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La endometriosis (EDT) es una de las enfermedades ginecológicas benignas más comunes en mujeres en edad reproductiva y se define por la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina. Debido a la cuestionada eficiencia de la terapéutica actual y basándonos en trabajos previos de nuestro grupo, orientamos la búsqueda de terapias alternativas hacia compuestos naturales que puedan administrarse por períodos prolongados sin causar efectos adversos. El objetivo general de esta tesis consistió en evaluar el efecto del ácido elágico y dos de sus metabolitos, urolitina A y B; sobre el crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murino de EDT. Asimismo, se evaluaron sus efectos sobre el crecimiento y comportamiento de células epiteliales y estromales endometriales in vitro. Los resultados obtenidos resultan prometedores ya que todos los tratamientos, especialmente con los metabolitos, provocaron efectos inhibitorios sobre el comportamiento celular y el desarrollo de la EDT, in vitro; así como las urolitinas demostraron tener efectos antiproliferativos y proapoptóticos in vivo. Estos resultados avalan continuar investigando los mecanismos de acción de estos compuestos, ya que podrían representar una nueva estrategia terapéutica potencial para el tratamiento de la EDT. Endometriosis (EDT) is one of the most common benign gynecological diseases in women of reproductive age and is defined by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. Due to the questioned efficiency of the current therapeutics, and based on previous work made by our research group, we focused our searching of alternative therapies towards natural compounds that can be administered for prolonged periods without causing adverse effects. The general objective of this thesis was to evaluate the effect of ellagic acid and two of its metabolites, urolithin A and B, on the growth of endometriotic lesions in a murine EDT model. Its effects on the growth and behavior of endometrial stromal and epithelial cells were also evaluated in vitro. The results obtained are promising because all treatments, especially metabolites, caused inhibitory effects on cell behavior and the development of EDT in vitro; Urolithins also showed antiproliferative and proapoptotic effects in vivo. These results support further research into the mechanisms of action of these compounds, as they could represent a potential new therapeutic strategy for the treatment of EDT. Fil: Mc Cormack, Bárbara Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los tumores de células de Leydig (TCL) son tumores endócrinos que se originan principalmente en el intersticio testicular, y en menor proporción en ovario, glándula adrenal y cordón espermático. Según reportes recientes asociados a una mejora en las técnicas de diagnóstico, la incidencia de los TCL testiculares se halla en aumento. Estos tumores se asocian a un 48% de infertilidad masculina, y si bien suelen ser benignos, cuando malignizan no responden a las terapias disponibles actualmente, dando como resultado una sobrevida promedio de solamente dos años. Más aun, múltiples trabajos reportan la reaparición de TCL hasta diez años después de su remoción, sugiriendo así la presencia de células remanentes en otros órganos al momento del tratamiento. Los TCL se caracterizan por una sobreproducción de esteroides, cuyo resultado es la pseudo-pubertad precoz en niños y la disfunción eréctil o ginecomastia, en adultos. En conjunto, lo expuesto evidencia la necesidad de establecer nuevos enfoques terapéuticos. La histamina (HA), amina biogénica sintetizada únicamente por la enzima histidina decarboxilasa (HDC), ha sido descripta en múltiples patologías como factor de crecimiento autócrino, además de su conocido rol como neurotransmisor y modulador de la inflamación. A su vez, ha sido relacionada con el síndrome carcinoide, en donde en forma secundaria a la patología de origen, como ser los tumores secretores de HA, el paciente experimenta diarrea, hipotensión, taquicardia, vasoconstricción, disnea, fibrosis retroperitoneal e incluso falla cardíaca. En nuestro laboratorio hemos descripto la sobreexpresión de HDC en células de Leydig (CL) tumorales MA-10, las cuales también presentan un aumento significativo en la actividad de la enzima en comparación con las CL normales. A su ez, observamos que en dichas células la HA es capaz de estimular la proliferación celular, y que ejerce un efecto modulador sobre la esteroidogénesis. En base a las consideraciones descriptas, el objetivo de este trabajo fue investigar el papel de la HA en la progresión de los TCL, su efecto sobre la neoangiogénesis tumoral, y la inhibición de HDC como potencial estrategia terapéutica, tanto para disminuir el tamaño tumoral como para evitar las complicaciones asociadas al tumor y a los tratamientos actuales. En este sentido, la orquiectomía radical y/o la quimioterapia utilizadas de rutina en la clínica conllevan efectos secundarios físicos y psicológicos, que afectan la calidad de vida de los pacientes. En primer término, realizamos ensayos in vitro en dos líneas celulares de TCL con diferente fenotipo (las CL de ratón MA-10, que secretan como esteroide mayoritario progesterona ante la estimulación con LH, y las CL de rata R2C, que secretan estradiol de forma constitutiva), y observamos que la HA incrementó la proliferación celular, la neoangiogénesis y la síntesis de esteroides. Además, las CL R2C presentaron elevada expresión de HDC, al igual que habíamos reportado previamente para las CL MA-10. En concordancia con estos resultados, observamos intensa marcación positiva para HDC en cortes de testículo de pacientes portadores de TCL, no así en controles normales de la misma edad. A su vez, la inhibición de HDC utilizando dos inhibidores, α-MHD y EGCG (sintético y natural, respectivamente) resultó en una disminución de la proliferación celular y la síntesis de esteroides, así como también disminuyó la producción de factores pro-angiogénicos por parte de las CL tumorales. Para los estudios in vivo se establecieron dos modelos de TCL murinos a partir de las líneas de CL tumorales citadas. En ambos modelos se evaluó el efecto de α-MHD y EGCG, solos o en combinación con Carboplatino (CP). En el caso de los TCL generados a partir de las CL MA-10, α-MHD fue capaz de disminuir el tamaño tumoral, solo y en combinación con CP, a diferencia de EGCG que no mostró efecto sobre el crecimiento del tumor en los tiempos y esquema de dosis estudiados. Por su parte, el crecimiento de los TCL generados a partir de las CL R2C sólo disminuyó post tratamiento con α-MHD o EGCG en combinación con CP; los inhibidores administrados solos no tuvieron efecto. Puntualmente la combinación de EGCG con CP fue la más eficaz, dado que el crecimiento de los tumores se detuvo a tiempos tempranos. A pesar de no observarse efecto de ninguno de los inhibidores solos sobre el crecimiento tumoral en los tiempos evaluados, se registró una disminución en los niveles de esteroides plasmáticos, demostrando así su capacidad de contrarrestar el desbalance hormonal asociado la presencia de un tumor endócrino. En conjunto, los resultados de estos ensayos dan cuenta de la necesidad de establecer a futuro a qué fenotipo pertenecen los pacientes con TCL, a fin de definir el inhibidor de HDC que será más efectivo. Con base en los hallazgos que aquí se describen, el presente trabajo demuestra por primera vez el rol de la HA en el crecimiento de los TCL, y sienta las bases para el desarrollo de una estrategia terapéutica novedosa, menos agresiva que las utilizadas actualmente, que apunte a la inhibición de HDC. Las publicaciones relacionadas con el efecto protector del EGCG sobre las gametas masculinas en pacientes sometidos a tratamientos oncológicos subrayan la importancia del presente trabajo, y validan el uso de EGCG en combinación con las terapias de rutina. Leydig cell tumors (LCT) are endocrine tumors that originate primarily in the testicular interstitium, and to a lesser extent in the ovary, adrenal gland and spermatic cord. According to recent reports associated with an improvement in diagnostic techniques, the incidence of testicular LCT is increasing. These tumors are associated with 48% male infertility, and although they tend to be benign, when they become malignant they do not respond to currently available therapies, resulting in an average survival of only two years. Moreover, multiple studies have reported the reappearance of LCT up to ten years after its removal, suggesting the presence of remaining cells in other organs at the time of treatment. LCTs are characterized by an overproduction of steroids, the result of which is early pseudo-puberty in children and erectile dysfunction or gynecomastia in adults. All in all, the evidence above demonstrates the need to establish new therapeutic approaches. Histamine (HA), a biogenic amine synthesized solely by histidine decarboxylase (HDC) enzyme, has been described in multiple pathologies as an autocrine growth factor, in addition to its well-known role as a neurotransmitter and modulator of inflammation. Also, HA has been related to the carcinoid syndrome, a paraneoplastic syndrome which causes the patient to experience diarrhea, hypotension, tachycardia, vasoconstriction, dyspnea, retroperitoneal fibrosis and even heart failure. In our laboratory we have described the overexpression of HDC in MA-10 tumor Leydig (LC) cells, which also have significantly increased enzyme activity compared to normal LC. Also, we observed that in these cells HA is capable of stimulating cell proliferation, and that it can modulate steroidogenesis. Based on the above, the objective of this thesis was to investigate the role of HA in the progression of LCT, its effect on tumor neo-angiogenesis, and the inhibition of HDC as a potential therapeutic strategy not only to reduce tumor growth but also to minimize complications related to the tumor itself and to current treatments. In this sense, radical orchiectomy and / or chemotherapy routinely used in the clinic have physical and psychological side effects that affect the life quality of the patients. Firstly, we performed in vitro assays in two LCT cell lines with different phenotype (MA-10 mouse LCs, which secrete progesterone upon stimulation with LH as a major steroid, and R2C rat LCs, which secrete estradiol in a constitutive manner), and we observed that HA increased cell proliferation, neo-angiogenesis and steroid synthesis. In addition, R2C LCs showed high HDC expression, as we had previously reported for MA-10 LCs. In accordance with these results, we observed intense positive HDC staining in testis sections of patients with LCT, but not in normal controls of the same age. Additionally, inhibition of HDC using two inhibitors, α-MHD and EGCG (synthetic and natural, respectively) resulted in a decrease in cell proliferation and steroid synthesis, as well as in a decreased production of pro-angiogenic factors by tumor LC. For in vivo studies, two murine LCT models were established based on the aforementioned tumor LC lines. In both models we evaluated the effect of α-MHD and EGCG, as single agents or in combination with Carboplatin (CP). In the case of the LCT generated from MA-10 LCs, α-MHD was able to decrease the tumor size, alone and in combination with CP, unlike EGCG which showed no effect on tumor growth over the time and dosing scheme studied. On the other hand, the growth of the LCT generated from R2C Lcs only decreased after treatment with α-MHD or EGCG in combination with CP; the inhibitors administered alone had no effect. Particularly, the combination of EGCG with CP was the most effective, since the growth of the tumors stopped at early stages. In spite of not observing an effect of any of the inhibitors alone on tumor growth in the evaluated times, we did see a decrease in plasma steroid levels, thus demonstrating their ability to counteract the hormonal imbalance associated with the presence of an endocrine tumor. Together, the results of these work evidence the need to establish the phenotype to which patients baring LCT belong, in order to define which HDC inhibitor would be most effective. Based on the findings described herein, this work demonstrates for the first time the role of HA in the growth of TCL, and sets the basis for the development of a novel therapeutic strategy, less aggressive than the ones currently used, directed to HDC inhibition. Recent publications related to the protective effect of EGCG on male gametes in patients undergoing cancer treatments underline the importance of this work, and validate the use of EGCG in combination with current therapies. Fil: Abiuso, Adriana María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las células madre amnióticas epiteliales (hAECs) son aisladas del amnios de la placenta humana a término. Son pluripotentes, no son tumorigénicas y poseen propiedades inmunomoduladoras. Estas características las vuelven candidatas ideales para la medicina regenerativa. La falla hepática es una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Si bien el trasplante representa el mejor tratamiento, existen varios obstáculos al respecto. Recientemente, las hAECs han sido propuestas como fuente alternativa de hepatocitos debido a su potencial de diferenciación hepatogénica. Por otro lado, el amnios presenta potencial terapéutico para tratar diferentes enfermedades, incluido el cáncer. Varios estudios indican que la membrana amniótica posee propiedades antiproliferativas, antiangiogénicas y proapoptóticas, concertando de esta manera una actividad antitumoral. El carcinoma hepatocelular (HCC) es el tercer tipo de cáncer que más muertes causa a nivel mundial. Actualmente, se buscan tratamientos alternativos a la radio o quimioterapia, con mayor efectividad. El presente trabajo de Tesis ha sido desarrollado con el objetivo de estudiar y caracterizar a las hAECs durante su diferenciación hepática, evaluando los mecanismos celulares relativos a la proliferación y a los caminos de transducción de señales activados, así como su potencial regenerativo. Por otro lado, se analizaron las propiedades antiproliferativas del medio condicionado de la membrana amniótica (MC-MA) en modelos de hepatocarcinoma, evaluando su potencial antitumoral. En primer lugar, demostramos utilizando un protocolo con factores de diferenciación (DH), que las hAECs se diferencian eficientemente a células símil-hepáticas, incrementándose la expresión de marcadores hepáticos y la síntesis de glucógeno, así como la proliferación y la progresión del ciclo celular; y activándose las vías de MAPK y de PI3K. El tratamiento de las hAECs con medio condicionado de hepatocitos en cultivo (MC) no resultó eficiente para inducir la diferenciación hepática y la proliferación de las hAECs. En este contexto, nos planteamos evaluar la capacidad regenerativa de las hAECs diferenciadas con el medio DH, en un modelo murino de daño hepático inducido con CCl4. Observamos que el trasplante de hAECs diferenciadas disminuye parámetros característicos de la fibrosis hepática como la necrosis, los depósitos de colágeno y los niveles de enzimas hepáticas. En conjunto, nuestros resultados evidencian la potencial aplicación de las hAECs diferenciadas en el tratamiento de enfermedades hepáticas en el contexto de la medicina regenerativa. Por otro lado, demostramos que el MC-MA disminuye significativamente la proliferación y la viabilidad de células HepG2 y HuH-7 y regula la expresión de microARNs involucrados en el desarrollo del HCC, contribuyendo a su posible efectiva acción antitumoral. Nuestros estudios amplían el conocimiento acerca de las propiedades antitumorales de la membrana amniótica, representando un avance para los futuros tratamientos alternativos contra el HCC. Amniotic epithelial stem cells (hAECs) can be isolated from the amnion of the human placenta at term. They are pluripotent, they are not tumorigenic and they have immunomodulatory properties. These characteristics would make it ideal candidates for regenerative medicine. Hepatic failure is one of the major causes of morbidity and mortality in the world. Although liver transplantation is the best treatment, there are several obstacles. Recently, hAECs have been spotlighted as alternative source of hepatocytes because of their potential for hepatogenic differentiation. On the other hand, the amnion has therapeutic potential to treat different diseases, including cancer. Several studies indicate that the amniotic membrane possesses antiproliferative, antiangiogenic and proapoptotic properties, thus leading to an antitumoral activity. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third type of cancer that causes more deaths worldwide. Currently, alternative treatments to radio- or chemotherapy have been searched. This work has been developed in order to study and to characterize the hAECs during their hepatic differentiation. In particular, we evaluated the cellular mechanisms regarding proliferation and the signaling pathways involved, as well as their regenerative potential. Moreover, we analyzed the antiproliferative properties of the human amniotic membrane conditioned medium (AM-CM) in hepatocarcinoma models, as part of its antitumoral potential. First, we demonstrated by applying a protocol with differentiation factors (HD), that hAECs efficiently differentiate to hepatic like cells, increasing hepatic markers expression and glycogen synthesis, as well as proliferation and cell cycle progression. The MAPK and PI3K pathways are activated during this differentiation process. The treatment of hAECs with conditioned medium of cultured hepatocytes (CM) was not efficient to induce neither hepatic differentiation nor proliferation of hAECs. In order to validate the regenerative capacity of the differentiated hAECs, we evaluated these hepatic like cells in a CCl4-induced mouse liver injury model. We observed that the differentiated hAECs transplantation decreases liver fibrosis characteristic parameters such as necrosis, collagen deposition and liver enzyme levels. Taken together, our results show the potential application of hepatocyte differentiated hAECs in the treatment of liver diseases. On the other hand, we demonstrated that AM-CM significantly decreases the proliferation and viability of HepG2 and HuH-7 cells and regulates the microRNAs expression involved in the HCC physiology, all together contributing to a possible effective anticancer action. Our studies increase the knowledge about the amniotic membrane antitumoral properties, representing an innovation for future alternative treatments against HCC. Fil: Riedel, Rodrigo Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las proteínas MAGE-I (Melanoma Antigen Gene) constituyen una de lasfamilias multigénicas más grandes con expresión tumoral, la cual agrupa a los Mage-A, Mage-B, Mage-C. Estos genes se caracterizan por su expresión específicaen tumores, por su alta conservación de secuencia (todos contienen un dominiocomún llamado MHD, Mage Homology Domain) y por su localización en elcromosoma X. Las primeras observaciones funcionales mostraron una correlaciónentre los altos niveles de expresión algunos Mage-A y la resistencia a drogasantitumorales. Así es que en los últimos años se ha investigado la potencial funciónde estos genes en distintos modelos. Nuestro grupo de trabajo ha aportado alestudio de los genes mage-I el mecanismo por el cual MageA2 causa la resistenciaa ciertos agentes quimioterapéuticos e impide el gatillado de la senescenciainducida por PML mediante la activación de oncogenes como Ha-Ras. Estosmecanismos involucran, por un lado, la interacción de MageA2 con el oncosupresorp53 y la inhibición de su actividad transcripcional por la unión MageA2/HDAC3 (deacetilasa de histonas 3) formando el complejo inhibitorio p53/MageA2/HDAC3;y, por otro lado, une en forma directa a PML-IV (proteína de la leucemiapromielocítica–3) interfiriendo en el eje PML-IV/p53. Las observaciones sobre la función y/o localización de otros MAGE-I nosllevaron a elaborar nuestra primera hipótesis: la conservación de secuencia dentrode esta familia de proteínas no implicaría necesariamente una redundanciafuncional. Por otro lado, dada la relevancia de la función de p53, nos llevó aformular nuestra segunda hipótesis de trabajo: podrían existir vías intracelularescapaces de proteger a p53 de la actividad de MageA2. En la primera parte de este trabajo de Tesis caracterizamos otro miembro dela familia MAGE-I, del subgrupo B: la proteína MageB2 logrando evidenciar que laexpresión de MageB2 induce proliferación en distintas líneas celulares en formaindependiente de la inhibición de p53. Vinculamos la actividad de MageB2 a laregulación de factores de transcripción pro-oncogénicos como de la familia E2Fs yc-Myc. Además MageB2 se acumula en el nucléolo, aunque su distribucióncomprende tanto en citoplasma como en el núcleo también, dato que nos llevó aevaluar y evidenciar su asociación a los ribosomas. En la segunda parte de este trabajo de Tesis determinamos que la expresiónde p14ARF (p14, Alternative Reading Frame) revierte la inhibición que MageA2ejerce sobre p53 causando la relocalización de MageA2 del núcleo a los nucléolosen forma similar a lo que hace con Mdm2, un inhibidor de la función de p53. En conjunto, estos resultados demuestran que las proteínas MAGE-I podríanparticipar en el balance que existe en las células tumorales entre factores prooncogénicosy proteínas supresoras de tumor. Ciertas proteínas MAGE-I como MageA2 puede bloquear la actividad de p53, pero a su vez ser regulada por p14- ARF (en el caso que la célula tumoral la expresara). Por otro lado MageB2 colaboracon el fenotipo proliferativo mediante la regulación de factores de transcripciónoncogénicos como E2Fs y c-Myc. MAGE-I (Melanoma Antigen Gene) proteins are one of the larger tumorexpression multigenic families, which bring together the Mage-A, Mage-B, Mage-C. These genes are characterized by its specific expression in tumors, by its highsequence conservation (all contain a common domain called MHD, Mage Homology Domain) and because of its location on the X chromosome. The firstfunctional observations showed a correlation between the Mage-A high expressionlevels and its resistance to antitumor doxorubicin and paclitaxel drug. So, amongthis past few years it have been published works about the potential function ofthese genes. Our working group had contributed to the mage-I genes studydescribing the mechanism by which MageA2 causes the resistance to certainchemotherapeutic agents in human melanoma cells and reduces the senescenceinduced by oncogenes such as ha-Ras in normal cells. This mechanism involvesinhibition of the transcriptional activity of the p53 oncosupresor by the action ofhistone deacetylases, HDACs. More recently, we have shown that MageA2 iscapable to bound directly to PML-IV (promyelocytic leukemia protein-IV)interfering with the senescence induced by the PML-IV/p53 axis. Our observations on the function and/or localization of others MAGE-Iproteins led us to develop our a first hypothesis: the conservation of sequencewithin the MAGE-I family not necessarily implies functional redundancy. On theother hand, given the importance of p53 function, our second hypothesis is that:there might be some intracellular pathway able to protect p53 activity from MageA2. In the first part of this Thesis work we have characterized another MAGE-Ifamily member from B group: the MageB2 protein, showing that its expressioninduces induces proliferation in different cell lines independently of p53. MageB2links this activity to the regulation of pro-oncogenic transcription factors, as c-Mycand E2Fs family. Also, MageB2 accumulates in the nucleolus, althoughdistribution comprises both in cytoplasm and nucleus too. These data prompted usto verify and evidence that MageB2 could be linked to ribosome function. In the second part of this thesis we determined that p14ARF (p14, Alternative Reading Frame) expression reverses the MageA2 inhibition exerted onp53. We observed that p14ARF expression causes MageA2 relocalization from thenucleoplasm to the nucleoli in a similarly way that relocates Mdm2, an inhibitor ofp53 function. Taken together, these results demonstrate that MAGE-I proteins mayparticipate in the balance that exists in tumor cells between pro-oncogenic factorsand tumor suppressor proteins. Certain MAGE-I proteins such as MageA2 canblock the p53 activity, but in turn can be regulated by p14ARF (in the case that thetumor cell express it). On the other hand, MageB2 collaborates with theproliferative phenotype through regulation of oncogenic transcription factors suchas E2Fs and c-Myc. Fil: Toledo, María Fernanda. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La eritropoyetina (Epo) es conocida como la hormona que regula la producciónde células eritroides. Sin embargo, su rol biológico se expandió a partir delhallazgo de la expresión de receptores específicos en otros tejidos, incluyendo elnervioso. Además, se describió un efecto neuroprotector de la hormona, el cualestaría asociado a inhibición de apoptosis. Debido al interés por expandir el usofarmacológico de la Epo hacia la protección de tejidos no hematopoyéticos, seintensificó la búsqueda de estructuras modificadas de la proteína. La entidad quemerece, actualmente, mayor investigación es la Epo carbamilada en los residuoslisina (cEpo). Evidencia derivada de estudios in vitro y en animales deexperimentación indican que esta forma de Epo mantiene su actividadneuroprotectora mientras que carece de actividad eritropoyética. Esta diferentefunción evitaría un aumento innecesario de la masa eritroide en el tratamiento depacientes no anémicos con enfermedades neurodegenerativas. Con el objeto de profundizar el conocimiento sobre las diferencias observadasen la función de Epo debido a la carbamilación, en el presente trabajo se utilizóun modelo que involucra células fisiológicas y varias líneas celulares para evaluar,en conjunto y comparativamente, los efectos de cEpo y de Epo en ensayosparalelos. Fueron utilizados cultivos de células progenitoras eritroides de médulaósea de ratón, distintas líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide,tales como UT-7, dependiente de Epo para su supervivencia, TF-1, dependiente de GM-CSF y puede proliferar en presencia de Epo por períodos cortos y K562,independiente de factores de crecimiento específicos, así como la línea de origenneuronal SH-SY5Y. El primer paso consistió en realizar la carbamilación de Epo recombinante,utilizando cianato de potasio, empleando distintos tiempos y concentraciones decianato apropiadas para asegurar un completo bloqueo de los residuos lisina de la Epo. El éxito de la carbamilación fue verificado mediante electroforesis en gel y Western blotting, demostrándose el aumento de la carga neta negativa de cEpo conrespecto a la de Epo. La modificación de la estructura de la proteína porcarbamilación puede causar alteraciones funcionales, cuyo estudio constituye elobjetivo de este trabajo de tesis. Los cultivos de células UT-7 y TF-1 en presencia de cEpo mostraron unasignificativa disminución de la viabilidad celular, provocando la muerte celular porapoptosis, mientras que la Epo mantuvo la viabilidad e indujo la proliferacióncelular de ambas líneas celulares. La cEpo tampoco pudo estimular el desarrollode unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E) en cultivos de células demédula ósea de ratón, ni previno la apoptosis inducida por la citoquinaproinflamatoria TNF-α en células eritroileucémicas K562. En cambio, cEpo, al igual que Epo, actuó como factor antiapoptótico frente a lainducción de muerte celular programada inducida por TNF-α o staurosporina encélulas neuronales SH-SY5Y. Los resultados de ensayos de inhibición de vías deseñalización intracelular permiten sugerir que las acciones neuroprotectoras de Epo y cEpo son mediadas por la activación de Jak2/PI3K. Estos resultadosconfirmaron que las modificaciones moleculares introducidas en la molécula de Epo por el proceso de carbamilación generan la pérdida de su habilidad paramantener la supervivencia de las células con capacidad de diferenciación eritroidepero no afecta su acción neuroprotectora mostrando, en este caso, una actividadsimilar a la de la Epo nativa. Mediante ensayos competitivos y de inhibición por anticuerpos, tanto en lascélulas SH-SY5y como en las TF-1, se observó que la Epo puede actuar a travésdel receptor homodimérico (REpo/REpo) y el heterodimérico formado por unasubunidad REpo y una subunidad ß common (Rßc), que es también subunidad delreceptor de GM-CSF. En cambio, cEpo necesita de las subunidades REpo y Rßcpara prevenir la apoptosis de las células neuronales. A partir de la hipótesis de que la carbamilación de Epo le permite conservar sucapacidad neuroprotectora pero le impide inducir la proliferación de célulaseritroides, el siguiente objetivo fue la investigación de vías de señalización quejuegan un papel clave en la proliferación celular inducida por Epo. Si bien encultivos de células eritroides UT-7 y TF-1 cEpo indujo la fosforilación de Jak2,primer paso de activación celular, demostramos por primera vez la incapacidad decEpo para mantener la fosforilaión de Akt y FOXO3a por el mismo periodo que lohace Epo. Esto lleva a la translocación de FOXO3a al núcleo promoviendo laexpresión de la proteína regulatoria del ciclo celular p27Kip1 y generando, así, elarresto del ciclo celular por cEpo. Dado que el efecto diferencial de cEpo y Epo con respecto a la proliferacióncelular se encontraría asociado al silenciamiento de vías de señalización poraumento de la velocidad de defosforilación analizamos la expresión y actividad deuna fosfatasa, la tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), involucrada en la desregulación dela señalización por Epo. Comprobamos que la inducción de PTP1B essignificativamente mayor en presencia de cEpo, incremento que parece estarasociado al aumento de calcio intracelular inducido por este factor. Lacolocalización de PTP1B con el Rßc sustenta la conclusión de que la fosfatasadesfosforila la señalización de cEpo, interrumpiendo la vía de supervivencia y, enconsecuencia, la proliferación celular, explicando, al menos en parte, la accióndiferencial entre Epo y cEpo sobre células eritroides. Palabras claves: eritropoyetina carbamilada, eritropoyetina, proliferacióncelular, receptor de eritropoyetina, receptor ß common, tirosina fosfatasa 1B,eritropoyesis, neuroprotección. Erythropoietin (Epo) is known as the hormone regulating the production oferythroid cells. However, its biological role was expanded after the discovery ofspecific receptors expressed in other tissues, including the nervous tissue. Moreover, a neuroprotective effect that could be associated to apoptosis inhibitionwas described for the hormone. Due to the interest in expanding the pharmacological use of Epo over theprotection of non-hematopoietic tissues, the search for modified structures of theprotein became more intense. The chemical entity currently under investigation isthe Epo carbamylated in lysine residues (cEpo). Results from in vitro and in vivoexperiments indicate that this form of Epo retains its neuroprotective ability, whilelacking in erythropoietic activity. This different function would prevent anunnecessary increase in erythroid mass in non-anemic patients under treatmentfor neurodegenerative diseases. With an aim to further the existing knowledge of the changes observed in Epoafter carbamylation, in the present work we used a model involving physiologicalcells as well as cell lines, to globally and comparatively evaluate the effects of Epoand cEpo in parallel assays. Erythoid progenitor cells from mouse bone marrowwere used to study the development of colony-forming units-erythroid (CFU-E). The cell lines capable of erythroid differentiation employed were UT-7, dependenton Epo for survival, TF-1, dependent on GM-CSF and able to proliferate in thepresence of Epo for short periods, and K562, independent of any specific growthfactor where cell line of neuronal origin was SH-SY5Y. The first step in the work consisted in the carbamylation of rhuEpo usingpotassium cyanide. This salt decomposes when dissolved generating an anionwhich allows it to bind the protein’s lysine residues. The carbamylation processwas carried out at different times and cyanide concentrations to ensure completebinding, and therefore the blockage of Epo’s lysine residues. The carbamylation of Epo was confirmed by gel electrophoresis, electrotransfer and immunodetection,where cEpo showed a decrease in positive charge due to the blockage of lysines,and consequently an increase in its net negative charge in comparison to Epo. Inthe carbamylation product (cEpo), a carbamyl group is coupled to each lysineresidue in the Epo molecule, thus modifying the protein structure and potentiallycausing functional alterations. In the presence of cEpo, cultures of UT-7 and TF-1 cells showed a significantdecrease in cell viability, leading to cell death by apoptosis, whereas Epomaintained viability and induced proliferation of both cell lines. cEpo did notsupport the development of colony-forming units-erythroid (CFU-E) in cultures ofmouse bone marrow cells, nor did it prevent apoptosis induced by theproinflammatory cytokine TNF-α in erythroleucemic K562 cells differentiated withhemin. On the other hand, both cEpo and Epo acted as antiapoptotic agents protectingfrom the induction of programmed cell death by TNF-α or staurosporin inneuronal SH-SY5Y cells. Based on inhibition assays for intracellular signalingpathways, it may be suggested that the antiapoptotic action of cEpo and Epo ismediated by the activation of Jak2/PI3K. Our results confirmed that the modifications introduced in the Epo moleculeafter carbamylation produce a loss of its ability to support the survival of cellscapable of erythroid differentiation, but it does not affect its neuroprotective actionon SH-SY5Y cells, showing an activity similar to that of the native Epo. By carring out inhibition and competence assays, we found that Epo can actthrough both receptors involved in neuronal SH-SY5Y and TF-1 cells: thehomodimer (REpo/REpo) and the heterodimer comprising a REpo monomer and aßcommon subunit (Rßc), which is also present in the GM-CSF receptor. Weobserved that cEpo requires both REpo and the R c subunit to prevent apoptosisin neuronal cells. Owing to the fact that after carbamylation Epo maintains its antiapoptoticability but can no longer induce erythroid cell proliferation, the following objectiveof this work was to investigate the signaling pathways playing a key role in Epoinducedcell proliferation. Although in cultures of erythroid UT-7 and TF-1 cellscEpo induced Jak2 phosphorylation, which is the first step of cell activation, wedemonstrated for the first time that cEpo was unable to maintain Akt and FOXO3a phosphorylated for the same period of time as did Epo. Dephosphorylation of FOXO3a, which promotes its translocation to the nucleus asthe transcription factor for the cell cycle regulatory protein p27kip1, wasdemonstrated through an increase in the expression of the latter in cultures withcEpo. Since the differential effect of Epo and cEpo on cell proliferation may beassociated to the silencing of transduction pathways by an increase in thedephosphorylation rate, we analyzed the expression and activity of the tyrosinephosphatase 1B (PTP1B), involved in the the desregulation of Epo’s signalling. Wefound that PTP1B induction is significantly higher with cEpo, an increase whichseems to be linked with the rise in intracellular calcium induced by this factor. Co-localization of PTP1B and Rßc supports the conclusion that the enzymedephosphorylates Epo’s signalling faster than that of cEpo, thus interruptingpathways of survival, and consequently, of proliferation. This explains, at least inpart, the differential effects of Epo and cEpo on erythroid cells. Keywords: erythropoietin, carbamylated erythropoietin, cell proliferation,erythropoietin receptor, ß common receptor, tyrosine phosphatase 1B,erythropoiesis, neuroprotection. Fil: Chamorro, María Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La endometriosis se define como la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidaduterina y sus principales síntomas asociados son el dolor y la infertilidad. Las terapias médicasdisponibles actualmente resultan insuficientes debido a las altas recidivas de la enfermedad y losefectos adversos que generan. Asimismo, en los últimos años, se ha propuesto a los inhibidores dela angiogénesis como posible alternativa terapéutica, así como también el uso de compuestosnaturales presentes en alimentos que formen parte de nuestra dieta. El objetivo general de esta tesis consistió en evaluar el efecto de un agenteantiangiogénico, el bevacizumab, y de dos polifenoles naturales, el resveratrol y el galato deepigalocatequina (EGCG); sobre el crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murinode endometriosis. Asimismo, se estudió el efecto in vitro de los polifenoles sobre la supervivenciade células epiteliales de endometrio eutópico provenientes de pacientes con endometriosis ymujeres controles. Nuestros resultados sugieren que el resveratrol y el EGCG tendrían un efecto inhibidor delcrecimiento del endometrio ectópico, regulando los niveles de apoptosis y proliferación celular, asícomo la vascularización de la lesión endometriósica. El bevacizumab también mostró ser efectivoen la inhibición de la endometriosis en el modelo murino. No obstante, es importante considerarsus posibles efectos secundarios y su costo como tratamiento. Siendo así, sugerimos que elresveratrol y el EGCG serían una opción terapéutica promisoria. Los resultados obtenidos en esta tesis avalan continuar investigando estos compuestosnaturales para poder definir los mecanismos de acción que participan en el efecto inhibitorioobservado, y determinar también las concentraciones plasmáticas efectivas en pacientes parapoder esclarecer su potencial utilidad como agentes preventivos en el tratamiento de laendometriosis. Endometriosis is defined as the presence of endometrial tissue outside the uterine cavitybeing its main associated symptoms, pain and infertility. Medical therapies available up to date areunsatisfactory due to their adverse effects and the frequent pathology recurrences. In the last fewyears, antiangiogenic agents and several natural compounds present in different dietary sourceshave been proposed as a potent alternative therapy. Given this scenario, the general objective of the present thesis was to evaluate the effectof bevacizumab, known for its antiangiogenic properties, as well as the effect of two naturalpolyphenols, resveratrol and epigallocatechin-3-gallate (EGCG), on the growth of endometrioticlesions in a mouse model of endometriosis surgically induced. Moreover, the effect of bothpolyphenols on the survival of epithelial endometrial cells from endometriosis patients and controlsubjects was evaluated in vitro. Our results suggest that resveratrol and EGCG would have a repressive effect onendometriotic growth, by increasing apoptosis and reducing cell proliferation and vascularizationwithin the epithelial fraction of the endometriotic lesion. Bevacizumab was also effective in theinhibition of endometriosis development in the mouse model. Nevertheless, it is important to takeinto account its adverse effects as well as its cost. Based on these data, we propose thatresveratrol and EGCG become a promising therapeutic option. Our results support to keep ongoing with the research in order to elucidate themechanisms of action involved in the observed inhibitory effects, and determine the effectivedoses for patients to clarify the usefulness of these agents in endometriosis treatment. Fil: Ricci, Analía Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La endometriosis se caracteriza por la presencia de focos de tejido endometrial por fuera de la cavidad uterina confiriéndole, a las mujeres que la padecen, fuertes dolores pélvicos e infertilidad. Basándonos en trabajos previos realizados en cáncer, evaluamos la aplicación de los inhibidores de aromatasa, los inhibidores de ciclooxigenasa (COX)-2 y los agonistas de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR)γ como posibles alternativas terapéuticas para la endometriosis. Específicamente evaluamos los efectos del inhibidor de aromatasa, anastrozole, del inhibidor selectivo de COX-2, celecoxib y del ligando de PPARγ, rosiglitazona sobre el crecimiento de células endometriales in vitro y sobre la implantación y crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murino de endometriosis. Los resultados obtenidos son promisorios ya que todos los tratamientos provocaron efectos inhibitorios del desarrollo de la endometriosis así como efectos antiproliferativos, proapoptóticos y antiangiogénicos tanto in vivo como in vitro. Por otro lado, luego de administrar anastrozole y celecoxib en forma conjunta, no pudimos demostrar una mejora del tratamiento combinado por sobre la aplicación de cada una de las terapéuticas de manera individual. Nuestros resultados avalan al inhibidor de COX-2 como una alternativa terapéutica concreta para la endometriosis y, sugieren que la combinación de celecoxib con una glitazona podría mejorar la involución de la endometriosis, aunque aún se requiere profundizar los estudios para confirmar estos últimos datos. Endometriosis is characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. Women suffering from endometriosis experience pelvic pain and infertility. On the basis of previous cancer research, we evaluated aromatase inhibitors, cyclooxygenase (COX)- 2 inhibitors and peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)γ agonists as possible alternatives for endometriosis treatment. Specifically, we evaluated the effects of anastrozole, an aromatase inhibitor, celecoxib, a selective COX-2 inhibitor, and rosiglitazone, a PPARγ agonist on endometrial cell growth in vitro and on the implantation and growth of endometriotic lesions in a murine model of endometriosis. The results obtained are promising given that all treatments inhibited endometriosis development and had antiproliferative, proapoptotic and antiangiogenic effects both in vitro and in vivo. On the other hand, after anastrozole and celecoxib combined administration we could not demonstrate an improvement over the drugs administered individually. Our results support the COX-2 inhibitor as a real option as an alternative for endometriosis treatment and suggest that celecoxib combined with a glitazone might improve endometriosis involution, although this must be further confirmed. Fil: Olivares, Carla Noemí. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La maduración del sistema nervioso es el resultado de un intrincado balance entre mecanismos de proliferación y diferenciación neuronal, apoptosis y refinamiento sináptico. Estos procesos no son exclusivos de la vida embrionaria, sino que algunas estructuras nerviosas se recambian continuamente aun durante la vida adulta. El caso mejor conocido es el de las neuronas receptoras olfatorias (ORNs), en las cuales este fenómeno se verifica durante toda la vida en todos los vertebrados analizados. El recambio cíclico de las ORNs ocurre también en respuesta a la muerte neuronal masiva provocada por la destrucción del epitelio olfatorio (EO), haciendo de este sistema un excelente modelo para el estudio de la neurogénesis y de la regeneración neuronal. El propósito de esta tesis es analizar algunos aspectos poco conocidos del proceso de neurogénesis usando un modelo de destrucción del EO en larvas de anuros por inmersión en sulfato de zinc (ZnSO4) desarrollado previamente en nuestro laboratorio. Para ello diseñamos una prueba comportamental con el fin de evaluar la capacidad de los animales de responder a estímulos olfatorios durante el proceso de regeneración. Esta herramienta nos permite analizar la funcionalidad del EO y luego procesar a los mismos animales para estudiar los fenómenos de proliferación celular, diferenciación neuronal y participación de factores tróficos en ese proceso mediante técnicas histológicas e inmunohistoquímicas. Observamos que los animales que responden al estímulo presentan niveles normales de proliferación celular y un grado avanzado de diferenciación de las ORNs a nivel histológico y de expresión de marcadores de maduración neuronal, aunque el tamaño de esta población celular es pequeño en relación a los animales intactos. A partir de esto concluimos que el grado de avance de la recuperación morfológica del EO requerido para la readquisición de la funcionalidad es relativamente escaso. Por otro lado, el análisis de la distribución del Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (BDNF) indica que aumenta su expresión en regiones específicas del sistema olfatorio luego del tratamiento con ZnSO4, lo que sugiere que desempeña un papel importante en la reconstitución del EO y su reconexión con el bulbo olfatorio. The nervous system maturation is the outcome of an intricate balance among proliferation, neuronal differentiation, apoptosis and synaptic refinement mechanisms. These processes are not fully restricted to embryonic development, as some nervous structures undergo continuous lifelong turnover. The best documented case is that of olfactory receptor neurons (ORNs) in which this phenomenon occurs throughout life in all vertebrates analyzed. Cyclic ORNs turnover also occurs in response to massive neuronal death induced by injury to the olfactory epithelium (OE), rendering this system as an excellent model to study neurogenesis and neuronal regeneration. This thesis aims to analyze some poorly known aspects of the neurogenic process using an experimental model of OE disruption induced by immersion of anuran larvae in zinc sulfate (ZnSO4) that has been previously developed in our lab. For that purpose we designed a novel behavioral test aimed to evaluate the animals’ responsiveness to olfactory stimuli during the regeneration process. This tool allows us to analyze OE functionality and then processing the same individuals to study cell proliferation, neuronal differentiation and involvement of trophic factors in this process by means of histological and immunohistochemical procedures. We observed that the stimulus-responsive animals show normal levels of cell proliferation and an advanced degree of ORNs differentiation at histological and maturity markers expression levels, even if this cell population has a small size related to that of intact animals. Based on this evidence we conclude that the degree of morphological recuperation required for acquisition of functionality is relatively small. On the other hand, analysis of Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) distribution shows that its expression increases in specific regions of the olfactory system after ZnSO4 treatment, thus suggesting that it plays an important role in OE reconstitution and reconnection to the olfactory bulb. Fil: Yovanovich, Carola Anabel Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Estudiamos los canales aniónicos ORCC y CFTR y el canal de sodio ENaC en la línea BeWo derivada de trofoblasto humano. La actividad iónica fue estudiada con la técnica de patch clamp en las configuraciones de canal único (inside out y cellattached) y célula entera (whole cell). La expresión de las proteínas fue analizada con técnicas corrientes de biología molecular. Los tres objetivos fueron: 1) identificar y caracterizar la actividad de esos canales con la ayuda de agentes farmacológicos, 2) estudiar la expresión de las proteínas de los canales clonados; 3) analizar la participación de esos canales en la proliferación, y la migración celular por medio del modelo de cierre de la herida. Los principales resultados fueron: Las células BeWo tienen canales aniónicos y catiónicos funcionales que se expresan en la membrana. Las corrientes de Na+ por el canal ENaC sensible al amiloride y las corrientes transportadas por el ORCC y CFTR participan en la migración o proliferación celular. La aldosterona que estimula la metilación de ENaC juega un papel importante en el mecanismo por el cual el ENaC participa en la migración celular. En conclusión, fuimos capaces de aislar y caracterizar canales aniónicos y catiónicos en las células BeWo y establecer su papel en la migración y proliferación celular. Anion channels such as ORCC and CFTR and the sodium channel ENaC were studied in the human trophoblastic cell line BeWo. Ion channel activity was recorded in the cell attached and inside out and in the whole cell configurations with patch-clamp technology and the expression of the proteins were studied with current techniques of molecular biology. Three main objectives were planned: 1) to identify and characterize the activity of these channels with pharmacological tools; 2) to study the expression of the cloned channels in the cell membranes; 3) to analyze the participation of these channels in the cellular processes and migration with the aid of a wound healing model. The main results were: BeWo cells have functional anionic and cationic channels and they are expressed in the membranes. Na+ currents mediated by the amiloride sensitive ENaC and currents transported by CFTR and ORCC are involved in either cell migration or cell proliferation. Aldosterone which stimulates protein methylation of ENaC seems to play an important role in the mechanism of action of ENaC in the migration process. In conclusion we were able to identify clearly anionic and cationic channels in BeWo cells and to establish their participation in the migration and proliferation processes. Fil: Marino, Gabriela Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La retina de los peces óseos, a diferencia de la retina de los mamíferos, posee células progenitoras multipotentes que proliferan a lo largo de toda la vida del animal, originando todos los tipos celulares retinianos, que se agregan al tejido diferenciado a medida que éste crece. Este crecimiento ocurre en una región histológicamente distinguible, ubicada entre la retina neural y el epitelio ciliar, denominada zona ciliar marginal (CMZ), cuyas células poseen capacidad proliferativa. Esta zona representa un anillo de tejido, alrededor de la retina madura, donde existe un gradiente de diferenciación celular, que comprende tanto stem cells (más periféricas) como células progenitoras ya comprometidas con determinados fenotipos retinianos (más centrales). Una característica sorprendente de la retina adulta de pez es que posee la capacidad de regenerarse completamente en respuesta al daño. Por consiguiente, la retina de este vertebrado ofrece características únicas para el estudio de los factores extracelulares e intracelulares que dirigen la proliferación celular y que llevan a la regeneración del tejido adulto. Tanto algunas neuronas como células gliales de la retina, así como también las células del epitelio pigmentario, liberan ATP hacia el espacio extracelular, donde éste, o sus productos de hidrólisis, actúan como neurotransmisores, o neuromoduladores, a través de su unión a receptores purinérgicos específicos. La liberación de ATP puede producirse en respuesta a diversos estímulos fisiológicos, ya sea mecánicos, químicos, osmóticos o eléctricos, o en respuesta a condiciones patológicas como la hipoxia, deshidratación, neurodegeneración o frente a una lesión. Los nucleótidos extracelulares, además de interactuar de manera autócrina o parácrina con receptores purinérgicos de membrana, son hidrolizados por ectonucleotidasas presentes en la membrana plasmática. Entre estas enzimas, una familia importante se denomina ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa (E-NTPDasa). La actividad de estas enzimas no sólo garantiza la finalización del estímulo inducido por los nucleótidos extracelulares, sino que además posibilita la conversión de unos nucleótidos en otros, por ejemplo, ATP a ADP, éste a AMP y luego a adenosina, o UTP a UDP. Estos productos de hidrólisis, a su vez, presentan diferente afinidad por distintos receptores, provocando diversas respuestas intracelulares. El conjunto de nucleótidos y nucleósidos extracelulares, receptores y NTPDasas se conoce como sistema de señalización purinérgica. En esta tesis doctoral, se realizó una caracterización detallada del posible rol regulatorio de las señales purinérgicas sobre la capacidad proliferativa y regenerativa de la retina adulta de pez cebra en respuesta al daño. Se utilizaron dos modelos de daño de tipo citotóxico, uno que provoca una lesión parcial del tejido, generando muerte celular solamente en las capas internas de la retina (interneuronas y células ganglionares), y otro que causa una lesión global, que involucra a todos los tipos celulares retinianos, incluyendo a los fotorreceptores. En primer lugar, se describió que una lesión citotóxica con ouabaína, ya sea parcial o global, indujo la activación mitótica de las células proliferativas presentes tanto en el tejido maduro diferenciado como en la CMZ, alcanzándose un pico de máxima proliferación a los 7 días luego de la lesión. Además, se evidenció un importante rol de los nucleótidos extracelulares en la regulación de esta activación mitótica luego de la inducción de ambos tipos de lesión, ya que el tratamiento con un exceso de enzimas que hidrolizan nucleótidos extracelulares disminuyó significativamente el máximo aumento de proliferación celular. Asimismo, el tratamiento con MRS2179 (un antagonista de los receptores purinérgicos metabotrópicos P2Y1 con alta afinidad por el ADP) disminuyó significativamente el pico de proliferación celular inducido por la lesión (tanto parcial como global) de la retina. Es interesante destacar que retinas no lesionadas y tratadas con un análogo poco hidrolizable del ADP presentaron un aumento significativo de la actividad proliferativa tanto en las capas de tejido maduro como en la CMZ. Estos resultados indicaron que el ADP es una señal suficiente para inducir activación mitótica de los precursores retinianos aún en ausencia de daño. El efecto del ADP en el tejido intacto fue también inhibido completamente por un antagonista del receptor P2Y1. Se observó también que los nucleótidos extracelulares son fundamentales para la reparación del tejido, ya que retinas lesionadas y posteriormente tratadas con apirasa o MRS2179 mostraron un mayor grado de desorganización tisular y desaparición nuclear en todas las capas retinianas, en comparación con retinas lesionadas. El grado de regeneración de las retinas dañadas y sometidas posteriormente a los tratamientos mencionados exhibió un retardo con respecto al tejido lesionado y en regeneración en presencia de señalización purinérgica endógena. Asimismo, se observó que el tratamiento de retinas lesionadas con ARL67156, un inhibidor selectivo de las ecto-ATPasas, disminuyó significativamente el incremento de proliferación celular, evidenciando la importancia de la actividad de las NTPDasas en la regulación de la proliferación celular inducida por la lesión del tejido. Por otra parte, se evidenció un importante rol de los nucleótidos extracelulares en la regulación de la muerte celular inducida por la lesión, ya que la remoción enzimática de estos nucleótidos incrementó significativamente este proceso. Este efecto fue reproducido al bloquear los receptores P2Y1, sugiriendo un rol neuroprotector del ADP, particularmente sobre los fotorreceptores retinianos. Estos resultados sugirieron que las señales purinérgicas son capaces de atenuar significativamente los efectos de la lesión citotóxica sobre la muerte neuronal y glial. Posteriormente, se observó que el nivel de expresión del ARNm de las NTPDasas 1, 2mq, 2mv, y 3 aumentó significativamente luego de inducida la lesión. En concordancia, el patrón espacial de expresión de la proteína NTPDasa2 sufrió importantes cambios luego de la inducción de la lesión. Finalmente, se describió la expresión del receptor P2Y1 en la retina de pez cebra. El nivel de su ARNm, así como su expresión proteica, aumentaron de manera significativa luego de inducida la lesión citotóxica con ouabaína. Se observó además, mediante la técnica de western blot, un cambio en el patrón de expresión en las etapas de degeneración y proliferación, luego de lesionar el tejido retiniano. En conjunto, estos resultados demuestran un rol fundamental, necesario y suficiente del sistema de señalización purinérgica en el control de los mecanismos de proliferación y muerte celular que ocurren durante el proceso de regeneración de la retina adulta de pez cebra. Teleost fish retina, in contrast with mammal retina, has multipotent progenitor cells that proliferate throughout the animal life, giving rise to all cell types of mature retina, which are added to the differentiated tissue whereas it grows. Moreover, teleost fish retina has a ciliary marginal zone (CMZ) with proliferative capacity, localized around the mature retina, where there is a gradient of cell differentiation, including stem cells, progenitor cells committed to specific retinal phenotypes, and fully differentiated neurons. Remarkably, in teleost fish mechanical, chemical, laser or light damage of the mature retina activates regenerative mechanisms. Regeneration and growth that occur in the adult teleost retina by neurogenesis have been helpful in identifying molecular and cellular mechanisms underlying cell proliferation and differentiation. In the retina, ATP is released from neurons and glia (and also from the retinal pigmented epithelium) to the extracellular milieu where this nucleotide, or its hydrolysis products, acts as a neurotransmitter or neuromodulator by binding to purinergic receptors. ATP release can occur in response to physiological stimuli or to pathological conditions, including retinal damage. Extracellular nucleotides such as ATP, ADP, and UTP are extracellularly dephosphorylated by ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) localized in the cell membrane. The activity of these enzymes not only guarantees the completion of a specific stimulus, but allows the conversion of some agonists to other, with different specificity for different receptors. Extracellular nucleotides and nucleosides, receptors and NTPDases are known as purinergic signaling system. In the present work, we performed a characterization of the possible regulatory role of purinergic signals on the capacity of the zebrafish retina to regenerate in response to damage. We use two different models of cytotoxic lesion: a partial lesion, which produces damage only in the inner layers of the retina, and a global injury, which involves all retinal layers, including photoreceptors. We described that cytotoxic lesion with ouabain, either partial or global, increases cell proliferation both in the mature retina and in the CMZ, with a maximum at 7 days post injury (dpi). Moreover, we demonstrated an important role for extracellular nucleotides in regulating injury-induced cell proliferation, regardless the magnitude of the injury, because treatment with enzymes that hydrolyze extracellular nucleotides significantly decreased the peak of cell proliferation. In addition, treatment with MRS2179 (an ADP-activated P2Y1 receptor selective antagonist) provoked a significant decrease in the injury-induced cell proliferative peak normally observed 7 dpi both in the CMZ and the mature retina. Interestingly, ADPβS significantly increased cell proliferation in intact retinas both at the CMZ and mature retina. Moreover, the selective antagonist MRS2179 of the metabotropic ADP- activated receptor P2Y1 significantly inhibited the increment in cell proliferation induced by ADPβS. We also demonstrated that extracellular nucleotides play a crucial role in retinal repair, since retinas treated with apirase or MRS2179 after lesioning were damaged at a higher level than control ouabain-treated retinas. Additionally, we observed that treatment with ARL67156, which has been shown to inhibit NTPDase activity, significantly reduced injury-induced cell proliferation, showing a role for the enzymes that catalyze the extracellular hydrolysis of ATP as well as other nucleotides in controlling cell proliferative activity in lesioned retinas. On the other hand, we described an important role for purinergic signals in regulating cell death induced by injury, since scavenging of extracellular nucleotides significantly increased cell death. This effect is partially reproduced by blocking P2Y1 receptors suggesting a neuroprotective function for ADP. Furthermore, lesioned retinas showed a significant increase of NTPDase1, 2mq, 2mv and 3 following injury. In accordance with this result, expression pattern of NTPDas2 changed after injury. Lesioned retinas also showed a significant increase of P2Y1 receptor mRNA expression relative to undamaged retinas in the proliferative phase. P2Y1 receptor protein, when assessed by western blot and immunocytochemistry, showed a lesion-induced change in its expression pattern as well as an increase and modified distribution on damaged retinal layers. In summary, this study demonstrated a crucial role for endogenous purinergic signals regulating cell proliferation, as well as cell death, induced by a cytotoxic injury of the adult zebrafish retina, which underlays retinal repair. Fil: Battista, Ariadna Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.