F3). In addition to these genes, we also analyzed the Krüppel-homolog 1 (Kr-h1) gene, a transcription factor in the immediate response to juvenile hormone, which plays an important role in caste development. promoting differentiation of ovaries into queens. For Kr-h1 we observed significant expression in the ovaries of workers in the L5F3 stage. Finally, Egfr, another gene of interest, did not show caste-specific ovarian expression. With this work we identified genes that are potentially involved in the differential development of the ovaries, providing a set of data for future functional validation.

Understanding the molecular machinery involved in certain traits of economic interest is important because the genetic information can be applied to animal breeding programs, defining greater accuracy in genomic selection. GWAS studies have identified general QTL and CNV regions on chromosome 4 in Gallus gallus species, in a Brazilian broiler population, associated with muscle development traits such as weight and percentage of breast. Searches for candidate genes present in these regions and that could be participating in muscle development were performed. The SAP30 gene was identified as a possible candidate for muscle development. Therefore, and to validate its function, SAP30 was edited using CRISPR/Cas9 and had its expression reduced by means of siRNA, in myoblast culture in vitro. After these analyses, morphometric analyzes were performed in cell culture to evaluate changes in the area size of these cells. Subsequently, RNA sequencing, differentially expressed genes and functional enrichment analyzes were performed to investigate gene networks and biological processes that mutations and/or reduced expression of SAP30 would be causing. The results for both papers presented the involvement of SAP30 in muscle cell hypertrophy. Both the reduction in gene expression and the induction of mutations in its sequence made the myotubes have a larger area in the treated groups when compared to controls. RNA sequencing analyzes revealed, for both, an important difference in the expression of genes related to muscle development, as well as genes that act in muscle formation and regeneration pathways. So, for the first time, we present the SAP30 gene as a possible regulator of muscle hypertrophy. Entender a maquinaria molecular envolvida em determinadas características de interesse econômico é importante para que informações genéticas possam ser aplicadas junto aos programas de melhoramento animal, visando estabelecer maior acurácia na seleção genômica. Estudos de GWAS identificaram regiões de QTL e CNV localizadas no cromossomo 4 na espécie Gallus gallus, em uma população brasileira de frangos de corte, associadas com características de desenvolvimento muscular, como peso e porcentagem de peito. Buscas por genes candidatos presentes nessas regiões e que pudessem estar participando do desenvolvimento muscular foram realizadas. O gene SAP30 foi identificado como um possível candidato ao desenvolvimento muscular. Diante disso, e com o objetivo de validar sua função, SAP30 foi editado usando CRISPR/Cas9 e teve sua expressão reduzida por meio de siRNA, em cultura de mioblastos in vitro. Após essas análises, análises morfométricas foram realizadas na cultura celular para avaliar as alterações ocorridas no tamanho de área dessas células. Posteriormente, as análises de sequenciamento de RNA, genes diferencialmente expressos e enriquecimento funcional foram realizadas para investigar redes gênicas e processos biológicos que as mutações e/ou redução da expressão do SAP30 estariam ocasionando. Os resultados para ambos os trabalhos mostram o envolvimento do SAP30 na hipertrofia de células musculares. Tanto a redução na expressão do gene, quanto a indução de mutações em sua sequência, fizeram com que os miotubos tivessem maior área nos grupos tratados, quando comparado aos controles. As análises de sequenciamento de RNA revelaram, para ambos, uma importante diferença na expressão de genes relacionados ao desenvolvimento muscular, bem como, genes que atuam em vias de formação e regeneração do músculo. Assim, pela primeira vez, apresentamos o gene SAP30 como um possível regulador de hipertrofia muscular.

O emprego de \"Total Genome Scan\" em modelos genéticos de doenças complexas tem sido fundamental para seleção de regiões cromossômicas envolvidas com traços complexos. Em nosso laboratório, identificamos cinco regiões cromossômicas associadas ao traço quantitativo pressão arterial (BP-QTL) que explicam 43% da variação da pressão arterial numa progênie obtida a partir de animais espontaneamente hipertensos (SHR) e \"Brown Norway\" (BN). Os BP-QTLs foram, então, validados por desenvolvimento de linhagens congênicas, incluindo uma para o cromossomo 4 (SHR.BN4) cuja substituição das sequências SHR pelo do animal BN levou a redução da pressão arterial sistólica basal (~14 mm Hg). O objetivo deste trabalho foi identificar as variantes genéticas candidatas neste intervalo cromossômico com base em diferenças no padrão de expressão gênica e na presença de alterações genéticas não sinônimas \"missense\" ou em regiões regulatórias conservadas que possam estar envolvidas na gênese da hipertensão. Identificamos 533 genes com expressão renal, dentre os 682 do intervalo, sendo que 28 apresentaram padrão de expressão diferente entre amostras de animais adultos (congênico vs. SHR) e seis apresentaram alterações não sinônimas \"missense\". É importante salientar que dos genes diferentemente expressos, encontramos alterações estruturais em regiões conservadas com potencial de participar na regulação em 11. Em conjunto, utilizamos uma plataforma integrada para selecionar 34 genes candidatos no cromossomo 4, dos quais 17 genes serão priorizados, para ser investigados quanto sua contribuição na hipertensão arterial do SHR e na hipertensão primária humana Total genome scan in genetic models of complex diseases have been instrumental to select candidate genes underlying complex traits. We previously mapped 5 blood pressure related quantitative trait loci (BP-QTLs) that explain about 43% of the BP variance in a progeny derived from Spontaneous Hypertensive Rat (SHR) and Brown Norway (BN) rats. The BP-QTLs were then validated by derivation of congenic strains, including one for chromosome 4 (SHR.BN4) in which a segment from BN replaced the SHR sequences reducing basal systolic BP (~14 mm Hg). The aim of this project is to identify the candidate genetic variants within the chromosome interval based on differences in renal gene expression patterns and structural changes in both non-synonymous missense or within adjacent regulatory sequences that may contribute to hypertension. We identified 533 genes with renal expression, out of 682 in the interval, in which 28 presented differences in expression pattern in adult samples (congenic vs. SHR) and six presented non-synonymous missense alterations. In addition, 11 out of 28 differentially expressed genes showed structural alterations in adjacent conserved regions that potentially contribute to gene regulation. Taken together, using the proposed combination of strategies, we selected 34 hypertensive candidate genes in chromosome 4, in which 17 will be prioritized, to be further explored to assess their contribution to hypertension in the SHR and to essential hypertension in humans.

A soja é uma importante commodity no Brasil, em 2019, a soja e seus derivados responderam por US$ 32,63 bilhões em exportações. No entanto, existem alguns obstáculos à obtenção de maior produtividade, como ataque de insetos, principalmente pelo complexo de percevejos, representados principalmente por Euschistus heros, Nezara viridula e Piezodorus guildinii, que diminuem o rendimento da cultura e podem transmitir fitopatógenos. Uma alternativa ao uso de inseticidas é o desenvolvimento de cultivares resistentes. Para um melhor entendimento da arquitetura genética envolvida na resistência da soja ao complexo do percevejo, foram sequenciados os genomas da cultivar de soja IAC-100 (resistente) e da cultivar CD-215 (suscetível), foram usados os dados de genotipagem por sequenciamento de uma população de 236 de linhagens endogâmicas recombinantes oriundas do cruzamento entre as cultivares estudadas, visando encontrar variantes comuns as mais resistentes e presentes apenas na cultivar IAC-100. Para a montagem dos genomas, utilizamos a tecnologia Chromium Genome (10x Genomics, San Francisco, EUA). A montagem do genoma foi realizada com os softwares Supernova 2.1.1, Ragoo 1.1 e REAPR 1.0.17, gerando montagens com aproximadamente 1 GB e scaffold N50 próximos de 54 MB, para ambas as cultivares nossos genomas apresentam de alta sintênia com os cromossomos da Williams 82 com número de genes e elementos repetitivos muito próximos (aproximadamente 58 mil genes e 44% de elementos repetitivos). A partir dos dados do sequenciamento do genoma, o pipeline do GATK foi usado para a descoberta de variantes e usando dados de genotyping-by-sequencing (GBS), de 236 indivíduos de uma população de linhagens endogâmicas recombinantes, oriundas do cruzamento entre a IAC-100 e CD-215, o pipeline do GATK foi usado para a chamada de SNPs. Foram selecionadas, a partir de dados históricos, as 25 linhagens mais resistentes ao complexo de percevejos, e polimorfismos compartilhados entre as mesmas e IAC-100 foram identificados. Foram identificados um total de 290.189 mil SNPs únicos na IAC-100 quando comparados com CD-215, além de 335.229 mil Indels únicos. A partir dos dados de GBS foram identificados 852 SNPs, compartilhados entre as 25 linhagens mais resistente da população e IAC-100, com esses SNPs muito próximos da posição de QTLs relatados para a resistência. Variantes estruturais foram visualizadas com o software IGV na região de QTLs relatados para a resistência, onde grandes variantes únicas na IAC-100, foram encontradas próximas de genes considerados candidatos a resistência, envolvidos com a biossíntese de fenilpropanóides/lignina, terpenos, número de vagens e desenvolvimento de sementes. Além de disponibilizar dois genomas de soja brasileiros com os melhores scaffolds N50 até hoje relatados, esses resultados abrem as portas para vários outros estudos e aplicações no melhoramento, como mapeamento fino, seleção assistida, expressão de genes candidatos e modificações genéticas nos mesmos usando CRISPR ou outros métodos. Soybean is an important commodity in Brazil in 2019, the soybean and its derivatives accounted for $ 32,63billion in exports. However, there are some obstacles to achieving greater productivity as insect attacks, particularly by stink bug complex that reduce crop yield and can transmit pathogens. An alternative to the use of insecticides is the development of resistant cultivars. For a better understanding of the genetic architecture involved in soybean resistance to the bed bug complex, the genomes of soybean cultivar IAC-100 (resistant) and cultivar CD-215 (susceptible) were sequenced. Genotyping data by sequencing a population of 236 recombinant inbred lines from the crossing of the two cultivars studied were also used, to find common variants, the most resistant and present only in the cultivar IAC-100. The genome assemblies, we use the Chromium Genome technology (10x Genomics, San Francisco, USA). The genome assemblies was performed with the software Supernova 2.1.1, 1.0.17 Ragoo 1.1, and REAPR generating assemblies with about 1 GB and N50 scaffold next 54 MB for both genomes cultivars. Our genomes have high synteny with the Williams82 chromosomes with several genes and repetitive elements very close (approximately 58 thousand genes and 44% repetitive elements). From the genome sequencing data, the GATK pipeline was used to discover variants and using data from genotyping-by-sequencing (GBS), of 236 individuals from a population of recombinant inbred lines, originated from the crossing between the IAC -100 and CD-215, the GATK pipeline was used for calling SNPs. The 25 most resistant genotypes to the bed bug complex were selected from historical data, and polymorphisms shared between them and IAC-100 were identified. A total of 290.189 thousand unique SNPs were identified in the IAC-100 when compared to CD-215, in addition to 335.229 thousand unique Indels. From the GBS data, 852 SNPs were identified, shared among the 25 most resistant genotypes in the population and IAC-100, with these SNPs very close to the position of QTLs reported for resistance. Structural variants were visualized with the IGV software in the region of QTLs reported for resistance, where large unique variants in IAC-100, were found close to genes considered candidates for resistance, involved with the biosynthesis of phenylpropanoids / lignin, terpenes, number of pods and seed development. In addition to providing two Brazilian soybean genomes with the best N50 scaffolds reported to date, these results open the door to several other studies and applications in breeding, such as fine mapping, assisted selection, expression of candidate genes and genetic modifications in them using CRISPR or other methods.

O zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) é um patógeno que apresenta elevado potencial de dano para a cultura do meloeiro. O controle genético desse vírus é a forma mais eficiente de manejo e o acesso PI414723 é a única fonte de resistência efetivamente utilizada em programas de melhoramento. Sua resistência é controlada ao menos por um locus dominante, denominado Zym-1. Este estudo objetivou: i: caracterizar o mecanismo de resistência de PI414723 ao ZYMV relacionado à infecção, multiplicação e/ou invasão sistêmica viral e ii: selecionar genes candidatos de resistência no locus Zym-1 utilizando as informações de mapas genéticos de meloeiro associados à sequência do genoma de Cucumis melo e quantificar os níveis de expressão dos genes selecionados. Para tanto, uma metodologia de quantificação absoluta do ZYMV por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) foi desenvolvida a fim de comparar o número de partículas virais entre os genótipos resistente PI414723 (PI) e suscetível \'Védrantais\' (Ved). Para caracterizar a resistência em PI, o vírus foi inoculado na metade dos cotilédones de ambos os genótipos, os quais foram divididos em regiões inoculadas (I) e não inoculadas (NI). O vírus foi quantificado nessas regiões e foi realizada a recuperação biológica de partículas virais aos 3, 7 e 10 dias após a inoculação (dai) e em folhas apicais aos 10 dai. Ainda, foi avaliado se o mecanismo de resistência envolve uma reação de hipersensibilidade (RH) no ponto de inoculação assim como ativação da resistência sistêmica adquirida (RSA), através da análise da expressão de genes que codificam proteínas PR. Em todos os tempos e tecidos analisados, os títulos virais foram maiores em Ved em comparação à PI. O vírus não foi detectado em folhas apicais de PI, mas o foi em alto título em Ved aos 10 dai. Foi observada a formação de RH em cotilédones de PI às 12 e 24 horas após a inoculação, e o mesmo não foi observado em cotilédones de Ved. Os genes PR1 e PR4 foram positivamente regulados somente em PI após a inoculação. Tomados em conjunto, os resultados mostram que o vírus infecta e se multiplica em ambos os genótipos, mas não invade PI sistemicamente. Além disto, ocorre ativação da RSA no genótipo resistente e o vírus fica restrito ao ponto de inoculação devido ao mecanismo de RH. Em relação à escolha de candidatos no locus Zym-1, 13 genes foram selecionados no cromossomo 2 com base em seus domínios funcionais envolvidos na resistência ao vírus. A expressão dos candidatos foi analisada em cotilédones às 12 e 24 horas após a inoculação (hai) e o vírus foi quantificado nesses tempos e aos 7 dias após a inoculação (dai). O título viral não variou entre os genótipos às 12 hai, mas foi maior em Ved às 24 hai. Dois genes foram positivamente regulados às 12 hai em PI, os quais correspondem a cópias do gene RTM2 (restricted TEV movement 2), responsável por restringir o movimento de vírus a longa distância. Ja às 24 hai, dois análogos de genes de resistência (RGA) foram negativamente regulados em Ved. Um desses RGAs codifica uma proteína CC-NB-LRR com domínio adicional Rx-like de reconhecimento de vírus e este foi positivamente regulado em PI. Portanto, mecanismos de defesa distintos são ativados no genótipo PI414723 em resposta à infecção pelo ZYMV, resultando na resistência à invasão sistêmica viral. The zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) is a pathogen that is able to severely reduce the yield of melon plants. The use of genetic control is the most efficient way of management for this virus, and the PI414723 (PI) melon accession is the only source of resistance effectively used in breeding programs. The PI resistance is controlled by at least a dominant locus called Zym-1. The objective of this study was: i: to characterize the mechanism of PI414723 resistance to ZYMV related to infection, multiplication and/or systemic viral spread and ii: to select resistance candidate genes at the Zym-1 locus using the information from genetic maps associated with the genome sequence of Cucumis melo, and then quantify the expression levels of the selected genes. Therefore, a methodology for absolute quantification of ZYMV by quantitative real-time PCR (RT-qPCR) was developed to compare the number of viral particles between the resistant PI and susceptible \'Védrantais\' (Ved) genotypes. To characterize the resistance in PI, the virus was inoculated into one half of the cotyledons of both genotypes, which were divided into inoculated (I) and non-inoculated (NI) regions. The virus was quantified in these regions and biological recovery of the viral particles was carried out at 3, 7 and 10 days after inoculation (dai) and in apical leaves at 10 dai. Furthermore, it was evaluated whether the resistance mechanism involves a hypersensitive reaction (HR) at the inoculation site as well as activation of the systemic acquired resistance mechanism (SAR), through the analysis of the expression of genes encoding PR proteins. In all evaluation times and analyzed tissues, viral titers were higher in Ved compared to PI. The virus was not detected in PI apical leaves, but it was highly detected in Ved at 10 dai. HR was observed in PI cotyledons at 12 and 24 hours after inoculation, the same was not observed in Ved cotyledons. The PR1 and PR4 genes were up regulated only in PI after inoculation. Taken together, the results show that the virus infects and multiplies in both genotypes but does not invade PI systemically. In addition, the SAR mechanism is activated in the resistant genotype and the virus is restricted to the inoculation site due to HR. Regarding the selection of candidate genes at the Zym-1 locus, 13 genes were selected on chromosome 2 based on their protein domains involved in virus resistance. The expression of the candidate genes was analyzed in cotyledons at 12 and 24 hours after inoculation (hai) and the virus was quantified at these same periods, as well as at 7 days after inoculation (dai). The viral titer did not vary between genotypes at 12 hai, but was higher in Ved at 24 hai. Two genes were up regulated at 12 hai in PI, which are copies of the RTM2 gene (restricted TEV movement 2), responsible for restricting the virus long distance movement. At 24 hai, two resistance gene analogs (RGA) were down regulated in Ved. One of these RGAs encodes a CC-NB-LRR protein with additional virus recognition domain (Rx-like) and has been up regulated in PI. Therefore, distinct mechanisms are activated in PI414723 in response to ZYMV infection, enabling this PI to resist systemic viral spread.

Among the diseases that impact sugarcane productivity is smut, caused by the fungus basidiomycete Sporisorium scitamineum. Modern sugarcane genotypes are highly polyploid interspecific hybrids. This feature restricts molecular studies and functional analyses for the identification of resistance candidate genes and the proofs-of-concept. The present work evaluated the use of Arabidopsis thaliana as a model plant for S. scitamineum colonization through the use of morphological and molecular analyses. The morphological analyses demonstrated that S. scitamineum recognizes A. thaliana as a potential host allowing teliospore germination, appressorium formation and hyphal growth on leaves. The infected plants showed symptoms such as: chlorosis, accumulation of anthocyanin in the meristem and leaves, reduction in biomass, and roots ramification in advanced stages of the colonization. Molecular analyzes detected a transcription reprogramming of genes related to pathogenicity described for smuts, as well as for new effector candidates involved in S.scitamineum-sugarcane interaction. S. scitamineum also modulated the expression in A. thaliana gene associated with meristematic functions; changes also observed in S. scitamineum-sugarcane interaction. This is the first report of using a model plant to study sugarcane smut. The establishment of the pathosystem S. scitamineum- A. thaliana will allow several future applications to understand better S. scitamineum-sugarcane interaction. Entre as doenças que impactam a produtividade da cana de açúcar está o carvão, causado pelo fungo basidiomiceto Sporisorium scitamineum. Os genótipos modernos da cana de açúcar são híbridos interespecíficos altamente poliploides. Essa característica restringe estudos moleculares e análises funcionais para a identificação de genes candidatos à resistência e a prova de conceitos. Nesse sentido, o presente trabalho avaliou o uso de Arabidopsis thaliana como planta modelo para a colonização de S. scitamineum por meio de análises morfológicas e moleculares. As análises morfológicas demonstraram que S. scitamineum reconhece A. thaliana como um hospedeiro e permite a germinação de telósporos, a formação de appressório e o crescimento de hifas do fungo nas folhas. As plantas infectadas apresentaram alguns sintomas como: clorose, acúmulo de antocianina no meristema e folhas, redução da biomassa e ramificação das raízes em estágios mais avançados na colonização. As análises moleculares detectaram expressão de genes relacionados à patogenicidade descrita para carvões, bem como para novos candidatos a efetores envolvidos na interação S. scitamineum-cana. S. scitamineum também orquestrou uma modulação da expressão de genes A. thaliana associados a alterações meristemáticas e à via do ácido jasmônico; as mesmas alterações também foram observadas em S. scitamineum-cana. Este é o primeiro relato do uso de planta modelo para estudo do carvão da cana de açúcar. Os resultados evidenciam que o fungo é capaz de causar alterações nas vias metabólicas do hospedeiro alternativo, semelhante ao seu hospedeiro natural. O estabelecimento do patossistema S. scitamineum-A. thaliana permitirá que várias aplicações futuras compreendam melhor a interação entre S. scitamineum e cana de açúcar.

Fungi of the Ustilaginaceae family are the main causal agents of smut disease in Poaceae plants, resulting in significant agronomic and economic losses. Smut species have a biotrophic lifestyle, which depends on a close interaction with a host to complete their life cycle and produce spores (2n). The fungus Sporisorium panici-leucophaei (Spl) infects and colonizes Digitaria insularis seedlings, causing the disease known as sourgrass smut disease. Despite presenting a similar life cycle compared to other smuts, scarce information is available about this pathosystem in the scientific literature. The development of a whip-like structure from the apex of sourgrass plants reveals potential for comparing with the sugarcane smut disease pathosystem. In this sense, the present work evaluated the colonization patterns in planta, the life cycle and formation of typical penetration structures of S. panici-leucophaei. In addition, complete genome sequencing of the S. panici-leucophaei was completed using two distinct sequencing platforms. The characterization of S. panici-leucophaei life cycle in vitro was concluded with the detection of distinct phases, such as spore germination, probasidium formation, sporidia formation and dikaryotic hyphae visualization In addition, it was possible to quantitatively establish the in planta infection time-course by spore germination 8 hours post-inoculation (hpi); appressorium formation at 48 hpi and hyphae detection at 72 hpi. The S. panici-leucophaei genome was completely assembled by generating a 22 chromosome assembly plus mitochondrial DNA. In addition, 6,404 genes were predicted, of which 382 were secreted along with 66 candidate effector genes, a pattern similar to that found for the S. scitamineum fungus. Comparative genomic analyses with the sugarcane smut genome yielded the first insights into shared and specific gene-content and provided useful information on a poorly studied plant pathogen. Fungos da família Ustilaginaceae são os principais agentes causais de doenças do carvão em plantas da família Poaceae, resultando em perdas agronômicas e econômicas significativas. As espécies causadoras de carvão apresentam estilo de vida biotrófico, dependente de uma íntima interação com o hospedeiro para completar seu ciclo de vida e produzir esporos (2n). O fungo Sporisorium panici-leucophaei (Spl) infecta e coloniza plântulas de Digitaria insularis, causando a doença denominada carvão do capim-amargoso. Apesar de possuir ciclo de vida semelhante à de outros carvões, poucas informações estão disponíveis sobre esse patossistema na literatura científica. O principal sintoma da doença causada por S. panici-leucophaei é mais semelhante ao carvão da cana-de-açúcar do que a de outras espécies de gramíneas. O desenvolvimento de uma estrutura em forma de chicote a partir do apex de plantas de capim-amargoso revelam potencial para comparar os patossistemas. Nesse sentido, o presente trabalho avaliou os padrões de colonização in planta, o ciclo de vida e formação de estruturas típicas penetração e colonização de S. panici-leucophaei. Além disso, o sequenciamento completo do genoma de S. panici-leucophaei foi concluído utilizando duas plataformas de sequenciamento distintas. A caracterização do ciclo de vida de S. panici-leucophaei in vitro foi concluída com a detecção das fases de germinação do esporo, formação do probasídio, formação de leveduras e geração da hifa dicariótica. Além disso, foi possível estabelecer quantitativamente o time-course de infecção in planta do patógeno através da germinação dos esporos 8 horas após a inoculação (hpi); formação do apressório às 48 hpi e detecção de hifas às 72 hpi. O genoma de S. panici-leucophaei foi concluído gerando uma montagem com 22 cromossomos mais o DNA mitocondrial. Além disso, 6,404 genes foram preditos, dos quais, 382 foram secretados juntamente com 66 genes candidatos a efetores, padrão similar ao encontrado para o fungo S. scitamineum. As análises genômicas comparativas com o genoma do carvão da cana-de-açúcar geraram os primeiros insights sobre o conteúdo gênico compartilhado e específico da espécie, além de fornecer informações úteis sobre um patógeno de planta pouco estudado.

Introdução: O hiperaldosteronismo primário (HP) é a causa mais comum de hipertensão arterial sistêmica (HAS) secundária, com prevalência de até 21% em pacientes com HAS resistente. Na última década, foram feitos consideráveis avanços na compreensão da patogênese do HP. Variantes patogênicas somáticas nos genes de canais iônicos KCNJ5, CACNA1D, ATP1A1 e ATP2B3, envolvidos na manutenção da homeostase iônica intracelular, foram descritas em 38%, 9,3%, 5,3% e 1,7% dos tumores, respectivamente. Variantes patogênicas somáticas no gene CTNNB1, fundamental para o desenvolvimento do córtex da suprarrenal, foram também identificadas em aproximadamente 5% dos aldosteronomas. Mais recentemente, uma variante germinativa no gene CACNA1H, que codifica a subunidade Alfa1H do canal de cálcio Cav 3.2, foi identificada em um paciente com aldosteronoma. Objetivos: O objetivo geral desse projeto foi investigar as bases genéticas do HP causado por aldosteronoma. Os objetivos específicos foram: 1) Investigar variantes patogênicas somáticas nos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 em aldosteronomas de indivíduos com HP; 2) Sequenciar o exoma (pareado sangue e tumor) dos casos de HP causados por aldosteronoma, negativos para variantes nos genes citados acima; 3) Correlacionar o genótipo com os parâmetros clínicos e hormonais dos pacientes com aldosteronomas. Métodos: As regiões hot-spot dos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 foram sequenciadas por Sanger em 62 tumores [56% mulheres; mediana de idade ao diagnóstico 50 anos (variação, 20 a 68)]. Pacientes sem variantes patogênicas somáticas nos genes descritos acima foram submetidos a genotipagem do exoma (pareado sangue e tecido) por sequenciamento paralelo em larga escala (HiSeq 2500, Illumina). Variantes germinativas raras (MAF < 0,01% no 1000 genomes, ExAC, gnomAD e AbraOM) em genes codificadores de canais iônicos ou associados a hiperplasia adrenal foram selecionadas para segregação familial. Resultados: Variantes patogênicas somáticas em heterozigose foram encontradas em 34 de 62 (54,8%) aldosteronomas. As variantes identificadas nos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 eram previamente conhecidas. Variantes patogênicas no KCNJ5 foram detectadas em 28 de 62 (45,2%) aldosteronomas. Duas variantes recorrentes foram encontradas: p.Gly151Arg em 13 de 28 (46%) e p.Leu168Arg em 14 de 28 (50%) tumores. A variante patogênica p.Glu145Gln do KCNJ5 foi identificada em um (4%) aldosteronoma. Adicionalmente, a variante patogênica p.Leu104Arg do ATP1A1 foi detectada em 2 (3,2%) aldosteronomas; a variante patogênica p.Leu425_Val426del do ATP2B3 em um (1,6%) caso e a variante patogênica p.Ser45Pro do CTNNB1 em 2 (3,2%) aldosteronomas. Uma nova variante p.Leu276Pro somática em heterozigose no CACNA1D foi identificada em um aldosteronoma no exoma e classificada como provavelmente patogênica. Aldosteronomas com variantes patogênicas no KCNJ5 foram diagnosticados mais frequentemente em mulheres (p= 0,047) e em idades mais jovens (p= 0,002) quando comparado com tumores sem variantes no KCNJ5. O tamanho do nódulo foi maior em aldosteronomas com variantes patogênicas no KCNJ5 (p= 0,0001). O percentual de pacientes com tempo de HAS < 5 anos foi similar nos dois grupos. A remissão pós-operatória da HAS foi observada em 50% dos pacientes com tumor contendo variante patogênica no KCNJ5, enquanto apenas 15% dos pacientes com tumor sem variante no KCNJ5 tiveram remissão da HAS (p= 0,003). Na análise multivariada, somente a presença de variante patogênica somática no KCNJ5 foi um preditor independente de remissão da HAS (p= 0,03). Após filtragem das variantes encontradas no sequenciamento exômico, quatro variantes germinativas missense em heterozigose foram consideradas deletérias em mais de 3 algoritmos de predição in silico: 1) uma nova variante (p.Pro559Thr) no gene CACNA1H, já associado ao fenótipo de HP; 2) a variante p.Arg178Cys no gene CACNA1I, que codifica a subunidade Alfa 1I do canal Cav 3.3; 3) a variante p.Glu52Ala no gene ATP13A3, que codifica uma proteína transmembrana da família de proteínas ATPase do tipo P; 4) a variante p.Tyr507Ser no gene KCNC4, que codifica o canal de potássio Kv 3.4. Conclusão: Foi caracterizado o espectro de variantes patogênicas somáticas em uma coorte brasileira de tumores corticais adrenais produtores de aldosterona, bem como o impacto das variantes no KCNJ5 na predição de remissão da HAS após adrenalectomia. Além disso, foram identificados novos genes candidatos provavelmente relacionados a patogênese do HP causado por aldosteronomas Introduction: Primary aldosteronism (PA) is the most common form of secondary hypertension (HT), with a prevalence of approximately 20% in patients with resistant hypertension. In the last decade, somatic mutations in KCNJ5, CACNA1D, ATP1A1 and ATP2B3 genes, which are involved in maintaining intracellular ionic homeostasis and cell membrane potential, were described in 38%, 9.3%, 5.3% and 1.7% of aldosterone-producing adenomas (APAs), respectively. All these mutations lead to the activation of calcium signaling, the major trigger for aldosterone production. Additionally, somatic activating mutations in exon 3 of CTNNB1 gene, which is involved in the adrenocortical development, were identified in approximately 5% of APAs. More recently, the germline p.V1951G CACNA1H variant was described in a PA patient with an APA. Aims: To investigate the genetics of APAs. The specific aims of this study were: 1) To investigate somatic variants in KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 and CTNNB1 genes in APAs from PA patients; 2) To perform exome sequencing of PA patients caused by APAs without mutations in those genes already associated with PA; 3) To correlate genetic findings and clinical parameters. Methods: Hot-spot regions of KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 genes were sequenced by Sanger in 62 APAs [56% women; median of age at diagnosis 50 yrs (range, 20 to 68)]. We performed whole exome sequencing (HiSeq 2500, Illumina) in paired blood and tumor DNA samples from 10 unrelated subjects with PA caused by APAs without somatic mutations in hot-spot regions of KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 and CTNNB1.We searched for rare germline coding variants (MAF < 0.01% in 1000 genomes, ExAC, gnomAD and AbraOM) in ionchannel genes, which are expressed in normal adrenal tissue, or in genes previously related to adrenal hyperplasia. Results: Pathogenic somatic heterozygous variants were identified in 34 out of 62 (54.8%) APAs. KCNJ5 pathogenic variants were detected in 28 out of 62 (45.2%) APAs. Two recurrent variants were found in KCNJ5: the p.Gly151Arg in 13 out of 28 (46%) and the p.Leu168Arg in 14 out of 28 (50%) APAs. KCNJ5 pathogenic variant p.Glu145Gln was identified in one (4%) APA. In addition, the p.Leu104Arg ATP1A1 mutation was detected in two APAs (3.2%); the p.Leu425_Val426del ATP2B3 mutation in one APA (1.6%); and the p.Ser45Pro CTNNB1 mutation in two APAs (3.2%). The novel CACNA1D somatic heterozygous variant p.Leu276Pro (likely pathogenic) was identified by exome sequencing in one APA. APAs with KCNJ5 pathogenic variants were diagnosed more often in women (p= 0.047) and at younger ages (p= 0.002) when compared to APAs without KCNJ5 variants. Nodule size was larger in APAs with KCNJ5 pathogenic variants (p= 0.0001). The frequency of PA patients com HT duration < 5 yrs was similar in both groups. HT remission was observed in 50% of patients with APAs harboring KCNJ5 pathogenic variants, whereas only 15% of patients with APAs without KCNJ5 pathogenic variants had HT remission (p= 0.003). In multivariate analysis, only the presence of a KCNJ5 pathogenic variant was an independent predictor of HT remission (p= 0.03). After exome sequencing analysis, four germline missense heterozygous variants predicted to be pathogenic in >=3 in silico tools were selected: 1) the novel p.Pro559Thr variant in CACNA1H gene, previously associated with PA phenotype; 2) the p.Arg178Cys variant in CACNA1I gene, which encodes the Alpha 1I subunit of Cav 3.3 channel; 3) the p.Glu52Ala variant in ATP13A3 gene, which is a member of the P-type ATPase family of membrane transport proteins; and 4) the p.Tyr507Ser variant in KCNC4 gene, which encodes the voltage-gated potassium channel Kv 3.4. Conclusion: We have characterized the spectrum of somatic pathogenic variants in a Brazilian cohort of APAs, and evaluated the impact of KCNJ5 somatic pathogenic variants in predicting HT remission after adrenalectomy. In addition, we identified potential novel gene candidates in the pathogenesis of PA caused by APAs

As fissuras orofaciais não-sindrômicas (FO-NS) correspondem a 70% de todos os casos de FO, possuem etiologia complexa e pouco compreendida, sendo consideradas de herança multifatorial com forte influência de fatores genéticos e ambientais. Apesar de estudos de análise de ligação e associação apontarem vários loci de susceptibilidade às FO-NS, o componente genético ainda não está totalmente explicado. Fatores ambientais também possuem um importante papel na etiologia das FO, e alguns já foram replicados em várias populações. Fatores como exposição materna ao álcool, drogas, tabaco, medicamentos, desnutrição e baixo nível socioeconômico são alguns dos fatores já associados a esta condição. As infecções periodontais são comuns em mulheres grávidas e estão associadas a parto prematuro, baixo peso fetal e, mais recentemente, foram reportadas como fator de risco aumentado para FO-NS nos fetos. Adicionalmente, o avanço das tecnologias de sequenciamento do DNA melhorou exponencialmente a compreensão do microbioma humano e sua influência no estado de saúde e doença, e, mais especificamente, o conhecimento sobre o impacto do microbioma na gravidez. O objetivo deste projeto foi identificar novos fatores etiológicos genéticos e ambientais das FO-NS. Para isso, primeiramente, sequenciamos 68 genes candidatos a FO por sequenciamento de nova geração em 193 indivíduos com FO-NS familial. Nós encontramos enriquecimento significativo de variantes raras e patogênicas de perda de função nos indivíduos com FO-NS e observamos que essas variantes estão em genes intolerantes a esse tipo de mutação. Também reportamos novas variantes raras do tipo perda de função no gene ARHGAP29 e sua importância na susceptibilidade as FO-NS familiais. Além disso, sugerimos o uso de um ponto de corte baseado no escore pLI do banco de dados ExAC como parâmetro para priorizar variantes em estudos de FO-NS familiares, assumindo modelo de herança mono ou oligogênico. Adicionalmente, estudamos o microbioma oral de mães de crianças com FO-NS e mães de crianças sem malformações, utilizando o sequenciamento da subunidade 16S do rRNA das bactérias com o objetivo de verificar diferenças consistentes na composição do microbioma oral de mães de crianças com FO-NS, levando em consideração a presença ou não de doenças infecciosas periodontais maternas. A casuística foi composta de 6 mães de recém-nascidos de até 1 mês que apresentaram FO-NS ao nascimento e mães de crianças sem qualquer malformação congênita. As análises de alfa e beta diversidades não demonstraram diferença significativa na composição do microbioma oral de mães de crianças com FO-NS e mães de crianças controle, contudo observamos que o grupo com infecções periodontais possui a diversidade taxonômica mais abundante do que o grupo hígido. Em resumo, nesse estudo piloto não foi possível identificar alterações no microbioma oral como um fator etiológico das FO-NS. Novas análises em uma casuística maior são necessárias para a confirmação desse achado The non-syndromic orofacial clefts (nsOFC) correspond to 70% of all OFC cases, have complex etiology and are poorly understood, being considered multifactorial inheritance with a strong influence of genetic and environmental factors. Although linkage and association analysis studies point to several nsOFC susceptibility loci, the genetic component is not yet fully explained. Environmental factors also play an important role in OFC etiology, and some have been replicated in several populations. Factors such as maternal exposure to alcohol, drugs, tobacco, drugs, malnutrition and low socioeconomic status are some of the factors already associated with this condition. Periodontal infections are common in pregnant women and are associated with preterm birth, low birth weight and, more recently, have been reported as an increased risk factor for nsOFC in fetuses. Additionally, the advancement of DNA sequencing technologies has exponentially improved the understanding of the human microbiome and its influence on health and disease status, and, more specifically, knowledge about the impact of the microbiome on pregnancy. The objective of this project was to identify new genetic and environmental etiological factors of nsOFC. For this, we first sequenced 68 candidate genes by next generation sequencing in 193 individuals with familial nsOFC. We found significant enrichment of rare and pathogenic loss of function variants in individuals with nsOFC and we observed that these variants were in genes intolerant to this type of mutation. We also reported new rare loss-of-function variants in the ARHGAP29 gene and its importance in the liability of familial nsOFC. In addition, we suggested the use of a cutoff point based on the ExAC database pLI score as a parameter to prioritize variants in familial nsOFC studies, assuming a mono or oligogenic inheritance model. In addition, we studied the oral microbiome of 6 mothers of newborns up to 1-month-old with nsOFC and 6 mothers of newborns without congenital malformations using the 16S rRNA sequencing in order to verify consistent differences in the composition of the oral microbiome of mothers of children with nsOFC, taking into account the presence or absence of maternal periodontal infectious diseases. The analysis of alpha and beta diversities did not show a significant difference in the composition of the oral microbiome of mothers of nsOFC children and mothers of control children, however, we observed that the group with periodontal infectious diseases has more abundant taxonomic diversity than the healthy group. In summary, in this pilot study, it was not possible to identify alterations in the oral microbiome as an etiological factor of FO-NS. New analyzes in a larger cohort are necessary to confirm this finding

A infertilidade é uma doença do sistema reprodutivo considerada um problema de saúde pública global, afetando aproximadamente 15% dos casais e 7% dos homens. Falência espermatogênica primária é definida como incapacidade dos testículos produzirem espermatozoides, apesar do suporte hormonal adequado. Esse estudo é o primeiro a comparar dois grupos de pacientes com falência espermatogênica primária por meio da técnica array-CGH+SNP, utilizando a plataforma 4X180 (Agilent®). Adicionalmente, foram comparados os resultados obtidos por essa técnica com bancos de dados genômicos de expressão. Foram analisados vinte e três pacientes com falência espermatogênica primária, sendo sete com oligozoospermia extrema e dezesseis com azoospermia não obstrutiva, assim como seis homens comprovadamente férteis (grupo controle). A análise genômica foi realizada pelo software Nexus 8.0 e as análises de bancos de dados genômicos de expressão por meio do software Nexus Expression 3.0 com nível de significância de 5%. Os primeiros resultados evidenciaram diferenças de número e de tamanho das alterações genômicas (CNVs e LOHs) entre os dois grupos da amostra e o grupo controle, sendo a diferença do número de CNVs de perdas do grupo com oligozoospermia significativamente maior do que no grupo controle. O grupo de pacientes com azoospermia apresentou alterações genômicas de maior tamanho, entre 552pb a 11.3MB, quando comparado aos homens oligozoospérmicos e ao grupo controle. A análise descritiva permitiu identificação de um gene candidato a fenótipo de falência espermatogênica primária na região 12q21.1-q21.2, o gene GLIPR1L1. Por meio da análise individualizada, identificamos dois genes candidatos ao fenótipo de infertilidade, o SHH, localizado na região 7q21.3, e o TMEM184A, localizado na região 7p22.3. Foram também descritas oito novas regiões de CNVs e LOHs nos dois grupos da amostra, direcionando novos estudos para correlação entre genótipo e fenótipo. Infertility is a disease of the reproductive system and a global public health problem affecting approximately 15% of couples and 7% of men. Primary spermatogenic failure is defined as the inability of the testes to produce sperm although there is adequate hormonal support. This study is the first to compare two groups of patients with primary spermatogenic failure using array-CGH + SNP technique with the 4X180 (Agilent®) platform. Also, we compared the results obtained by this technique with genomic expression databases. Twenty-three patients with primary spermatogenic failure were analyzed, seven with extreme oligozoospermia and sixteen with nonobstructive azoospermia. We used six proven fertile men as a control group. Genomic analysis was performed by Nexus 8.0 software and analysis of genomic databases of expression was performed using the Nexus Expression 3.0 software with 5% significance level. Initial results showed differences in both the number and size of genomic alterations (CNVs and LOHs) between the two sampled infertility groups and the control group. The main difference was that the number of overall CNVs losses which was significantly higher in the oligozoospermia group than in the control group. The group of patients with azoospermia showed larger genomic alterations, between 552bp and 11.3MB size, compared to oligozoospermic men and the control group. A descriptive analysis was used to identify a candidate gene, GLIPR1L1, for the primary spermatogenic failure phenotype in the region 12q21.1-q21.2. Through individualized analysis, we identified two other candidate genes that may have a relationship with the infertility phenotype, SHH, located in the 7q21.3 region, and TMEM184A, located on the 7p22.3 region. Eight new areas of CNV and LOHs have also been described in the two sample groups, for more extensive genotype and phenotype correlative studies.

The inoculation with Azospirillum brasilense is one of the main strategies to supplement the inorganic inputs of nitrogen (N) and to increase the root development in maize. However, the beneficial inoculation effects are not always reached, which, in part, is due to genotypic variation in the plant host, resulting in different degrees of outcome. In this context, we aimed to study the genetic control and genomic prediction of maize traits related to the responsiveness to A. brasilense inoculation. For this, 118 maize hybrids were conducted under N stress and N stress plus A. brasilense treatments in controlled conditions over 2016 and 2017 seasons. We evaluated root and shoot traits and performed diallel analyses, association mapping, and genomic prediction methods considering 59,215 Single-Nucleotide Polymorphism (SNP) markers. Our results revealed a quantitative inheritance of the partnership-related maize traits, with both additive and non-additive genetic effects involved in the genetic control. Furthermore, several candidate genes were identified for the maize-A. brasilense association, especially with heterozygous (dis)advantage effects. In general, the prediction accuracies were higher mostly for the inoculated treatment compared to the non-inoculated. Finally, our findings enable a deeper understanding towards the genetic basis of the maize responsiveness to A. brasilense and may support plant breeders to establish selection strategies aiming the development of superior genotypes for this association. A inoculação com Azospirillum brasilense é uma das principais estratégias para suplementar os insumos inorgânicos de nitrogênio (N) e aumentar o desenvolvimento radicular do milho. No entanto, os efeitos benéficos da inoculação nem sempre são alcançados, o que, em parte, é devido à variação genotípica da planta hospedeira, que ocasiona diferentes graus de resultados. Neste contexto, nosso objetivo foi estudar o controle genético e a predição genômica de caracteres de milho relacionados à responsividade para a inoculação com A brasilense. Para isso, 118 híbridos de milho foram conduzidos sob estresse de N e estresse de N mais A brasilense em condições controladas nos anos de 2016 e 2017. Nós avaliamos características de raiz e parte aérea e realizamos análises dialélicas, mapeamento associativo e métodos de predição genômica considerando 59.215 marcadores Single-Nucleotide Polymorphism (SNP). Nossos resultados revelaram uma herança quantitativa das características do milho relacionadas à essa parceria, com efeitos genéticos aditivos e não-aditivos envolvidos no controle genético. Além disso, vários genes candidatos foram encontrados para a associação milho-A brasilense, especialmente com efeitos de (des)vantagens de heterozigotos. Em geral, as acurácias de predição foram mais maiores principalmente para o tratamento inoculado em comparação ao não inoculado. Finalmente, nossos resultados possibilitam uma compreensão mais aprofundada das bases genéticas da responsividade do milho à A. brasilense e podem auxiliar os melhoristas de plantas a estabelecerem estratégias de seleção visando o desenvolvimento de genótipos superiores para essa associação.

A tropical forage breeding program contains several peculiarities, especially when it involves polyploid species and facultative apomixis. Despite their importance, there is still a lack of information on genetic studies of critical forage traits and on the employment of genomic tools when compared to other crops and temperate forages. The genus Brachiaria is the most important for forage in tropical regions mainly beef production. The commercial species in this genus are excellent perennial forage, and the identification of superior genotypes depends on the selection of many characteristics under complex genetic control, with high cost and time-consuming evaluation. Therefore, the knowledge about uses and applications of classic and genomic tools in forage traits may be useful to support breeding programs and the development of new cultivars. In this context, the aim was to evaluate several different classic and genomic tools to be employed as selection strategies in a traditional tropical forage breeding program. A panel of tetraploid hybrids obtained from crossing Urochloa brizantha x Urochloa ruziziensis was phenotyped and genotyped to evaluate genetic parameters and perform genomic studies. The classic phenotypic analysis showed no clear trend of the importance of additive and non-additive genetics effects for agronomical and nutritional traits. The Mulamba and Mock index should be used in the univariate level, due to the promotion of a more balanced response to selection for all traits in the multivariate selection. In the genomic extraction and evaluations, the reads that were aligned to a \'mock\' reference genome, created from GBS data of the cultivar \'Marandu\', had more SNP discovered compared to the closest true reference genomes, Setaria viridis and S. italica. We recommended different thresholds of sample depth and genotype quality (GQ) to eliminate poor quality reads without introducing genotype bias. Cross-validation revealed that missing genotypes were imputed with a median accuracy of 0.85 using Random Forest algorithm to produce a complete genotype matrix, regardless of heterozygote frequency. The genome-wide association analysis (GWAS) revealed candidate genes associated with many tropical forage traits across all cutting seasons, which could be the first step toward marker-assisted selection (MAS). Moreover, our results suggest that accounting for allele dosage is essential, since the tetraploid level provided more information about the true biological state. Therefore, our findings revealed the complexity of the genetic architecture of Urochloa spp. traits and provided important insights towards the application of GWAS in polyploids species. The genomic selection analysis revealed that GBLUP-A (additive) and GBLUP-AD (additive + dominance) showed similar prediction abilities considering both single and multi-trait models. Conversely, combining GBLUP-AD and tetraploid information could improve the selection coincidence. Furthermore, the multi-trait validation scheme 2 (VS2), where one trait is not evaluated for some individuals, provided an increment of up to 30% to the prediction ability. Therefore, it is an useful strategy for traits with low heritability. Overall, all genomic selection models considered provided greater genetic gains than the phenotypic selection. Similarly, the allele dosage associated with additive, dominance and multi-trait factors increased the accuracy of genomic prediction models for interspecific polyploid hybrids. Finally, genomic tools should be used in forages breeding programs in order to reduce cost and time. Um programa de melhoramento de forragem tropical contém várias peculiaridades, especialmente quando se trata de espécies poliplóides e de apomixia facultativa. Apesar de sua importância, atualmente, faltam informações sobre estudos genéticos de características forrageiras e sobre o emprego de ferramentas genômicas quando comparadas a outras culturas e forragens de clima temperado. O gênero Brachiaria é o mais importante para formação de pastagens nas regiões tropicais, principalmente para produção de carne bovina. As espécies comerciais deste gênero são excelentes forrageiras perenes, e a identificação de genótipos superiores depende da seleção de muitas características sob controle genético complexo, com alto custo e avaliação demorada. Portanto, o conhecimento sobre usos e aplicações de ferramentas clássicas e genômicas em características forrageiras pode ser útil para apoiar programas de melhoramento e o desenvolvimento de novas cultivares. Nesse contexto, objetivou-se avaliar diversas ferramentas clássicas e genômicas a serem empregadas como estratégias de seleção em um programa tradicional de melhoramento de forrageiras tropicais. Um painel de híbridos tetraplóides obtidos do cruzamento Urochloa brizantha x Urochloa ruziziensis foi fenotipado e genotipado para avaliar parâmetros genéticos e realizar estudos genômicos. Para a análise fenotípica clássica, concluímos que não havia uma tendência clara da importância dos efeitos genéticos aditivos e não-aditivos para características agronômicas e nutricionais. O índice de Mulamba e Mock deve ser usado no nível univariado, devido à promoção de uma resposta mais equilibrada à seleção para todas as características na seleção multivariada. Na extração e nas avaliações genômicas, as leituras que foram alinhadas ao genoma de referência \'simulado\', criado a partir dos dados de GBS da cultivar \'Marandu\', tiveram a maior porcentagem de descoberta de marcadores SNP comparado aos genomas de referência mais próximos, Setaria viridis e S. italica. Recomendamos diferentes limiares de profundidade de leitura e qualidade de genótipo (GQ) para eliminar leituras de baixa qualidade sem introduzir viés de chamada de genótipo. A validação cruzada revelou que os genótipos ausentes foram imputados com uma precisão mediana de 0,85 pelo algoritmo Random Forest para produzir uma matriz genotípica completa, independentemente da frequência de heterozigotos. A análise de associação genômica ampla (GWAS) revelou genes candidatos associados a muitas características forrageiras tropicais, o que poderia ser o primeiro passo em direção à seleção assistida por marcadores (MAS). Além disso, nossos resultados sugerem que a contabilização da dosagem alélica é essencial, uma vez que o nível tetraploide fornece mais informações sobre o verdadeiro estado biológico. Portanto, nossos achados revelam a complexidade da arquitetura genética de características de Urochloa spp. e fornecem informações importantes para a aplicação de GWAS em espécies poliploides. A análise de seleção genômica revela que o GBLUP-A (aditivo) e o GBLUP-AD (aditivo + dominância) mostraram capacidades de predição semelhantes, considerando tanto os modelos simples quanto os multi-característica. Por outro lado, combinando-se GBLUP-AD e informação tetraploide foi possível melhorar a coincidência de seleção. Além disso, o esquema de validação multi-característica 2 (VS2), onde uma característica não é avaliada para alguns indivíduos, pode fornecer um incremento de até 30% da capacidade de previsão. Portanto, é uma estratégia útil para características com baixa herdabilidade. No geral, todos os modelos de seleção genômica considerados proporcionaram maiores ganhos genéticos do que a seleção fenotípica tradicional. Da mesma forma, a dosagem do alelo associado a fatores aditivos, de dominância e multicaracteres aumentou a acurácia dos modelos genômicos de predição para híbridos poliploides interespecíficos. Finalmente, ferramentas genômicas devem ser utilizadas em programas de melhoramento de forragens para reduzir custos e tempo.

Introdução: O reconhecimento de fatores genéticos como variável etiológica de condições típicas do desenvolvimento e as implicações psicológicas cognitivo-comportamentais que permeiam diversas problemáticas clínicas, faz da interdisciplinaridade uma prática efetivamente recomendável. A busca por genes de suscetibilidade para a função atencional tem evidenciado resultados inconsistentes, uma vez que se mostram inconclusivos quanto à variabilidade de genes candidatos implicados na etiologia desta condição cognitiva complexa. Objetivo: Investigar os processos neuropsicológicos atencionais de crianças com diferentes tipos de fissura labiopalatina relacionados à frequência de variantes no gene DRD4. Método: Participaram do presente estudo 150 probandos, de ambos os sexos, na faixa etária de 07 a 10 anos, formando os grupos: G1 com 50 participantes com fissura labiopalatina e dificuldades atencionais; G2, 50 participantes com fissura labiopalatina sem alterações atencionais; e, G3, com 50 participantes sem fissura labiopalatina, sem alterações atencionais. Os sujeitos foram submetidos à análise neuropsicológica da função cognitiva avaliada e para as análises moleculares no gene DRD4, foi coletada saliva. Os achados foram submetidos à estatística quantitativa por meio do teste Qui-quadrado e análise descritiva, sendo adotado o nível de significância de p0,05. Resultados: Os grupos constituídos foram homogêneos quanto ao sexo, idade e nível intelectual, com escores na média ou acima dela, tendo o predomínio da fissura transforame incisivo na composição amostral. Em todos os grupos o nível socioeconômico predominante foi baixo superior. No G1, o nível de atenção sustentada, quando comparado por tipo de fissura, o tipo pré-forame mostrou-se mais prejudicado em 60,8% e o transforame em 63,8%, nas classificações limítrofe e deficitário. O tipo transforame teve o desempenho mais rebaixado quanto à flexibilidade cognitiva e velocidade de processamento. Quando comparada a atenção alternada, houve diferença estatisticamente significante superior (p

A pigmentação dos olhos, cabelos e pele, bem como presença ou ausência de sardas, está entre os exemplos mais visíveis da variação fenotípica humana. O estudo da diversidade genética em genes de pigmentação tem beneficiado diferentes áreas do conhecimento, como a área da genética e antropologia forense, bem como a área relacionada a saúde e bemestar. Adicionalmente, a presença de estruturas secundárias na íris tem sido reportada como importante fator na percepção de cor de olho observada que um indivíduo pode ter referente a íris e também a fatores de risco para algumas doenças oculares, ainda que as bases genéticas envolvidas nestas características sejam pouco conhecidas. Os genes OCA2 e HERC2 representam dois genes associados à variação normal da pigmentação. Este trabalho avaliou a relação de polimorfismos nas regiões regulatórias e codificantes destes dois genes com os fenótipos de pigmentação e estruturas secundárias presentes na íris encontrados em uma amostra populacional de 340 indivíduos do estado de São Paulo, por meio de sequenciamento de nova geração. Análises de regressão logística e linear para as variáveis qualitativas e quantitativas da cor dos olhos e estruturas secundárias presentes na íris foram realizadas. 170 pontos de variação ao longo das regiões estudadas foram identificados, dos quais 18 estão associadas a pelo menos um fenótipo de pigmentação e estruturas secundárias presentes na íris. Destaca-se a existência de muitos polimorfismos que não se mostrara-se associados quando avaliados independentemente, porém foram associados quando analisados sob a ótica de interações epistáticas, considerada uma possível explicação para a variabilidade encontrada nestes fenótipos, principalmente aqueles intermediários, como a cor dos olhos verdes e mel. O uso de variáveis quantitativas para os olhos revelou pela primeira vez a associação do polimorfismo não sinônimo rs201872292 no gene HERC2 com olhos claros, independente do efeito do polimorfismo rs12913832. Ainda, a associação do polimorfismo rs58358300 localizado em um íntron do gene HERC2 com pigmentação da esclera, o que representa a primeira vez que um polimorfismo é associado a esta característica. Este foi o primeiro estudo no Brasil que se propôs a analisar polimorfismos genéticos em genes candidatos à variação normal da pigmentação humana com estruturas secundárias presentes na íris. Os resultados confirmam a hipótese de que polimorfismos dos genes OCA2 e HERC2 podem contribuir para a formação dos fenótipos clássicos de pigmentação de olhos, pele, cabelos e estruturas secundárias presentes na íris humana dos indivíduos da população brasileira. The pigmentation of the eyes, hair and skin, as well as the presence or absence of freckles, are amongst the most visible examples of human phenotypic variation. The study of genetic diversity in pigmentation genes has contributed greatly to the fields of forensics genetics, anthropological genetics and public health. In addition, the presence of iris features has been reported to influence the perception of overall iris color and also consists in risk factors for ocular diseases, although very little is known about the genetic basis of these traits. The OCA2 and HERC2 genes have been associated with normal variation of pigmentation in diverse populations. The present study evaluated the relationship of polymorphisms in the regulatory and coding regions of these two genes with the pigmentation phenotypes and iris features found in a population sample of 340 individuals from the state of São Paulo, Brazil, through next-generation sequencing. Logistic and linear regression analyzes for the qualitative and quantitative variables were performed. A total of 170 points of variation throughout the studied regions were identified, of which 18 were associated with at least one pigmentation phenotype when analyzed as qualitative and/or quantitative variables and iris features. It is worth mentioning that many associations that were not observed when evaluated independently, were indeed associated when analyzed from the perspective of epistatic effects, which is considered a possible explanation for the variability found in these phenotypes, especially those presented as intermediate, such as green and hazel eye colors. The use of quantitative variables to evaluate the eye color, acquired from photographs, revealed for the first time the association of the nonsynonymous mutation rs201872292 in the HERC2 gene with light eyes, independently of the effect of the rs12913832 polymorphism. We highlight the association of the polymorphism rs58358300 located in an intron of the HERC2 gene with sclera pigmentation, which was the first time that a polymorphism is associated with this feature. This was the first study in Brazil to analyze genetic polymorphisms in candidate genes related to normal variation of human pigmentation and iris features by next-generation sequencing. The results confirm the hypothesis that OCA2 and HERC2 genes may contribute to classic pigmentation phenotypes of eyes, skin, hair, freckles and iris features in the Brazilian population.

A perda auditiva hereditária é uma característica com grande heterogeneidade genética. Mais de uma centena de genes já foram relacionados com a audição e, com o advento do sequenciamento massivo em paralelo, novas variantes têm sido identificadas como candidatas a causar surdez hereditária. Porém, estudos funcionais para verificação do efeito das mutações candidatas são necessários. Modelos animais permitem estudos funcionais eficientes para confirmação do efeito de mutações em genes candidatos, sendo uma ferramenta poderosa para compreender melhor os efeitos genéticos, moleculares, fisiológicos e comportamentais destas alterações. Previamente, foi identificada em nosso laboratório uma mutação de sentido trocado em um gene que codifica um coativador nuclear como principal candidata a causar surdez hereditária em uma família de São Paulo. A função principal deste gene é regular positivamente a transcrição gênica mediada por receptores nucleares. Contudo, não há dados na literatura sobre a expressão e o papel deste gene no sistema auditivo. Desta forma, tivemos como objetivo principal investigar a expressão do gene candidato em sistemas mecanossensoriais de camundongo e zebrafish. Detectamos, por meio de RT-PCR, a expressão do RNAm na cóclea inteira e no órgão de Corti associado à estria vascular de camundongos com idades P4, P10 e P16. Posteriormente, experimentos de qRT-PCR mostraram maior expressão nos estágios P10 e P16, em relação ao estágio P4, com parcela significativa da expressão gênica concentrada no órgão de Corti associado à estria vascular. Com relação à proteína, foi detectada, por meio de ensaios de imunofluorescência, a sua expressão nos cortes histológicos de cóclea de camundongos P4, P10 e P14, em várias estruturas diferentes da cóclea: membrana basilar, membrana de Reissner, órgão de Corti, estria vascular, limbo espiral e gânglio espiral. Experimentos de hibridação in situ em zebrafish inteiro foram realizados e a expressão do RNAm foi observada na orelha interna de larvas com idade 3 e 5 dias pós-fertilização (dpf) e de juvenis com 5 e 7 semanas pós-fertilização (spf). Nossos experimentos forneceram dados inéditos que sugerem um papel conservado deste gene no desenvolvimento do sistema auditivo de camundongos e no desenvolvimento e fisiologia do sistema auditivo de zebrafish. Para investigarmos se a falta de expressão do gene afeta o sistema auditivo realizamos experimentos visando à edição gênica do gene candidato por meio do sistema CRISPR/Cas9 em zebrafish. Dada a dificuldade para a padronização da técnica, não obtivemos resultados conclusivos durante o período de estudo. Nosso trabalho mostrou pela primeira vez a expressão do RNAm e da proteína no sistema auditivo de modelos animais, o que é fundamental para reforçar o potencial papel da mutação na surdez hereditária identificada na família. Desta maneira, contribuímos para a delineação de futuros experimentos funcionais que elucidem o papel deste gene e da mutação correspondente no desenvolvimento e na fisiologia do sistema auditivo Hereditary hearing loss is a characteristic with high genetic heterogeneity. More than one hundred genes have been related to hearing and, with the advent of massive parallel sequencing, new variants have been identified as candidates for causing hereditary deafness. However, functional studies to verify the effect of candidate mutations are necessary. Animal models provide efficient functional studies to confirm the effect of mutations and candidate genes, being a powerful tool to understanding the genetic, molecular, physiological and behavioural effects of these genetic variants. Previously, a missense mutation in a gene coding a nuclear receptor coactivator has been identified in our laboratory as the main candidate for causing hereditary hearing loss in a family from São Paulo. The main function of this gene is to positively regulate gene transcription mediated by nuclear receptors. However, there is no data in the literature about its expression or about its function in the hearing system. Thus, we aimed to investigate its expression in mechanosensory systems of mice and zebrafish. Through RT-CPR, we have detected expression of the mRNA in whole cochlea and in organ of Corti associated to stria vascularis of P4, P10 and P16 mice. In addition, qRT-PCR revealed higher expression in P10 and P16 stages, compared to P4 stage, and that a significant fraction of the expression is concentrated in the organ of Corti associated to stria vascularis. Regarding the protein, immunofluorescence assays revealed expression of the coactivator in histological sections of P4, P10 and P14 mice cochlea, with fluorescencent signals in several structures: basilar mebrane, Reissner\'s membrane, organ of Corti, stria vascularis, spiral limbus and spiral ganglion. Whole-mount in situ hybridization assays were conducted in zebrafish, revealing the mRNA expression in the inner ear of 3 and 5 days-post-fertilization (dpf) larvae and of 5 and 7 weeks-post-fertilization (wpf) juveniles. Our experiments provided unprecedented data suggesting a conserved role of this gene in the development of the auditory system of mice and in the development and physiology of the auditory system of zebrafish. In order to investigate if the lack of the gene expression affects the auditory system, we performed experiments aiming genetic edition through CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Given the difficulty to standardize the technique, we could not obtain conclusive results during the study period. Our work has shown for the first time the expression of the candidate gene mRNA and protein in the auditory in animal models, which is fundamental to reinforce the potential role of the mutation in the hearing loss identified in the family. Thus, we have contributed to the delineation of future functional experiments that will unveil the role of the gene and its corresponding mutation in the development and physiology of the auditory system

The selection on genetic values predicted from markers could substantially increase the rate of genetic gain in animals by increasing accuracy of prediction and reducing generation interval, especially for difficult to measure traits, such as feed efficiency. Feed efficiency is the most important trait in animal production due to its impacts on cost of production and environmental factors. Many metrics measure the feed efficiency, such as ratio of gain to feed (FER), the ratio of feed to gain (FCR) and residual feed intake (RFI). Nevertheless, in ovine, no study with the aim of understand the genetic variants or the accuracy of genomic estimated breeding value (GEBV) for feed efficiency traits was published yet. Moreover, before to apply the genomic information, it is necessary to understand and characterized the population structure, for instance, by linkage disequilibrium (LD). Both genome-wide association studies (GWAS) and genomic selection (GS) leverage LD between marker and causal mutation. Based on the above considerations, the aim of this study was to map LD in ovine, characterized by Brazilian Santa Inês sheep; to search genetic variants for feed efficiency traits (FER, FCR and RFI) through GWAS; and to verify the accuracy of GEBV for RFI. In total, 396 samples (animals) of Longissimus dorsi muscle were collect. A high-density panel of SNP (Illumina High-Density Ovine SNP BeadChip®) comprising 54,241 SNPs was used to obtain the genotyping data. The phenotype data was comprised of 387 animals. The average LD between adjacent markers for two LD metrics, r² and |D\'|, were 0.166 and 0.617, respectively. The degree of LD estimated was lower than reported in other species and it was characterized by short haplotype blocks. Consequently, for genomic analyses, high-density panels of marker are recommended. Many markers were associated to feed efficiency traits in GWAS, mainly to RFI trait. Few candidate genes were reported in this study, highlighting NRF-1 (nuclear respiratory factor 1), which controls mitochondrial biosynthesis, the most important process responsible by a great fraction of the produced energy. Finally, we verified the accuracy of GEBV for RFI using few Bayesian regression models, and we found low accuracy, ranging from 0.033 (BayesB with π=0.9912) to 0.036 (BayesA), which might be explained by the low relationship among animals and small training population. A seleção com base nos valores genéticos genômicos preditos pode aumentar substancialmente a taxa de ganho genético em animais por meio do aumento da acurácia de predição e redução do intervalo de gerações, especialmente para características de difícil e/ou onerosa mensuração, como eficiência alimentar. A eficiência alimentar é uma das características mais importantes na produção animal devido principalmente aos seus impactos econômicos e ambientais. Muitas métricas representam a eficiência alimentar, por exemplo: a relação do ganho de peso e consumo alimentar (EA), a proporção do consumo alimentar e ganho de peso (CA) e o consumo alimentar residual (CAR). Em ovinos, nenhum estudo com o objetivo de buscar variantes genéticas ou verificar a acurácia do valor genético genômico estimado para eficiência alimentar foi publicado. Adicionalmente, antes de aplicar a informação genômica, é necessário compreender e caracterizar a estrutura da população, como por meio do desequilíbrio de ligação (LD). O estudo de associação genômica (GWAS) e seleção genômica (GS) consideram o LD entre marcador e a mutação causal. Com base nas considerações acima, o objetivo deste estudo foi mapear o LD em ovinos, caracterizado pela raça ovina Santa Inês; localizar variantes genéticas para as características de eficiência alimentar (EA, CA e CAR) utilizando a abordagem GWAS; e verificar a acurácia da estimação dos valores genéticos genômico para o CAR. No total, foram coletadas 396 amostras (animais) do músculo Longissimus dorsi, para posterior genotipagem utilizando o painel de alta densidade (Illumina High-Density Ovine SNP BeadChip®), compreendendo 54.241 SNPs. O banco fenotípico é composto por 387 animais. O LD médio entre marcadores adjacentes para duas métricas de LD, r² e |D\'|, foram 0,166 e 0,617, respectivamente. O grau de LD estimado foi menor que o relatado em outras espécies e foi caracterizado por blocos de haplótipos curtos. Consequentemente, para as análises genômicas são recomendados painéis de marcadores de alta densidade. No GWAS, foram encontrados muitos marcadores associados aos fenótipos, em especial, à característica CAR. Alguns genes candidatos foram relatados neste estudo, destacando-se o NRF-1 (fator respiratório nuclear 1), que controla a biossíntese mitocondrial, o processo mais importante responsável por grande parte da produção de energia. Finalmente, verificamos a acurácia do valor genético genômico estimado para o CAR usando modelos de regressão Bayesiana, e encontramos baixos valores para acurácia (0,033 a 0,036) o que pode ser explicado pelo baixo grau de relacionamento entre os indivíduos e tamanho reduzido da população de treinamento.

O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-α), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-α. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-α), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-α are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.

This thesis presents a more in-depth understanding of the interaction between the pathogenic fungus Sporisorium scitamineum and sugarcane, a disease known as \"cane smut\". The development of a long structure like a \"whip\" from the meristem of infected plants is the main characteristic of the disease, allowing the effective dispersion of teliospores in the field. Infected plants have a reduced sucrose content and juice quality, leading to considerable economic losses. In the first chapter, the gene expression profile of the pathogen during its development in planta - in the first moments of infection and after the emission of the whip - and in vitro was evaluated using the RNAseq technique. Were analyzed genes preferentially expressed in each condition, differentially expressed in comparison to its growth in vitro, and expressed only during interaction. The results allowed the identification of some potential pathogenicity mechanisms, active effectors and gene clusters expressed only during interaction. In the second chapter, the transient expression technique was used to determine the target cell compartment of some of the candidate effectors and to establish a viable protocol for the study of S. scitamineum proteins. The four putatively secreted genes most expressed during the initial moments of the interaction were fused to the gene encoding the fluorescent green protein (Citrine) and expressed in Nicotiana benthamiana. The results of confocal microscopy and westernblots indicated an accumulation of each candidate protein in the membrane, cytosol and/or nucleus, in addition to the occurrence of post-translational modifications. These data offer new study opportunities for the identification of plant proteins that interact with such effectors. In the third chapter, the transcriptional responses of sugarcane in the first moments of a compatible interaction and after the development of the whip were analyzed using again the data obtained from the dual RNAseq cane-smut. Among the main responses, was identified an increase in MADS-type transcription factors expression, indicating that the whip development may use a route similar to flowering, whose signaling seems to start as early as the colonization. In addition, whip development is accompanied by increased transcription of genes involved in energetic pathways, and hormones synthesis and signaling pathways. Genes encoding RGAs were differentially expressed and may be related to pathogen effector\'s recognition. In the fourth chapter, the metabolic profile of sugarcane was evaluated during disease progression, confirming that in the meristem of infected plants carbon allocation is channeled to energetic pathways, besides the regulation of several amino acids and changes in plant cell composition in response to whip development. Metabolomics approach also allowed the identification of a probable mycotoxin derived from S. scitamineum. The results obtained in this study contributed to increase the understanding of the interaction between S. scitamineum and sugarcane that is characterized by high complexity and specialization to the host, and can be used in a way to help the characterization of resistant varieties and contribute to the improvement of sugarcane with resistance to smut. Esta tese apresenta uma compreensão mais aprofundada da interação entre o fungo patogênico Sporisorium scitamineum e a cana-de-açúcar, doença conhecida como \"carvão da cana\". O desenvolvimento de uma longa estrutura similar a um \"chicote\" a partir do meristema de plantas infectadas é a principal característica da doença, permitindo a efetiva dispersão dos teliósporos no campo. As plantas doentes apresentam um teor reduzido de sacarose e qualidade do sumo, levando a perdas econômicas consideráveis. No primeiro capítulo, o perfil de expressão gênica do patógeno durante o seu desenvolvimento in planta - nos primeiros momentos da infecção e após a emissão do chicote - e in vitro foi avaliado utilizando a técnica RNA-Seq. Foram analisados os genes preferencialmente expressos em cada condição, diferencialmente expressos em relação ao crescimento em meio de cultura, ou expressos apenas durante a interação. Os resultados permitiram a elaboração de hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade, sobre os genes candidatos a efetores ativos e a identificação de agrupamentos de genes expressos apenas durante a interação. No segundo capítulo, para determinar o compartimento celular alvo de alguns dos efetores candidatos e estabelecer um protocolo viável para o estudo de proteínas de S. scitamineum foi utilizada a técnica de expressão transiente. Os quatro genes mais expressos durante os momentos iniciais da interação que fazem parte do secretoma do fungo foram fusionados ao gene que codifica a proteína verde fluorescente (Citrina) e expressos em Nicotiana benthamiana. Os resultados de microscopia confocal e westernblots indicaram um acúmulo de cada uma das proteínas candidatas na membrana, citosol e/ou núcleo, além da ocorrência de modificações pós-traducionais. Esses dados oferecem novas oportunidades de estudo para a identificação de proteínas vegetais que interagem com tais efetores. No terceiro capítulo, as respostas transcricionais da cana-de-açúcar nos primeiros momentos de uma interação compatível e após o desenvolvimento do chicote foram analisadas utilizando novamente os dados obtidos a partir do dual RNAseq cana-carvão. Entre as principais respostas da cana destacou-se um aumento da expressão de genes que codificam fatores de transcrição do tipo MADS, indicando que o desenvolvimento do chicote pode usar uma rota semelhante à do florescimento, cuja sinalização parece iniciar logo nos primeiros momentos de colonização. Além disso, o desenvolvimento do chicote é acompanhado pelo aumento da transcrição de genes envolvidos em vias energéticas, e vias de síntese e sinalização hormonal. Genes que codificam para RGAs foram diferencialmente expressos e podem estar relacionados ao reconhecimento de efetores. No quarto capítulo, foi avaliado o perfil metabólico da cana-de-açúcar durante a progressão da doença, confirmando que no meristema de plantas infectadas ocorre um aumento da alocação de carbono em vias energéticas, além da regulação de vários aminoácidos e mudanças em relação à composição da parede celular em resposta ao desenvolvimento do chicote. A abordagem metabólica também permitiu a identificação de uma provável micotoxina derivada de S. scitamineum. Os resultados obtidos neste estudo contribuíram para aumentar a compreensão da interação entre S. scitamineum e a cana-de-açúcar que se caracteriza pela alta complexidade e especialização ao hospedeiro, e poderão ser utilizados de forma a auxiliar a caracterização de variedades resistentes e contribuir para o melhoramento da cana-de-açúcar com resistência ao carvão.

As síndromes mielodisplásicas (SMD) constituem um grupo heterogêneo de doenças hematológicas de origem clonal, caracterizado por hematopoese ineficaz, citopenia e risco de evolução para leucemia mieloide aguda (LMA). As anormalidades citogenéticas adquiridas são marcadores prognósticos bem estabelecidos em SMD. No entanto, a técnica de citogenética metafásica apresenta limitações, incluindo baixa resolução e necessidade de divisão celular, sendo que defeitos cromossômicos podem não ser detectados. Tecnologias baseadas em microarranjo (array) de DNA, como o Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-A), são importantes para avaliação do genoma normal e neoplásico. O SNP-A foi desenvolvido para o estudo de todo o genoma, apresenta uma resolução superior a citogenética metafásica convencional, pode ser realizado em células na interfase, e detecta alterações cromossômicas não visualizadas pela citogenética metafásica. Além disso, o SNPA fornece dados de genotipagem para detecção de perda neutra de heterozigose, também denominada de dissomia uniparental somática. Regiões cromossômicas com deleção, perda neutra de heterozigose ou ganho são comuns em pacientes com neoplasias hematológicas e sugeriu genes candidatos a supressores de tumor e oncogenes. O objetivo do presente estudo foi a caracterização da coorte de pacientes com suspeita clínica de SMD e o uso integrado do método de citogenética convencional e SNP-A no serviço de hematologia da nossa instituição na investigação de alterações citogenéticas em pacientes com SMD e doenças relacionadas. Durante o período do estudo, foram recebidas um total de 114 amostras de pacientes com suspeita clínica de SMD. A análise clínica, morfológica e citogenética permitiu confirmar o diagnóstico de SMD ou doenças relacionadas em 43 pacientes (SMD [n=34], SMD/NMP [n=5], LMA com alterações mielodisplásicas [n=4]). Vinte e um pacientes foram classificados como citopenia idiopática de significado indeterminado (CISI) e 50 indivíduos apresentaram outros diagnósticos. SNP-A foi realizado em 17 pacientes com SMD e doenças relacionadas. Dentre os pacientes selecionados para o SNP-A, anormalidades cromossômicas foram observadas em 6/17 (35%) casos pelo cariótipo convencional e em 8/17 (47%) casos pela técnica de SNP-A. SNP-A não detectou quatro alterações cromossômicas previamente identificadas pela citogenética convencional: duas translocações balanceadas e duas alterações numéricas. SNP-A confirmou os demais achados identificados pela citogenética convencional e detectou um total de 32 novas lesões (1 ganho, 19 perdas e 12 UPDs) em 6 pacientes com SMD ou doenças relacionadas. SNP-A pode complementar a citogenética convencional na detecção de anormalidades cromossômicas em neoplasias mieloides. Myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of clonal hematopoietic diseases, characterized by inefficient hematopoiesis, peripheral blood cytopenias and a risk to progress to acute myeloid leukemia (AML). Acquired chromosomal abnormalities have prognostic value in MDS. However, metaphase cytogenetics has some limitations including low resolution and the requirement of cell division, and chromosomal abnormalities may not be detected. New technologies based on array, the Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP-A), are able to evaluate the whole genome. The SNP-A has superior resolution compared to metaphase cytogenetics, may be used in interphase cells, and may detect chromosomal abnormalities not detected by metaphase cytogenetics. In addition, the SNP-A read-out includes genotyping calls and hybridization signal strength, corresponding to gene copy number, allowing detecting copy neutral loss of heterozigosity (CN-LOH), also known as uniparental dissomy (UPD). Deletions, copy neutral loss of heterozigosity or gain are frequent in patients with haematopoietic neoplasms and has already suggested the location of tumor suppressor genes and oncogenes. The aim of this study was to characterize the cohort of patients with clinical suspicion of MDS and to establish the integrative use of the conventional cytogenetic and the SNP-A in the investigation of chromosomal abnormalities in patients with MDS and related diseases followed at our institution. The clinical, morphological and cytogenetic evaluation allowed us to confirm the diagnosis of MDS or related disease in 43 patients (MDS [n=34], MDS/MPN [n=5], AML with myelodysplastic changes [n=4]). Twenty-one patients were diagnosed with idiopathic cytopenia with undetermined significance (ICUS) and 50 patients had other diagnosis. SNP-A were performed in 17 patients with MDS and related disease. Chromosomal abnormalities were observed in 6/17 (35%) cases by metaphase cytogenetics, and in 8/17 (47%) of the cases by SNP-A. SNP-A did not detected two balanced translocations and two numerical alterations previously observed by metaphase cytogenetics. SNP-A confirmed all the other findings observed by metaphase cytogenetics and SNP-A detected a total of 32 new lesions (1 gain, 19 losses and 12 UPDs) in 6 MDS and related diseases. SNP-A may complement metaphase cytogenetics to improve the detection of chromosomal abnormalities in myeloid neoplasms.

O Brasil é um dos principais produtores mundiais de Eucalyptus spp., mas a produção dessa cultura tem sido comprometida por perdas causadas pelo fungo Puccinia psidii Winter, agente causal da ferrugem do eucalipto. Compreender os mecanismos moleculares da patogenicidade desse fungo, conhecer a composição química de variedades de Eucalyptus spp. resistentes e suscetíveis ao fitopatógeno e ter em mãos uma ferramenta de diagnóstico precoce da doença são conhecimentos de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias de controle do fitopatógeno. Uma das principais barreiras que limitam o estudo molecular de P. psidii é o fato dessa espécie ser biotrófica obrigatória, tendo seu desenvolvimento in vitro limitado. Estudos de investigação a respeito de fungos biotróficos obrigatórios são realizados principalmente in planta e em estágios tardios da doença, deixando grande parte do conhecimento dos processos iniciais de infecção desconhecidos. Informações a respeito dos estágios iniciais da infecção, nos quais diversas estruturas típicas são formadas e podem indicar importantes características sobre fungos biotróficos, são de difícil acesso em estudos in planta em função da grande quantidade de material vegetal em relação à quantidade de material do fitopatógeno, que não é passível de ser removido completamente das amostras analisadas. Dessa forma, o presente projeto de pesquisa foi realizado com os objetivos de desenvolver um protocolo para induzir a germinação e a morfogênese estrutural in vitro de P. psidii, identificar genes candidatos relacionados à diferenciação das estruturas de infecção e de fatores de virulência, caracterizar os metabólitos presentes nas ceras cuticulares de folhas de Eucalyptus grandis resistentes e suscetíveis à ferrugem do eucalipto e desenvolver uma metodologia sensível e eficaz para detectar, quantificar e monitorar a presença de P. psidii em folhas de Eucalyptus grandis assintomáticas. Os dados obtidos no presente trabalho podem auxiliar a compreensão da interação planta-patógeno durante os estágios iniciais de infecção da ferrugem e colaboram para o entendimento da biologia do fitopatógeno para que no futuro sejam desenvolvidas melhores estratégias de controle de P. psidii em plantios de eucalipto. Brazilian production of Eucalyptus spp. is one of the greatest in the world but it has been affected by Puccinia psidii Winter, the causal agent of eucalyptus rust. The comprehension of molecular mechanisms of pathogenicity and chemical composition of resistant and susceptible eucalyptus plants as well as having a molecular tool for early detection of the disease in field can be used for the development of improved control strategies against this phytopathogen. Molecular studies of P. psidii is limited because it is an obligate biotrophic fungus with limited in vitro development. Biotrophic fungi investigations are made mainly in planta at late developmental stages of the disease. This way, most information of early stages of infection as the development of specialized structures of biotrophic fungi are little understood. The study of early stages of the infection process of biotrophic fungi in planta is hampered by the high amount of plant material in relation to fungi material which is difficult to be obtained in an isolated form for analysis. In this work we developed a protocol to increase in vitro germination and structural differentiation of P. psidii and used this protocol to obtain isolated fungi material for the identification of candidate genes related with virulence factors and initial structural morphogenesis. Moreover, we analyzed the composition of metabolites present in the cuticular wax of leaves from resistant and susceptible E. grandis plants and developed a methodology for the detection of P. psidii in asymptomatic leaves of Eucalyptus grandis. Data obtained in this work help the comprehension of E. grandis-P.psidii interaction at early stages of the infection process and can be used for the development of improved control strategies of eucalyptus rust.

The study of natural genetic variations affecting organogenic capacity in tomato (Solanum lycopersicum) is attractive due to the existence of several tomato wild relatives with enhanced organogenic capacity. The characterization of such variations is relevant not only in order to manipulate plant development, but also to understand its ecological and evolutionary significance. The objective of this work was to characterize three tomato loci whose alleles from the wild relative S. pennellii enhance in vitro shoot and root regeneration, and analyze their involvement in the acquisition of competence phase. In the first manuscript, we report the genetic and physiological characterization of the loci Rg3C, Rg7H and Rg8F. The S. pennellii alleles were introgressed into the tomato genetic model cv. Micro-Tom (MT), creating the near isogenic lines (NILs) MT-Rg3C, MT-Rg7H and MT-Rg8F. In the second manuscript we present a comparative analysis between the Near-Isogenic Lines (NILs) MT-Rg3C and MT-Rg1. Since Rg1 was proposed to be a key gene in the acquisition of competence, and was mapped in the chromosome three, it is believed that Rg3C is probably equivalent to the Rg1 allele from S. peruvianum. After the introgression of the loci into the MT background, the NILs presented enhanced regeneration of both roots and shoots, confirming that the loci were successfully introgressed. The analysis of the time for acquisition of competence and induction, together with the molecular characterization of the NILs, indicate that the genes present in the loci Rg3C, Rg7H and Rg8F affect in vitro regeneration by distinct pathways. While Rg3C decreased the time required for both acquisition of competence and induction, the other loci seem to influence only the time of acquisition of competence, in the case of Rg8F, or the time of induction, in the case of Rg7H. Additionally, although MT-Rg3C has an enhanced shoot branching phenotype, MT-Rg7H and MT-Rg8F did not differ from MT in this trait. This indicates that enhanced in vitro shoot formation in tomato is not necessarily related to a deleterious high branching phenotype. Comparative analyses of MT-Rg1 and MT-Rg3C strongly indicate that Rg1 and Rg3C are alleles of a same gene controlling regeneration capacity. Integrating Rg1 and Rg3C mapping information, we were able to narrow the number of candidate genes for Rg1/Rg3C to only 27, which were also analyzed and discussed. O estudo de variações genéticas naturais afetando a capacidade de organogênese in vitro em tomateiro (Solanum lycopersicum) é promissor devido a existência de uma série de espécies selvagens relacionadas ao tomateiro, que apresentam alta capacidade organogênica in vitro. A caracterização de tais variações é relevante não apenas com o objetivo de manipulação do desenvolvimento vegetal, mas também com o intuito de entender o significado ecológico e evolutivo de tal característica. O objetivo desse trabalho foi caracterizar três loci de tomateiro, cujos alelos vindos de seu parente selvagem S. pennellii aumentam a capacidade de regeneração de gemas caulinares e radiculares in vitro, e analisar o envolvimento de tais loci na fase de aquisição de competência para regeneração. Nós apresentamos no primeiro capítulo a caracterização genética e fisiológica dos loci Rg3C, Rg7H e Rg8F. Os alelos de S. pennellii foram introgredidos na cultivar modelo Micro-Tom (MT), criando as linhagens quase isogênicas (Near Isogenic Lines - NILs) MT-Rg3C, MT-Rg7H e MT-Rg8F. No segundo capítulo nós analisamos comparativamente as NILs MT-Rg3C e MT-Rg1. Uma vez que Rg1 foi proposto como gene chave na aquisição de competência, e assim como Rg3C está localizado no cromossomo 3, acredita-se que Rg3C seja provavelmente ortólogo ao gene Rg1 de S. peruvianum. Após a introgressão dos loci na cultivar MT, as NILs, assim como esperado, apresentaram alta taxa de regeneração tanto de gemas caulinares, quanto de radiculares in vitro, confirmando que os loci foram devidamente introgredidos. A análise do tempo de aquisição de competência e indução, juntamente com a caracterização molecular das NILs, indicam que os genes localizados nos loci Rg3C, Rg7H e Rg8F afetam a regeneração in vitro através de rotas distintas. Enquanto Rg3C diminui o tempo necessário tanto para a aquisição de competência quanto para indução de gemas caulinares, os outros dois loci parecem influenciar apenas a aquisição de competência, no caso de Rg8F, ou a indução de gemas caulinares, no caso de Rg7H. Além disso, apesar de MT-Rg3C apresentar alta ramificação, MT-Rg7H e MT-Rg8F não diferiram de MT nesse aspecto, o que evidencia que a formação de gemas caulinares in vitro não está necessariamente relacionada ao aumento da ramificação. As análises comparativas entre MT-Rg3C e MT-Rg1 indicam fortemente que Rg1 e Rg3C sejam dois alelos de um mesmo gene controlando a alta capacidade de regeneração. Através do cruzamento dos dados de mapeamento disponíveis para esses dois alelos foi possível diminuir o número de genes candidatos à Rg1/Rg3C para apenas 27 genes, que são apresentados nesse trabalho.

Introdução: A investigação de genes associados a doenças complexas em estudos caso-controle, baseada na frequência de variantes polimórficas, pode não ser adequada na presença de estratificação populacional advinda da mistura étnica, que é uma das características da população brasileira. Torna-se, portanto, difícil utilizar esta metodologia, pelo risco de associações espúrias devido às diferenças no background genético dos indivíduos casos e controles. Marcadores informativos de ancestralidade (AIMs) podem ser aplicados para estimar ancestralidade e corrigir estas distorções. As mesmas variantes genéticas de susceptibilidade para o diabetes tipo 1 autoimune (DM1A) como os alelos HLADR3- DR4 e os polimorfismos do PTPN22, CTLA4 e VNTR-INS presentes em caucasianos não foram sempre encontradas com a mesma frequência na nossa população com DM1A, ou conferiram risco menor quando presentes. Tais diferenças podem advir da nossa miscigenação. Portanto, no presente estudo, objetivou-se: 1) Analisar uma amostra de portadores de DM1A da cidade de São Paulo e controles não diabéticos, utilizando marcadores genéticos autossômicos de ancestralidade, identificando os componentes ancestrais individuais e os da população, permitindo assim, maior compreensão da sua potencial estratificação; 2) Verificar o papel dos alelos do sistema HLA-DR e DQ, dos polimorfismos dos genes PTPN22, CTLA4 e INS-VNTR, na predisposição à doença, corrigindo para o viés introduzido pela estratificação da nossa população. Materiais e métodos: 915 pacientes com DM1A, idade de 24,6±13,0 anos, 81,7% autorreferidos brancos e 789 controles, idade 28,5 ± 11,5 anos, 65,6% autorreferidos brancos participaram do estudo. A genotipagem dos 93 marcadores informativos de ancestralidade foi realizada por meio da plataforma BeadXpress (Illumina, EUA). A composição ancestral dos indivíduos foi caracterizada pelo programa Structure 2.3, e os alelos e variantes dos genes candidatos, testados por meio de análise structured association, utilizando o programa STRAT. Resultados: A ancestralidade européia prevaleceu no grupo de pacientes com DM1A e nos controles, (77% e 71%, respectivamente), seguida pela africana e ameríndia. Os alelos - DRB1*0301, -DR4 (subtipos -*0401, -*0402, -*0405) e - DR*09, e os alelos DQB1*0201 e -*0302 foram confirmados como predisponentes, mesmo após a correção para a estrutura de nossa população, assim como os alelos protetores- DRB1 (*0302, -*07, -*10, -*11, -*13, -*14 e -*15) e -DQB1 (*0402, -*0503, -*0602 e -*0603). Os haplótipos DRB1*0301/DQB1*0201, - *0401/0302, -*0402/0302, -*0405/0302, -*09/0202 predominaram no grupo DM1A, enquanto -*0302/0402, -*07/0202, -*10/0501, -*11/0301, -*11/0602, - *13/0603, -*14/0503 e -*15/0602 conferiram proteção. A correção para estratificação evidenciou o alelo DRB1*16 e o haplótipo -*07/0201 como de proteção e o DQB1*0501, que inicialmente era de proteção, como neutro. Também confirmou o haplótipo -*09/0202, como de risco e o -*0302/0402, de proteção, à semelhança do observado em afro-americanos. Os haplótipos - *10/0501, -*11/0602 e -*13/0603, protetores na nossa população e em afroamericanos, foram neutros nos caucasianos. A susceptibilidade determinada pelos genótipos I/I do INS VNTR e CT + TT do gene PTPN22 foram confirmadas após correção para estrutura populacional. O polimorfismo CTLA4 rs231775A > G não pôde ser avaliado. Conclusão: Evidenciamos diferenças nas variantes genéticas de susceptibilidade e proteção ao DM1A na nossa população em relação às caucasianas e afroamericanas, possivelmente decorrentes da mistura étnica. A correção para a estrutura populacional foi importante para confirmar a característica de proteção conferidas pelo alelo -DRB1*16 e haplótipo -*07/0201 Introduction: The investigation of genes associated with complex diseases in case-control studies, based on the frequency of polymorphic variants, may not be appropriate in the presence of population stratification arising from the ethnic admixture, which is characteristic of the Brazilian population. It is therefore difficult to apply this method, due to the risk of spurious associations related to differences in the genetic background of individual cases and controls. Ancestry informative markers (AIMs) can be used to estimate ancestry and correct these distortions. The same genetic variants of susceptibility to type 1 autoimmune diabetes (T1AD) like HLA- DR3 -DR4 alleles and polymorphisms in PTPN22, CTLA4 and VNTR-INS genes usually present in caucasians were not always found at the same frequency in our population with T1AD, or conferred lower risk when present. These discrepancies may result from our miscigenation. Therefore, in this study, we aimed to: 1) analyze a sample of patients with T1AD and health controls, mostly living in São Paulo, using genetic autosomal markers of ancestry, to identify the ancestry of individual components and of the population, that could identify its potential stratification; 2) Evaluate the role of HLA-DR and -DQ alleles and polymorphisms of PTPN22, CTLA4 and INSVNTR genes in the predisposition to disease, correcting for the bias introduced by the stratification of our population. Methods: 915 patients with T1D, aged 24.6±13.0 years, 81.7% self-reported as white and 789 controls, aged 28.5±11.5 years, 65.6% self-reported as white participated of the study. Genotyping of 93 informative markers was performed by BeadXpress platform (Illumina, USA). The ancestry composition of individuals was characterized by Structure 2.3 program, and variants and alleles of candidate genes were tested using structured association analysis with the STRAT program. Results: The european ancestry prevailed in T1AD and control groups (77% and 71%, respectively), followed by african and amerindian. The -DRB1*0301, -DR4 (subtypes -*0401, -*0402, -*0405) and -DR*09 alleles as well as -DQB1 *0201 and -*0302 alleles were confirmed as predisposing to T1AD, even after correcting for the structure of our population. The same was observed for the protective alleles: -DRB1 (-*0302, - *07, -*10, -*11, -*13, -*14 and -*15) and - DQB1 (-*0402, -* 0503, -*0602 and -*0603). HLA-DRB1*0301/DQB1*0201, - *0401/0302, -*0402/0302, -*0405/0302, -*09/0202 haplotypes predominated in T1AD group, while -*0302/0402, -*07/0202, -*10/0501, -*11/0301, -*11/0602, - *13/0603, -*14/0503 and -*15/0602 conferred protection. The correction for stratification evidenced DRB1*16 allele and -*07/0201 haplotype as protective and DQB1*0501, initially associated with protection, as neutral. This analysis also confirmed the -*09/0202, as a risk haplotype and -*0302/0402, -*10/0501, - *11/0602 and -*13/0603 as protective in our population, similar to reported in african-americans, although neutral in caucasians.The susceptibility to T1AD determined by INS VNTR I/I and PTPN22 CT+TT haplotypes were confirmed after correcting for population structure. The CTLA4 rs231775 A > G polymorphism could not be evaluated. Conclusion: We demonstrated differences in genetic variants associated with susceptibility and protection to T1AD in our population when compared to caucasian and african-american Abstract populations, possibly due to the ethnic admixture. The correction for the population structure was important to confirm the protection conferred by - DRB1*16 allele and -*07/0201 haplotype

A maioria dos casos de puberdade precoce central (PPC) em meninas permanece idiopática. A hipótese de uma causa genética vem se fortalecendo após a descoberta de alguns genes associados a este fenótipo, sobretudo aqueles implicados com o sistema kisspeptina (KISS1 e KISS1R). Entretanto, apenas casos isolados de PPC foram relacionados à mutação na kisspeptina ou em seu receptor. Até recentemente, a maioria dos estudos genéticos em PPC buscava genes candidatos selecionados com base em modelos animais, análise genética de pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico, ou ainda, nos estudos de associação ampla do genoma. Neste trabalho, foi utilizado o sequenciamento exômico global, uma metodologia mais moderna de sequenciamento, para identificar variantes associadas ao fenótipo de PPC. Trinta e seis indivíduos com a forma de PPC familial (19 famílias) e 213 casos aparentemente esporádicos foram inicialmente selecionados. A forma familial foi definida pela presença de mais de um membro afetado na família. DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico de todos os pacientes. O estudo de sequenciamento exômico global realizado pela técnica ILLUMINA, em 40 membros de 15 famílias com PPC, identificou mutações inativadoras em um único gene, MKRN3, em cinco dessas famílias. Pesquisa de mutação no MKRN3 realizada por sequenciamento direto em duas famílias adicionais (quatro pacientes) identificou duas novas variantes nesse gene. O MKRN3 é um gene de um único éxon, localizado no cromossomo 15 em uma região crítica para a síndrome de Prader Willi. O gene MKRN3 sofre imprinting materno, sendo expresso apenas pelo alelo paterno. A descoberta de mutações em pacientes com PPC familial despertou o interesse para a pesquisa de mutações nesse gene em 213 pacientes com PPC aparentemente esporádica por meio de reação em cadeia de polimerase seguida de purificação enzimática e sequenciamento automático direto (Sanger). Três novas mutações e duas já anteriormente identificadas, incluindo quatro frameshifts e uma variante missense, foram encontradas, em heterozigose, em seis meninas não relacionadas. Todas as novas variantes identificadas estavam ausentes nos bancos de dados (1000 Genomes e Exome Variant Server). O estudo de segregação familial em três dessas meninas com PPC aparentemente esporádica e mutação no MKRN3 confirmou o padrão de herança autossômica dominante com penetrância completa e transmissão exclusiva pelo alelo paterno, demonstrando que esses casos eram, na verdade, também familiares. A maioria das mutações encontradas no MKRN3 era do tipo frameshift ou nonsense, levando a stop códons prematuros e proteínas truncadas e, portanto, confirmando a associação com o fenótipo. As duas mutações missenses (p.Arg365Ser e p.Phe417Ile) identificadas estavam localizadas em regiões de dedo ou anel de zinco, importantes para a função da proteína. Além disso, os estudos in silico dessas duas variantes demonstraram patogenicidade. Todos os pacientes com mutação no MKRN3 apresentavam características clínicas e hormonais típicas de ativação prematura do eixo reprodutivo. A mediana de idade de início da puberdade foi de 6 anos nas meninas (variando de 3 a 6,5) e 8 anos nos meninos (variando de 5,9 a 8,5). Tendo em vista o fenômeno de imprinting, análise de metilação foi também realizada em um subgrupo de 52 pacientes com PPC pela técnica de MS-MLPA, mas não foram encontradas alterações no padrão de metilação. Em conclusão, este trabalho identificou um novo gene associado ao fenótipo de PPC. Atualmente, mutações inativadoras no MKRN3 representam a causa genética mais comum de PPC familial (33%). O MKRN3 é o primeiro gene imprintado associado a distúrbios puberais em humanos. O mecanismo preciso de ação desse gene na regulação da secreção de GnRH necessita de estudos adicionais Most cases of central precocious puberty (CPP) in girls remain idiopathic. The hypothesis of a genetic cause has been strengthened after the discovery of some genes associated with this phenotype, particularly those involved with the kisspeptin system (KISS1 and KISS1R). However, genetic defects in KISS1 and its receptor are rare and have been identified in only a few patients with CPP.over the past years. To date, most genetic studies in CPP was based mainly on a candidate gene approach, including genes selected in animal studies, human models of patients with hypogonadotropic hypogonadism or in genome wide association studies. In the present study, we used whole exome sequencing, a more advanced method of sequencing, to identify variants associated with CPP. Thirty-six patients with the familial form of CPP (19 families) and 213 apparently sporadic cases were initially selected. The familial form was defined by the presence of more than one member affected in the family. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes in all patients. Whole exome sequencing performed by ILLUMINA technique in 40 members of 15 families with CPP, identified inactivating mutations in a single gene, MKRN3, in five out of these families. Analysis of MKRN3 mutations performed by automatic sequencing in two additional families (four patients) identified two novel mutations. MKRN3 is an introless gene located on chromosome 15, in the Prader Willi syndrome critical region, and it is expressed only by the paternal allele due to the maternal imprinting. Following the initial findings, we searched for MKRN3 mutations in 213 patients with apparently sporadic CPP using polymerase chain reaction followed by direct enzymatic purification and automated sequencing (Sanger). Three new mutations and two previously reported, including four frameshifts and one missense variant was identified in six unrelated girls with CPP. All variants were not described in the two databases (1000 Genomes and Exome Variant Server). The familial segregation analysis performed in three out of these girls with apparently sporadic CPP and MKRN3 mutations confirmed the autosomal dominant inheritance with complete penetrance and exclusive transmission through the paternal allele, revealing familial inheritance in apparently sporadic cases. Most of these MKRN3 mutations were frameshifts or nonsense, leading to premature stop codons and truncated proteins, thus demonstrating positive genotype- phenotype correlation. The two missense mutations (p.Arg365Ser and p.Phe417Ile) identified were located within zinc finger motifs, regions predicted to be essential for the protein function. Besides that, all missense mutations were predicted to be pathogenic by in silico analysis. All patients carrying MKRN3 mutations exhibited typical clinical and hormonal features of premature activation of the reproductive axis. The median age of puberty onset was 6.0 years in girls (ranging from 3.0 to 6.5) and 8.0 years in boys (ranging from 5.9 to 8.5). In view of the imprinting phenomenon, methylation analysis was also performed in a subgroup of 52 patients with CPP by MSMLPA technique, but no methylation abnormalities were detected. In conclusion, our work has identified a new gene associated with CPP. Currently, inactivating mutations in MKRN3 represent the most common genetic cause of familial CPP (33%). MKRN3 is the first imprinted gene associated with pubertal disorders in humans. However, its precise mechanism of action in the regulation of GnRH secretion needs further studies

A grelina é um hormônio potente de ação central e periférica, que possui um importante papel na regulação do apetite, consumo alimentar e balanço energético. Fatores genéticos têm sido estudados para explicar as alterações do comportamento alimentar nestes pacientes e os polimorfismos do gene da grelina humana (GHRL) têm sido investigados como importantes fatores de risco para estas doenças, mas os achados ainda são inconclusivos. O presente trabalho objetivou avaliar os polimorfismos do sistema grelina relacionados aos genes GHS-R e MBOAT4 e seu envolvimento na etiologia dos TA no Brasil. Foram coletadas amostras de sangue (10 ml) de 128 indivíduos (76 pacientes e 52 controles) para a análise genética (extração do DNA genômico e posterior genotipagem através do PCR tempo real), e realizadas outras avaliações: psiquiátrica, clínica e nutricional e revisão de prontuário. Não foi encontrada associação entre a frequência dos genótipos do SNP rs495225 no gene GHS-R e dos genótipos do SNP rs10096097 no gene MBOAT4 e os diagnósticos de AN, BN e TCA. Estes genes são fortes genes candidatos para a obesidade e outros distúrbios da alimentação em virtude de suas funções biológicas e localizações, no entanto, outros estudos são necessários para esclarecer se suas variantes podem interferir na regulação do apetite e/ou possam ser um fator de risco para o desenvolvimento dos TA. Não há registro, até o momento; desta investigação ter sido realizada anteriormente na população brasileira Ghrelin is a potent hormone, and has central and peripheral action that has an important role in the regulation of appetite, food intake and energy balance. Genetic factors have been studying to explain the changes in feeding behavior in these patients and polymorphisms of the gene of human ghrelin (GHRL) are investigated as important risk factors for these diseases, but the findings are still inconclusive. This study aimed to evaluate the polymorphisms of ghrelin system related to GHS-R and MBOAT4 genes and their involvement in the etiology of eating disorders in Brazil. Blood samples were collected (10 ml) of 128 subjects (76 patients and 52 controls) for genetic analysis (extraction of genomic and subsequent DNA genotyping by real-time PCR), and evaluations: psychiatric, clinical and nutritional and review record. No association was found between the frequency of SNP rs495225 genotype in the GHS-R gene and SNP rs10096097 genotypes in MBOAT4 gene and AN, BN and TCA diagnostics. These genes are strong candidate genes for obesity and other eating disorders because of its biological functions and locations, however, further studies are needed to clarify whether its variants may interfere with the regulation of appetite and / or may be a risk factor for the development of ED. There is no record, to date; this investigation was done previously in Brazilian population

CONTEXTO: A doença de Alzheimer de início tardio (DAIT) representa a maior parte dos casos de doença de Alzheimer (DA). OBJETIVO: Revisar resultados relevantes para genes candidatos e de suscetibilidade para a DAIT. MÉTODOS: Revisão bibliográfica, a partir de 1990, empregando os bancos de dados PubMed e SciELO. RESULTADOS: Polimorfismos genéticos são mais relevantes para a DAIT que mutações, sendo que o alelo E*4 do gene APOE é o maior fator de risco conhecido até o momento. No entanto, outros genes vêm sendo investigados e existem dados disponíveis sobre a relação com DAIT para os genes da apolipoproteína CI, alfa-1-antiquimiotripsina, receptor sigma tipo 1, enzima conversora de angiotensina, alfa 2-macroglobulina, proteína relacionada ao receptor de LDL, interleucina 1 alfa e beta, paraoxonase, transportador de serotonina e receptores de serotonina. CONCLUSÕES: A DAIT tem etiologia multifatorial e um grande número de marcadores genéticos influencia em seu desenvolvimento. Essas variantes precisam ser investigadas na população brasileira, cuja formação étnica é distinta daquela de populações norte-americanas e europeias. Somente assim será possível a determinação do perfil genético de risco, que facilitará a detecção de indivíduos com maior probabilidade de desenvolver a doença.BACKGROUND: Late Onset Alzheimer's disease (LOAD) represents the majority of cases of Alzheimer's disease. OBJECTIVES: To review relevant results to candidate and susceptibility genes related to LOAD. METHODS: Bibliographic review, starting from 1990, utilizing PubMed and SciELO data banks. RESULTS: Genetic polymorphisms are more relevant for LOAD than mutations, and E*4 allele of APOE gene is the major risk factor known until now. Neverthless, other genes are being investigated and data are available about the relation with LOAD to the genes coding for apolipoprotein CI, antichymotrypsin, sigma receptor type 1, angiotensin converting enzyme, alfa 2-macroglobulin, LDL receptor related protein, interleucin 1 alfa and beta, paraoxonase, serotonin transporter and serotonin receptors. CONCLUSIONS: LOAD presents multifactorial etiology, and a broad number of genetic markers interferes with its development. They should be further pursued in the Brazilian population, in which ethnic background is distinct from North-american and European populations. Only with this data, a determination of the genetic risk profile will be feasible, and will improve the detection of the individuals at greater probability of developing the disease.

Tocoferóis, compostos com atividade de vitamina E (VTE), são antioxidantes lipofílicos sintetizados exclusivamente por organismos fotossintetizantes. A produção desses compostos ocorre a partir da ligação de um grupo cromanol a uma cadeia isoprênica, esta originada a partir de duas vias metabólicas possíveis: pela síntese de novo ou pela ativação do fitol liberado durante a quebra da clorofila, esta dependente de fitol quinase (VTE5). Conhecer os mecanismos responsáveis pela síntese e pelo acúmulo de vitamina VTE em plantas cultivadas é de grande interesse devido sua importância para a fisiologia vegetal e para a saúde humana. Frutos de tomate e seus derivados constituem fonte significativa de VTE na dieta humana. Para além da importância nutricional, o tomateiro emerge como um interessante modelo de estudo dos mecanismos regulatórios subjacentes à biossíntese de tocoferóis, visto que seu fruto combina uma ativa síntese de novo de isoprenóides juntamente com a degradação de clorofila durante o amadurecimento. Em estudo anterior, loci para caracteres quantitativos (QTL) para tocoferol em frutos foram identificados a partir da determinação dos níveis das isoformas α, β, μ e δ em uma população de linhagens introgredidas (ILs) de Solanum pennellii. Genes candidatos dentro dos intervalos dos QTL foram propostos, incluindo alguns relacionados à defitilação da clorofila e ao metabolismo fitol, CLOROFILASE (CLH) e um homólogo à VTE5, nomeado FARNESOL QUINASE (FOLK). Nesse contexto, o presente trabalho apresenta contribuições para o entendimento da regulação da biossíntese de VTE em tomateiro. Para tanto, adotaram-se diferentes abordagens, as quais incluem: a caracterização inicial da regulação transcricional dos genes envolvidos na biossíntese de tocoferóis ao longo do desenvolvimento de tomateiro; a exploração dos determinantes genéticos envolvidos no QTL para tocoferol a partir da análise do perfil transcricional de ILs; a análise integrada das mudanças do metabolismo de tocoferóis e outros isoprenóides em mutantes de tomateiro deficientes no amadurecimento e na degradação de clorofila; e, por fim, o estudo detalhado do metabolismo do fitol por meio da caracterização funcional dos genes codificantes para VTE5, FOLK e CLH(1). Os resultados obtidos fornecem valiosas informações sobre os mecanismos que controlam o acúmulo de VTE, além de expor inúmeras conexões entre o metabolismo de tocoferol e outras vias metabólicas que, em última análise, impactam a fisiologia de tomateiro Tocopherols, compounds with vitamin E activity, are lipid-soluble antioxidants exclusively synthesized by photosynthetic organisms. The formation of tocopherol involves the condensation of a chromanol group with an isoprenoid chain, derived from two possible metabolic pathways: from the de novo biosynthesis or from chlorophyll phytol tail recycling, which depends on phytol kinase (VTE5) activity. Understanding the mechanisms underlying synthesis and accumulation of vitamin E in crops is of great interest because of its implications for plant physiology and human health. Tomato fruit and its derivatives constitute a significant dietary source of VTE for humans. Beyond the nutritional value, tomato emerges as an interesting study model of the regulatory mechanisms underlying tocopherol biosynthesis, since fruit couples an active de novo synthesis of isoprenoids together with chlorophyll degradation along ripening. In a previous work, quantitative trait loci (QTL) for VTE content were identified in ripe fruits by tocopherol determination of α, β, μ and δ isoform levels in a population of Solanum pennellii introgression lines (IL). Candidate genes within QTL intervals were proposed, including some related to chlorophyll dephytylation and phytol metabolism, a CHLOROPHYLLASE (CLH) and a VTE5 homolog, named FARNESOL KINASE (FOLK). In this context, this work presents contributions to understanding the regulation of VTE biosynthesis in tomato. For this, different approachs were taken including: an initial characterization of transcriptional regulation of the genes involved in tocopherol biosynthesis along tomato development; the exploitation of genetic determinants involved in QTL for tocopherol from the transcriptional profile analyses of ILs; the integrated analyses of tocopherols metabolism changes and other isoprenoids in ripening impaired and chlorophyll degraded tomato mutants; and, finally, the detailed study of phytol metabolism by means of functional characterization of the genes encoding for VTE5, FOLK and CLH(1). Our results provide valuable insights into the mechanisms that control the VTE accumulation and also expose several cross-talks between the tocopherol metabolism and other metabolic pathways that, ultimately, impact on tomato physiology

A fim de contornar a problemática imposta pela recalcitrância da parede celular à hidrólise, o processo de produção de etanol a partir de biomassa vegetal requer um passo denominado de pré-tratamento, que consiste em tornar a biomassa mais acessível à ação de glicosil hidrolases que atacam a parede celular. O melhor conhecimento de processos de degradação de parede operados pela própria planta tem o potencial de direcionar as pesquisas em bioernegia, indicando quais os mecanismos mais eficientes para desmontar o complexo de polímeros da parede celular. Cunhado pré-tratamento biológico, este consiste na hidrólise de polissacarídeos estruturais empregando mecanismos e elementos chave de processos de degradação de parede celular que ocorrem na própria planta. Um exemplo de evento com esta característica é a formação de aerênquima lisígeno, que consiste na abertura de espaços de gás em tecidos parenquimáticos. A formação do aerênquima em cana-de-açúcar se dá de forma modular, sendo o processo constituído por seis etapas: 1) percepção do sinal inicial; 2) separação celular: 3) expansão celular; 4) morte celular programada; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. O presente trabalho teve como principal foco estudar a regulação das duas etapas iniciais, visando obter conhecimentos que possibilitem para tornar a biomassa de cana de açúcar menos resistente à penetração de enzimas. O aerênquima ocorre na raiz de cana-de-açúcar por um processo constitutivo. Sua independência de um indutor externo foi corroborada mediante tratamento com nutrientes e inibidor da percepção por etileno (1-MCP) pela análise dos cinco centímetros mais apicais da raiz. O atraso na formação do aerênquima após tratamento com nutrientes levou à expressão diferencial de genes relacionados à degradação de parede celular, morte celular programada e sinalização por etileno. Por outro lado, o 1-MCP não afetou visivelmente a formação do aerênquima, porém alterou o balanço hormonal na raiz. O padrão transcricional das raízes tratadas com 1-MCP revelou aumento da expressão de genes relacionados à expansão celular e estresse oxidativo. Tais padrões são discutidos à luz da regulação hormonal da formação do aerênquima através do estabelecimento de um balanço hormonal definido entre auxina e etileno. Ambos os experimentos levaram à seleção de quatro genes candidatos: dois fatores de transcrição (ScRAV1 e ScERF1) e duas glicosil hidrolases (ScEPG1 e ScARA1), sequenciados e analisados quanto à diversidade hom(e)óloga, sequências promotoras e estrutura gênica em comparação a S. bicolor. A topologia das reconstruções filogenéticas e a distribuição diferencial de sítios para RAV e ERF nos promotores de ScEPG1 e ScARA1 não parece refletir padrões de expressão distintos, visto que os diferentes hom(e)ólogos demonstraram ser igualmente expressos. Em sistema heterólogo, o fator de transcrição RAV apresentou atividade repressora sobre o promotor de ScEPG1. Tal papel de RAV sugere regulação negativa sobre a degradação da lamela média e sobre o processo de perda de adesão e separação celular. A identificação de reguladores-chave da formação do aerênquima consiste em importante elo entre a sinalização hormonal e a degradação de parede celular, possibilitando a melhor compreensão dos mecanismos de controle da degradação endógena de parede celular. Os dados produzidos possibilitam a aplicação biotecnológica dos genes sequenciados, além de consistirem em significativo avanço no conhecimento sobre a fisiologia do processo estudado e na dinâmica da regulação da expressão gênica acoplada a aspectos filogenéticos das sequências alvo. In order to circumvent the problems imposed by the cell wall recalcitrance to hydrolysis, the process underlying biofuel production requires a step called pretreatment, aimed at making biomass more accessible to the action of glycosil hydrolases that attack the cell wall. The increased knowledge of wall degradation processes operated by the plant itself has the potential to influence research in the bioernergy field, pointing out the most efficient mechanisms to disassemble the cell wall complex polymeric structure. The term coined biological pretreatment means taking advantage of key elements and mechanisms of cell wall degradation processes occurring in the plant itself in order to disassemble the entangled polysaccharide structure. One example of endogenous cell wall degradation process is the lysigenous aerenchyma formation, which consists in the opening of gas spaces in parenchyma tissue. The aerenchyma formation in sugarcane is thought to be a modular process that occurs in six steps: 1) target cells perception; 2) cell separation; 3) cell expansion; 4) programmed cell death; 5) hemicellulose hydrolysis and 6) cellulose hydrolysis. This work has as the main objective to study the regulation of the two initial steps, aiming at acquiring knowledge that would afford to turn biomass less resistant to enzyme penetration. The aerenchyma develops within the roots of sugarcane as a constitutive process. Its independence from an external inducer was corroborated in this work by subjecting sugarcane plants to treatment with nutrients and one inhibitor of ethylene perception (1-MCP) when the five more apical centimeters of the root were analyzed. After treatment with nutrients, the delayed aerenchyma formation led to differential expression of cell wall degradation-, programmed cell death- and ethylene signalling-related genes. Under visual inspection, 1-MCP did not show effect on aerenchyma development. Instead, it changed the hormone balance mainly in the two most apical root segments. The transcriptional pattern of 1-MCP treated roots revealed increased expression of cell expansion- and oxidative stress-related genes. Such patterns are discussed in the light of the hormone regulation of the aerenchyma development through the establishment of a balance between auxin and ethylene within root segments. Both experiments led to the selection of four two candidate genes, two transcription factors (ScRAV1 and ScERF1) and two glycosil hydrolases (ScEPG1 and ScARA1), that were sequenced and analyzed regarding homEURologous diversity, promoter sequences and gene structure compared to S. bicolor. The topology of the phylogenetic reconstructions and the differential distribution of sites for RAV and ERF within ScEPG1 and ScARA1 promoters did not reflect distinct expression patterns. Different hom(e)ologous of each target gene were equally expressed. In an heterologous system, RAV transcription factor interacted with ScEPG1 promoter, reducing the activity encoded by the reporter gene. This suggests the repressive role of RAV on pectin degradation within the middle lamella, leading to reduced cell adhesion and cell separation, possibly regulated by this glycosyl hydrolase. The identification of key regulators of the aerenchyma formation is an important link between hormone signaling and the wall degradation within the sugarcane roots. It enables a better understanding of control mechanisms underlying wall modifications when performed by the plant itself. Altogether, the data produced in this work allows biotechnological application of sequenced genes. Moreover, the produced data unveil key aspects regarding physiologycal aspects of aerenchyma development and highlights features related to the dynamics of gene expression in sugarcane coupled to the phylogenetic aspects of the four target sequences.

A teca é uma árvore de grande importância comercial pelas características de cor e durabilidade de sua madeira. Devido a sua rusticidade e fácil adaptação ao clima, plantios de teca tornam-se cada vez mais atrativos ao redor do mundo. Contudo, esta espécie apresenta escassez de estudos genéticos moleculares a respeito tanto de sua madeira, quanto de sua tolerância às variações ambientais. Uma vez que o transcriptoma pode apresentar grande quantidade de informação a respeito dos genes expressos por um conjunto celular, neste trabalho foi realizado o primeiro transcriptoma de teca, onde foram sequenciadas flores, folhas, raízes e seedlings pela tecnologia Illumina. A montagem do transcriptoma foi realizada com o programa Trinity acima de 100 milhões de reads e gerou mais de 400 mil contigs, os quais tiveram as anotações funcionais adquiridas com o programa Blas2GO. 51% dos contigs foram anotados, mostrando alta similaridade com as espécies Vitis vinifera e Solanum licopersicum; destes, 78% obtiveram anotações funcionais com o Gene Ontology, totalizando 5.165 termos para Processo Biológico, 2.846 termos para Função Molecular e 742 para Componente Celular. A expressão diferencial foi obtida com o programa edgeR a 5% de probabilidade de erro e mostrou que, para 187.315 contigs montados através da fusão de todas as bibliotecas sequenciadas, 18 mostraram expressão diferencial para flor, 14 para folha, 13 para raiz e 29 para seedling. Após a etapa de caracterização do transcriptoma, foi realizado um experimento de estresse por déficit hídrico em casa-de-vegetação, onde plantas de teca foram submetidas a estresse Moderado (40% de água no substrato por 20 dias), estresse Severo (20 a 40% de água por 30 dias) e tratamento controle (substrato saturado). As medições através de analisador de gases por infravermelho (IRGA) mostraram queda na fotossíntese (até 70% a menos do que o controle), na transpiração (até 77%) e na condutância estomática (até 85%) entre os tratamentos; além disto, o conteúdo relativo de água foliar caiu 13% entre o tratamento severo e o controle, e níveis de prolina livre foram até 3,5 vezes mais altos nos tratamentos de estresse. A temperatura foliar aumentou significativamente com o aumento da irradiância de fótons aplicada. A busca por genes relacionados ao estresse por déficit hídrico na biblioteca de transcritos de Raiz retornou 1.145 sequências, e destas, 4 foram caracterizadas: TgTPS (trealose 6-fosfato sintase), TgPIP (aquaporina, proteína intrínseca de membrana plasmática), TgDREB2 (proteína de ligação a elemento responsivo a desidratação) e TgAREB (proteína de ligação a elemento responsivo a ácido abscísico). Apenas TgTPS, TgPIP e TgDREB2 mostraram alto grau de conservação entre as espécies, podendo ser corretamente amplificadas via PCR e validadas por sequenciamento. Assim, com o banco de dados de transcritos obtido pelo RNA-seq, foi possível identificar genes candidatos ao estudo de características vegetativas e reprodutivas de teca, contribuindo para entender os mecanismos moleculares desta espécie florestal. Teak is a tree of great commercial importance by the characteristics of color and durability of its wood. Due to its hardiness and easy adaptation to climate, teak plantations become increasingly attractive around the world. However, this species has a lack of molecular genetic studies on both of its wood, as their tolerance to environmental variations. Once the transcriptome can provide lots of information about the genes expressed by a cell group, this work represents the first transcriptome teak, which were sequenced flowers, leaves, roots and seedlings by Illumina technology. The transcriptome assembly was performed with Trinity program above 100 million reads and generated more than 400,000 contigs, which have acquired the functional annotations with Blas2GO program. 51% of the contigs were annotaded, showing high similarity to Vitis vinifera and Solanum licopersicum; of these, 78% had functional annotations with the Gene Ontology, totaling 5,165 terms for Biological Process, 2846 terms for Molecular Function and 742 for Cell Component. The differential expression was obtained with the edgeR program at 5% probability of error and showed that for 187,315 contigs assembled by merging all sequenced libraries, 18 showed differential expression to flower, 14 to leaf, 13 to root and 29 for seedling. After this step of characterization of the transcriptome, we performed a stress experiment by water deficit at greenhouse, where teak plants were subjected to Moderate stress (40% of water in the substrate for 20 days), Severe stress (20 to 40% water for 30 days) and control treatment (saturated substrate). Measurements by infrared gas analyzer (IRGA) showed a decrease in photosynthesis (up to 70% less than the control), transpiration (up 77%) and stomatal conductance (up 85%) between treatments; furthermore, leaf relative water content dropped 13% between the treatment control and severe, and free proline levels were up to 3.5 fold greater in stress treatments. The leaf temperature increased significantly with increasing irradiance of photons applied. The search for genes related to stress by water deficit in the root transcripts library returned 1,145 sequences, and these, 4 were characterized: TgTPS (trehalose 6-phosphate synthase), TgPIP (aquaporin, protein intrinsic of plasma membrane), TgDREB2 (dehydration responsive element binding protein) and TgAREB (abscisic acid responsive element binding protein). Only TgTPS, TgPIP and TgDREB2 showed a high degree of conservation between species, and can be properly amplified by PCR and validated by sequencing. Thus, with the database of transcripts obtained by RNA-seq, candidate genes were identified for the study of vegetative and reproductive characteristics teak, helping to understand the molecular mechanisms of this forest species.

A pesquisa de variações no número de cópias (CNVs; copy number variants) cromossômicas tem revelado o importante papel destas alterações genômicas na diversidade populacional e na etiologia de doenças humanas. O modelo de associação de CNVs a doenças envolve deleções e/ou duplicações individualmente raras, mas com segmentos cromossômicos de tamanhos relevantes. Os pacientes com baixa estatura de início pré-natal constituem um grupo heterogêneo com quadros clínicos complexos frequentemente resultantes de alterações genéticas, que, desde o período intrauterino, perturbam os mecanismos e vias de desenvolvimento e crescimento fetais. Assim sendo, aventamos a hipótese de que CNVs raras possam estar entre as causas genéticas de baixa estatura de início prénatal. Para tanto, nosso estudo visou avaliar a presença de deleções ou duplicações submicroscópicas em um grupo selecionado de pacientes nascidos pequenos para idade gestacional (PIG) com baixa estatura persistente sem causa definida. Foram avaliados 51 pacientes nascidos PIG com baixa estatura persistente após o 4º ano de vida que apresentavam dismorfismos, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor (DNPM) ou deficiência intelectual, porém sem caracterizar síndromes conhecidas e com cariótipo normal. Amostras de DNA dos pacientes foram submetidas à hibridização genômica comparativa por microarray (aCGH; array comparative genomic hybridization) baseada em oligonucleotídeos na plataforma 60K. Os achados foram comparados com CNVs descritas em bancos de dados de controles normais. Foram identificadas 18 CNVs, ausentes em controles saudáveis, em 17 dos 51 pacientes (33%). As alterações foram avaliadas para classificação de sua patogenicidade de acordo com os seguintes critérios: 1) padrão de herança e segregação familiar; 2) sobreposição a coordenadas genômicas de síndromes conhecidas; 3) sobreposição a CNVs patogênicas descritas em banco de dados; 4) e conteúdo gênico. Quatro CNVs, encontradas em 3 pacientes, foram classificadas como patogênicas: 1) del 22q11.21; 2) dup 10q26.2-26.3 e del 10q26.3; e 3) del 4q28.2-q31.21. Cinco CNVs, encontradas em 5 pacientes, foram classificadas como provavelmente patogênicas: 4) del 3q27.1-q27.3; 5) del 20p13; 6) dup 14q11.2-q12; 7) dup 16q24.1-q24; e 8) dup Xq31.1-q13.2. Somando os grupos, encontramos CNVs patogênicas ou provavelmente patogênicas em 16% do total de pacientes. De acordo com a segregação familiar, 4 variações foram consideradas de significado clínico incerto, enquanto 5 foram benignas. Para estabelecer uma relação causal genótipo-fenótipo e identificar genes associados a baixa estatura de início pré-natal, foi realizada uma análise ampla do conteúdo gênico das variações classificadas como patogênicas, provavelmente patogênicas ou de significado clínico incerto, através do uso de efetivas ferramentas de bioinformática. Nossos resultados nos levam às seguintes conclusões: 1) a frequência de CNVs patogênicas e provavelmente patogênicas no estudo foi de 16%, evidenciando que CNVs raras provavelmente estão entre as causas genéticas de baixa estatura de início pré-natal; 2) o aCGH permitiu a elucidação do diagnóstico e das bases genéticas envolvidas no fenótipo em 8 pacientes selecionados; e 3) foram encontradas CNVs em diferentes regiões cromossômicas, com diferentes genes candidatos, que podem estar envolvidos nos mecanismos de regulação do crescimento e/ou nas vias regulatórias de desenvolvimento intrauterino Analysis of chromosomic copy number variants (CNVs) have demonstrated the important role of these genomic imbalances in population diversity and human disease. The model of CNV disease association involves deletions and/or duplications that are individually rare but encompass chromosomal segments of relevant size. Prenatal onset short stature patients constitute a complex group characterized by clinical heterogeneity. The causes of prenatal growth impairment frequently involve genetic changes that disturb the mechanisms and the pathways of fetal growth and development. Thus, we hipothesized that rare CNVs might contribute to the genetic etiology of prenatal onset short stature. In order to evaluate this assumption, our study analyzed the presence of submicroscopic deletions and/or duplications in a selected group of patients born small for gestational age with persistent short stature but without a recognized cause. A total of 51 patients with prenatal and postnatal growth retardation associated with dysmorphic features, developmental delay and/or intellectual disability, but without criteria for known syndromes, were selected. All patients had normal G-banded karyotyping. Array-based comparative genomic hybridization (aCGH) in a whole-genome 60K platform was performed using DNA obtained from all patients. Detected CNVs were compared with CNV data from healthy controls individuals, excluding common copy number polymorphisms. In 17 of the 51 patients screened (33%), 18 rare CNVs were identified. The pathogenicity of CNVs was assessed by considering the following criteria: inheritance and familial segregation; overlap with genomic coordinates for a known genomic imbalance syndrome; overlap with CNVs previously identified in other patients with prenatal onset short stature; and gene content. Four distinct CNVs, found in three patients, were classified as pathogenic: 1) del 22q11.21; 2) dup 10q26.2-26.3 and del 10q26.3; and 3) del 4q28.2-q31.21. Five CNVs, found in five patients, were classified as probably pathogenic: 4) del 3q27.1-q27.3; 5) del 20p13; 6) dup 14q11.2-q12; 7) dup 16q24.1-q24; and 8) dup Xq31.1-q13.2. Taken both groups together, we found pathogenic or probably pathogenic CNVs in 16% of patients. According to familial segregation, four variants were considered as variants of uncertain clinical significance, while five variants were considered as benign. In an attempt to establish a causal genotype-phenotype correlation and to identify genes involved in growth impairment of prenatal onset, the gene content of the variants was analyzed using bioinformatics tools for gene prioritization. Based on our results, it is possible to make the following conclusions: 1) the frequency of pathogenic or probably pathogenic CNVs was at least 16%, indicating that rare CNVs are probably among the genetic causes of prenatal onset short stature; 2) aCGH clarified the diagnosis and the genetic etiology involved in the phenotype of 8 selected patients; and 3) we found CNVs in distinct chromosomal regions with several candidate genes that may be involved in the mechanisms of growth regulation and/or in the regulatory pathways of intrauterine development

O transtorno bipolar (TB) possui alta prevalência na população mundial e causa perdas significativas na vida dos portadores. É uma doença com importante fator genético, cuja herança se caracteriza por mecanismos complexos de transmissão envolvendo múltiplos genes que estão sob influência de inúmeros fatores ambientais. Várias estratégias de investigação genética têm sido utilizadas para identificar genes determinantes de vulnerabilidade ao TB. Estudos com gêmeos, de ligação e de associação permitiram caracterizar a herdabilidade dessa doença, identificar regiões cromossômicas potencialmente associadas ao TB e avaliar a contribuição de genes candidatos na sua etiologia. Em virtude da complexidade do modo de transmissão do TB e de sua heterogeneidade fenotípica muitas dificuldades são encontradas na identificação desses genes. Paralelamente, estudos psicossociais apontam para fatores ambientais de relevância no desencadeamento do TB. Com a compreensão crescente dos mecanismos epigenéticos de controle da expressão gênica, incluindo a interação do genoma com fatores ambientais, e a abordagem dimensional dos transtornos mentais, abrem-se perspectivas promissoras de pesquisas futuras para elucidar os fatores envolvidos na manifestação do transtorno bipolar.Bipolar disorder (BD) is a highly prevalent mental disease worldwide. This disorder has a genetic inheritance characterized by complex transmission mechanisms involving multiple genes under the influence of several environmental factors. Many investigation strategies have been put forward in order to identify BD susceptibility genes. Twin, linkage and association studies have contributed to the characterization of its herdability through the identification of genomic regions potentially linked to BD and the candidate genes investigation approach. Because of the complexity of the transmission pattern for BD and its phenotypic heterogeneity many difficulties have emerged in defining exact bipolar susceptibility genes. On the other hand, psychosocial studies point out to relevant environmental factors in the etiology of BD. The increasing understanding of gene expression regulation by epigenetic mechanisms, including gene-environment interaction, and the dimensional approach to the mental disorders offer promissing directions to future researches in order to uncover the factors envolved in the etiology of Bipolar disorder.