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Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-09-14T14:29:56Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2550346 bytes, checksum: 02433b69f69485ae8296bd313d7fd4b5 (MD5) Made available in DSpace on 2016-09-14T14:29:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2550346 bytes, checksum: 02433b69f69485ae8296bd313d7fd4b5 (MD5) Previous issue date: 2016-01-05

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Streptococcus pneumoniae is a human pathobiont that colonizes the nasopharynx. S. pneumoniae is responsible for causing non-invasive and invasive disease such as otitis, pneumonia, meningitis, and sepsis, being a leading cause of infectious diseases worldwide. Due to similarities with closely related species sharing the same niche, it may be a challenge to correctly distinguish S. pneumoniae from its relatives when using only non-culture based methods such as real time PCR (qPCR). In 2007, a molecular method targeting the major autolysin (lytA) of S. pneumoniae by a qPCR assay was proposed by Carvalho and collaborators to identify pneumococcus. Since then, this method has been widely used worldwide. In 2013, the gene encoding for the ABC iron transporter lipoprotein PiaA, was proposed by Trzcinzki and collaborators to be used in parallel with the lytA qPCR assay. However, the presence of lytA gene homologues has been described in closely related species such as S. pseudopneumoniae and S. mitis and the presence of piaA gene is not ubiquitous between S. pneumoniae. The hyaluronate lyase gene (hylA) has been described to be ubiquitous in S. pneumoniae. This gene has not been used so far as a target for the identification of S. pneumoniae. The aims of our study were to evaluate the specificity, sensitivity, positive predicted value (PPV) and negative predicted value (NPV) of the lytA and piaA qPCR methods; design and implement a new assay targeting the hylA gene and evaluate the same parameters above described; analyze the assays independently and the possible combinations to access what is the best approach using qPCR to identify S. pneumoniae. A total of 278 previously characterized strains were tested: 61 S. pseudopneumoniae, 37 Viridans group strains, 30 type strains from other streptococcal species and 150 S. pneumoniae strains. The collection included both carriage and disease isolates. By Mulilocus Sequence Analysis (MLSA) we confirmed that strains of S. pseudopneumoniae could be misidentified as S. pneumoniae when lytA qPCR assay is used. The results showed that as a single target, lytA had the best combination of specificity, sensitivity, PPV and NPV being, 98.5%, 100.0%, 98.7% and 100.0% respectively. The combination of targets with the best values of specificity, sensibility, PPV and NPV were lytA and piaA, with 100.0%, 93.3%, 97.9% and 92.6%, respectively. Nonetheless by MLSA we confirmed that strains of S. pseudopneumoniae could be misidentified as S. pneumoniae and some capsulated (23F, 6B and 11A) and non-capsulated S. pneumoniae were not Identified using this assay. The hylA gene as a single target had the lowest PPV. Nonetheless it was capable to correctly identify all S. pneumoniae. Streptococcus pneumoniae é uma bactéria patogénica que coloniza a nasofaringe humana. S. pneumoniae é responsável por causar doenças, tanto invasivas como não invasivas como: otite, pneumonia, meningite e sepsis, continuando a ser uma das principais causas de doenças infecciosas a nível mundial. Devido a semelhanças com espécies que lhe são estreitamente relacionadas, e que compartilham o mesmo nicho ecológico, pode ser um desafio identificar corretamente S. pneumoniae aplicando apenas técnicas não dependentes do passo de cultura bacteriana como a técnica de PCR em tempo real (qPCR). Em 2007, um método molecular para identificação de S. pneumoniae baseado num qPCR e tendo como alvo o gene da autolisina principal (lytA) de S. pneumoniae foi proposto por Carvalho e seus colaboradores. Desde então, este tem sido usado de uma forma sistemática por vários grupos. Em 2013, foi proposto por Trzcinszki e seus colaboradores o uso da lipoproteína ABC transportadora de ferro PiaA como alvo num qPCR. O piaA qPCR foi usado em paralelo com o lytA qPCR. Contudo, a presença de genes homólogos de lytA foi descrita em espécies filogeneticamente próximas, como S. pseudopneumoniae e S. mitis, e a presença do gene piaA não é ubíquo entre S. pneumoniae. O gene da proteína hyaluronato lyase (hylA) é descrito como sendo ubíquo a todas as estirpes de S. Pneumoniae. Este gene ainda não foi usado até ao momento como alvo para a identificação de S. pneumoniae. Assim o objectivo do nosso estudo foi a avaliação da especificidade, sensibilidade, valor positivo preditivo (VPP) e valor negativo preditivo (VNP) do método lytA e piaA qPCR; construção de hylA qPCR avaliando os mesmos parâmetros acima referidos; analise dos ensaios de uma forma independente e em conjunto, para poder retirar conclusões sobre qual o melhor gene alvo, ou alvos, a usar na identificação de S. pneumoniae. Foram testadas um total de 278 estirpes anteriormente caracterizadas: 61 S. pseudopneumoniae, 37 estirpes do grupo Viridans, 30 estirpes referência de outras espécies de Streptococcus e 150 estirpes de S. pneumoniae. A coleção usada incluía tanto estirpes obtidas em colonização como estirpes obtidas em doença. Através do método Multilocus sequence analysis (MLSA) verificámos que estirpes de S. pseudopneumoniae podem ser incorretamente identificadas como S. pneumoniae quando é utilizado o lytA qPCR. Ainda assim, os resultados mostraram que como alvo único, o gene lytA apresenta a melhor combinação de valores de especificidade, a sensibilidade, VPP e VNP sendo, respetivamente, 98.5%, 100.0%, 98.7% e 100.0%. A combinação de genes com a melhor combinação de valores de especificidade, sensibilidade, VPP e VNP foi lytA e piaA, com 100.0%, 93.3%, 97.9% e 92.6%, respetivamente. De realçar que pelo método MLSA verificámos que estirpes de S. pseudopneumoniae podem ser incorretamente identificadas como S. pneumoniae e algumas estirpes capsuladas (23F, 6B e 11A) e não-capsuladas de S. pneumoniae não são identificadas quando usada esta combinação de genes. O gene hylA como alvo único apresentou o valor de PPV mais baixo, todavia identificou corretamente todos os S. pneumoniae.

Mestrado em Biologia Aplicada Os níveis de glicémia podem variar consoante a alimentação, exercício físico, stress, entre outros factores. Contudo quando se verifica elevação dos níveis de glicémia de um modo contínuo poderá estar instalada uma das causas mais frequentes de hiperglicemia, a Diabetes Mellitus (DM). A DM é um distúrbio metabólico resultante da inexistência absoluta ou deficiência parcial da secreção de insulina. Um diagnóstico precoce e o seu controlo são imprescindíveis para moderar a evolução da doença. O objectivo deste estudo foi comparar os resultados de glicémia de 260 participantes através de duas metodologias distintas: O método hexoquinase glucose II e através da utilização do glicosímetro FreeStyle Precision. Após aplicação de vários testes estatísticos verificou-se que existiam diferenças significativas, sendo estas mais evidentes no sexo feminino, em indivíduos com idade ≥65 anos e em diabéticos tipo II. Apesar de ambas as técnicas possuem interferências, verificou-se uma tendência por parte do glicosímetro para determinar valores mais elevados de glicémia dos pacientes. The levels of blood glucose may vary according to nourishment, exercise, stress among other facts. However, whenever the blood glucose levels arrise in a continuous basis, that´s when we verify one of the most common causes of hyperglycemia, the Diabetes Mellitus (DM). The DM is a metabolic disorder that results from the absolute absence or partial deficiency of insulin secretion. Early diagnosis and control are essential to moderate disease progression. The goal of this study was to compare the blood glucose of 260 participants using two different methodologies: The hexokinase glucose II and by using the FreeStyle Precision glucometer. After performing several statistical tests, they showed that there were significant differences, which were more evident in female, subjects aged ≥ 65 years and people whith diabetes type II. While both techniques have interferences, we verified a tendency for the glumometer to raise the blood glucose levels of patients.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular As citopatias mitocondriais constituem um grupo de doenças clinicamente e geneticamente heterogéneas, que resultam de uma diminuição do metabolismo energético devido a um défice da fosforilação oxidativa de origem genética. A mitocôndria é um organelo citoplasmático presente em todas as células eucariotas, à excepção dos eritrócitos, que tem a particularidade de possuir o seu próprio genoma transmitido pela linha materna. O DNA mitocondrial codifica treze das cerca de 80 subunidades estruturais dos complexos da fosforilação oxidativa, as restantes são codificadas pelo DNA nuclear assim como todas as outras proteínas (~1500) necessárias para a manutenção do mtDNA e função mitocondrial; uma mutação num destes genes poderá causar uma citopatia mitocondrial mesmo que secundária. As citopatias mitocondriais são assim doenças que podem atingir qualquer órgão/tecido, geralmente multissistémicas, associadas a uma grande variedade de sinais e sintomas, em todas as idades, e associadas a qualquer tipo de hereditariedade. As mutações patogénicas no DNA mitocondrial são mais frequentes nos adultos, estimando-se que apenas sejam responsáveis por 10 à 25 % dos casos pediátricos, em que a alteração genética é maioritariamente de origem nuclear. O diagnóstico das citopatias mitocondriais torna-se então um desafio. Deverá idealmente envolver uma abordagem multidisciplinar incluindo avaliações de âmbito clínico, metabólico, bioquímico, histológico e molecular. O diagnóstico molecular é muitas vezes fundamental para a confirmação de citopatia mitocondrial. Neste trabalho elaborou-se um algoritmo com guias de orientação para o estudo genético dos genes mitocondriais e nucleares, em sangue e/ou músculo esquelético, de crianças e adultos. A abordagem molecular do genoma mitocondrial evidenciada no algoritmo foi avaliada através do estudo retrospectivo e prospectivo de doentes com suspeita de citopatia mitocondrial. Os resultados obtidos permitiram o diagnóstico molecular em alguns doentes bem como realçar a eficácia de algumas das vias indicadas. Este algoritmo poderá auxiliar os técnicos de sáude no planeamento e racionalização do diagnóstico molecular, tornando-o mais eficaz e rentável, possibilitando a caracterização genética de um maior número de casos, e assim permitir o aconselhamento genético e eventualmente o diagnóstico pré-natal. Mitochondrial disorders are a heterogeneous group of diseases characterized by impaired energy metabolism due to presumed genetically-based oxidative phosphorylation dysfunction. Mitochondria are unique in mammalian cells, being the only subcellular organelles other than the nucleus that contain functional DNA. Mitochondrial DNA encodes 13 protein subunits required for oxidative phosphorylation plus 22 transfer RNAs and two ribosomal RNAs. Another ~80 oxidative phosphorylation subunits plus all other proteins and RNAs needed for mtDNA expression and mitochondrial function are encoded by the nucleus and require import into the mitochondria; mutations in most of these genes can cause human disease. Mitochondrial disorders present as single- or multi-system diseases, with a wide variety of signs and symptoms, at any age, and with all patterns of inheritance. Mutations in mitochondrial DNA are more frequently found in adults, representing 10 to 15% of the genetic cause in children which is mostly of nuclear origin. This complexity presents a challenge for the diagnosis of patients with suspected mitochondrial disease. A multidisciplinary approach should be address including clinical, metabolic, histological, biochemical and molecular studies. Molecular genetics is important, when possible, to confirm the diagnosis. In this work an algorithm was elaborated for the orientation of the molecular study of mitochondrial or nuclear genome, in blood or muscle, of children and adults. The genetic approach of mitochondrial genome was tested through the retrospective and prospective studies of patients with suspected mitochondrial disorders. The results led to the molecular diagnostic in some patients and emphasize the efficacy of some guidelines. This algorithm should provide guidance on the management of these disorders for all the technicians involved, as well as an increasing number of molecular diagnosis allowing a better prognosis and accurate recurrence risk counseling.

Mestrado em Biomedicina Molecular A demência frontotemporal (DFT) é a segunda forma mais comum de demência em pessoas com mais de 65 anos. A DFT e uma doença autossómica dominante, causada por atrofia cerebral frontotemporal, englobando um grupo heterogéneo de doenças neurodegenerativas, esporádicas ou familiares. A apresentação típica é uma alteração da personalidade e do comportamento social, e disfunção da linguagem. Pode ainda surgir associada a um quadro parkinsónico ou a esclerose lateral amiotrófica (ELADFT). Atualmente foram já implicados 5 loci. Até ao momento, estão apenas descritos na literatura 8 doentes portugueses com DFT. Este estudo pretendeu contribuir sobretudo para a caracterização do espectro mutacional de doentes portugueses com DFT. Foi realizada a pesquisa de mutações nos genes MAPT, GRN e VCP, de acordo com a indicação e pedido dos médicos, nas seguintes combinações: MAPT (n=9), MAPT + GRN (n=23), GRN (n=3), GRN + VCP (n=1), MAPT + GRN + VCP (n=31). Foi feita PCR para amplificação de todos os exões e regiões intrónicas flanqueantes, seguida de sequenciação direta bidirecional, e de MLPA (para pesquisa de grandes rearranjos nos genes MAPT e GRN), em 67 doentes portugueses não aparentados: 37 homens e 30 mulheres, com manifestações clínicas sugestivas de DFT; 55 tinham diagnóstico clínico de DFT, 2 de DFT-ELA, 7 de DFT-parkinsonismo e 3 com um fenótipo de demência pouco definido. A pesquisa de mutações por sequenciação identificou 69 variantes, incluindo 6 novas, descritas pela primeira vez neste estudo: c.1561+119 G>A, c.1561+165 G>A, c.1827+15 C>T no gene MAPT; e c.351G>T, c.811+2T>C, 2160+32A>G no gene VCP. Com base numa abordagem bioinformática, apenas a variante c.811+2T>C foi considerada como patogénica, fazendo com que este estudo seja o primeiro a identificar um doente português com uma mutação no gene VCP. A MLPA não mostrou deleções/duplicações em nenhum dos outros doentes. Apesar das limitações do estudo, que se descrevem, foi possível excluir que as mutações nos genes MAPT, GRN e VCP, bem como os grandes rearranjos nos genes MAPT e GRN, sejam causa importante de DFT, nos doentes portugueses. Frontotemporal dementia (FTD) is the second most common form of dementia in persons over age 65 years. FTD is an autosomal dominant disorder, caused by frontotemporal cerebral atrophy, covering a heterogeneous group of sporadic or familial neurodegenerative diseases. The most common presentation is an early change in personality and social behavior, with speech dysfunction. It may also associate with Parkinsonism, or with amyotrophic lateral sclerosis (ALS-FTD). Currently, five loci have been implicated in FDT. There are only 8 Portuguese patients with FTD described in the scientific literature. This study aimed at contributing to the characterization of the mutational spectrum of FTD in Portuguese patients. According to the physician’s request, mutation analysis of MAPT, GRN and VCP genes was performed, in the following combination: MAPT (n=9), MAPT + GRN (n=23), GRN (n=3), GRN + VCP (n=1), MAPT + GRN + VCP (n=31). PCR of all exons and flanking intronic regions was followed by bidirectional direct sequencing, and by MLPA analysis (to detect large gene rearrangements) in MAPT and GRN genes, in 67 unrelated Portuguese patients: 37 males and 30 females, with clinical manifestations suggestive of FTD (55 with clinical diagnosis of FTD, 2 of FTD-ALS, 7 FTD-Parkinsonism, and 3 with an unclear dementia phenotype). Mutation screening identified 69 sequence variations, including 6 novel variants (described for the first time in this study): c.1561+119 G>A, c.1561+165 G>A, c.1827+15 C>T in MAPT; and c.351G>T, c.811+2T>C, 2160+32A>G in VCP. Following a bioinformatics approach, c.811+2T>C was the only variant considered to be patogenic, making this the first study to identifie a VCP mutation in a Portuguese patient. MLPA did not show any deletions/duplications in any of the other patients. Despite the limitations of this study, which we describe, it was possible to exclude that mutations in MAPT, GRN and VCP, as well as large rearrangements in MAPT and GRN are not a major cause of FTD in Portuguese patients.

Mestrado em Biomedicina Molecular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2014-03-18T18:26:02Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 3024221 bytes, checksum: a5a5bd3f15f6c408b28a29e51cb49097 (MD5) Made available in DSpace on 2014-03-18T18:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 3024221 bytes, checksum: a5a5bd3f15f6c408b28a29e51cb49097 (MD5) Previous issue date: 2012

Mestrado em Biologia Molecular e Celular A infeção pelo VHC nos últimos anos tem vindo a revelar-se um problema de saúde pública à escala mundial. De facto, apesar dos enormes avanços quer no diagnóstico, quer no tratamento de doentes infetados por este vírus, estima-se que cerca de 3% da população mundial, correspondendo a 170 milhões de indivíduos, esteja infetada pelo VHC permanecendo uma grande parte assintomática por vários anos, tornando-se assim, num problema de saúde à escala global. A tentativa laboratorial de reduzir cada vez mais o período de janela no diagnóstico laboratorial da infeção pelo VHC fez com que surgissem no mercado testes de diagnóstico de infeção viral ativa, com uma cinética e correlação excelente com a carga viral do vírus. O período de janela da pesquisa de anticorpos para o VHC é de cerca de 45 a 60 dias, enquanto que para os teste de quantificação do antigénio do core do vírus é apenas de 14 dias, mais 2 dias que na pesquisa do RNA viral. O objetivo principal deste trabalho consistiu na avaliação da utilidade clínica do teste de quantificação do antigénio do core do VHC da Abbott Diagnostics®. Para tal, foram analisadas com este teste 105 amostras de doentes dos Hospitais da Universidade de Coimbra-E.P.E. a fazer tratamento para a infeção pelo vírus, e os resultados foram comparados com os resultados obtidos pelo método de PCR em tempo real pelo teste COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV da Roche®. A análise estatística mostrou uma correlação significativa entre os dois testes (ρ=0,97 para um p

Mestrado em Biologia Molecular e Celular A ubiquinona (também chamada de Coenzima Q10, CoQ10) é uma benzoquinona presente em praticamente todas as células do organismo que participam dos processos de produção de ATP e é sintetisada na membrana interna da mitocondria. A principal fonte de CoQ10 é obtida por síntese endógena e uma pequena parte é adquirida através da dieta. A CoQ10 desempenha diversas funções biológicas nas células, entre as que se destacam a de transportador de electrões na cadeia respiratória mitocondrial e a participação no sistema anti-oxidante do organismo. Como tal, uma deficiência de ubiquinona pode causar efeitos nocivos importantes no organismo, uma vez que se veriam implicadas estas funções chave do metabolismo celular. A deficiência primária de CoQ10 (MIM 607426) é uma doença rara, de transmissão autossómica recessiva e com uma apresentação clínica muito variável, estando associada a quatro principais fenótipos clínicos: 1) encefalopatia caracterizada por mioglobinúria mas também com envolvimento do sistema nervoso central; (2) doença predominantemente encefalopática com ataxia e atrofia cerebelar; (3) miopatia isolada com RRFs e armazenamento lipídico; (4) doença multissistémica tipicamente infantil e encefalopatia; (5) nefropatia isolada ou associada a encefalopatia. Se as mutações encontradas, nestes doentes, estiverem localizadas nos genes envolvidos na biossíntese da CoQ10, então classifica-se estes síndromes como primários, se pelo contrário, as mutações estão presentes noutros genes, estamos perante a formas secundárias. O objectivo deste estudo é identificar e caracterizar sob o ponto de vista bioquímico e molecular as formas primárias com alteração da cadeia respiratória mitocondrial (CRM), patologia ainda não diagnosticada no nosso país. Inicialmente será implementado o doseamento da CoQ10 no músculo, plasma e eventualmente em fibroblastos por HPLC-reversa por detecção electroquímica. Nos doentes com os valores baixos de CoQ10, vai-se proceder ao estudo molecular dos genes envolvidos na biossíntese, em que já existem alterações descritas, no sentido de estabelecer uma relação fenótipo-genótipo. Os doentes vão ser seleccionados pelo diagnóstico clínico suspeito e/ou com alterações da CRM compatíveis com deficiência da ubiquinona. Este trabalho vai permitir a identificação das deficiências de CoQ10 que são de extrema importância visto serem as únicas Citopatias Mitocondriais potencialmente tratáveis. Para além disso, a identificação das mutações responsáveis por esta deficiência, vai permitir a possibilidade de diagnóstico pré-natal e implementação de terapêutica precoce. The ubiquinone (also known as Coenzyme Q10, CoQ10) is a benzoquinone present in virtually all body cells that participate in production of ATP, and is synthesized in the inner membrane of mitochondria. The main source of CoQ10 is the endogenous synthesis and only a small part is acquired through the diet. CoQ10 has several biological functions in cells, among which stand out the electron carrier function in the mitochondrial respiratory chain and the participation in the body’s anti-oxidant system. Thus, a ubiquinone deficiency can cause significant adverse effects on the body, since key functions involved in cellular metabolism are affected. The primary deficiency of CoQ10 (MIM 607426) is a rare autosomal recessive disease with a highly variable clinical presentation, and which is associated with four major clinical phenotypes: (1) encephalomyopathy characterized by mioglobinúria and brain involvement; (2) predominantly encephalopathic illness with ataxia and cerebellar atrophy, (3) isolated myopathy with ragged-red fibers (RRF's); (4) typical infantile multisystemic disease with encephalopathy and (5) isolated nephropathy or associated with encephalopathy. If the mutations found in these patients are located in genes involved in the biosynthesis of CoQ10, these syndromes are classified as primary, on the contrary, if mutations are present in other genes, these are secondary forms. The aim of this study is to identify and characterize, from the point of view of biochemical and molecular changes, the primary forms of CoQ10 deficiency with mitochondrial respiratory chain (CRM) alterations, a disease not yet diagnosed in our country. Initially it will be implemented the determination of CoQ10 in muscle, plasma and possibly in fibroblasts by reverse HPLC-electrochemical detection. In patients with low levels of CoQ10, will be carried out the molecular study of the genes involved in biosynthesis, for which there are already changes described, to establish a phenotype-genotype relationship. Patients will be selected by the suspected clinical diagnosis and / or changes in CRM compatible with ubiquinone deficiency. The work will allow the identification of the deficiencies of CoQ10 which are extremely important because they are the only potentially treatable mitochondrial cytopathies. In addition, the identification of mutations responsible for this deficiency will allow the possibility of prenatal diagnosis and implementation of early treatment. i ÍNDICE

Mestrado em Biologia Molecular e Celular A malária representa um grave problema, não só em termos de saúde pública, mas também ao nível do desenvolvimento cultural e sócio-económico. A malária é uma doença infecciosa, causada por um protozoário do género Plasmodium e é transmitida naturalmente ao hospedeiro humano por picada da fêmea do mosquito do género Anopheles infectado. As espécies de parasitas que podem infectar os humanos e causar malária são quatro: P. vivax, P. falciparum, P. ovale e P. malariae, sendo a espécie P. falciparum a mais patogénica, causando doença grave. A forma grave da doença pode ter complicações cerebrais, hepáticas, renais, circulatórias e hematológicas. Atendendo às alterações climáticas ocorridas nos últimos anos e ao aumento de viajantes para zonas endémicas bem como ao facto que no passado a Região de Aveiro já foi afectada pela malária, é importante estudar a incidência de malária na Região de Aveiro, avaliando a sua evolução, de modo a evitar o ressurgimento da malária. Este trabalho teve como objectivo avaliar a incidência de malária no distrito de Aveiro, caracterizar a população afectada e relacionar os casos positivos de malária com alterações nos parâmetros hematológicos e bioquímicos. O diagnóstico de malária foi feito em pacientes do Hospital Infante D. Pedro de Aveiro (HIDP), durante o período de Janeiro de 2005 a Janeiro de 2009. Durante este período foram diagnosticados dez casos clínicos positivos de malária. A suspeita de malária ocorreu quando o paciente apresentava sintomas da doença (febre, vómitos, náuseas, mal-estar, diarreia, entre outros), associados a viagens recentes a países onde a malária é endémica. O diagnóstico laboratorial foi feito através da observação de Plasmodium no esfregaço de sangue periférico (ESP) e da realização de exames bioquímicos e hematológicos. Os resultados laboratoriais obtidos revelaram alterações a nível hepático e hematológico com observação de parasitas de Plasmodium, nomeadamente de P. falciparum. Os níveis de alanina aminotransferase (ALT), de aspartato aminotransferase (AST), de bilirrubina total (BILT) e de desidrogenase láctica (LDH), foram, de um modo geral, superiores aos valores de referência. Pelo contrário, os níveis de hemoglobina (Hb), de glóbulos vermelhos (GV) e plaquetas (PLT) apresentaram valores mais baixos que os valores de referência. De um modo geral, em estádios mais avançados da doença verificou-se uma maior alteração dos parâmetros bioquímicos e hematológicos bem como uma maior parasitémia, podendo nestas situações serem mesmo observadas formas de esquizontes e gametócitos. Conclui-se que os casos de malária detectados neste estudo foram importados de países endémicos para esta doença, nomeadamente de África, não se tendo verificado nenhum caso de transmissão em Portugal. The Malaria is a serious problem not only for public health, but also for the cultural and socio-economic development. The Malaria is an infectious disease caused by a protozoan of the genus Plasmodium and is transmitted naturally to the human host through the infected female mosquito bite of the Anopheles genus. Parasites species that can infect humans and cause malaria are four: P. vivax, P. falciparum, P. ovale and P. malariae, being P. falciparum specie the most pathogenic, causing severe illness. The severe form of the disease can lead to brain, liver, kidney and circulatory system complications as well as hematologic alterations. Given the climatic changes that have occurred in recent years and the increase of travellers to endemic areas as well as the fact that in the past the Aveiro Region has been affected by malaria, it is important to examine the incidence of malaria in Aveiro, evaluating its development, so as to prevent the resurgence of malaria. This study has the objective to evaluate the incidence of Malaria in the Aveiro Region, characterize the affected population, relate the malaria positive cases to hematologic and biochemical parameter alterations. The diagnostic was realized in Hospital Infante D. Pedro (HIDP) in Aveiro patients, during the period from January 2005 to January 2009. During this period ten positive clinical cases for Malaria were diagnosed. Malaria suspicion occurs when the patient shows illness symptoms (chills, fever, muscle pain and splenomegaly) associated with recent travel to countries where Malaria is endemic. The diagnostic was realized through plasmodium observation in peripheral blood smear and with haematological and biochemical tests. The laboratory test results reveal changes in liver function, blood count and Plasmodium parasites observation, particularly P. falciparum in the peripheral blood smear. The Aspartate Aminotransferase (AST), Alanine Aminotransferase, (ALT) Total Bilirrubins (BILT) and Lactic Dehydrogenase (LDH) levels were generally higher when compared to normal values. In the other hand, the haemoglobin (Hb), red cells (GV) and platelets (PLT) values were lower than the reference levels. Generally, in advanced stages of the disease a higher alteration of the biochemical and hematologic parameters was found, as well as a higher parasite percentage. Forms like schizonts and gametocites may be found in this situation. We concluded that this Malaria cases were imported from endemic zones, namely Africa, and there weren’t transmission cases in Portugal.

Mestrado em Biologia Celular e Molecular As doenças lisossomais de sobrecarga (DLS) são um grupo de doenças hereditárias do metabolismo, caracterizadas pela deficiência em determinadas vias catabólicas intralisossomais. A doença de Danon é uma doença de transmissão associada ao cromossoma X, clinicamente caracterizada por cardiomiopatia, miopatia do músculo esquelético e atraso mental variável e resulta da ocorrência de mutações no gene LAMP2 que codifica a proteína associada a membrana do lisossoma-2 (LAMP-2). Nesta patologia, assim como na doença de Pompe, ocorre a acumulação de vacúolos intracitoplasmáticos com material autofágico e resíduos de glicogénio nos músculos esqueléticos e cardíacos. Para um diagnóstico diferencial da doença de Danon, torna-se fundamental o diagnóstico molecular. Actualmente, em Portugal, não está implementado nenhum método molecular de diagnóstico da doença de Danon. 0s objectivos deste estudo são implementar uma metodologia molecular para pesquisa de alterações do gene LAMP2 por sequenciação genómica, cobrindo as 9 regiões codificantes e as junções intrónicas flaqueadoras e, ainda, contribuir para o diagnóstico diferencial da doença de Danon em casos de diagnóstico complexo. A amostra seleccionada para este estudo consistiu em 33 casos recebidos de consultas de referência, na área das doenças neuromusculares, com suspeita clínica de doença de Pompe, não confirmada após procedimento analítico de diagnóstico. O uso de DBS como material biologico proporcionou grandes vantagens em relação ao sangue total devido ao seu prático manuseamento e transporte e envio de amostras a distância, permitindo, deste modo, reportar esta metodologia para uma escala nacional de rastreio. Para além deste facto, a nova metodologia torna-se num processo mais rápido e económico através da extracção automática do gDNA no aparelho Bio Robot EZ1 e da utilização de primers com cauda. Foram detectadas 4 alterações em 17 dos 33 casos estudados, incluindo 3 polimoríismos do gene LAMP-2 já descritos na literatura e 1 nova alteração intrónica, cuja natureza causal deverá ser objecto de estudo em trabalho futuro. O desenvolvimento deste trabalho de mestrado permitiu implementar um método molecular de diagnóstico da doença de Danon, possibilitando o seu diagnóstico diferencial em casos de diagnóstico complexo. A metodologia proposta tem aplicabilidade imediata ao nível da caracterização da doença de Danon na população portuguesa. Finalmente, esta abordagem molecular permitirá oferecer a população portuguesa um diagnóstico correcto e eficaz da doença de Danon e, consequentemente, um tratamento adequado, um aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal as famílias afectadas. Lysosomal storage diseases (LSD) are a group of inherited metabolic diseases characterized by the impairment of the intralysosomal catabolic pathways. Danon disease is a rare X-linked disorder characterised clinically by cardiomyopathy, skeletal myopathy and variable mental retardation and results from mutations in the LAMP2 gene that encodes the lysosome-associeted membrane protein-2 (LAMP-2). In this disease, as well as in Pompe disease, occurs the accumulation of intracytoplasmic vacuoles containing autophagic material and residues of glycogen in skeletal and cardiac tissues. For a differential diagnosis of Danon disease, a molecular diagnosis is essential. Until now, in Portugal, no method has been implement for the molecular diagnosis of Danon disease. The goals of this study are to implement a molecular methodology by genomic sequencing of the LAMP2 gene, covering all 9 coding regions and flanking intron-exon junctions and alço, to contribute to the differential diagnosis of Danon disease in cases of complex diagnostic. The sample selected for this study consisted of 33 cases with compatible clinical features of Pompe disease and with as yet unconfirmed diagnosis following routine analytic procedures. The use of Dried Blood Spots as biological material provided great advantages compared to whole blood because of its convenient handling and transportation, allowing a nationwide screening. In addition, the new methodology becomes a quicker and cheaper process through the automatic extraction of gDNA by Bio Robot EZ1 and the use of primers with M13 tails. In this study, we were able to identify 4 variants in theLAMP-2 gene among the 33 studied cases, that included 3 known polymorphisms and 1 new intronic variant, which should be studied in future. This work enabled the implementation of a molecular diagnostic method for Danon disease, as well as, the differential diagnosis in cases of complex diagnosis. The proposed method is readily applicable to the characterization of Danon's disease in the portuguese population. Finally, this molecular approach will lead to accurate diagnosis of Danon's disease allowing genetic counselling and prenatal diagnosis for families affected.