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[ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) se trata de un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Las mutaciones en la enzima Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son unas de estas alteraciones. Las mutaciones más frecuentes en esta proteína afectan a las posiciones R140 y R172, provocando una ganancia de función con la producción del oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG). A pesar de que ambas inducen la producción de 2-HG, la mutación R172 produce mayor cantidad de oncometabolito, presenta menos concurrencias con otras alteraciones genéticas y se asocia a una peor respuesta a la quimioterapia y un mayor riesgo de recaída. Los modelos de investigación han permitido conocer el papel de las mutaciones genéticas en el desarrollo de la enfermedad. A pesar de ello, es necesario desarrollar nuevos modelos que expresen de forma endógena estas mutaciones para estudiar en profundidad las vías moleculares afectadas. Por todo ello, en esta Tesis se han desarrollado nuevas estrategias de edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9 con el objetivo de desarrollar nuevos modelos in vitro e in vivo de mutaciones implicadas en LMA. Debido a la baja eficiencia de transfección de los plásmidos CRISPR en las líneas celulares leucémicas, el método más empleado para introducir los elementos CRISPR han sido principalmente vectores lentivirales. Para evitar los inconvenientes de este tipo de vectores, en esta Tesis se ha desarrollado una estrategia alternativa para la introducción de la nucleasa Cas9 y los guías CRISPR. El gen codificante de la Cas9 se introdujo en el genoma de células NB4 mediante transducción con lentivirus, generando una línea celular con expresión constitutiva de la nucleasa. Por otro lado, se desarrolló un sistema sencillo de producción de los guías CRISPR mediante PCR con los elementos esenciales para su expresión y la expresión del reportero GFP de forma opcional. Con el objetivo de o, [CA] La leucèmia mieloide aguda (LMA) es tracta d'un grup heterogeni de desordres hematològics produïts per alteracions genètiques en les cèl·lules precursores mieloides. Les mutacions en l'enzim Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son d'aquestes alteracions. Les mutacions més freqüents en aquesta proteïna afecten a les posicions R1240 i R172, produint un guany de funció amb la producció de l'oncometabolit D-2-hidroxiglutarat (2-HG). A pesar que ambdues indueixen la producció de 2-HG, la mutació R172 produeix mes quantitat de oncometabolit, presenta menys co ocurrències con altres alteracions genètiques i s'associa a una pitjor resposta a la quimioteràpia i un major risc de recaiguda. Els models d'investigació han permés conéixer el paper de les mutacions genètiques en el desenvolupament de la malaltia. Malgrat això, és necessari desenvolupar nous models que expressen de manera endògena aquestes mutacions per a estudiar en profunditat les vies moleculars afectades. Per tot això, en aquesta Tesis s'han desenvolupat noves estratègies d'edició gènica mitjançant el sistema CRISPR/Cas9 amb l'objectiu de desenvolupar nous models in vitro i in vivo de les mutacions implicades en la LMA. Degut a la baixa eficiència de transfecció dels plasmids CRISPR en les línies cel·lulars leucèmiques, el mètode més emprat per a introduir els elements CRISPR han sigut principalment vectors lentivirals. Per a evitar els inconvenients d'aquesta mena de vectors, en aquesta Tesis s'ha desenvolupat una estratègia alternativa per a la introducció de la nucleasa Cas9 i els guies CRISPR. El gen codificant de la Cas9 es va introduir al genoma de cèl·lules NB4 mitjançant transducció amb lentivirus, generant una línia cel·lular amb expressió constitutiva de la nucleasa. D'altra banda, es va desenvolupar un sistema fàcil de producció dels guies CRISPR mitjançant PCR amb els elements essencials d'expressió i amb l'expressió del reporter GFP de manera opcional. Amb l'objectiu d'optimitzar la tècnica i p, [EN] Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous group of haematological disorders caused by genetic alterations in myeloid precursors. Mutations in the Isocitrate dehydrogenase enzyme are among these alterations. The most frequent mutations in this protein affect R140 and R172 positions, leading to a gain of function with the production of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG). Although both induce the 2-HG production, the R172 mutation generates greater amount of oncometabolite, has fewer co-occurrences with other genetic alterations and is associated with worse chemotherapy response and higher relapse risk. Research models have made possible to study the role of genetic mutations in disease development. Despite this progress, new models with endogenous expression of these mutations are needed to study in depth the molecular pathways involved. Therefore, in this Thesis we have developed new gene editing strategies using the CRISPR/Cas9 system with the aim of developing new in vitro and in vivo models of mutations involved in AML. Regarding in vitro model, due to the low transfection efficiency of CRISPR plasmids in leukemic cell lines, the most commonly method used for introducing CRISPR elements have been mainly lentiviral vectors. To avoid the disadvantages of this type of vectors, in this Thesis we have developed an alternative strategy for introducing Cas9 nuclease and CRISPR guides. The gene encoding the Cas9 was introduced into NB4 genome by lentiviral transduction producing a stable cell line that constitutively express the nuclease. On the other hand, a simple system for the production of CRISPR guides by PCR with essential elements of expression was developed and with GFP reporter expression optionally. In order to optimise the technique and test its efficiency in different targets, two genes involved in AML were modified. These were IDH2 gene, in which R172 mutation was introduced, and MYBL2 gene. Finally, editing efficiencies obtained with

[ES] La Leucemia Mieloide Aguda (LMA) es un tipo de neoplasia hematológica que se caracteriza por la proliferación descontrolada de precursores mieloides indiferenciados. Resulta en un defecto de la hematopoyesis normal y un descenso en el número de eritrocitos, plaquetas y linfocitos normales en la sangre. La incidencia de la enfermedad está estrechamente ligada a la edad, llegando a 12,2/100.000 casos para individuos mayores de 65 años. La LMA destaca por su alta variabilidad citogenética y molecular, que ha fundamentado la creación de esquemas de clasificación de LMA en función del riesgo y subtipo molecular. Con el desarrollo de las tecnologías de secuenciación, han surgido nuevas iniciativas como el proyecto ¿The Cancer Genome Atlas (TCGA)¿, dedicados a la caracterización molecular exhaustiva a nivel ¿ómico de cientos de tumores. Múltiples estudios dentro de este proyecto han tratado de establecer nuevos grupos de clasificación molecular y pronostica en base a eventos mutacionales de concurrencia y exclusividad mutua. Dentro de los casos analizados, para un grupo de pacientes (casi un 4%) no se ha conseguido asociar ninguna mutación driver de la enfermedad. El splicing es un proceso celular complejo que precisa una correcta distinción de los exones e intrones mediante el reconocimiento de elementos específicos tal como los sitios de splicing (SS) y los reguladores (SRE). Algunas variantes genéticas descritas, incluidas las que se localizan dentro de los intrones, pueden alterar este proceso como consecuencia, entre otros, de la activación/creación de un SS, dando lugar a un transcrito aberrante que incluye una región intronica inesperada, llamada ¿pseudoexón¿ (PE). Las mutaciones intrónicas profundas son variantes raras que no han sido exploradas hasta la fecha en la LMA, a pesar del papel que podrían jugar en su desarrollo y pronóstico, ya que podrían estar involucradas en los casos en los que no se ha identificado ninguna mutación conductura de la enfermedad., [EN] Acute Myeloid Leukemya (AML) is a type of hematologic malignancy characterized by the uncontrolled proliferation of undifferentiated myeloid precursors. It results in a defect in normal hematopoiesis and a decrease of normal red blood cells, platelets, and lymphocytes in blood. The indicence of the disease is linked to age, reaching 12.2/100,000 cases among individuals past the age of 65. AML stands out for its high cytogenetic and molecular variability, which has become the foundation for AML classification schemes based on risk and molecular subtype. With the development of sequencing technologies, new initiatives have emerged such as the "The Atlas of the Cancer Genome (TCGA)" project, which aimed to achieve the exhaustive molecular characterization of hundreds of tumors at -omic level. Multiple studies within this project have attempted to establish new molecular and pronostic classification groups based on mutational events of concurrence and mutual exclusivity. Among the analyzed cases, for a group of patients (¿ 4%) it was not possible to identify any driver mutation. Splicing is a complex cellular process that requires a correct distinction between exons and introns by the recognition of splice sites (SS) and regulatory elements (SRE). Some described genetic variants, including those located within introns, can alter this process as a consequence, among others, of the activation / creation of a SS, giving rise to an aberrant transcript that includes an unexpected intronic region, called ¿pseudoexon¿ (PE). Deep intronic mutations are rare variants that, to date, have not been explored in AML, despite the role they may have in its development and prognosis, as they may be involved in cases in which the cause of the desease is not yet identified. Assessment of the predictive power of SpliceAI, regSNP and SPiP: In the following dissertation, the accuracy of three new generation bioinformatic predictors designed for the prediction of the effect on splicing o

[ES] La Leucemia Mieloide Aguda (LMA) es un tipo de neoplasia hematológica que se caracteriza por la proliferación descontrolada de precursores mieloides indiferenciados. Resulta en un defecto de la hematopoyesis normal y un descenso en el número de eritrocitos, plaquetas y linfocitos normales en la sangre. La incidencia de la enfermedad está estrechamente ligada a la edad, llegando a 12,2/100.000 casos para individuos mayores de 65 años. La LMA destaca por su alta variabilidad citogenética y molecular, que ha fundamentado la creación de esquemas de clasificación de LMA en función del riesgo y subtipo molecular. Con el desarrollo de las tecnologías de secuenciación, han surgido nuevas iniciativas como el proyecto ¿The Cancer Genome Atlas (TCGA)¿, dedicados a la caracterización molecular exhaustiva a nivel ¿ómico de cientos de tumores. Múltiples estudios dentro de este proyecto han tratado de establecer nuevos grupos de clasificación molecular y pronostica en base a eventos mutacionales de concurrencia y exclusividad mutua. Dentro de los casos analizados, para un grupo de pacientes (casi un 4%) no se ha conseguido asociar ninguna mutación driver de la enfermedad. El splicing es un proceso celular complejo que precisa una correcta distinción de los exones e intrones mediante el reconocimiento de elementos específicos tal como los sitios de splicing (SS) y los reguladores (SRE). Algunas variantes genéticas descritas, incluidas las que se localizan dentro de los intrones, pueden alterar este proceso como consecuencia, entre otros, de la activación/creación de un SS, dando lugar a un transcrito aberrante que incluye una región intronica inesperada, llamada ¿pseudoexón¿ (PE). Las mutaciones intrónicas profundas son variantes raras que no han sido exploradas hasta la fecha en la LMA, a pesar del papel que podrían jugar en su desarrollo y pronóstico, ya que podrían estar involucradas en los casos en los que no se ha identificado ninguna mutación conductura de la enfermedad., [EN] Acute Myeloid Leukemya (AML) is a type of hematologic malignancy characterized by the uncontrolled proliferation of undifferentiated myeloid precursors. It results in a defect in normal hematopoiesis and a decrease of normal red blood cells, platelets, and lymphocytes in blood. The indicence of the disease is linked to age, reaching 12.2/100,000 cases among individuals past the age of 65. AML stands out for its high cytogenetic and molecular variability, which has become the foundation for AML classification schemes based on risk and molecular subtype. With the development of sequencing technologies, new initiatives have emerged such as the "The Atlas of the Cancer Genome (TCGA)" project, which aimed to achieve the exhaustive molecular characterization of hundreds of tumors at -omic level. Multiple studies within this project have attempted to establish new molecular and pronostic classification groups based on mutational events of concurrence and mutual exclusivity. Among the analyzed cases, for a group of patients (¿ 4%) it was not possible to identify any driver mutation. Splicing is a complex cellular process that requires a correct distinction between exons and introns by the recognition of splice sites (SS) and regulatory elements (SRE). Some described genetic variants, including those located within introns, can alter this process as a consequence, among others, of the activation / creation of a SS, giving rise to an aberrant transcript that includes an unexpected intronic region, called ¿pseudoexon¿ (PE). Deep intronic mutations are rare variants that, to date, have not been explored in AML, despite the role they may have in its development and prognosis, as they may be involved in cases in which the cause of the desease is not yet identified. Assessment of the predictive power of SpliceAI, regSNP and SPiP: In the following dissertation, the accuracy of three new generation bioinformatic predictors designed for the prediction of the effect on splicing o

[ES] La Leucemia Mieloide Aguda (LMA) es un tipo de neoplasia hematológica que se caracteriza por la proliferación descontrolada de precursores mieloides indiferenciados. Resulta en un defecto de la hematopoyesis normal y un descenso en el número de eritrocitos, plaquetas y linfocitos normales en la sangre. La incidencia de la enfermedad está estrechamente ligada a la edad, llegando a 12,2/100.000 casos para individuos mayores de 65 años. La LMA destaca por su alta variabilidad citogenética y molecular, que ha fundamentado la creación de esquemas de clasificación de LMA en función del riesgo y subtipo molecular. Con el desarrollo de las tecnologías de secuenciación, han surgido nuevas iniciativas como el proyecto ¿The Cancer Genome Atlas (TCGA)¿, dedicados a la caracterización molecular exhaustiva a nivel ¿ómico de cientos de tumores. Múltiples estudios dentro de este proyecto han tratado de establecer nuevos grupos de clasificación molecular y pronostica en base a eventos mutacionales de concurrencia y exclusividad mutua. Dentro de los casos analizados, para un grupo de pacientes (casi un 4%) no se ha conseguido asociar ninguna mutación driver de la enfermedad. El splicing es un proceso celular complejo que precisa una correcta distinción de los exones e intrones mediante el reconocimiento de elementos específicos tal como los sitios de splicing (SS) y los reguladores (SRE). Algunas variantes genéticas descritas, incluidas las que se localizan dentro de los intrones, pueden alterar este proceso como consecuencia, entre otros, de la activación/creación de un SS, dando lugar a un transcrito aberrante que incluye una región intronica inesperada, llamada ¿pseudoexón¿ (PE). Las mutaciones intrónicas profundas son variantes raras que no han sido exploradas hasta la fecha en la LMA, a pesar del papel que podrían jugar en su desarrollo y pronóstico, ya que podrían estar involucradas en los casos en los que no se ha identificado ninguna mutación conductura de la enfermedad., [EN] Acute Myeloid Leukemya (AML) is a type of hematologic malignancy characterized by the uncontrolled proliferation of undifferentiated myeloid precursors. It results in a defect in normal hematopoiesis and a decrease of normal red blood cells, platelets, and lymphocytes in blood. The indicence of the disease is linked to age, reaching 12.2/100,000 cases among individuals past the age of 65. AML stands out for its high cytogenetic and molecular variability, which has become the foundation for AML classification schemes based on risk and molecular subtype. With the development of sequencing technologies, new initiatives have emerged such as the "The Atlas of the Cancer Genome (TCGA)" project, which aimed to achieve the exhaustive molecular characterization of hundreds of tumors at -omic level. Multiple studies within this project have attempted to establish new molecular and pronostic classification groups based on mutational events of concurrence and mutual exclusivity. Among the analyzed cases, for a group of patients (¿ 4%) it was not possible to identify any driver mutation. Splicing is a complex cellular process that requires a correct distinction between exons and introns by the recognition of splice sites (SS) and regulatory elements (SRE). Some described genetic variants, including those located within introns, can alter this process as a consequence, among others, of the activation / creation of a SS, giving rise to an aberrant transcript that includes an unexpected intronic region, called ¿pseudoexon¿ (PE). Deep intronic mutations are rare variants that, to date, have not been explored in AML, despite the role they may have in its development and prognosis, as they may be involved in cases in which the cause of the desease is not yet identified. Assessment of the predictive power of SpliceAI, regSNP and SPiP: In the following dissertation, the accuracy of three new generation bioinformatic predictors designed for the prediction of the effect on splicing o

Acute myeloid leukemia (AML) is a hematologic malignancy characterized by the accumulation of hematopoietic mature myeloid cells in bone marrow and peripheral blood. Leukemic stem cells acquire a broad spectrum of cooperating genetic (chromosomic and molecular) and epigenetic lesions, which leads to proliferation, apoptosis and differentiation deregulation and transformation of hematopoietic stem cells 1,2 Cytogenetic analyses allow patient stratification in different risk groups that can be treated accordingly. Normal karyotype AML (NK-AML) represents 50% of patients and it is included within the intermediate risk group, Howerver, his group shows a very heterogeneous clinical outcome. Therefore, identification of molecular alterations is especially relevant in this group in order to apply the most appropriate therapeutic strategy. The Cancer Genome Atlas (TCGA) described the most recurrently mutated genes in AML and recently, they have proposed 9 functional categories in which genes are grouped according to their biological function. This functional classification suggests new cooperations in the development of the leukemic phenotype (transcription-factor fusions, gene encoding nucleophosmin, tumor-suppressor genes, DNA-methylation-related genes, signaling genes, chromatin-modifying genes, myeloid transcription-factor genes, cohesin-complex genes, and spliceosome-complex genes)3. Besides genetic factors, recent studies demonstrated that epigenetic alterations such as aberrant DNA promoter methylation and aberrantly expressed microRNAs (miRNAs) play an important role in the pathogenesis of AML5. miRNAs are small non-coding RNA molecules which hybridize to the 3¿-untranslated regions (3¿ UTR) of messenger RNAs (mRNAs) and cause their post-transcripcional regulation. Therefore, when miRNA expression is modified, they are able to act as tumor suppressors or oncogenes, altering gene expression and consequently signaling pathways. In this sense, miRNA control processes s, La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia hematológica caracterizada por la acumulación de células hematopoyéticas mieloides inmaduras en la médula ósea y en sangre periférica. Estas células adquieren un amplio espectro de alteraciones genéticas (cromosómicas y moleculares) y epigenéticas que alteran la proliferación, apoptosis y los procesos de diferenciación1,2 y contribuyen a la transformación maligna. Las alteraciones citogenéticas permiten la estratificación de los pacientes en distintos grupos de riesgo, sin embargo, aproximadamente un 50% de las LMAs no muestran ninguna alteración citogenética, presentando un cariotipo normal (LMA-CN). Este grupo de pacientes se cataloga de riesgo intermedio, si bien su desarrollo evolutivo es muy heterogéneo. Por ello, la identificación de alteraciones moleculares en este grupo es especialmente relevante a la hora refinar la clasificación del riesgo y por tanto poder aplicar la estrategia terapéutica más adecuada para cada paciente. El Cancer Genome Atlas (TCGA) describió los genes más frecuentemente mutados en la LMA y los ha agrupado, en base a su función, en 9 categorías funcionales, destacando así nuevas cooperaciones en el desarrollo del fenotipo leucémico (metilación del DNA, modificadores de la cromatina, factores de transcripción mieloides, supresores de tumores, nucleofosmina, cohesina, señales de activación, espliceosoma y fusiones de factores de transcripción)3. Además recientes estudios han demostrado que las alteraciones epigenéticas como la metilación aberrante de los promotores o la expresión aberrante de microRNAs (miRNAs) tienen un papel relevante en la leucemogénesis5 Los miRNAs, moléculas de RNA no codificante, se unen a las regiones no traducidas en el extremo 3¿ (3¿-UTR) de los RNA mensajeros (mRNA) provocando su regulación postranscripcional. De este modo, cuando la expresión de los miRNAs se ve alterada, pueden actuar como supresores tumorales u oncogenes, alterando la expresión génica y consec

Acute myeloid leukemia (AML) is a hematologic malignancy characterized by the accumulation of hematopoietic mature myeloid cells in bone marrow and peripheral blood. Leukemic stem cells acquire a broad spectrum of cooperating genetic (chromosomic and molecular) and epigenetic lesions, which leads to proliferation, apoptosis and differentiation deregulation and transformation of hematopoietic stem cells 1,2 Cytogenetic analyses allow patient stratification in different risk groups that can be treated accordingly. Normal karyotype AML (NK-AML) represents 50% of patients and it is included within the intermediate risk group, Howerver, his group shows a very heterogeneous clinical outcome. Therefore, identification of molecular alterations is especially relevant in this group in order to apply the most appropriate therapeutic strategy. The Cancer Genome Atlas (TCGA) described the most recurrently mutated genes in AML and recently, they have proposed 9 functional categories in which genes are grouped according to their biological function. This functional classification suggests new cooperations in the development of the leukemic phenotype (transcription-factor fusions, gene encoding nucleophosmin, tumor-suppressor genes, DNA-methylation-related genes, signaling genes, chromatin-modifying genes, myeloid transcription-factor genes, cohesin-complex genes, and spliceosome-complex genes)3. Besides genetic factors, recent studies demonstrated that epigenetic alterations such as aberrant DNA promoter methylation and aberrantly expressed microRNAs (miRNAs) play an important role in the pathogenesis of AML5. miRNAs are small non-coding RNA molecules which hybridize to the 3¿-untranslated regions (3¿ UTR) of messenger RNAs (mRNAs) and cause their post-transcripcional regulation. Therefore, when miRNA expression is modified, they are able to act as tumor suppressors or oncogenes, altering gene expression and consequently signaling pathways. In this sense, miRNA control processes s, La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia hematológica caracterizada por la acumulación de células hematopoyéticas mieloides inmaduras en la médula ósea y en sangre periférica. Estas células adquieren un amplio espectro de alteraciones genéticas (cromosómicas y moleculares) y epigenéticas que alteran la proliferación, apoptosis y los procesos de diferenciación1,2 y contribuyen a la transformación maligna. Las alteraciones citogenéticas permiten la estratificación de los pacientes en distintos grupos de riesgo, sin embargo, aproximadamente un 50% de las LMAs no muestran ninguna alteración citogenética, presentando un cariotipo normal (LMA-CN). Este grupo de pacientes se cataloga de riesgo intermedio, si bien su desarrollo evolutivo es muy heterogéneo. Por ello, la identificación de alteraciones moleculares en este grupo es especialmente relevante a la hora refinar la clasificación del riesgo y por tanto poder aplicar la estrategia terapéutica más adecuada para cada paciente. El Cancer Genome Atlas (TCGA) describió los genes más frecuentemente mutados en la LMA y los ha agrupado, en base a su función, en 9 categorías funcionales, destacando así nuevas cooperaciones en el desarrollo del fenotipo leucémico (metilación del DNA, modificadores de la cromatina, factores de transcripción mieloides, supresores de tumores, nucleofosmina, cohesina, señales de activación, espliceosoma y fusiones de factores de transcripción)3. Además recientes estudios han demostrado que las alteraciones epigenéticas como la metilación aberrante de los promotores o la expresión aberrante de microRNAs (miRNAs) tienen un papel relevante en la leucemogénesis5 Los miRNAs, moléculas de RNA no codificante, se unen a las regiones no traducidas en el extremo 3¿ (3¿-UTR) de los RNA mensajeros (mRNA) provocando su regulación postranscripcional. De este modo, cuando la expresión de los miRNAs se ve alterada, pueden actuar como supresores tumorales u oncogenes, alterando la expresión génica y consec