Search

Um ihr eigenes Überleben zu sichern und sich Vorteile gegenüber anderen Bewohnern ihrer Umwelt zu verschaffen, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, bioaktive Sekundärmetabolite zu produzieren. Diese kann sich der Mensch als Antibiotika, Immunsuppressiva oder als Leitsubstanzen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe wie HIV-Proteaseinhibitoren oder Insulinmimetika ebenfalls zu Nutze machen. Damit stellen sie eine wichtige Quelle potentiell nutzbarer Wirkstoffe dar. Große Fortschritte wurden in den vergangenen Jahrzehnten auf dem Gebiet der Erforschung der für die Biosynthese dieser Metabolite notwendigen mikrobiellen Werkzeuge gemacht. Einerseits sind nichtribosomale Peptidsynthetasen und Polyketidsynthasen weit verbreitete Enzyme, die in viele Biosynthesen von Grundstrukturen involviert sind und aufgrund ihrer modularen Struktur viel Spielraum für Manipulationen durch die Synthetische Biologie bieten. Andererseits können Sekundärmetabolite durch Modifikationsenzyme (tailoring enzymes) wie z. B. Prenyltransferasen weiter verarbeitet werden, was ihre biologische Aktivität häufig erhöht. Um diese Enzyme gezielt einsetzen zu können, ist es von essentieller Bedeutung, ihre Struktur und Funktion zu untersuchen und zu verstehen. Zahlreiche prenylierte Bisindolylbenzochinone aus der Gruppe der prenylierten Indol-alkaloide konnten bereits aus Ascomyceten isoliert werden, biochemische Informationen waren bisher allerdings nur für die Biosynthese von Terrechinon A in Aspergillus nidulans verfügbar. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten die putativen Prenyltransferasegene astPT und ATEG_00702 (EAU39348) aus Aspergillus terreus heterolog in Escherichia coli exprimiert und anschließend bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Das rekombinante Protein AstPT katalysierte in Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) die N- und C-Prenylierung von Asterrichinon D (AQ D). Als enzymatische Produkte konnten zwei mono- und zwei diprenylierte Substanzen isoliert werden, deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie aufgeklärt wurden. Wie andere Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie war AstPT in seiner Katalyse unabhängig von Metallionen und folgte der Michaelis-Menten-Kinetik mit einer Michaelis-Konstante von 463 µM und einer Wechselzahl von 0,16 1/s für AQ D bzw. von 33,5 µM und 0,02 1/s für DMAPP. Besonderheiten von AstPT sind die Einführung von Prenyleinheiten an zwei verschiedenen Positionen des Substrates und zum anderen die hohe Spezifität für seine aromatischen Substrate. AstPT akzeptierte weder Aminosäuren noch cyclische Dipeptide, wie sonst typisch für Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie. Hingegen akzeptierte sie vier Hydroxyxanthonderivate als Substrate und katalysierte O-Prenylierungen in Anwesenheit von DMAPP, Geranyl- (GPP) und Farnesyldiphosphat (FPP), was bisher nur für ein Enzym der DMATS-Superfamilie beobachtet werden konnte. Die Michaelis-Konstante für das beste Xanthonderivat wurde mit 17,3 µM bestimmt, allerdings war die Wechselzahl für AQ D um das 160-fache höher als für das Xanthonderivat. EAU39348 konnte AQ D nicht umsetzen, mit Didemethylasterrichinon D (DDAQ D) als aromatisches Substrat war hingegen die Bildung von mehreren Produkten zu beobachten. Die langsame Umsetzung von AQ D durch AstPT und die alleinige Umsetzung von DDAQ D durch EAU39348 deuten auf eine bevorzugte Produktion von DDAQ D-Derivaten in Aspergillus terreus hin, die in deren höherer Bioaktivität begründet sein könnte. Ein drittes putatives Prenyltransferasegen, CHGG_03684, konnte aus Chaetomium globosum kloniert und in verschiedenen Expressionssystemen getestet werden. Unter diesen Bedingungen konnte jedoch kein lösliches Protein erhalten werden. Nach Solubilisierung der Protein-Einschlusskörper mittels Harnstoff wurde eine Renaturierung durch Dialyse versucht. Mit dem erhaltenen Protein und AQ D konnte in Anwesenheit von DMAPP keine Umsetzung beobachtet werden. Des Weiteren wurden vier putative, NRPS-ähnliche Gene aus Aspergillus terreus bzw. Chaetomium globosum mittels PCR amplifiziert. ATEG_02004, ATEG_03563 und CHGG_03687 konnten in den Expressionsvektor pJW24 kloniert werden, der pyrG als Selektionsmarker für die anschließende Transformation trägt. Das Konstrukt mit ATEG_02004 konnte erfolgreich in Aspergillus niger AB 1.13 eingebracht und die Integration in Genom mittels PCR nachgewiesen werden. Die Untersuchung der Sekundärmetabolit-produktion der Transformanten führte allerdings nicht zur Identifizierung der Funktion von ATEG_02004. In einem weiteren Projekt innerhalb dieser Arbeit wurde die Bedeutung verschiedener Aminosäuren in FtmPT1 untersucht, um den auf der Enzymstruktur basierten Reaktions-mechanismus zu bestätigen. Durch zielgerichtete Mutagenese mittels PCR und anschließende Überproduktion und Aktivitätstests konnte die Beteiligung des Glutamatrests 102 an der Stabilisierung des Indolstickstoffs über Wasserstoffbrückenbindungen und seine Rolle als Protonenakzeptor während der Katalyse gezeigt werden. Der Austausch von Glycin 115 führte zur Änderung der Prenylierungsposition von C 2 nach C 3 unter Entstehung eines Hexahydropyrroloindols. Dies konnte sowohl für das natürliche Substrat von FtmPT1, Brevianamid F, als auch für verschiedene cyclische Dipeptide nachgewiesen werden. Damit wurde die essentielle Rolle von G115 in der Prenylierung in FtmPT1 aufgezeigt. Mutationen der entsprechenden Aminosäure in CdpC3PT, A115, senkten nur die Aktivität. Mit dem Austausch von Tyrosin 205 gegen Phenylalanin konnte die Akzeptanz von sechs Hydroxynaphthalinderivaten gegenüber dem Wildtypprotein verbessert werden., Microorganisms developed the capability to produce bioactive secondary metabolites to ensure their own viability and get evolutionary advantages. These metabolites can be used as antibiotics or immunosuppressive drugs, but also as lead structures for the development of new drugs like HIV protease inhibitors or insulin mimetics. Therefore, microorganisms are an important source of potentially active pharmaceutical ingredients. Significant progress has been achieved in the past decades in the research on the biosynthesis of these compounds. On the one hand, nonribosomal peptide synthetases and polyketide synthases are common enzymes involved in the biosynthesis of the backbones of numerous metabolites and their module-based structure represents a target for manipulations with the means of synthetic biology. On the other hand, secondary metabolites can be further modified by tailoring enzymes like prenyltransferases which often leads to a higher biological activity. It is of particular importance to investigate these structures and to understand their functions in order to make use of those enzymes. Many prenylated bisindolylbenzoquinones belonging to prenylated indole alkaloids have been isolated from ascomycetes, but biochemical information has been available only for the biosynthesis of terrequinone A in Aspergillus nidulans prior to this thesis. In this thesis the putative prenyltransferase genes astPT and ATEG_00702 (EAU39348) from Aspergillus terreus were expressed heterologously in Escherichia coli and subsequently purified to near homogeneity. The recombinant protein AstPT catalysed the N- and C-prenylation of asterriquinone D in the presence of dimethylallyldiphosphate (DMAPP). The enzyme products, two mono- and two diprenylated compounds, were isolated and their structure was elucidated by NMR spectroscopy and mass spectrometry. As other prenyltransferases from the DMATS-superfamily, AstPT was not dependent on the presence of metal ions for its catalytic activity. The reaction apparently followed Michaelis-Menten kinetics and the Michaelis constant was determined at 463 µM with a turnover number at 0.16 s-1 for AQ D and at 33.5 µM and 0.02 s 1 for DMAPP, respectively. Special features of AstPT were the introduction of prenyl moieties at two distinct sites of the substrate and its high specificity towards its aromatic substrate. It accepted neither amino acids nor cyclic dipeptides, which are typical substrates of prenyltransferases of the DMATS-superfamily. However, it accepted four hydroxyxanthone derivatives as substrates and catalysed O-prenylations in the presence of DMAPP but also from geranyl- (GPP) and farnesyldiphosphate (FPP). This phenomenon has only been observed for one enzyme from this group before. The best accepted xanthone derivative had a Michaelis constant at 17.3 µM, but the turnover number for AQ D was 160 times higher than for this hydroxyxanthone. EAU39348 was not able to convert AQ D. Using didemethylasterriquinone D (DDAQ D) as aromatic substrate, the formation of several products was observed. The slow conversion of AQ D by AstPT and the exclusive acceptance of DDAQ D by EAU39348 may indicate that the production of DDAQ D derivatives is preferred in Aspergillus terreus. The reason for this might be the stronger biological activities of DDAQ D derivatives in comparison to AQ D derivatives. A third putative prenyltransferase gene, CHGG_03684, was cloned from Chaetomium globosum and overproduction was tested in different expression systems. Unfortunately, no soluble protein was obtained under these conditions. An attempt of renaturation via dialysis was made after solubilisation of inclusion bodies with urea, but no activity was observable after incubation with AQ D and DMAPP. Furthermore, four putative NRPS-like genes from Aspergillus terreus and Chaetomium globosum were amplified via PCR. ATEG_02004, ATEG_03563 and CHGG_03687 were cloned into the expression vector pJW24 containing pyrG as a selection marker for subsequent transformations. The construct with ATEG_02004 was successfully trans-ferred into Aspergillus niger AB 1.13 and the genomic integration was confirmed via PCR. The function of ATEG_02004 could not be identified by investigation of the produced secondary metabolites. In addition, the importance of several amino acid residues in FtmPT1 was studied in this thesis to support the proposed reaction mechanism, which is based on the enzyme structure. The involvement of glutamate 102 in the stabilization of the indole nitrogen and its role as proton acceptor during catalysis was shown in activity assays after site-directed mutagenesis and overproduction of the proteins. Exchange of glycine 115 for threonine led to a shift of the prenylation position from C 2 to C 3 and the introduction of a hexahydropyrroloindole. This was observed by using the natural substrate brevianamide F as well as different cyclic dipeptides. These results revealed the essential role of G115 in the prenylation of FtmPT1. Mutation of the corresponding amino acid in CdpC3PT did not have any effect on the prenylation position and simply decreased the activity. The exchange of tyrosine 205 for phenylalanine increased the acceptance of six hydroxynaphthaline derivatives. more...

Hydroxyzimtsäureester und -amide, z.B. Hydroxycinnamoylchinat, Hydroxycinnamoylshikimat, Hydroxycinnamoyltyramin und Rosmarinsäure, sind im Pflanzenreich sehr weit verbreitet. Pflanzen synthetisieren diese Stoffe zur Abwehr gegen Bakterien oder Pilze, nutzen sie aber auch als UV-Schutz. Die Rosmarinsäuresynthase (RAS, Hydroxy-cinnamoylCoA:Hydroxyphenyllactat Hydroxycinnamoyltransferase) ist für die Biosynthese der Rosmarinsäure (RA), einem wichtigen phenolischen Inhaltsstoff der Buntnessel (Coleus blumei), essentiell. Zur Kristallisation und Strukturanalysen des RAS-Proteins wurde RAS-cDNA heterolog in E. coli exprimiert. Da das Protein hauptsächlich in inclusion bodies vorliegt, wurde eine Rückfaltung und Resolubilisierung durchgeführt. Auf Grund der geringen Aktivität wurde das RAS-Protein in SoluBL21TM E. coli-Zellen heterolog exprimiert. Nach Aufreinigung durch Gelpermeationschromatographie konnte aktives, sauberes Protein für Kristallisationsversuche verwendet werden. Es erfolgte jedoch kein Kristallwachstum. RAS, HST (Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat Hydroxycinnamoyltransferase), die zur Bildung von Lignanen und Monolignolen wichtig ist, und HQT (Hydroxycinnamoyl-CoA:Chinat Hydroxycinnamoyltransferase), ein Enzym der Chlorogensäure (CA)-Biosynthese, sind wichtige Vertreter der Hydroxycinnamoyltransferasen (HCTs). Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung verschiedener HCTs in dem Efeublättrigen Gundermann (Glechoma hederacea). Die krautige, mehrjährige Pflanze ist in Europa, Asien und Amerika beheimatet und kann als interessantes Untersuchungsobjekt angesehen werden, da sie RA, CA und Kaffeesäure akkumuliert. Eine partielle cDNA-Sequenz, die möglicherweise für eine Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat/Chinat Hydroxycinnamoyltransferase kodiert, konnte aus Glechoma herderacea isoliert werden. Außerdem wurden die RA-, CA- und Kaffeesäuregehalte, sowie die Transkriptmenge der RAS, HST und einer unbekannten HCT in Blättern, Blüten, Stängeln und Wurzeln bestimmt. Die untersuchten Transkripte konnten in allen Organen, außer in Wurzeln, nachgewiesen werden. Die Blüten akkumulierten 12,5% RA, während der Gehalt in Blättern, Stängeln und Wurzeln bei etwa 1% lag. Darüber hinaus wurde die Akkumulation der CA, RA und Kaffeesäure und außerdem die spezifische Aktivitäten der RAS und der Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL) in einer Suspensionskultur von Glechoma hederacea bestimmt. Während des Untersuchungszeitraums von 14 Tagen wurden Wachstums- und Mediumsparameter, sowie der Sekundärmetabolismus untersucht. Die maximale PAL-Aktivität konnte an Tag 5 und die maximale RAS-Aktivität an Tag 8 bestimmt werden. RA war im Vergleich mit den anderen Sekundärmetaboliten mit fast 26% an Tag 7 am stärksten vertreten. In einem anderen Projekt wurden die spezifische Aktivität und Substratspezifität von bereits konstruierten CbRAS/HST- und CbHST/RAS-Chimären analysiert. Die Kristallstrukturanalyse verschiedener HCTs zeigt, dass sie aus zwei ungefähr gleich großen Domänen aufgebaut sind. Durch den Austausch der beiden Domänen konnten die Chimären synthetisiert werden. Die Aktivitätstests zeigten geringe RAS-Aktvität bei beiden Chimären, wohingegen keinerlei HST-Aktivität gemessen werden konnte. Melissa officinalis gehört wie die beiden vorher erwähnten Pflanzen zur Familie der Lamiaceae (Unterfamilie Nepetoideae) und dient aufgrund des Gehalts an ätherischem Öl und Phenolcarbonsäuren als Arzneipflanze. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von geringen Ozonkonzentrationen auf den Primär- und Sekundärstoffwechsel untersucht. Die Melissenpflanzen wurden geringen Ozonkonzentrationen (80 ppb, 5 h) ausgesetzt, da verschiedene Studien gezeigt haben, dass erhöhte Hintergrundkonzentrationen genauso schädlich wie Ozonspitzenkonzentrationen sein können. Die Probenahme erfolgte 0, 3, 5, 12 und 24 h nach Beginn der Ozon-Begasung. Es wurden Änderungen der photosynthetischen Funktionen bestimmt, außerdem wurden ökophysiologische, biochemische und strukturelle Parameter untersucht. Nach Ende der Begasungsperiode konnten makroskopisch keinerlei Schäden erkannt werden, doch auf mikroskopischer Ebene zeigten sich nekrotische Bereiche in den Blättern. Auch wurden die photosynthetischen Funktionen stark beeinflusst. Verschiedene Enzyme, z.B. PAL, Hydroxyzimtsäure:Coenzym A Ligase (4CL), Tyrosin Aminotransferase (TAT) und RAS, sind an der Biosynthese der RA beteiligt. Durch quantitative Real-time-PCR wurden die Transkriptionslevel dieser Gene in Melissa officinalis untersucht. Es erfolgte eine schnelle Hochregulierung aller Gene, aber 24 h nach Beginn der Ozon-Begasung waren nur noch RAS und PAL hochreguliert. Die spezifische Aktivität der RAS korrelierte mit einem Absinken des RA-Gehalts, wohingegen die PAL-Aktivität einen Anstieg um 163% nach 12 h aufwies. In einem zweiten Begasungsexperiment unter den gleichen Bedingungen wurden antioxidative Effekte in der Zitronenmelisse untersucht. Die Probenahme erfolgte 0, 3, 5, 12, 24 und 48 h nach Beginn der Ozon-Begasung. Es konnten ein signifikanter Anstieg an Ascorbat, Dehydroascorbat und Gesamtascorbat, sowie ein biphasischer Verlauf des Redoxstatus festgestellt werden. Ein hohes Radikalfängerpotential korrelierte mit einem hohen Gesamtgehalt an phenolischen Verbindungen und einem hohen Carotinoidgehalt. Außerdem stiegen der Gehalt an Wasserstoffperoxid und Prolin. Die Bestimmung der Katalaseaktivität zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem Anstieg nach 5 h und einem Abfall nach 48 h. Zusammenfassend verdeutlichen diese Ergebnisse den Einfluss von Ozonstress auf die Arzneipflanze Melissa officinalis., Hydroxycinnamic esters and amides e.g. hydroxycinnamoylquinate, hydroxycinnamoyl-shikimate, hydroxycinnamoyltyramine and rosmarinate are quite abundant in the plant kingdom. Plants can use these compounds as defense strategies against herbivores, pathogens or UV-irradiation. Rosmarinic acid synthase (RAS, 4-coumaroyl-CoA:hydroxyl-phenyllactic acid hydroxycinnamoyltransferase) is an important enzyme in the formation of rosmarinic acid (RA), the main phenolic compound in Coleus blumei. For structural analyses of RAS, the RAS-cDNA was heterologously expressed in Escherichia coli. The protein was mostly found as insoluble inclusion bodies. After solubilization and refolding of CbRAS, the protein was insufficiently active. So the expression was performed with SoluBL21TM E. coli and after purification by gel permeation chromatography, very active and pure protein could be used for crystallization. Unfortunately no crystals were growing. RAS, HST (hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate hydroxycinnamoyltransferase), which is important for the formation of monolignols, and HQT (hydroxycinnamoyl-CoA:quinate hydroxyl¬cinnamoyltransferase), a compound essential for the formation of chlorogenic acid (CA), are important members of the hydroxycinnamoyltransferases (HCTs). The cloning and characterization of these HCTs present in Glechoma hederacea was an objective of this study. Glechoma hederacea L. (Lamiaceae) is a perennial plant, which is distributed widely in Europe, Asia and America and an ideal candidate, because it produces RA, CA and caffeic acid. By several attempts a partial sequence putatively encoding a HSCQT was isolated from Glechoma hederacea. Additionally, the presence of caffeic acid, CA, RA and the transcript abundances of RAS, HST and an unknown HCT in flowers, leaves, stems and roots of naturally grown G. hederacea were determined. The RAS, HST and HCT genes were expressed in all organs apart from roots. Flowers accumulated astonishingly 12.5% RA in their dry mass and leaves, stems and roots around 1%. In another part of this project the accumulation of caffeic acid, CA and RA and the determination of RAS and phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activities in a suspension culture of Glechoma hederacea was studied. Growth, medium and secondary metabolism parameters were assessed during a cultivation period of 14 days. The maximum PAL activity was observed on day 5, while the maximum of the RAS activity was accomplished on day 8. The main caffeic acid derivative definitely was RA, which reached 25.9% of the dry mass on day 7. This is among the highest level of a secondary metabolite in plant cells ever observed. The activity and substrate acceptance of already constructed chimeric proteins consisting of RAS and HST halves (CbRAS/HST, CbHST/RAS) were determined. The assumption is that hydroxycinnamoyltransferases are formed by two almost equally sized domains I and II. The chimeras were designed by exchanging the two main domains of RAS and HST, which is important for the formation of monolignols. RAS and HST activity assays revealed low RAS-activities in both chimeric proteins while HST activity could not be detected. Lemon balm (Melissa officinalis) is a commonly used medicinal plant, which belongs to the family Lamiaceae (subfamily Nepetoideae). The pharmaceutical properties are e.g. sedative, carminative, spasmolytic, antibacterial and antiviral mostly due to the content of essential oil (citral, citronellal) and phenolic acid esters. The influence of low ozone concentrations on primary and secondary metabolism of lemon balm was studied. Melissa plants were exposed to low ozone (O3) dosages (80 ppb for 5 h), because high background levels of O3 are considered to be as harmful as episodic O3 peaks. Samples were taken 0, 3, 5, 12 and 24 h from beginning of exposure (FBE). The influence on different ecophysiological, biochemical and structural parameters were analyzed. At the end of the ozone exposure, no visible foliar symptoms were detectable, but at microscopic level a small number of dead cells were found. Nevertheless several photosynthetic reactions were significantly affected. Several enzymes are responsible for the biosynthesis of RA, among them PAL, 4-coumarate:coenzyme A ligase (4CL), tyrosine aminotransferase (TAT) and RAS. The transcript levels of these genes have been investigated by quantitative RT-PCR in lemon balm. All analyzed genes were quickly up-regulated at 3 h of O3 exposure, but at 24 h from beginning of exposure (FBE) only RAS and PAL were up-regulated. The specific activity of RAS was closely correlated with a decrease in RA content, while the specific activity of PAL increased at 12 h FBE to 163% in comparison to control levels. In a second treatment with 80 ppb ozone for 5 h the antioxidant effects of Melissa officinalis were assessed. Sampling took place 0, 3, 5, 12, 24 and 48 h FBE. A significant increase of ascorbate, dehydroascorbate, total ascorbate 48 h FBE and a biphasic redox status was measured. Strong scavenging capacities, measured with the DPPH assay, were correlating with a high content of total phenols and carotenoids. Furthermore the hydrogen peroxide and proline contents also increased significantly 48 h FBE. The catalase activtity showed a biphasic trend with an increase 5 h FBE and a decrease 48 h FBE. In conclusion these experiments provide insight into the effect of abiotic stress caused by ozone on the pharmaceutically important plant Melissa officinalis. more...

In der vorliegenden Dissertation wurden Arbeiten zur biochemischen Charakterisierung der SAM-abhängigen N-Methyltransferase FgaMT aus A. fumigatus sowie verschiedener putativer Prenyltransferasen unterschiedlicher Aspergillen durchgeführt. Das putative Gen fgaMT, bestehend aus zwei Exons von 272 bp und 748 bp, getrennt durch ein Intron von 72 bp, wurde in dem Biosynthese-Gencluster von Fumigaclavin C in A. fumigatus identifiziert. Das abgeleitete Protein FgaMT besteht aus insgesamt 339 Aminosäuren und weist eine molekulare Masse von 38.1 kDa auf. Der codierende Abschnitt dieses Gens konnte per PCR erfolgreich aus cDNA amplifiziert werden. Nach Klonierung in den Expressionsvektor pQE60 wurde das entstandene Expressionskonstrukt pOR15 mit dem Stamm E. coli XL1 Blue MRF´ transformiert. Die Überexpression des fgaMT-Gens erfolgte bei 37 oC, 200 rpm und 1 mM IPTG Endkonzentration im Medium. Das lösliche FgaMT-His6 wurde bis zur Homogenität aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Mit Hilfe von Enzymassays wurde bewiesen, dass FgaMT in Anwesenheit von S-Adenosylmethionin (SAM) als Co-Substrat die Methylierung von 4-Dimethylallyltryptophan (4-DMAT) an der NH2-Gruppe katalysiert. Das Produkt dieser Reaktion wurde durch Analyse per NMR und Massenspektroskopie eindeutig als 4-Dimethylallylabrin nachgewiesen. Da FgaMT 4-DMAT, nicht aber L-Tryptophan als Substrat akzeptierte, konnte nachgewiesen werden, dass FgaMT den zweiten Schritt in der Biosynthese von Ergotalkaloiden katalysiert. Das Enzym benötigt keine Metall-ionen für seine enzymatische Aktivität und weist eine relativ hohe Substratspezifität gegenüber einem Prenylrest an Position C-4 des Indolringes auf. Derivate von 4-DMAT mit Modifikationen am Indolring wurden ebenfalls von FgaMT als Substrate akzeptiert. Sogar 4-Methyl-L-tryptophan wurde von FgaMT umgesetzt. Die KM-Werte wurden mit 0,12 mM für 4-DMAT und 2,4 mM für SAM bestimmt. Die Umsatzrate betrug 2,0 s-1. Durch eine Analyse über FPLC konnte gezeigt werden, dass FgaMT als Homodimer wirkt. Das putative Prenyltransferasegen NFIA_112230 konnte von dem von mir betreuten Bachelor-Studenten Andreas Schweitzer aus genomischer DNA von N. fischeri NRRL181 amplifiziert und mit dem Expressionsvektor pQE60 kloniert werden. In Fortführung dieses Projektes wurde das Gen von mir in dem Stamm E. coli XL1 Blue MRF´ erfolgreich überexprimiert und das abgeleitete, rekombinante Enzym EAW20699-His6 isoliert. Das Protein konnte mit einer molekularen Masse von ca. 50 kDa fast bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Um das natürliche Substrat von EAW20699 zu identifizieren, wurde eine Vielzahl von Enzymassays mit unterschiedlichen Substraten durchgeführt und über HPLC analysiert. Bisher konnte jedoch noch keine Prenylierungsaktivität nachgewiesen werden. Die beiden putativen Prenyltransferasegene AN9229-PT1 und AN9229-PT2 aus A. nidulans sowie das Gen ATEG_03092.1 aus A. terreus, ebenfalls für eine Prenyltransferase kodierend, wurden erfolgreich durch Fusions-PCR aus Fosmiden bzw. gDNA der entsprechenden Aspergillus-Stämme amplifiziert und in die beiden E. coli Expressionsvektoren pQE60 und pHis8, sowie im Falle von AN9229-PT2, auch in den Hefevektor pYES2/NT C kloniert und mit den entsprechenden Wirtsstämmen transformiert. Die erfolgreiche Klonierung konnte durch die Sequenzierung der Expressionskonstrukte bei allen drei Prenyltransferasegenen verifiziert werden. Die Überexpression der Gene war in dem für die Expression von pQE60-Konstrukten optimierten Wirtsstamm E. coli M15 [pREP4] ebenfalls erfolgreich, wobei die überproduzierten Proteine jedoch anscheinend zu “inclusion bodies“ aggregierten, ausfielen und nicht mehr ohne Weiteres isoliert und gereinigt werden konnten. Im Falle der Überexpression von AN9229-PT2 konnte aber durch Kultivierung unter sehr milden Bedingungen (niedrige Kultivierungstemperatur und Dauer, Induktion durch geringe IPTG-Konzentration) bzw. durch Aufreinigung mit Laurylsarcosin, das Protein in geringer Menge isoliert werden. Die Enzymassays mit den so gewonnenen Proteinen, wie auch durchgeführte Assays mit dem Rohextrakt, zeigten bisher aber noch keine Prenyltransferaseaktivität. Auch Enzymassays mit Rohextrakten der beiden anderen Prenyltransferasen AN9229-PT1 und EAU36366 wiesen auf keine enzymatische Aktivität hin., The main topics of the present dissertation are the biochemical characterisation of a SAM-dependent N-methyltransferase from A. fumigatus and different putative Prenyltransferases from various Aspergillus species. The putative gene fgaMT, consisting of two exons with a size of 272 bp and 748 bp and an intron sequence with a size of 72 bp, was identified in a biosynthetic gene cluster of fumigaclavines in A. fumigatus. Its deduced protein FgaMT comprises 339 amino acids with a molecular mass of 38.1 kDa. The coding region of the gene was successfully amplified from a cDNA library by PCR. After cloning of fgaMT into the expression vector pQE60 the created expression construct pOR15 was transformed into E. coli strain XL1 Blue MRF´. Overexpression of fgaMT was carried out by cultivation at 37 oC, 200 rpm and 1 mM IPTG induction. Soluble FgaMT-His6 was purified to near homogeneity and characterised biochemically. By performing enzyme assays we could prove that FgaMT catalyzes the methylation of 4-dimethylallytryptophan (4-DMAT) in the presence of S-adenosylmethionine (SAM) at the NH2-group. The product of this reaction was identified as 4-dimethylallyl-L-abrine by NMR and mass spectrometry analysis. FgaMT only accepts 4-DMAT but not L-Trp as substrate, which proves that FgaMT is responsible for the second step in the biosynthesis of ergot alkaloids. This enzyme does not require metal ions for its enzymatic activity and shows relatively high substrate specificity towards tryptophan derivatives with a prenyl moiety at position C-4 of the indole ring. 4-DMAT derivatives with modifications at the indole ring were also accepted as substrates. Even 4-methyl-L-tryptophan was accepted by FgaMT. KM values were determined at 0.12 mM for 4-DMAT and 2.4 mM for SAM. The turnover number was 2.0 s-1. FPLC analysis showed that FgaMT acts as a homodimer. The putative prenyltransferase gene NFIA_112230 from Neosartorya fischeri NRRL 181 was successfully amplified by PCR and cloned into expression vector pQE60. This work was started by bachelor student Andreas Schweitzer under my supervision. The expression construct pAS6os was transformed with E. coli XL1 Blue MRF´, the gene was successfully overexpressed and the derived, recombinant protein EAW20699-His6 was isolated. The protein with a molecular mass of about 50 kDa was purified to near homogeneity. To identify its natural substrate a series of enzyme assays with various different substances were carried out and analyzed by HPLC. Until now no prenylation activity could be detected for the recombinant enzyme. Two putative prenyltransferase genes from A. nidulans FGSC A4, named AN9229-PT1 and AN9229-PT2, and the putative prenyltransferase gene ATEG_03092.1 from A. terreus DSM1958 were successfully amplified by Fusion-PCR from Fosmids or gDNA of the appropriate Aspergillus strains, respectively. The amplified genes were cloned into the expression vectors pQE60 and pHis8, and in case of AN9229-PT2, also into pYES2NT/C. The gene sequences were verified by sequencing of the expression constructs. Expression of the genes was successful in the optimized overexpression E. coli strain M15 [pREP4], but the overproduced proteins aggregated to so called inclusion bodies and could not be used for further experiments. In case of AN9229-PT2, it was possible to isolate little amounts of soluble protein by cultivation under mild conditions (low temperature, short cultivation duration and low IPTG concentration) and purification with N-laurylsarcosin, alternatively. Enzyme assays carried out with purified protein as well as with crude extracts in the presence of different possible substrates showed no enzymatic activity until now. Similarily, enzyme assays carried out with crude extracts of AN9229-PT1 and EAU36366 showed the same result. more...

Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Funktionsweise von Polyketidsynthasen (PKS) zu leisten. Hierzu wurden Mutagenesestudien sowie biochemische Untersuchungen an Chalkonsynthase (CHS) und Acridonsynthase (ACS) aus Ruta graveolens durchgeführt. Neben den bereits vorliegenden Enzymen aus Ruta sollte die Klonierung weiterer PKS aus Dictamnus albus Vergleiche in einem homologen System ermöglichen. Die Umwandlung der Ruta-ACS in eine funktionelle CHS wurde erfolgreich abgeschlossen. Es konnte gezeigt werden, dass es mit nur drei Mutationen möglich ist, die ACS-Aktivität auf wenige Prozent des ursprünglichen Umsatzes zu senken und gleichzeitig die Fähigkeit zur Bildung des Naringeninchalkons deutlich zu steigern, so dass dies nun die Hauptaktivität der hergestellten Mutante ist. Der umgekehrte Weg, die Umwandlung der CHS in eine ACS, gestaltete sich schwieriger. Es wurden zahlreiche Hinweise auf notwendige Bedingungen für diesen offensichtlich komplizierteren Weg erarbeitet. So konnten bei der Mutante Rk1 unter bestimmten Bedingungen eine geringe ACS-Aktivität gemessen werden. Des Weiteren zeigten Hemmtests, dass die Bindung des Startsubstrats N-Methylanthraniloyl-CoA in allen CHS-Mutanten möglich ist, im Gegensatz zur Wildtyp-CHS. Die folgende Charakterisierung zeigte, dass die Mutanten Rk1 und Rk2 in erhöhtem Maße Anthraniloyl-CoA, das postulierte Startsubstrat der Hydroxychinolonsynthase (HQS), umsetzen. Erste Hinweise deuten darauf hin, dass die vorgenommenen Mutationen der CHS nicht nur zur teilweisen Umwandlung in eine ACS geführt haben, sondern möglicherweise auch zu einer HQS. Mit der Klonierung und funktionellen Expression der Chalkonsynthase aus Diptam steht eine weitere PKS aus der Familie der Rutaceae zur Verfügung. Der Vergleich mit bereits bekannten Sequenzen erbrachte Hinweise auf weitere Sequenzstellen, durch deren Austausch die bisher unvollständige Umwandlung der CHS in eine Acridonsynthase erreicht werden könnte. Die noch ausstehende Klonierung der HQS wird dazu beitragen, die Fragen, die sich aus den unterschiedlichen Substratspezifitäten der untersuchten Enzyme und Mutanten ergeben haben, zu beantworten., Chalcone synthases (CHSs) and acridone synthases (ACSs) belong to the superfamily of type III polyketide synthases (PKSs) and condense the starter substrate 4-coumaroyl-CoA or N-methylanthraniloyl-CoA with three malonyl-CoAs to produce flavonoids and acridone alkaloids, respectively. While acridone alkaloids are confined almost exclusively to the Rutaceae, flavonoids occur abundantly in all seed-bearing plants. ACSs and CHSs had been cloned from Ruta graveolens and shown to be closely related polyketide synthases which use N-methylanthraniloyl-CoA and 4-coumaroyl-CoA, respectively, as the starter substrate to produce the acridone or naringenin chalcone. As proposed for the related 2-pyrone synthase from Gerbera, the differential substrate specificities of ACS and CHS might be attributed to the relative volume of the active site cavities. The primary sequences as well as the immunological cross reactivities and molecular modeling studies suggested an almost identical spatial structure for ACS and CHS. Based on the Ruta ACS2 model the residues Ser132, Ala133 and Val265 were assumed to play a critical role in substrate specificity. Exchange of a single amino acid (Val265Phe) reduced the catalytic activity by about 75% but grossly shifted the specificity towards CHS activity, and site-directed mutagenesis replacing all three residues by the corresponding amino acids present in CHS (Ser132Thr, Ala133Ser and Val265Phe) fully transformed the enzyme to a functional CHS with comparatively marginal ACS activity. The results suggested that ACS divergently has evolved from CHS by very few amino acid exchanges, and it remains to be established why this route of functional diversity has developed in the Rutaceae only. The reverse triple mutation of Ruta-CHS1 (mutant R2) affected only insignificantly the CHS activity and did not confer ACS activity. However, competitive inhibition of CHS activity by N-methylanthraniloyl-CoA was observed for the mutant and in contrast to wild-type CHSs. Homology modeling of ACS2 with docking of 1,3-dihydroxy-N-methylacridone suggested that the starter substrates for CHS or ACS reaction are placed in different topographies in the active site pocket. Additional site specific substitutions (Asp205Pro/Thr206Asp/His207Ala or Arg60Thr and Val100Ala/ Gly218Ala, respectively) diminished the CHS activity to 75%-50% of the wild-type CHS1 without promoting ACS activity. The results suggest that conformational changes in the periphery beyond the active site cavity volumes determine the product formation by ACSs vs. CHSs in Ruta graveolens. It is likely that ACS has evolved from CHS, but the sole enlargement of the active site pocket as in CHS1 mutant R2 is insufficient to explain this process. more...