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Protein science has been advanced with new development of various separation and analytical techniques, and one of the most useful techniques at the beginning was various electrophoretic fractionation. In 1973, Watson & Crick reported on a structure of deoxyribonucleic acid, and then molecular biology has progressed rapidly. In 1991, the international cooperative project on human genome started, and ended in 2003, reporting more than 99% of the whole base sequence of human genome. However, the project has left most of human genes functionally unknown. Currently the major research in life science is aiming to determine biological functions of individual proteins as well as regulatory networks among many proteins, namely “proteomics”.

Separax 膜と反応するIgM-κ型M蛋白を見いだし検討を加えた. ジアセチルセルロースとトリアセチルセルロースを等量混合し油性成分を含まないセ・ア膜を用い電気泳動を行ったところ, 明瞭なM蛋白帯は認めず原点のα1からβ位に残る幅広い異常蛋白帯が観察された. 水酸基の多い電気浸透除去剤であるヒドロキシプロピルセルロースを含有した緩衝液によるSeparax 膜電気泳動では, Separax-SP膜と同様, 明瞭なM蛋白帯が観察され, 従来のセ・ア膜のアセチル基を水酸基に変えたミクロフィルターFR 100でも明瞭なM蛋白帯が観察された. 患者M蛋白と Separax 膜のアセチル基との反応が考えられ, セルロース膜による血液透析などの既往歴がまったくないことから, その反応様式は免疫学的な交差反応に基づいている可能性が考えられた.

二次元電気泳動法, 二次元イムノブロット法によりアポHを分析した. 精製アポHは分子量が約49,000, pI5～7にある等電点を異にした六つのスポットとして出現した. また, ノイラミニダーゼ処理後の二次元電気泳動像では分子量約48,000, スポットが三つに, ともに減少した. これらのことから, アポHの構造上の多様性の一つの理由としてその糖鎖構造が関与していることが示唆された. さらにこの精製アポHが, ヒト赤血球に対して溶血活性をもつことを明らかにした.

免疫電気泳動において, アルブミンの沈降線がγ領域まで尾を引いている症例を見いだし検討を加えた. 異常沈降線の出現するアルブミンは, ゲル濾過法にて高分子のG'分画に溶出された. 酸処理した患者IgGに正常血清, ウシ血清アルブミンを添加すると, 原血清と同様なアルブミンの異常沈降線が観察された. イオン交換クロマトグラフィーを行うことによって微量のIgG-κ型M-蛋白が検出され, その分画には異常沈降線を形成するアルブミンを認めた. 患者IgGを papain 分解することにより, Fab fragment にアルブミンの沈降線が観察された. 再結合実験において形成された異常沈降線は, ウシ血清アルブミンよりもヒト血清アルブミンの方が強いこと, ヒト血清アルブミンとウシ血清アルブミンとは抗原性に共通部分が存在することなどから, アルブミンと結合するIgG-κ型M-蛋白は, ヒト血清アルブミンに対する抗体である可能性が高い.

Two types of new cellulose acetate membrane, Seleca-V membrane, were developed; G membrane with mild electro osmosis and A membrane with marked electro osmosis. G membrane had its application point at the post-γ zone, and A membrane at the pre-albumin zone. G membrane was found to be supericr to A membrane in its resolution, precision and reproducibility for clinical application.

Silent 型低ChE血症と考えられる一症例の家系検索を行った. 検索の結果, 活性を示すChEは発端者の同胞1名において arylesterase であることが予想されたが他の家族は正常のアロステリック酵素であることが示された. 発端者および同胞1名のアイソザム像はChE-1～ChE-5のすべての band が観察されたがいずれの band も活性の低下がみられ, とくにChE-5の活性低下が著明であった. その他の家族のアイソザイム像は正常であった. 酵素蛋白量の測定では活性発現を示さない酵素蛋白が発端者に認められた. また家族においては予想される酵素蛋白量と測定値は一致した. 以上のことより発端者は type Iと type IIの中間的性質を示すS1 gene, S2 gene の double ヘテロ接合体が推定され, 同胞は type Iのホモ接合体, 第1子および第2子は type Iのヘテロ接合体と推定された.

全自動血清蛋白分画測定装置が多く用いられるようになってから, 電気泳動図の観察によるM-蛋白の検出, ことに微量M-蛋白の検出が行われにくくなっている. また, 検査結果の数値のみの報告では, 検査結果が臨床家によって十分に活用されるとは限らない. このような状況に鑑みて, セルロースアセテート膜電気泳動法を用いる全自動血清蛋白分画測定装置とコンピュータをオンラインで結んで, 自動分析の結果を用いて, M-蛋白の検出と病態の判定を行うプログラムを開発した.M-蛋白の検出のための5種類のプログラムを併用した場合の検出率は通常または多量のM-蛋白を含む血清では27例について100%, 微量のM-蛋白を含む血清でも90% (14例中13例) であった. 病態判定については24例中19例 (79%) について正しい判定結果がえられた.

構造異常と考えられる低分子IgGの出現した多発性骨髄腫のきわめて稀な1症例を経験し検討を加えた. 精製されたIgG型M-蛋白は, 抗γFab抗血清, 抗γCH2ドメイン抗血清には全く反応しなかった. SDS-PAG電気泳動では, 2-ME処理前で94,000と99,000の2本のバンドが, 処理後では44,000と28,000のバンドがそれぞれ観察された. Western blotting 法により, 44,000のバンドは抗γ鎖抗血清, 抗γFc抗血清と, 28,000のバンドは抗λ鎖抗血清とそれぞれ反応することが確認された. γ鎖の subclass はIgG2であるにもかかわらず Protein Aに結合性を示さないこと, 抗γCH2ドメイン抗血清には全く反応しないこと, 正常γ鎖に比較し分子量が約6,000ダルトン小さいこと, などからCH2ドメインの欠損が強く示唆されるとともにλ鎖がダイマーとして異常γ鎖に結合している可能性が考えられた.

従来報告されていた熱凝固反応と異なるIgM型 pyroglobulin を見いだし検討を加えた. 精製されたIgMは単独でその性状がかなり弱くなることが確認された. しかも患者の精製IgMに正常のIgG, 補体成分を含む分画液を添加することによりゲル化凝固時間は大幅に短縮され, 両者を除いたものでは逆に延長することがわかった. これらの蛋白成分は熱凝固発現に促進的作用をしている可能性がある. とくにIgGにおいては等電点あるいは subclass の相違により反応性が異なることが示唆された. さらに, 還元アルキル化した7S IgMでは熱凝固性はまったく阻止されず, 19S IgMよりもゲル化凝固に要する時間が短いことが確認された. 精製IgMはPAS染色で強染されたことから, 還元アルキル化によって隠れた糖鎖が露出し7S IgMのほうがよりゲル化凝固しやすくなるのかもしれない.

Polyclonal IgGがビリルビンと結合したきわめて希な症例を見いだし検討を加えた. ビリルビン-IgG複合体は, 強酸, 2-ME処理, Triton X-100処理などでもその結合は解離せず, Michaelsson 変法によるビリルビンの測定で総ビリルビンの方が直接ビリルビンよりも低値であるという矛盾した結果が示された. ステロイド療法によりビリルビン-IgG複合体は1週間で消失し, ビリルビン測定でも総/直接比の逆転はみられなくなり, しかもステロイド療法を中止すると同様な臨床症状, 検査異常が認められた. ステロイドによる解離実験ではその結合の一部に解離を認めた. 回復期のIgGを用いた再構成実験では, 酸処理後ビリルビンと結合できるようになりIgGと結合した間接ビリルビンのほとんどは直接ビリルビンとして測定されてしまうことが確認された. 現在のビリルビン測定法の重大な問題点と思われる.

α1-microglobulin(α1-m)was detected by radioimmunoassay in the culture medium of a hepatoma cell line (C-Hc4). The level of this protein in the culture medium measured by radioimmunoassay increased proportionately with cell numbers. With the addition of puromycin and cycloheximide to the culture medium, the production of this protein was completely blocked. It was, therefore, suggested that this protein was actively produced by hepatoma cells.This protein showed a complete immunochemical identity with purified α1-m, serum and urinary α1-m from a patient with renal insufficiency by Ouchterlony immunodiffusion and tandem crossed immunoelectrophoresis.In crossed immunoelectrophoresis, this protein migrated at the α1-region, being slightly slower than purified and serum α1-m. On SDS disc electrophoresis combined with immune precipitation, this protein was also found to migrate slightly slower than purified α1-m. These results might be caused by a minor difference of its constituent from that of the purifiedα 1-m during the process of synthesizing this protein in hepatoma cells.

A new method was established for a high yield of purified IgD by using ion exchange chromatography under the conditions where the IgD protein was not absorbed.Despite the buffer containing 0.01M e-amino caproic acid was used to protect against proteolysis, spontaneous degradation of IgD occured during purification step at 4°C. The molecular weight of this degradation fragment was about 123, 000 daltons determined by SDS-PAGE. It was, therefore, probable that the fragments were F (ab)2δ or the dimer of Fcδ and Fabδ.For the study of the reactivity aginst Fabδ portion, specific rabbit anti-IgD antibody was prepared and compared with those supplied commercially. The results indicated that the latter did not show any reaction against Fabδ, suggesting that it may lack the antibody against Fdδ.

In this report, we described the differences between the LDH-IgG complexes in patient's sera (ten cases) and anti-LDH5 antibody in affinity to 5'-AMP and Cibacron Blue F3G-A. LDH-IgG complexes in all cases were dissociated either by passing the patient's serum through a column containing 5'-AMP-Sepharose 4B or Blue Sepharose CL-6B-e.g., the electrophoretic LDH isoenzyme pattern for concentrated bound fraction was normal. Although the unbound fraction was devoid of LDH activity, a mixture of this fraction and normal serum had the same abnormal pattern as the patient's serum alone. However, this was not true for a mixture of anti-LDH5 antiserum and normal serum.We propose the following hypothesis for the LDH-IgG complex formation: LDH can recognize the abnormal γ-Fab region of IgG which show similarities with the conformation of NAD+ at the NAD+ binding site of the molecule, but the affinity of the LDH molecule for immunoglobulin is much weaker than that for NADH or 5'-AMP.

An improved new membrane, Separax-S, was studied for its routine application of the serum protein fractionation. In comparison to the conventional Separax membrane, Separax-S has less endoosmotic effect and gives more reproducible and clear protein sepration. The application point of the serum now locates on the beta fraction, and the linear beta-lipoprotein band is less apparent. The fractional values of the serum protein are not significantly different from those of the conventional membrane, except that the beta fraction is slightly higher with the new membrane, Separax-S. Glycoproteins, lipoproteins, and isoenzymes of lactate dehyrogenase and alkaline phosphatase could be separated sufficiently with the new membrane.The normal serum protein fractional values in both adults and children are reported by using the new Separax-S membrane with the standard methodology.

A new method for the discrimination of epitopes of monoclonal antibodies by biotin-avidin enzymeimmunoassay was developed. The principle of this method was as follows: Several monoclonal antibodies reacted with one antigen were defined. After incubation of one non-biotinylated monoclonal antibody in the antigen coated polystylene plate, biotinylated another monoclonal antibody was added and incubated. After washing, peroxidase conjugated avidin was reacted. Finally, peroxidase activity was assayed using O-phenylenediamine as substrate containing H2O2. As the results, it was probable that the non-biotinylated monoclonal antibody was different from the biotinylated monoclonal antibody when peroxidase activity could be detected. On the other hand, it was suggested that the non-biotinylated antibody had a same epitope of the biotinylated antibody, or the antigenic determinants which were recognized with both monoclonal antibodies were very closed when peroxidase activity couldn't be detected.This method was very easy and safe to handle comparing with the method using radioactive compounds. The biotinylated antibodies, furthermore, were stable over one year when they were stocked at 4°C.

The characteristic wavy band is recognized exclusively in association with IgG-myeloma protein. The pseudo-wavy band is also seen in some cases of IgG-myeloma, as well as IgA-myeloma, macroglobulinemia, IgG-benign monoclonal gammopathy and hypergammaglobulinemia such as liver cirrhosis, chronic thyroiditis, renal cell carcinoma and reticulum cell sarcoma.Formation of the wavy band depends on both the nature of the abnormal globulin involved and the property of the supporting medium used. The more the reduced specific viscosity of the abnormal globulin, the more the tendency of forming the wavy band. In addition, the pores in the supporting medium should be small and irregular in their size, in order to develop the characteristic wavy band. It is most characteristically demonstrated on Oxoid and Separax membranes. Among other cellulose acetate membranes, Millipore and Sepraphore III membranes have the least tendency to form the wavy band.

The technique of thin-layer gel filtration using Sephadex G-200 Superfine is described. Serum proteins are separated into 3 major fractions: A-fraction, G-fraction and M-fraction. Each fraction is quantitated with dye elution technique. The technique is relatively easy, and its result is almost comparable to that of ultracentrifugal analysis. Thus, we believe that it should be used routinely for screening serum protein abnormalities.Also described are the normal values of adult serum proteins analyzed with this technique, and the correlation between the results obtained with this technique and the cellulose acetate electrophoretic technique.