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Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad Pública de Navarra.--2020-08-11.--Sobresaliente Cum Laude, [ES] Una molécula de RNA mensajero (mRNA) está compuesta por una región codificante (CDS) flanqueada por dos regiones no traducidas (UTRs), la 5’UTR y la 3’UTR, respectivamente. En eucariotas, las 3’UTRs son elementos claves en la regulación post-transcripcional. El acortamiento o la desregulación de estas regiones están asociado con diversas enfermedades como el cáncer o trastornos metabólicos. En comparación, el conocimiento de las funciones de las 3’UTRs en bacterias es mucho menor. Durante los últimos años, se ha demostrado que las 3’UTRs bacterianas pueden regular la expresión del mRNA que las contiene al igual que pueden ser reservorios de RNAs no codificantes (ncRNAs). Se les ha vinculado en la regulación de procesos bacterianos esenciales como la virulencia, el metabolismo del hierro y la formación de biofilm. En consecuencia, las 3’UTRs pueden jugar un papel mucho más amplio de lo que se había sugerido inicialmente. Sin embargo, todavía hay muchas cuestiones por resolver, por ejemplo, ¿cuál es el grado de conservación de sus secuencias tanto a nivel intra- como inter-especie? ¿Con qué frecuencia los genes ortólogos de bacterias estrechamente relacionadas mantienen conservadas las 3'UTRs? ¿Cómo afectan las variaciones nucleotídicas a la funcionalidad de las 3'UTRs y, en consecuencia, a la expresión de los mRNAs? En esta Tesis, por medio de análisis comparativos globales de los mRNAs que codifican genes ortólogos en distintas especies del género Staphylococcus, descubrimos que la mayoría de los mRNAs contienen 3’UTRs que no están conservadas. Por el contrario, las 5’UTRs se encuentran más conservadas que las 3’UTRs, sugiriendo un sesgo evolutivo hacia las 3’UTRs. La realización de mapas transcriptómicos de diversas especies de Staphylococcus confirmó que las 3’UTRs de genes ortólogos presentaban variaciones en su longitud además de los cambios en sus secuencias. Con el fin de investigar si esta variabilidad afectaba a la expresión proteica, se crearon mRNA quiméricos fusionando las CDSs de los genes icaR, ftnA y rpiRc de Staphylococcus aureus con las 3’UTRs de los mRNAs ortólogos de diferentes especies del mismo género. Los resultados mostraron que las variaciones nucleotídicas en las 3’UTRs alteraban tanto los niveles de mRNA como de proteína. Estos resultados sugerían que las 3’UTRs de genes ortólogos podían tener funciones distintas en cada especie bacteriana. Los cambios en los niveles de expresión podían ser explicados por la presencia o ausencia de elementos reguladores específicos localizados en las diferentes 3’UTRs. Las variaciones en las secuencias de las 3’UTRs podían ocurrir por diferentes procesos incluyendo reordenamientos genómicos, variaciones nucleotídicas locales y transposiciones de secuencias de inserción. Por último, extendiendo los análisis comparativos globales a 3’UTRs funcionales ya descritas, al igual que a los sets completos de mRNAs de Escherichia coli y Bacillus subtilis, descubrimos que la variabilidad de las 3’UTRs es un fenómeno que se encuentra extendido en las bacterias. En resumen, esta Tesis demuestra que las variaciones nucleotídicas en las 3’UTRs, que ocurren de manera natural por la evolución, son capaces de producir cambios en la expresión del mRNA. Esto puede crear funciones reguladoras específicas en una determinada especie, lo que posiblemente podría contribuir a una mayor diversidad entre las especies bacterianas., [EN] A messenger RNA (mRNA) molecule is composed of a coding sequence (CDS) flanked by two untranslated regions (UTRs), the 5’UTR and the 3’UTR, respectively. In eukaryotes, 3’UTRs are key components of post-transcriptional regulatory mechanisms. Shortening or deregulation of these regions is associated with diseases such as cancer and metabolic disorders. Comparatively, little is known about the functions of 3’UTRs in bacteria. Over the past few years, researchers have shown how bacterial 3’UTRs can act as reservoirs for trans-acting non-coding RNAs (ncRNAs) as well as regulators of the expression of their own mRNAs. These recent findings place 3’UTRs as important players in the regulation of key bacterial processes such as virulence, iron metabolism and biofilm formation. As a consequence, 3’UTRs could play a broader role than initially anticipated with many questions still unanswered. For example, are 3’UTR sequences preserved within and between bacterial species? How often do orthologous genes from closely-related bacteria contain conserved functional 3’UTRs? Do nucleotide variations affect 3’UTRs functionality and, thus, mRNA expression? In this Thesis, we performed genome-wide comparative analyses of mRNAs encoding orthologous proteins in the genus Staphylococcus. We discovered that most of these mRNAs contained non-conserved 3’UTR sequences. In contrast, 5’UTRs were more conserved than 3’UTRs suggesting an evolutionary bias within 3’UTRs. Transcriptional mapping of different staphylococcal species confirmed that 3’UTRs were also variable in length. To test if the 3’UTR variability could affect protein expression, we created chimeric mRNAs by fusing the Staphylococcus aureus icaR, ftnA and rpiRc CDSs with the 3’UTRs of orthologous genes from several staphylococcal species. Northern and Western blot analyses revealed that the nucleotide variations in the 3’UTR sequences altered the mRNA and protein levels. This suggested that the 3’UTRs from orthologous mRNAs may have distinct functional roles. Next, we demonstrated that the differences in the mRNA and protein levels could be explained by the presence or absence of specific regulatory elements within the 3’UTRs. We also showed that sequence variations in the 3’UTRs might occur through different processes, including gene rearrangements, local nucleotide changes and transposition of insertion sequences. Finally, we extended the genome wide comparative analyses to already described functional 3’UTRs and the entire set of mRNAs from Escherichia coli and Bacillus subtilis. The results suggested 3’UTR variability to be a widespread phenomenon in bacteria. In summary, this Thesis shows how natural nucleotide variations in 3’UTRs affect mRNA expression. This common occurrence might be responsible for creating different functional species-specific regulatory roles and, ultimately, bacterial diversity through the course of evolution., Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación recibida a través de los siguientes proyectos de investigación: European Research Council Consolidator grant ERC-coG-2014-646869: “High-throughput in vivo studies on post-transcriptional regulatory mechanisms mediated by bacterial 3’-UTRs”. Ministerio de Economía y Competitividad. BFU2011-56698-P: “Regulación post-transcripcional mediada por las regiones 3' no traducidas del RNA mensajero en bacterias”. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. PIE-201540I013: “Regulación post-transcripcional mediada por RNAs y proteínas de unión a RNA en bacterias patógenas”

Staphylococcus aureus es una bacteria ubicua capaz de colonizar una gran variedad de ambientes. En el hombre, S. aureus coloniza las fosas nasales, piel de las axilas, ingles, garganta o incluso el tracto intestinal. Se calcula que un 20% de las personas adultas son portadores nasales de S. aureus. En determinadas circunstancias. la bacteria es capaz de atravesar la barrera epitelial y alcanzar los órganos internos. Cuando esto ocurre, S. aureus se convierte en un patógeno muy versátil capaz de causar enfermedades muy diversas que pueden ir desde infecciones leves como forúnculos o abscesos hasta enfermedades graves como endocarditis, osteomielitis, neumonía osíndrome del shock tóxico. El desarrollo de S. aureus en distintos ambientes requiere que la bacteria sea capaz de sensar las condiciones ambientales, transmitir los estímulos al citoplasma y activar los cambios necesarios para adecuar la fisiología a dicho ambiente. El principal mecanismo para sensar y responder a las señales ambientales en bacterias son los sistemas de dos-componentes (TCSs). Los TCSs están formados por un sensor de membrana o histidina kinasa (HK) y un regulador de respuesta citoplásmico (RR). En el proceso de activación, el sensor recibe su señal específica y se autofosforila en un dominio histidina. A continuación el fosfato es transferido al residuo aspártico del RR que se encuentra en el citoplasma. De esta forma, el RR se activa y desencadena una respuesta que será acorde a la señal recibida. Normalmente, una bacteria posee varios TCSs, siendo su número proporcional al tamaño del genoma, al número de ambientes distintos en las que es capaz de crecer y a la complejidad de su diferenciación celular. Así, bacterias que viven en ambientes muy constantes, como las bacterias intracelulares estrictas carecen de TCSs, mientras que bacterias que viven en ambientes diversos pueden poseer cientos de ellos. En relación con el número y la función de los TCSs existen varias preguntas que hasta ahora no han sido analizadas: ¿Cuantos TCSs necesita una bacteria de vida libre? ¿Son necesarios los TCSs cuando la bacteria crece en un ambiente constante? ¿Existe activación cruzada entre TCSs distintos in vivo?

En organismos eucariotas, la presencia de elementos reguladores en las regiones 3’ no traducidas (3’-UTRs) del RNA mensajero (mRNA), que controlan su estabilidad y la eficiencia de su traducción, está ampliamente reconocida. En cambio, la posible relevancia de las 3’-UTRs como elementos funcionales de los mRNAs bacterianos ha sido menospreciada. En esta Tesis Doctoral, se presentan evidencias que muestran que un tercio de los mRNAs de Staphylococcus aureus, uno de los patógenos más importantes a nivel mundial, contienen 3’-UTRs mayores de 100 nucleótidos (nt) de largo y, por lo tanto, con capacidad para albergar funciones reguladoras. Además, se vio que la mayoría de estas 3’-UTRs incluyen un terminador de transcripción Rho-independiente. Basados en esta información, fue posible predecir las 3’-UTRs en otras bacterias. Así, mediante el análisis de 25 genomas, se muestra que las 3’-UTRs largas están ampliamente distribuidas en el mundo procariota. Con el fin de evaluar el rol que las 3’-UTRs pueden ejercer en el control de la expresión de los mRNAs, se seleccionó la 3’-UTR larga del mRNA de icaR, que codifica para el represor de la síntesis de principal exopolisacárido de la matriz del biofilm de S. aureus. Se descubrió que una región de esta 3’- UTR hibrida con una región de la 5’-UTR que incluye la secuencia Shine- Dalgarno. Como resultado de esta interacción, se crea una región de RNA de cadena doble que bloquea la formación del complejo de iniciación de la traducción y que, además, es reconocida por la endoribonucleasa RNase III que digiere este dúplex de RNA, promoviendo la degradación del mRNA de icaR. Además, se descubrió que cambios conformaciones en la estructura de la 5’-UTR controlan la interacción con la 3’-UTR en respuesta a la temperatura. A 23ºC (temperatura ambiental), una región de la 5’-UTR hibrida con una zona de la región codificante (ORF) generando una estructura secundaria cerrada de tres horquillas que impide la interacción con la 3’-UTR, lo que causa la acumulación de la proteína IcaR y, en consecuencia, la inhibición de la formación del biofilm. En cambio, a 37ºC (temperatura del hospedador) esta conformación estructural se abre permitiendo la interacción entre la 5’- y la 3’-UTR, inhibiendo la traducción de IcaR y facilitando la formación de biofilm. En resumen, esta Tesis Doctoral muestra un nuevo mecanismo de regulación post-transcripcional que modula la expresión génica en respuesta a cambios en la temperatura ambiental, a través de la modificación de la interacción entre dominios de RNA codificados tanto en la 3’-UTR como en la 5’-UTR de una misma molécula de mRNA.