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A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf - 810, Xf - 818 e Xf - 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf - 810 e Xf - 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf - 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf - 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N-terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". The recent sequencing of its genome, achieved in 2000, was the first of a plant pathogen, a fact that stimulated the search for putative pathogenicity factors employed by this bacterium while infecting citrus trees. X. fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, being transmitted by sharpshooter vectors. Several authors argue that the bacterium produces enzymes to degrade plant cell, as a way to colonize new xylem vessels through pit membrane degradation. The identification of putative cellulases, xylanases, pectinases and proteases on X. fastidiosa genome, led us to carry out the present work to characterize the putative products of the endoglucanase genes Xf - 810, Xf - 818 and Xf - 2708. These genes were cloned into expression vectors and the proteins were produced in Escherichia coli. Based upon enzymatic assays, those proteins were characterized as endoglucanases (EC 3.2.1.4), which are cellulases able to promote the endo-hydrolysis of cellulose chains. These cellulases degraded carboxymethylcellulose, Avicel and xylan, while only Xf - 810 and Xf - 818 degraded acid swollen cellulose. The hydrolysis of carboxymethylcellulose was higher at acidic pH between 5.2 and 5.6) and at a temperature of 65 °C. As a group, these enzymes were able to degrade soluble and insoluble cellulose derivatives, while only the cellulase Xf - 818 could hydrolyze the cello-oligosaccharides cellotetrose and cellopentose, thus showing a high catalytic diversity. This protein also has the capacity to bind microcristalline cellulose, confirming the presence of a functional cellulose-binding domain. We set a protocol, employing anion exchange, metal affinity and gel filtration chromatography, to purify the Xf - 818 enzyme expressed in E. coli as a N-hexahistine fusion tag. The endoglucanase activity studied gives support for an eventual role of such cellulases during host colonization by the bacterium. Besides that, it agrees with similarities searches observed on the sequencing of X. fastidiosa genome.

Este trabalho apresenta estudos bioanalíticos envolvendo a bactéria Xylella fastidiosa. A X. fastidiosa é uma bactéria aeróbica, responsável pela doença Clorose Variegada dos Citros. Durante o projeto genoma foi possível mapear diversas proteínas, sendo uma das enzimas a hidroxinitrila liase (HNL). As indústrias de química fina, em especial a farmacêutica, vêm utilizando enzimas para produção de enantiômeros que visam à formação de novas drogas quirais com alto teor de pureza. As enzimas HNLs são proteínas presentes na superfamília α/β-hidrolases, da qual também fazem parte as lipases e esterases. As hidroxinitrilas são empregadas na síntese de compostos quirais, para melhores condições em biocatálise. HNLs são enzimas que catalisam a formação reversível de cianoidrinas utilizando ácido cianídrico (HCN) e aldeídos ou cetonas. Por esta razão, foi analisado o potencial de biocatálise enantiosseletiva da XfHNL referente ao substrato (R,S)-ibuprofeno e a síntese do éster racêmico, α-metil benzil acetato, e também a síntese de cianoidrinas catalisadas pela XfHNL. Pelas três reações estudadas neste trabalho foi possível observar que XfHNL não possui enantiosseletividade em dois dos substratos testados. Também foi estudado neste trabalho a expressão proteica nos meio de cultura líquidos XDM2, XDM4 e XDM5 até então não estudados por eletroforese OFFGEL, uma nova plataforma semi-preparativa para fracionamento de proteínas. Foi realizado um estudo preliminar desse meios, para avaliar a expressão proteica, e também o meio de cultura BCYE para visualizar possíveis fatores sinal difusível (DSF) por espectrometria de massas e seu comportamento em eletroforese capilar. Por fim, foi fabricado um microdispositivo de microfluídico feito em poliéster-toner (PT) para biomimetizar o xilema para o estudo in vitro de X. fastitiosa e seu comportamento na colonização. Assim sendo, foi possível visualizar o crescimento, a formação de biofilme e a presença de goma xantana dentro do microchip. This work involves bioanalytical studies of Xylella fastidiosa. The X. fastidiosa is an aerobic bacteria, responsible for the disease Citrus Variegated Chlorosis. During the genome project was possible to characterize several proteins, one of the enzymes hydroxynitrila lyase (HNL). Industries, especially pharmaceuticals, have been using enzymes for production of enantiomers aimed at the formation of new chiral drugs with high purity. Enzymes are proteins present in HNLs superfamily α / β-hydrolases, which are also part of lipases and esterases. The HNLs have been employed in the synthesis of chiral compounds for better conditions in biocatalysis. HNLs are enzymes that catalyze the reversible formation of cyanohydrins using hydrocyanic acid (HCN) and aldehydes or ketones. For this reason, we investigated the potential of enantioselective biocatalysis of XfHNL respect to substrate (R,S)-ibuprofen and synthesis of racemic ester, α-methyl benzyl acetate. Also, the synthesis of cyanohydrins catalyzed by XfHNL. By three reactions involved in this work, it was observed that there were not XfHNL enantioselectivity in 2 of the substrates studied. Also, it was studied protein expression in liquid culture medium XDM2, XDM4 and XDM5 hitherto studied by electrophoresis OFFGEL, a new platform for semi-preparative protein fractionation. We conducted a quick study and through this liquid medium, BCYE, to view possible DSFs by mass spectrometry and their behavior in capillary electrophoresis. And finally, it was produced a PT microdevice in order to mimic the xylem vessels to study of X. fastitiosa in vivo and its behavior. Accordingly, it is possible to display the growth, biofilm formation and the presence of xanthan gum in the microchip.

A morte súbita dos citros (MSC) foi identificada em 2001, no município de Comendador Gomes, Minas Gerais, e desde então foi responsável pela perda de 4 milhões de plantas na região sul do Triângulo Mineiro, e no norte e noroeste do estado de São Paulo. É uma doença de combinação copa/porta-enxerto, afetando principalmente laranjeira doce enxertada em limoeiro Cravo, e que culmina na morte das plantas. Passados dez anos do seu relato, até hoje não se tem conhecimento exato do agente causal e dos possíveis vetores. Sabe-se, todavia, que em todas as plantas com morte súbita encontram-se o vírus da tristeza dos citros (Citrus tristeza virus - CTV) e um vírus do Gênero Marafivirus, Família Tymoviridae, denominado Citrus sudden death associated virus (CSDaV). Devido esse fato, há a necessidade de separá-los para testar os postulados de Koch para o CSDaV. O principal objetivo deste trabalho foi tentar isolar o CSDaV para verificar o seu real envolvimento com a MSC. Também se procurou purificar esse vírus para a produção de antissoro policlonal para trabalhos de diagnose da doença. Para a purificação do CSDaV foi utilizado o protocolo de purificação do Potato leaf roll virus, porém os resultados não foram satisfatórios devido a constante presença do CTV. Tentativas de remoção do CTV por meio de imunoprecipitação com antissoro homólogo não foram satisfatórias. O antissoro produzido reagiu indistintamente com extratos de plantas infectadas com o CSDaV e o CTV. O CSDaV foi transmitido mecanicamente para plantas de Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor e C. quinoa, causando principalmente infecção localizada. A presença do vírus foi confirmada por RT-PCR e a sua identidade por meio do sequenciamento de nucleotídeos do produto da amplificação. Tentativas de transmissão do CSDaV usando inóculo de extrato de folhas de plantas do campo , por meio da Cuscuta sp., através de cortes no tronco das plantas com lâmina embebida no inóculo, com pulgões Toxoptera citricida aparentemente virulíferos somente para o tymovirus e por meio da inoculação de sementes de citros deram resultados negativos. Citrus sudden death (CSD) disease was identified in 2001, at Comendador Comes County, State of Minas Gerais, Brazil. Since then the disease has caused the death of 4 million trees in Southwestern Minas Gerais State and Northern São Paulo State. This new and destructive disease affects sweet orange as well as other species, varieties, and hybrids when grafted on Rangpur (Citrus limonia). Then years after the first report on CSD, the causal agent and possible vector(s) have not been precisely identified. It is known, however, that all disease trees are infected with Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death associate virus (CSDaV), which is a member of the Genus Marafivirus, Famíly Tymoviridae. Due to this, it is necessary to separate these pathogens, in order to complete Kochs postulated for the CSDaV. The main purpose of the present work was to try to isolate the CSDaV to verify its role on CSD disease. In addition, attempts were done to purify the virus and produce polyclonal antiserum for disease diagnosis. Purification was carried out as described for Potato leaf roll virus, but results were not suitable due to the constant presence of CTV. Efforts to remove CTV by immunoprecipitation with homologous antiserum did not succeed. The produced antiserum reacted indistinctly with extracts of plants infected with both viruses. SCDaV was mechanically transmitted to Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor, and C. quinoa, causing mainly local infection. Infection was confirmed by RT-PCR and virus identity was determined by nucleotide sequence of the amplified fragment. Efforts to transmit CSDaV, using as inoculum extract from field infected plants, by means of Cucucuta sp., by incisions on the trunk of the test-plants, with Toxoptera citricida apparently viruliferous only for the tymovirus, and by means of citrus seed inoculation gave negative results.

A bactéria XvIella fastidiosa tem sido associada com doenças economicamente importantes como a clorose variegada de citros (CVC) em citros no Brasil e a doença de Pierce em videiras nos Estados Unidos (Hopkins, 1989 e Purcell et al., 1997). A importância econômica da indústria de citricultura no Brasil e o grande prejuízo causado pela CVC em pomares brasileiros têm resultado em um extensivo programa de pesquisa que começou com o sequenciamento do genoma completo da X Fastidiosa (Simpson., et ai 2000). A bactéria é transmitida por insetos conhecidos como \"cigarrinhas\" que se alimentam da seiva do xilema. O principal efeito da doença é o surgimento de manchas amarelas nas folhas que progridem para toda a extensão levando-a à necrose. Os frutos de plantas infectadas são pequenos (representando 1/3 do tamanho de um fruto normal), apresentam casca dura e são impróprios para o consumo. Esta bactéria apresenta em seu genoma um Operon contendo 9 genes (B,C,D,E,F,H,J,K,M) responsáveis pela biossíntese do exopolissacarídeo denominado goma fastidiana, que pode estar envolvido na sua patogenicidade. No presente trabalho temos como objetivo estudar as enzimas GUMC, que provavelmente está envolvida na etapa de polimerização e/ou secreção do polissacarídeo formado através da membrana da bactéria, e GUMK, uma glucuronosiltransferase ou glicosiltransferase IV, que adiciona uma molécula de ácido glicurônico à molécula da manose para a formação do tetrassacarídeo (manose-α-1,3- glucose-β-1,4-glucose-P-P-polyprenol). O gene gumC foi clonado no vetor de expressão pMALc-2x, a proteína de fusão GUMC-MBP foi expressa com uma massa molecular calculada de 98kDa e foi purificada através de coluna de afinidade. A proteína de fusão foi caracterizada pela reação com o anticorpo anti-MBP por imunoblotting. Através da técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL), foram realizados estudos de agregação com a proteína de fusão GUMC-MBP. Ensaios de cristalização foram realizados e microcristais da proteína de fusão GUMC-MBP foram obtidos. Após a clivagem da proteína de fusão com a enzima Factor Xa, a enzima GUMC foi separada através da cromatografia de troca aniônica. A massa molecular da enzima foi determinada através da cromatografia de filtração em gel, superose 12, eluindo na forma monomérica com 53kDa. A proteína GUMC foi caracterizada pela reação com o anticorpo anti-GUMC-MBP (produzido em camundongos) através da técnica de imonublotting. A enzima também foi caracterizada através da técnica do dicroísmo circular (CD), apresentando um espectro característico de estrutura secundária enovelada, composta predominantemente por α-hélices. Foram realizadas 9 construções para a retirada das regiões transmembrânicas das regiões 5 e 3° do gene gumC (1 construção para o vetor de expressão pET29b e 8 para o vetor pMALc-2x). Em uma das construções, a proteína de fusão modificada GUMC-MBP 5C foi expressa no vetor de expressão pMALc-2x e foi purificada em coluna de afinidade. A proteína de fusão modificada GUMCMBP foi clivada com a enzima Factor Xa. Estudos de agregação molecular das proteínas de fusão GUMC-MBP e GUMC-MBP modificada C5 e das enzimas GUMC e GUMCC5 modificada poderão ser realizados futuramente. O gene gumK foi clonado no vetor pMAc-2x, a proteína de fusão GUMK-MBP foi expressa, com uma massa molecular calculada de 86kDa e foi purificada em coluna de afinidade. A proteína de fusão foi caracterizada por imunoblotting e medidas de dicroísmo circular foram realizadas. Após clivagem com o Factor Xa, a enzima GUMK foi purificada através da cromatografia de troca catiônica. Ensaios de cristalização foram realizados onde microcristais e cristais em forma de agulha foram obtidos. Futuramente, estudos estruturais e funcionais destas enzimas poderão trazer informações sobre a patogenicidade da X fastidiosa, assim como possibilitar o desenvolvimento de inibidores específicos The bacterium Xylella fastidiosa has been associated with diseases of economically importante crop as the citrus variegated chiorosis (CVC) in citrus in Brazil and the Pierce\'s disease in grapevines in the United States (Hopkins. 1989 and Purcell et al., 1997). The economic importance of the citrus industn - in Brazil and the high level of damage caused bv CVC in brazilian orchards hm -e resulted in an extensive research program starting with the sequencing of the entire genome of X. fastidiosa (Simpson et al.. 2000). The bacterium is transmitted bv specific sharpshooter lealloppers when the insect feeds on the talem sap. Tvpical disease svmptoms include conspicuous variegations. with chlorotic amas on the upper side and small necrotic lessions on the lower side of the leaves. The affected fruits are smaller. often no more than one-third of the diameter of healthy fruits, hardened and without commercial value. X fastidiosa has a nine-gene operou (B, C. D. E. F, H. J. K. and M genes) responsible for the biosvnthesis of exopolysaccharides, denoted fastidian gum, that mas be linked directly to the pathogenecin - of the microorganism. In this work our main aim is to study the GLIM(\' enzyme, that may be responsible for gum polymerization or secretion through the membrane of X fástidiosa and GUMK enzyme, a glucuronosvltransferase or glycosyltransferase IV. that adds a glucuronic acid to tetrasaccharide manose-α-1,3- glucose-β-1,4-glucose-P-P-po1visoprenyl. The gume gene was cloned into the pMAL-c2x expression vector, and GIIMC-MBP fusion protein was expressed with estimate molecular mass 98kDa. was purified through affinin - column and was characterized through the reaction of antiMBP antibodv by imunoblotting. Molecular aggregation studies of GII.MC-MBP fusion protein were measured by Dynamic Light-Scattering (DLS). Crystallization screens were made and microcrvstals were obtained. The GUMC-MBP fusion protein were cleavaged with Factor Xa and the GIM\' enzyme purified through ion exchange chromatography. The GUMC molecular mass were determined using size exclusion chromatography, superosel2. Anti-GUMC-MBP antibodies were already produced in mice and were used to characterize the GUMC protein. by imunoblotting technique. In addition, according to circular dichroism spectroscopy, GUMC protein prevalent secondary structure is α-hefix. Nine constructions for the gtmiC gene. without 5 - and 3° transmembrane regions (one for cloning in pET29b and 8 for cloning in pMALc-2x) were carried out. One of the constructions. the modified fusion protein GIIMC-MBP C5. was expressed into the pMALc-2x expression. vector. The modified fusion protein GLIMC-MBP 5C were purified through affmin - resin and cleavaged with the Factor Xa enzvme. In the future. aggregation states of GIIMC-MBP and modifiecl GUMC -MBP C5 fusion proteins. and GII.MC and modificai GUMC C5 enzymes could be measured by DLS and compared. The gumK gene. cloned into the pMALc-2x expression. vector. expressed a GIIMK-MBP fusion protein soluble with molecular mass 86kDa. This fusion protein was purified through affmin - resin. The GIIMK-MBP fusion protein was characterized for imunoblotting and CD measurements. The GUMK-MBP fusion protein was cleavaged with Factor Xa enzvme and the GUMK enzyme was purified through cationic Exchange chromatography. Crvstallization screens were made and micmcrystals and crystals in needle form were obtained. Future enzvmes characterization three-dimensional structure will allow - further structural and functional studies on the pathogenicity of X. fastidiosa. as well as to development of specific inhibitors