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In dieser Arbeit wurden sekundär transplantierbare, gestielte Fettgewebskonstrukte entwickelt. Diese bestehen aus volumenstabilen, bioabbaubaren Polyurethan-Schwämmen, Fibrin, humanen Stammzellen (Adipose-derived stromal and stem cells (ASC) oder Stroma-Vaskuläre-Fraktion (SVF)) und proliferativen und induktiven Nährmedien und wurden mikrochirurgisch vaskularisiert und in ein Mausmodell implantiert. Diese Arbeit konzentriert sich auf den Vergleich von Stammzellformulierungen und die Physiologie der Gewebeentstehung, um einer klinischen Translation näher zu kommen. In this work, secondary transplantable, pedicled fat-tissue constructs were developed. They consist of volume-stable, biodegradable polyurethane-scaffolds, fibrin, human stem-cells (adipose-derived stromal and stem cells (ASC) or stromal-vascular-fraction (SVF) and proliferative and inductive culture medium and were microsurgically vascularized and implanted in a mouse model. This work focuses on the comparison of stem-cell formulations and the physiology of tissue development to reach another step towards clinical translation.

Die vorliegende Arbeit beschreibt einen Tierversuch im Bereich des Adipose Tissue Engineerings. Dabei wurden Polyurethanscaffolds mit humanen mesenchymalen Stammzellen besiedelt und in 25 Nacktmäuse subkutan implantiert. Neben der Formstabilität der Scaffolds wurden die Auswirkungen eines Gefäßanschlusses, einer Induktion der Stammzellen und das Verhältnis zwischen implantierten und wirtseigenen Zellen nach einem Beobachtungszeitraum von 12 Wochen untersucht. This dissertation describes an animal experiment in the field of adipose tissue engineerings. Therefor scaffolds of polyurethane colonised with human mesenchymal stem cells were implanted subcutaneously into 25 nudemice. After 12 weeks of observation we analyzed the form stability of the scaffolds, the integration of a vascular pedicle, the effect of induction of the stem cells and the relation between implanted and host cells.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Anzüchtung humaner Chondrozyten auf der Trägermatrix Novocart® 3D und die Eignung des Materials für die Deckung von Gewebsdefekten in der rekonstruktiven Kopf-/Hals- Chirurgie untersucht. Die aus humanem Septumknorpel gewonnenen Chondrozyten wurden in Monolayerkultur expandiert, auf dem Träger angesiedelt und in einen dreidimensionalen Gewebsverband übersiedelt. Die Kulturbedingungen wurden optimiert und durch neue Erkenntnisse aus den Vorversuchen erweitert. So konnten das Verhalten der expandierten Zellen auf der Trägermatrix, verschiedene Beimpfungsstrategien und die Optmierung des Kulturmediums untersucht werden. The present thesis deals with the cultivation of human chondrocytes on the carrier Novocart® and the carriers suitability for covering tissue defects in reconstructive head and neck surgery. Chondrocytes obtained from human septal cartilage have been expanded in monolayer culture, seeded on the carrier an settled in a threedimensional tissue structure. The culture conditions have been optimized and extended in consideration of prior experiments. We were able to investigate the cells behaviour on the carrier, develope different seeding strategies and optimize the culture medium.

EINLEITUNG: Durch Verwendung tissue engineerter autologer Fettzellen können Nachteile klassischer Verfahren des Weichgewebsersatzes nach Verbrennungen, Tumoroperationen und Traumata wie Narbenbildungen im Spendergebiet und Abstoßungsreaktionen vermieden werden. METHODIK: Um die A. und V. femoralis von 48 athymischen Nacktmäusen wurden mit Präadipozyten beimpfte Polyurethanschäume (PU; ø 5mm, Dicke 2mm) implantiert. Als Kontrolle dienten beimpfte Konstrukte ohne Gefäßanschluss im Nacken des Versuchstiers. Die in vitro unterschiedlich vorkultivierten PUs wurden nach 1, 5, 12 und 24 Wochen in vivo, histologisch ausgewertet. ERGEBNISSE: Es zeigt sich eine deutlich höhere Angio- und Adipogenese der PUs mit Gefäßanschluss, die zudem mit der Dauer der in vitro-Vorkultivierung ansteigt. INTRODUCTION: The use of tissue engineered autologous fat-cells avoids side effects of classical methods in reconstructive surgery like scar tissue formation at donor site and rejection of transplants. METHODS: Polyurethane scaffolds (ø 5mm, thickness 2mm) seeded with adipocyte precursor cells were implanted around the femoral vessels of 48 nude athymic mice. As control groups, scaffolds were implanted into the neck without connection to vessels. The in vitro differently precultivated scaffolds were explanted after 1, 5, 12 and 24 weeks in vivo. RESULTS: Histological analysis revealed higher angio- and adipogenesis in scaffolds with vascular integration and long in vitro precultivation time.

In der Arbeit wurden humane Präadipozyten isoliert, amplifiziert und in Polyurethangerüste eingebracht. Diese wurden um die Leistenarterie von Nacktmäusen implantiert und nach definierten Zeitpunkten explantiert. Als Ergebnis wurde die Eignung von Polyurethan als Scaffold bestätigt, das Überleben der Präadipozyten nachgewiesen, und die Neovaskularisierung durch das femorale Gefäßbündel dargestellt. Die Differenzierung der Präadipozyten zu reifen Fettzellen war größtenteils negativ. In this study human preadipocytes were isolated, amplificated and brought into polyurethane scaffolds. These were implanted around die femoral vessels of nude mice and harvested after specific time periods. As results the applicability of polyurethane as a scaffold was prooved, the survival of preadipocytes was shown and the neovascularization of the femoral pedicle was presented. The differentiation of the adipose precursor cells into mature fat cells was mostly negativ.

In dieser Studie wurden mit primären, humanen Chondrozyten besiedelte Polyurethankonstrukte axial durch einen implantierten Gefäßstiel der Maus perfundiert und für 3 Wochen in vivo belassen. Anschließend wurden sie in eine Bauchtasche transponiert, als Kontrolle dienten nicht-perfundierte Konstrukte. In den histologischen und biochemischen Untersuchungen zeigte sich in Abhängigkeit der Verbleibedauer in vivo ein deutlich höheres Zellwachstum bei gleichzeitigem Verlust der knorpeltypischen hyalinen Morphe bei den perfundierten Konstrukten, nicht jedoch bei den Kontrollen. In this study we seeded human chondrocytes onto polyurethane scaffolds an inserted a vascular pedicle of an immunodeficient mouse into it to promote vascularization. After 3 weeks in vivo the seeded scaffolds were transposed into an abdominal pouch. As controls served seeded scaffold without vascular contact. The histological and biochemical examinations revealed an increase in cell number corresponding to the time spent in vivo while losing the cartilage-specific morphologic features at the same time. The controls did not show these alterations.

Um die Rolle des Sauerstoffgehalts in tissue-engineerten Knorpelkonstrukten besser zu verstehen, wurden Sauerstoffmessungen mithilfe von Glasfaser-Mikrosensoren im Zentrum von Polyurethanzellträgern durchgeführt, die im Vorfeld mit humanen Chondrozyten beimpft und unterschiedlich lang kultiviert wurden. Im Anschluß daran erfolgten Untersuchungen zu Vitalität, Nassgewicht, Zellzahl und Glykosaminoglykangehalt. To understand the role of oxygen tension in tissue engineered cartilage, measurements with fiber-optic microsensors in the center of polyurethan constructs were done. These constructs were seeded with human chondrocytes and has been cultivated various periods of time. After all that, investigations followed about vitality, wet weight, cell density and the amount of glucosamine glykane.

Der Ersatz von Weichteildefekten ist eine der größten Herausforderungen der modernen Medizin. Fettgewebskonstrukte, die nach dem Prinzip des Tissue Engineering generiert werden, stellen einen vielversprechenden Therapieansatz dar. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag daher in der Schaffung eines Goldstandards zur Isolierung und Kultivierung von Präadipozyten. Ein weiteres Ziel war die Beimpfung von dreidimensionalen Polyurethankonstrukten und deren Kultivierung in vitro. Dies erfolgte durch Variation geeigneter Kulturmedien, unterschiedlich langer Denaturierungszeiten und unter Verwendung eines MiniMacsTM Systems. The correction of soft tissue defects is a challenge in plastic surgery. By using tissue-engineering techniques, generated autologous fat grafts represent a promising solution. In this study we created a standard for preadipocytes isolation and cultivation. Furthermore preadipocytes were seeded on 3D polyurethane scaffolds, which were cultivated in vitro afterwards. Therefore a variation of culture media, different periods of digestion and the use of a MiniMacsTM System were tested.

15 Kaninchen wurden Ohrknorpelbiopsien entnommen, in Monolayerkulturen vermehrt und in einem 3D-Zellträger aus Polycaprolactone besiedelt. Diese Knorpelzellkonstrukte wurden in einen Hautlappen implantiert und mittels mikrochirurgisch implantierter Gefäßschlinge neovaskularisiert. Anschließend wurden sie als 3D-Gewebelappen gehoben und in situ mikrochirurgisch frei reimplantiert. Makroskopisch konnte gezeigt werden, dass die präfabrizierten 3D-Lappen, basierend auf dem neu implantierten Gefäßstiel, frei transplantierbar sind. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die gezüchteten 3D-Ohrknorpelkonstrukte in einen präfabrizierten Hautlappen integriert werden können. Interessant ist dies insbesondere für gezüchtete Gewebe die unabhängig von Hautlappen Defekte ersetzen sollen, wie zum Beispiel Leberzellen oder kontraktile Elemente. Dies ist eine neue und vielversprechende Neovaskularisationstechnik für den Bereich des Tissue Engineering. 15 rabbits were operated. Cartilage-engineered constructs were created by isolating chondrocytes from auricular biopsies, amplifying in monolayer culture, and then seeding them onto polycaprolactone scaffolds. Each prefabricated skin flap, with implanted cartilage-engineered construct was neovascularized by implantation of an arteriovenous vascular pedicle. The neovascularized 3D-flaps were freely transplanted into position using microsurgery. All neovascularized skin flaps with embedded tissue engineered cartilage constructs were free-transferred as free flaps effectively. The implanted constructs were protected and well integrated within the flap. This method is very interesting with respect to the replacement of tissue regardless of skin flaps like e.g. liver cells or contractile elements. It is a new and promising technique for neovascularisation in tissue engineering.

In dieser Studie wurde ein experimentelles Modell an der Maus zur Untersuchung präfabrizierter Neovaskularisation Tissue Engineerter Konstrukte etabliert, welches eine technisch simple, zeit- und kostensparende Alternative zu bestehenden Modellen bieten soll. Untersucht wurde die Neovaskularisation zweier Gefäßkonfigurationen in Abhängigkeit des Faktors Zeit: um das femorale Gefäßbündel der Mäuse wurde ein Polyurethan-Schwamm gelegt und mit Silikonfolie isoliert. Zum einen wurde das Gefäßbündel als axialer Durchfluss belassen, zum anderen distal der PU Matrix ligiert. In einem zweiten Versuchsdurchgang wurden mit bovinem und humanem Knorpel besiedelte Implantate an axialem Durchfluss präfabriziert. Die Auswertung erfolgte makroskopisch und mikroskopisch im Hinblick auf Neovaskularisation und Zellmorphometrie. Sämtliche Ergebnisse wurden mit Daten aus Literatur, bzw. eigenen Untersuchungen an Kaninchen verglichen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem hier untersuchten Modell um eine vereinfachte, aber valide Versuchs-Variante handelt. Aim of this study was to establish an experimental model in the mouse to investigate prefabricated neovascularization of Tissue Engineered Constructs, which presents a technically simple, timesparing and affordable alternative to various existing models. Neovascularization of two different vessel configurations was investigated as a function of time: a polyurethane sponge was wrapped around the femoral vessel of the mice and isolated with silicone foil. On the one hand, the vessel bundle was left as an axial flow through, on the other hand the vessel bundle was ligated beyond the construct. In a second experimental step implants colonized with human or bovine chondrocytes were prefabricated along a flow through pedicle. Analysis was done macroscopically and microscopically in terms of neovascularization and cell morphometry. Results were compared to the data from the literature, respectively to own results of former investigations. Ultimately it was able to proof, the investigated model represents a simplified, but valid experimental alternative.

In vorliegender Arbeit sollte untersucht werden, ob durch Bestrahlung die Migration von Plattenepithelkarzinomzellen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) induziert wird und ob der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) und die EGFR-abhängigen Signalwege dafür verantwortlich gemacht werden können. Aufsteigende Strahlendosen induzierten einen dosisabhängigen Anstieg der Migration. Die Inhibition des EGFR oder der nachfolgenden Signalwege reduzierte die Migration, die Stimulation der Tumorzellen mit EGF verursachte hingegen einen Anstieg der Migration. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass der EGFR und seine nachfolgenden Signalwege in die strahleninduzierte Migration von HNSCC involviert sind. Die Proteine dieser Signalwege könnten in Kombination mit einer Strahlentherapie zukünftig ein Therapieziel bei HNSCC darstellen. The aim of this study was to evaluate whether radiotherapy induces migration in Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and whether blocking of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream pathways reduces tumor cell migration. Increasing doses of irradiation induced a dose-dependent enhancement of migrating cells. The inhibition of EGFR or the downstream pathways reduced the migration, whereas stimulation of HNSCC cell with EGF caused a increase in migration. These results demonstrate that the EGFR and its downstream pathways are involved in radiation induced migration of HNSCC cells. The proteins of these pathways might be a target for therapy of HNSCC in combination with radiotherapy.

Präfabrikation von axial neovaskularisierten Hautlappen, die einen weiteren Entwicklungsschritt in der rekonstruktiven Chirurgie darstellen und durch deren Anwendung auf den Bereich des “Tissue Engineerings“ sich vitale, dreidimensionale Strukturen originalgetreu züchten lassen. In experimentellen Studien am Kaninchen wurde die Neovaskularisation bei 156 Bauchhautlappen mit unterschiedlichen Modellvarianten des implantierten Gefäßstiels nach 4, 8, 12, 16 und 20 Tagen der Präfabrikation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass nach einer Minimalzeit von 20 Tagen bei allen Modellvarianten eine ausreichende Neovaskularisation stattgefunden hatte. Die beste Neovaskularisation fand im Modell mit maximalem Blutfluss des implantierten Gefäßstiels in Kombination mit Hautexpansion statt, gefolgt von den Modellen mit maximalem Blutfluss und die langsamste Neovaskularisation fand sich im Modell mit minimalem Blutfluss. In einer weiteren Studie wurden gezüchtete Knorpelzellkonstrukte in präfabrizierte Hautlappen mit endständiger Anastomose am Kaninchen implantiert, nach 6 Wochen Präfabrikationszeit als Verbundgewebelappen gehoben und in situ mikrochirurgisch reimplantiert. Es konnte gezeigt werden, dass alle Knorpelzellkonstrukte im Hautlappen gut umhüllt, mechanisch stabil und gut neovaskularisiert waren. In allen Konstrukten fand eine knorpelähnliche Neubildung statt. Neovascularized prefabricated flap represents a new valuable trend in reconstructive surgery. Tissue engineering can provide a promising method for replacing any three-dimensional tissue defect. In the first experimental study in rabbits, neovascularization was evaluated in a total of 156 abdominal prefabricated flaps at the various retention times of 4, 8, 12, 16 and 20 days after flap prefabrication using different types of implanted vascular pedicles. The results indicated that 20 days appears to be the minimal length of time required for matured neovascularization in all models. Neovascularization was best in Model 5 with maximal blood flow in the implanted vascular pedicle combined with flap expansion, followed by maximal blood flow in Models 2, 3, 4 and the worst results found in Model 1 with minimal blood flow. In the second study, cartilage-engineered constructs were implanted beneath prefabricated skin flaps using an arteriovenous vascular pedicle with maximal blood flow. After 6 weeks, the neovascularized flaps with embedded cartilage-engineered constructs were completely removed based on the newly implanted vascular pedicle, and then re-transferred microsurgically into position. The results showed that the implanted constructs were well integrated and protected within the flap, stable in both form and size and well neovascularized. All constructs showed the development of neocartilage-like tissue.

In der prospektiven klinischen Studie wurde die Hebedefektmorbidität bei insgesamt 46 Rippenknorpelentnahmen zur autologen Ohrmuschelrekonstruktion untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die funktionellen Defizite nach der Hebung im Bereich der Spenderstelle nur von temporärer Dauer waren. Bei allen Patienten erholten sich die vorübergehend abgeschwächten Muskelgruppen innerhalb kürzester Zeit. Ästhetische Einbußen in Form von Konturunregelmäßigkeiten am Brustkorb waren lediglich bei sehr schlanken und jungen Patienten zu diagnostizieren, ferner stellten die mehrheitlich unter 10 cm langen Narben nur eine geringe optische Einschränkung dar. In keinem einzigen Fall traten Thoraxdeformitäten auf. Basierend auf den Ergebnissen kann die Hebedefektmorbidität in Relation zum Operationsergebnis als vernachlässigbar bezeichnet werden. In the prospective study the donor-site morbidity after harvesting rib cartilage for autogenous ear reconstruction has been investigated at overall 46 cases. It has been proven that functional deficits at the donor-site have been of temporary nature only. The preliminary weakened muscle groups of all patients recovered rapidly. Aesthetic losings in the form of contour irregularities at the chest wall have been observed merely at very slender and young patients, furthermore the scars, which are mainly below 10 cm, represent just a minor visual restriction. Chest wall deformities occurred in no single case. Based on these results the donor-site morbidity can be rated as negligible in relation to the result of the surgery.