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Esta pesquisa foi desenvolvida, utilizando 15 vacas lactantes (Holandês x Gir) alimentadas à vontade com rações isoprotéicas constituídas de 60% de silagem e 40% de concentrado na matéria seca (MS) e 0; 0,7; 1,4; e 2,1% de uréia, correspondentes aos teores de 2,08; 4,01; 5,76; e 8,07% de proteína bruta na forma de compostos nitrogenados não-protéicos (NNP), com os objetivos de desenvolver metodologia não-invasiva, para estimar a produção de proteína microbiana, utilizando-se a excreção total de derivados de purinas (DP); avaliar as concentrações de creatinina, uréia e N-uréia no plasma e no leite; e comparar as excreções de DP e uréia obtidas a partir de coletas de urina total e spot. Os animais tinham peso vivo médio inicial de 511,8 kg e foram distribuídos ao acaso entre tratamentos. O período experimental teve duração de 90 dias para cada vaca, iniciando-se imediatamente após o parto. Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente por análises de variância e de regressão. As amostras de urina foram obtidas a partir de coletas com 24 horas de duração ou a partir de amostra de urina obtida aproximadamente 4 horas após a alimentação (urina spot), enquanto as de sangue foram obtidas 4 horas após o fornecimento do alimento. As concentrações de uréia e N-uréia no plasma e leite, assim como a excreção de creatinina, que apresentou valor médio de 23,60 mg/kg PV, não foram afetadas pela adição de quantidades crescentes de NNP à ração. As excreções urinárias de uréia, alantoína, ácido úrico e DP, as purinas absorvidas e a produção de N microbiano não foram influenciadas pela dieta. As excreções diárias estimadas de uréia, alantoína e ácido úrico seguiram o mesmo padrão obtido pela coleta de 24 horas de duração. Amostra spot de urina foi capaz de estimar satisfatoriamente a excreção de DP e, subseqüentemente, a produção de N microbiano. This research was carried out, using 15 dairy cows (Holstein x Gyr) full fed isoproteic diets with 60% silage and 40% concentrate in the dry matter (DM) basis and 0, 0.7, 1.4, and 2.1% urea correspondent to 2.08, 4.01, 5.76, and 8.07% of crude protein levels in the form of non protein nitrogen compounds (NNP), with the objectives to a non invasive methodology, to estimate the microbial protein production, using the total excretion of purine derivatives (PD); to evaluate the concentrations of creatinine, urea and N-urea in the plasma and in the milk; and to compare the PD and urea excretions obtained from total urine and spot collections. The animals averaging initial live weight of 511.8 kg were randomized allotted to the treatments. The experimental period last 90 days for each cow, starting immediately after calving. The results were interpreted by variance and regression analyses. The urine samples were obtained from 24-h collections or from urine sample obtained, approximately, four hours post feeding (spot urine), while the blood samples were obtained four hours post feeding offer. The urea and N-urea concentrations in the plasma and in the milk, as well as the creatinine excretion, that showed average value of 23.60 mg/kg LW, were not affected by the addition of increasing NNP levels to the diet. The urinary excretions of urea, allantoin, uric acid and PD, the absorbed purines and the microbial N production were not influenced by dietary NNP levels. The daily estimated excretions of urea, allantoin and uric acid followed the same pattern obtained by the 24-h collection. Urine spot sample was satisfactory to estimate the PP excretion and, subsequently, the microbial N production.