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As primeiras células responsáveis pela percepção olfatória são os neurônios olfatórios (OSNs) presentes no epitélio olfatório (EO) da cavidade nasal, que reconhecem moléculas voláteis presentes no ar, denominadas odorantes, através de receptores específicos. Diferentemente de neurônios do sistema nervoso central (SNC), que estão relativamente protegidos de genotoxinas exógenas, OSNs estão em constante contato com agentes potencialmente genotóxicos, incluindo o oxigênio atmosférico. Além disto, em contraste com a maioria dos neurônios do SNC, OSNs são periodicamente repostos através de neurogênese adulta, portanto, possuem um tempo de vida menor do que outros neurônios. A função olfatória diminui durante o envelhecimento normal e patológico, através de mecanismos que ainda não estão totalmente claros. Em doenças neurodegenerativas, a perda do olfato é um dos sintomas iniciais e é utilizada como marcador de resposta a alguns tratamentos. Relações causais entre deficiências em reparo de DNA e neurodegeneração já foram demonstradas em vários modelos experimentais. No entanto, ainda não se sabe se alterações nessas vias contribuem para a perda olfatória observada nessas condições, provavelmente porque não há dados disponíveis na literatura sobre vias de reparo de DNA em OSNs. Por isso, o objetivo deste estudo foi caracterizar as vias de reparo de DNA presentes em populações de OSNs maduros e seus precursores. Analisamos dados de expressão de genes de reparo extraídos de dois transcriptomas diferentes, um relacionado à idade e outro, ao estágio de diferenciação destes neurônios. Em seguida, validamos os resultados obtidos da análise in silico através de PCR em tempo real utilizando amostras de EO de camundongos da linhagem C57BL/6J em duas idades (neonatos e com três semanas de idade). Nossos resultados indicam que OSNs são proficientes em todas as vias de reparo de excisão analisadas, apresentando expressão detectável de genes essenciais de cada via. A comparação entre populações enriquecidas em precursores ou em neurônios maduros, nas duas análises, sugere que a atividade de pelo menos quatro vias de reparo de excisão é menor em camundongos jovens, quando comparados aos neonatos, sugerindo, portanto, que há diminuição na expressão durante a diferenciação destas células. Esta observação vai corrobora com dados da literatura que mostraram que a expressão e atividade de proteínas de reparo em células proliferativas é maior do que em célulasterminalmente diferenciadas. Para testar a hipótese de que, por estarem em constante contato com agentes genotóxicos, OSNs acumulam mais lesões em DNA do que células no SNC, comparamos os níveis de lesões em DNA obtido de amostras de EO e de bulbo olfatório (BO), e de córtex temporal (CT), uma região cerebral que não apresenta taxas significativas de neurogênese e não expostas ao ambiente externo. A taxa de lesão foi calculada a partir de dados obtidos por PCR de longa extensão. Resultados obtidos utilizando EO, BO e CT de camundongos com três semanas de idade mostram que a amplificação em amostras de CT é muito menor do que em EO ou BO, sugerindo que neurônios do SNC acumulam mais lesões do que neurônios de regiões que apresentam neurogênese, mesmo que estas estejam constantemente expostas a agentes genotóxicos exógenos. Além disso, a eficiência de amplificação de fragmentos longos de DNA mitocondrial (mtDNA) foi menor em EO do que em BO, sugerindo que a constante exposição ao oxigênio atmosférico contribui para o acúmulo de lesões ao mtDNA, que é mais suscetível do que o DNA nuclear. Esse trabalho demonstra, pela primeira vez, que OSNs expressam proteínas essenciais de vias de reparo de DNA, cuja expressão decresce durante o processo de maturação dos neurônios olfatórios. Esses resultados devem contribuir para o entendimento dos mecanismos de manutenção da integridade genômica nestas células tão únicas. The first cells responsible for olfactory perception are the olfactory sensory neurons (OSNs), located in the olfactory epitelhium (OE) in the nasal cavity, which recognize volatile molecules in the air, called odorants, through olfactory receptors. Unlike neurons located in the central nervous system (CNS), which are relatively protected from exogenous toxins, OSNs are in constant contact with genotoxic agents, including atmospheric oxygen. Moreover, in contrast with most neurons in CNS, OSNs are periodically replaced through adult neurogenesis, therefore, having shorter lifespan than most neurons. Olfactory function decreases during normal and pathological aging, through mechanisms that are still not fully understood. In neurodegenerative diseases, olfactory loss is an early symptom and, in some cases, is used as a treatment response marker. DNA repair defects have been causally linked with neurodegeneration in different experimental models. However, it still unclear whether DNA repair alterations contribute to olfactory loss in these conditions, probably because there are no data available on DNA repair dynamic in OSNs. Therefore, our goal was to characterize the DNA repair pathways present in precursor and mature OSNs populations. We analyzed gene expression data from age-related and differentiation stage-related transcriptomes of these neurons, and validated the results by real time PCR using mouse OE samples from C57BL/6J lineage in two different ages (newborns and three weeks old). Our results indicate that OSNs are proficient in all DNA repair pathways investigated, showing detectable expression of essential genes from each pathway. When comparing populations enriched for mature OSNs or its precursors, our results suggest that the activities of at least four repair pathways are lower in young mice than in newborns, suggesting that DNA repair expression decreases during OSNs differentiation. This observation is consistent with published data showing that the expression and activities of repair proteins is lower in terminally differentiated than in proliferative cells . To test the hypothesis that OSNs would accumulate more DNA damage than CNS neurons, since they are in constant contact wtih genotoxic agents, we compared DNA damage levels in nuclear and mitochondrial DNA from OE, olfactory bulb (OB), and temporal cortex (TC) samples. We chose to use the TC region and a non-olfactory related control as it does not show significant adult neurogenesis and it is not exposed to external environment. Lesion rate wascalculated from data obtained by long extension PCR. Results from 3 weeks old mice OE, OB and TC samples showed that the amplification in TC samples is much lower than OE or OB samples, suggesting that neurons in CNS accumulate more damage than neurons that undergo neurogenesis. Besides, lesion frequency was higher in OE mitochondrial DNA (mtDNA) than in OB, suggesting that the constant exposure to atmospheric oxygen may contribute to accumulation of mtDNA lesions. This work demonstrates, for the first time, that OSNs are proficient in at least four DNA repair pathways, and that expression of key genes in these pathways decreases with differentiation. These results will contribute to better our understanding of the mechanisms involved in genomic stability in such unique cell types.

Os astrocitomas são os tumores cerebrais primários mais frequentes, dentre os quais, o glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais agressivo, sendo classificado como astrocitoma de grau IV. O tratamento envolve remoção cirúrgica seguida de quimio e radioterapias, porém essa abordagem não é eficaz devido à alta resistência das células tumorais. Em um trabalho anterior, buscando caracterizar os mecanismos associados à esta característica, investigamos a expressão de genes de reparo de DNA em astrocitomas de diferentes graus. Foram encontradas alterações em 19 genes. Através da combinação destas alterações em todos os arranjos possíveis, definimos um grande conjunto de assinaturas de expressão gênica que foi utilizado como filtro para a busca de correlação em bancos de dados públicos. No total, 421 assinaturas foram associadas à redução na sobrevida dos pacientes, sendo que cinco dos genes (EXO1, NEIL3, BRCA2, BRIP1 e DDB2) foram isoladamente relacionados ao pior prognóstico. Notavelmente, DDB2 foi o único gene subexpresso a apresentar esta correlação, levando a um risco de morte aproximadamente três vezes maior. No presente estudo in vitro, após radiação ionizante, observamos que células com baixos níveis de DDB2 reparam mais rapidamente as quebras induzidas no DNA, saem mais facilmente da parada de ciclo na fase G2/M e se tornam ainda mais resistentes a este tratamento. Além disso, o silenciamento de DDB2 induziu o aumento dos níveis de Zeb1, um importante promotor da transição epitélio-mesênquima, bem como dos índices de invasão e migração celular. Estes dados mostram que a redução nos níveis de DDB2 induz um fenótipo mais agressivo, corroborando a correlação com pior prognóstico dos pacientes observado anteriormente. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que a função de DDB2 não está limitada ao âmbito do reparo de DNA, apontam uma potencial relação com o controle da transição epitélio-mesênquima e mostram que este gene possui papel fundamental no estabelecimento da agressividade e resistência de GBM. Astrocytomas are the most common primary brain tumors. Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive type and is classified as grade IV astrocytoma. The treatment involves surgical resection followed by chemo and radiotherapies, however this approach is not effective due to the high resistance of tumor cells. In a previous work, to characterize the cellular mechanisms associated to this characteristic, we investigated the expression of DNA repair genes in samples of different astrocytoma grades. We found alterations in 19 genes. By combining these expression changes in all possible arrangements, a large set of gene expression signatures was defined and used as a filter to seek correlations in public databases. As a result, 421 signatures were associated with reduced patient survival. Among them, five genes (EXO1, NEIL3, BRCA2, BRIP1 and DDB2) were individually related to worse prognosis. Notably, DDB2 was the only down regulated gene to exhibit this correlation, making the risk of death approximately three times higher. In the present in vitro study, after ionizing radiation, we observed that cells with low levels of DDB2 are capable of faster DNA breaks repair, easily exit the G2/M arrest and become even more resistant to this treatment. Furthermore, DDB2 silencing enhanced the levels of Zeb1, an important promoter of the epithelial-mesenchymal transition, as well as the rates of cell invasion and migration. These data indicate that DDB2 knockdown leads to a more aggressive cell behavior, corroborating the association with worse prognosis previously observed. Taken together, these results suggest that DDB2 function is not limited to DNA repair, they point out its potential participation in epithelial-mesenchymal transition control and show that this gene might play a key role in GBM\'s aggressiveness and resistance.

Introdução: O câncer se tornou um grande problema de saúde pública mundial, sendo o câncer de mama o mais incidente em mulheres. A terapia endócrina com o tamoxifeno, um modulador seletivo do receptor de estrógeno (SERM), é aplicada em câncer de mama receptor de estrógeno (RE) positivo, porém, pacientes tratadas por um longo período podem desenvolver resistência ao medicamento. O tratamento padrão para o câncer de mama triplo negativo é a quimioterapia com antraciclinas e taxanos, individual ou em combinação com cirurgia e/ou radioterapia, porém muitos fatores devem ser considerados. Assim, aumenta a necessidade por novas estratégias terapêuticas para o tratamento do câncer de mama, especialmente para o fenótipo triplo-negativo e, consequentemente, abre-se uma grande área para a aplicação de produtos naturais, como o resveratrol. Estudos tem demonstrado que fitoquímicos, como o resvetatrol, podem ser usados em combinação com agentes quimioterapêuticos, aumentando sua eficácia e diminuindo sua toxicidade. Objetivos: Avaliar os efeitos citotóxicos do resveratrol e dos metabólitos do tamoxifeno (N-desmetiltamoxifeno e 4-hidroxitamoxifeno), em tratamentos isolados e em associação, na proliferação e apoptose de células de câncer de mama RE-positivo (MCF-7) e células de câncer de mama triplo negativo (MDA-MB-231). Materiais e Métodos: A avaliação dos efeitos citotóxicos de resveratrol e metabólitos do tamoxifeno na proliferação e apoptose das células de câncer de mama foi realizada a partir do Ensaio de Viabilidade Celular (método de análise colorimétrica utilizando o Metil Tiazol Tetrazolium - MTT), cálculo de Coeficiente de Interação entre Drogas (CID) para avaliar o grau de sinergia entre os tratamentos, marcação celular com anexina V e iodeto de propídeo, Hypotonic Fluorescent Solution e western-blot (caspase 3, 8 e 9). Resultados: O tratamento associado de resveratrol 165 ?M + desmetiltamoxifeno 30 ?M e resveratrol 165 ?M + hidroxitamoxifeno 40 ?M mostrou diminuir significativamente a viabilidade celular de MCF-7 e MDA-MB-231, quando comparado com o tratamento isolado de desmetiltamoxifeno 30 ?M e hidroxitamoxifeno 40 ?M, respectivamente. Os tratamentos associados também mostraram aumento de células MCF-7 e MDA-MB-231 marcadas com anexina V e iodeto de propídeo e aumento de núcleos hipodiplóides, porém, a maior ativação de caspase 3, 8 e 9 ocorreu apenas em MCF-7. Conclusões: Os resultados obtidos indicam que os tratamentos associados reduziram a viabilidade de células MCF-7 e MDA-MB-231 e induziram ativação de apoptose somente em MCF-7. Assim, sugere-se que a redução na viabilidade de MDA-MB-231 deve estar relacionada com mecanismos independentes de ativação de caspases. Introduction: Cancer has become a major public health problem worldwide, with breast cancer being the most common in women. Endocrine therapy with tamoxifen, a selective estrogen receptor modulator (SERM), is used in estrogen receptor (ER)-positive breast cancer, but patients treated over a long period may develop resistance to the drug. The standard treatment for triple negative breast cancer is chemotherapy with anthracyclines and taxanes, either alone or in combination with surgery and / or radiotherapy, but many factors must be considered. Thus, there is a growing need for new therapeutic strategies for the treatment of breast cancer, especially for the triple-negative phenotype and, consequently, opens up a great area for the application of natural products, such as resveratrol. Studies have shown that phytochemicals, such as resvetatrol, can be used in combination with chemotherapeutic agents, increasing their efficacy and decreasing their toxicity. Objectives: To evaluate the cytotoxic effects of resveratrol and the metabolites of tamoxifen (N-desmetiltamoxifen and 4-hydroxytamoxifen) in isolated and combined treatments on the proliferation and apoptosis of ER-positive breast cancer cells (MCF-7) and cancer cells of triple negative breast (MDA-MB-231). Materials and methods: The evaluation of the cytotoxic effects of resveratrol and metabolites of tamoxifen on the proliferation and apoptosis of breast cancer cells was performed from the Cell Viability Assay (colorimetric analysis using Methyl Thiazole Tetrazolium - MTT), Coefficient of Drug Interaction (ICD) to assess the degree of synergy between treatments, cell marking with annexin V and propidium iodide, Hypotonic Fluorescent Solution and western blot (caspase 3, 8 e 9). Results: The associated treatment of resveratrol 165 ?M + desmethyltamoxifen 30 ?M and resveratrol 165 ?M + hydroxytamoxifen 40 ?M showed a significant decrease in the cellular viability of MCF-7 and MDA-MB-231 when compared to the isolated treatment of desmethyltamoxifen 30 ?M and hydroxytamoxifen 40 ?M, respectively. Associated treatments also showed increase of MCF-7 and MDA-MB-231 cells labeled with annexin V and propidium iodide and increase of hypodiploid nuclei, but the greater activation of caspase 3, 8 and 9 occurred only in MCF-7. Conclusions: The results indicate that the associated treatments reduced the viability of MCF-7 and MDA-MB-231 cells and induced activation of apoptosis only in MCF-7. Thus, it is suggested that the reduction in the viability of MDA-MB-231 should be related to independent mechanisms of caspase activation.

O arbovírus Oropouche (OROV), da família Peribunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, é importante causador de doença febril nas Américas Central e do Sul. Como outros Orthobunyavirus, OROV é envelopado, com genoma compreendido por três segmentos de RNA de fita simples de polaridade negativa, nomeados de acordo com o seu tamanho, como S (small), M (médio) e L (large). O segmento S codifica a proteína estrutural do nucleocapsideo N e, em uma fase de leitura alternativa, a proteína não estrutural NSs. Apesar da patogênese de OROV ser pouco conhecida, dados obtidos com modelos experimentais murinos indicam que a apoptose desempenha um papel central na morte de células infectadas. Portanto, embora não seja essencial à replicação de OROV, NSs pode desempenhar papeis importantes para a patogênese. Nosso grupo demonstrou previamente que OROV induz apoptose em células HeLa pela via intrínseca, e esse efeito requer a síntese de proteínas virais. No presente estudo objetivamos investigar o papel da proteína NSs de OROV na apoptose induzida em células HeLa. Nós encontramos que a superexpressão da proteína NSs de OROV induz apoptose em diferentes linhagens de células humanas (Glioblastoma, Huh7 e HCE) 24 horas após transfecção. NSs induz apoptose pela via intrínseca, com liberação de citocromo c da mitocôndria, ativação de caspases 9 e 3, e fragmentação de cromatina. Curiosamente, a proteína NSs também induz apoptose pela via extrínseca, confirmada pela detecção de caspase 8 ativada. Um clone infeccioso do OROV sem a proteína NSs (OROVdelNSs) também não induz apoptose em células HeLa até 36 horas pós-infecção, confirmando a importância da proteína NSs para a indução de morte celular por apoptose. A predição da estrutura da proteína NSs revelou a presença de uma sequência de treze aminoácidos na região C-terminal da proteína, que tem similaridade como receptor de TNF. Ensaio de PCR array indicou que a proteína NSs de OROV causa aumento na quantidade de transcritos de TNF em células HeLa. The arbovirus Oropouche (OROV), of the family Peribunyaviridae, genus Orthobunyavirus, is an important cause of febrile disease in Central and South America. Like other Orthobunyaviruses, OROV is enveloped, with a genome comprised of three segments of single-stranded RNA of negative polarity, named according to their sizes as S (small), M (medium) and L (large). The S segment encodes the structural nucleocapsid N protein and, on an alternative reading frame, the NSs nonstructural protein. Although the pathogenesis of OROV is poorly understood, data obtained from murine experimental models indicate that apoptosis plays a central role in killing infected cells. Therefore, while not essential for the replication of OROV, NSs may play important roles in the pathogenesis. Our group has previously demonstrated that OROV induces apoptosis in HeLa cells via the intrinsic pathway, and this effect requires the synthesis of viral proteins. The present study aimed to investigate the role of OROV protein NSs in apoptosis induced in HeLa cells. We found that overexpression of the NSs protein induces apoptosis in different human cell lines (glioblastoma neuroblastoma and human corneal epithelium) 24 hours after transfection. NSs induces apoptosis by the intrinsic pathway, with release of cytochrome c from mitochondria, activation of caspases 9 and 3, and chromatin fragmentation. Interestingly, the NSs protein also induces activation of caspase 8, an element of the extrinsic pathway of apoptosis. An OROV infectious clone lacking the NSs protein (OROVdelNSs) does not induce apoptosis in HeLa cells up to 36 hours postinfection, confirming the importance of the NSs protein for the induction of cell death by apoptosis. The prediction of the structure of the NSs protein revealed the presence of a sequence of thirteen amino acids in the C-terminal region of the protein, which has similarity as a TNF receptor, and this could shed light into a possible mechanism of apoptosis to be validated by experiments silencing target genes in Hela cells.

Abelhas adultas produzem vitelogenina, a principal proteína da hemolinfa. Ela está envolvida na reprodução, comportamento, imunidade, longevidade e regulação da organização social. A interferência por RNA interference é a mais promissora ferramenta para estudos de função gênica, baseada na introdução de duplex de RNA (dsRNA) que induz a degradação de transcritos alvo-específicos. Injeção de dsRNA altera a transcrição de vitelogenina, mas evidências apontam que a ativação do sistema imune em abelhas seja um efeito colateral destaa manipulação. Desenvolvemos um método para o silenciamento do gene codificador de vitelogenina no desenvolvimento pós-embrionário, que minimiza os efeitos da manipulação, onde 0,5 ?g de dsRNA de vitelogenina (dsVg) ou de GFP (controle exógeno, dsGFP) foi oferecido na dieta natural de larvas de segundo estágio, as quais foram mantidas na colônia. Nosso enfoque principal foi a compreensão dos efeitos do silenciamento pós-transcricional de rainhas e operárias de A. mellifera, em especial na fase larval. Operárias adultas reconhecem larvas tratadas e as remove. Mantemos certa distância entre as células de cria que recebiam o tratamento e a remoção de larvas tratadas diminuiu consideravelmente. A expressão de transcritos de vitelogenina em indivíduos sem tratamento e tratados foi analisada no quinto estágio larval de ambas as castas, bem como em operárias adultas de 7 dias e rainhas recémnascidas, utilizando-se PCR em tempo real e a expressão do gene codificador de actina como controle endógeno. Em adultos, controles sem tratamento e dsGFP expressaram quantidades similares de transcritos de vitelogenina. Os grupos alimentados com dsVg tiveram expressão reduzida de vitelogenina, a saber: quinto estágio larval de operárias (91%) e de rainhas (71%), operárias de 7 dias (88%) e rainhas recém-nascidas (70%). O silenciamento da vitelogenina não afetou a morfologia dos adultos, mas sim a fisiologia de larvas de ambas as castas, como nos títulos de hormônio juvenil e concentração de proteínas circulantes na hemolinfa. Concluímos que a ingestão de dsRNA é um método não-invasivo que induz silenciamento gênico e, assim, uma ferramenta eficiente para estudos funcionais pós-genoma. Os mecanismos regulatórios do gene codificador de vitelogenina e seu papel na diferenciação de castas estão em discussão. Adult bees produce vitellogenin (Vg), the main protein in hemolymph; it is involved in honey bee (Apis mellifera) reproduction, behavior, immunity, longevity and regulation of social organization. Genetic interference mediated by injection of double-stranded RNA (dsRNA) is a powerful tool for the analysis of gene function in Apis mellifera. Injection of dsRNA effectively alters vitellogenin transcription; however, evidence has been found of immune system activation in treated bees, which could be a collateral effect of treatment. Consequently, we developed a non-invasive protocol for disruption of the A. mellifera genes exemplified by vitellogenin mRNA silencing, to understand it, mainly, in the female larval context. Second instar larvae were treated as follows: the treatment group received 0,5 ?g of double-stranded vitellogenin RNA (dsVg) mixed with larval food deposited in the worker brood cells; control group 1 was left to develop without treatment, while control group 2 received dsGFP (Green Fluorescent Protein), as an exogenous control. Treated and control larvae were maintained in the colony until adult emergence. Workers recognized dsRNAtreated larvae and frequently removed them. To circumvent this problem we increased the distance between the treatment groups. Vg gene expression were determined for fifth instar larvae of both castes and for 7 day-old workers and newly-emerged queens, evaluated by quantitative real time PCR, using actin as an endogenous control. For adults, we found that controls, dsGFP- and non-treated bees expressed similar amounts of Vg transcripts. The dsVg-fed groups had significantly reduced Vg gene expression in fifth instar larvae of workers (91%) and queens (71%) and, also, in 7 day-old workers (88%) and newly-emerged queens (70%). Disruption of the Vg gene did not affect adults morphology but physiological larval traits of both castes, as juvenile hormone titre and protein concentration. We conclude that dsRNA ingestion is an effective non-invasive method for inducing knockdown and an efficient approach for post-genome functional studies. The regulatory mechanisms of vitellogenin gene and its rules during caste differentiation are discussed.