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[ES] El cultivo in vitro es un pilar fundamental de la Biotecnología Vegetal. Las técnicas de cultivo in vitro permiten aislar y cultivar de manera axénica órganos, tejidos y células vegetales para obtener una respuesta morfogenética. Las tres aplicaciones que se pueden realizar aprovechando estas técnicas son la multiplicación, la mejora genética y el saneamiento vegetal del material de partida. Para abordar estas tres aplicaciones es necesario desarrollar metodologías específicas. Byblis es uno de los géneros de plantas carnívoras más desconocidos incluso entre los aficionados al cultivo de este tipo de plantas. Todas las especies que lo conforman presentan su superficie totalmente recubierta por tricomas pegajosos similares a los de Drosera y Drosophyllum, con los que capturan y digieren sus presas. Sin embargo, sus singulares flores violetas, que producen durante todo su desarrollo, son únicas de este género y les confieren un valor ornamental añadido. En este trabajo se ha abordado la multiplicación de Byblis liniflora Salisb. mediante el uso de técnicas de cultivo in vitro para poder desarrollar futuros programas de micropropagación en esta especie tan poco estudiada. Estos avances ayudarán a su conservación ya que las técnicas de micropropagación permiten mantener y amplificar diferentes genotipos en condiciones axénicas. Además, se han puesto las bases para desarrollar programas de mejora genética que aumenten su variabilidad intraespecífica actual mediante el aprovechamiento de la variación somaclonal. Por último, se ha conseguido poner a punto un método de transformación genética, inexistente hasta ahora en esta especie, que abre un amplio abanico de posibilidades tanto para realizar estudios básicos como para iniciar programas de mejora encaminados a modificar caracteres de interés., [EN] Tissue culture is a fundamental part of Plant Biotechnology. This sort of techniques allows the isolation and axenic cultivation of plant organs, tissues, and cells to obtain a morphogenetic response. The three applications we can achieve by taking advantage of these techniques are multiplication, plant breeding and plant sanitation. It will be necessary to develop specific methodologies for all three applications. Byblis is one of the most unknown carnivorous plants genus, even among those who are interested in the cultivation of these plants. All the species have their surface covered by sticky trichomes similar to those of Drosera and Drosophyllum. They capture and digest the prey. However, its unique violet flowers, which it produces throughout its development, are unique to this genus and give it an added ornamental value. In this work we have achieved the multiplication of Byblis liniflora Salisb. by using in vitro culture techniques to develop future micropropagation programs in this species. These advances will help in its conservation since micropropagation techniques allow the maintenance and amplification of different genotypes under axenic conditions. In addition, we have set the basis for the development of genetic breeding programs to increase its current intraspecific variability by exploiting somaclonal variation. Finally, we have developed a genetic transformation protocol for the first time in literature which opens up a wide range of possibilities for both basic studies and breeding programs focused on the modification of specific traits.

[ES] El cultivo in vitro es un pilar fundamental de la Biotecnología Vegetal. Las técnicas de cultivo in vitro permiten aislar y cultivar de manera axénica órganos, tejidos y células vegetales para obtener una respuesta morfogenética. Las tres aplicaciones que se pueden realizar aprovechando estas técnicas son la multiplicación, la mejora genética y el saneamiento vegetal del material de partida. Para abordar estas tres aplicaciones es necesario desarrollar metodologías específicas. Byblis es uno de los géneros de plantas carnívoras más desconocidos incluso entre los aficionados al cultivo de este tipo de plantas. Todas las especies que lo conforman presentan su superficie totalmente recubierta por tricomas pegajosos similares a los de Drosera y Drosophyllum, con los que capturan y digieren sus presas. Sin embargo, sus singulares flores violetas, que producen durante todo su desarrollo, son únicas de este género y les confieren un valor ornamental añadido. En este trabajo se ha abordado la multiplicación de Byblis liniflora Salisb. mediante el uso de técnicas de cultivo in vitro para poder desarrollar futuros programas de micropropagación en esta especie tan poco estudiada. Estos avances ayudarán a su conservación ya que las técnicas de micropropagación permiten mantener y amplificar diferentes genotipos en condiciones axénicas. Además, se han puesto las bases para desarrollar programas de mejora genética que aumenten su variabilidad intraespecífica actual mediante el aprovechamiento de la variación somaclonal. Por último, se ha conseguido poner a punto un método de transformación genética, inexistente hasta ahora en esta especie, que abre un amplio abanico de posibilidades tanto para realizar estudios básicos como para iniciar programas de mejora encaminados a modificar caracteres de interés., [EN] Tissue culture is a fundamental part of Plant Biotechnology. This sort of techniques allows the isolation and axenic cultivation of plant organs, tissues, and cells to obtain a morphogenetic response. The three applications we can achieve by taking advantage of these techniques are multiplication, plant breeding and plant sanitation. It will be necessary to develop specific methodologies for all three applications. Byblis is one of the most unknown carnivorous plants genus, even among those who are interested in the cultivation of these plants. All the species have their surface covered by sticky trichomes similar to those of Drosera and Drosophyllum. They capture and digest the prey. However, its unique violet flowers, which it produces throughout its development, are unique to this genus and give it an added ornamental value. In this work we have achieved the multiplication of Byblis liniflora Salisb. by using in vitro culture techniques to develop future micropropagation programs in this species. These advances will help in its conservation since micropropagation techniques allow the maintenance and amplification of different genotypes under axenic conditions. In addition, we have set the basis for the development of genetic breeding programs to increase its current intraspecific variability by exploiting somaclonal variation. Finally, we have developed a genetic transformation protocol for the first time in literature which opens up a wide range of possibilities for both basic studies and breeding programs focused on the modification of specific traits.

[ES] El cultivo in vitro es un pilar fundamental de la Biotecnología Vegetal. Las técnicas de cultivo in vitro permiten aislar y cultivar de manera axénica órganos, tejidos y células vegetales para obtener una respuesta morfogenética. Las tres aplicaciones que se pueden realizar aprovechando estas técnicas son la multiplicación, la mejora genética y el saneamiento vegetal del material de partida. Para abordar estas tres aplicaciones es necesario desarrollar metodologías específicas. Byblis es uno de los géneros de plantas carnívoras más desconocidos incluso entre los aficionados al cultivo de este tipo de plantas. Todas las especies que lo conforman presentan su superficie totalmente recubierta por tricomas pegajosos similares a los de Drosera y Drosophyllum, con los que capturan y digieren sus presas. Sin embargo, sus singulares flores violetas, que producen durante todo su desarrollo, son únicas de este género y les confieren un valor ornamental añadido. En este trabajo se ha abordado la multiplicación de Byblis liniflora Salisb. mediante el uso de técnicas de cultivo in vitro para poder desarrollar futuros programas de micropropagación en esta especie tan poco estudiada. Estos avances ayudarán a su conservación ya que las técnicas de micropropagación permiten mantener y amplificar diferentes genotipos en condiciones axénicas. Además, se han puesto las bases para desarrollar programas de mejora genética que aumenten su variabilidad intraespecífica actual mediante el aprovechamiento de la variación somaclonal. Por último, se ha conseguido poner a punto un método de transformación genética, inexistente hasta ahora en esta especie, que abre un amplio abanico de posibilidades tanto para realizar estudios básicos como para iniciar programas de mejora encaminados a modificar caracteres de interés., [EN] Tissue culture is a fundamental part of Plant Biotechnology. This sort of techniques allows the isolation and axenic cultivation of plant organs, tissues, and cells to obtain a morphogenetic response. The three applications we can achieve by taking advantage of these techniques are multiplication, plant breeding and plant sanitation. It will be necessary to develop specific methodologies for all three applications. Byblis is one of the most unknown carnivorous plants genus, even among those who are interested in the cultivation of these plants. All the species have their surface covered by sticky trichomes similar to those of Drosera and Drosophyllum. They capture and digest the prey. However, its unique violet flowers, which it produces throughout its development, are unique to this genus and give it an added ornamental value. In this work we have achieved the multiplication of Byblis liniflora Salisb. by using in vitro culture techniques to develop future micropropagation programs in this species. These advances will help in its conservation since micropropagation techniques allow the maintenance and amplification of different genotypes under axenic conditions. In addition, we have set the basis for the development of genetic breeding programs to increase its current intraspecific variability by exploiting somaclonal variation. Finally, we have developed a genetic transformation protocol for the first time in literature which opens up a wide range of possibilities for both basic studies and breeding programs focused on the modification of specific traits.

Mejora genética vegetal. Historia y evolución de las herramientas

Mejora genética vegetal. Historia y evolución de las herramientas

Mejora genética vegetal. Historia y evolución de las herramientas

[ES] El descubrimiento de nuevos genes implicados en caracteres de interés agronómico puede acelerar el desarrollo de nuevas variedades más eficientes y respetuosas con el medio ambiente. Una de las vías más exitosas para descubrir nuevos genes es el análisis genético de mutantes. En efecto, la identificación y caracterización de un mutante aporta una información valiosa sobre la función del gen mutado, y puede ser el paso previo a la clonación y análisis funcional de dicho gen. En nuestro laboratorio se ha obtenido una colección de más de 7500 líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum) y de especies silvestres relacionadas en el contexto de un programa de Mutagénesis Insercional que se está abordando en colaboración con el Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS, Murcia). La caracterización fenotípica de esta colección ha hecho factible la detección de 641 mutantes afectados en caracteres relacionados con el cuajado, desarrollo, maduración y calidad del fruto de tomate o la tolerancia a estrés abiótico en especies silvestres. El análisis de estos mutantes nos está permitiendo identificar algunos de los genes que controlan estos caracteres. Recientemente, los avances en investigación en plantas se han visto impulsados como consecuencia de la puesta a punto de técnicas de edición de genes mediante CRISPR-Cas. Esta metodología, que deriva de un sistema inmune desarrollado a lo largo de la evolución por arqueas y bacterias, permite incorporar mutaciones estables y heredables en lugares precisos de un gen. En el contexto de nuestro programa de Mutagénesis Insercional, el sistema CRISPR permitirá confirmar si el gen clonado a partir de un mutante es responsable de su fenotipo. El principal objetivo de este Trabajo Final de Grado será obtener dos colecciones de plantas transgénicas de tomate (cv. Moneymaker) con el sistema CRISPR-Cas9. Se abordarán las diferentes fases relacionadas con la obtención de las plantas transgénicas y se determinará la ef, [EN] The discovery of new genes involved in characters of agronomic interest can accelerate the development of new, more efficient, and environmentally friendly varieties. One of the most successful ways to discover new genes is the genetic analysis of mutants. Indeed, the identification and characterization of a mutant provides valuable information on the function of the mutated gene and may be the previous step to cloning and functional analysis of the gene. In our laboratory, a collection of more than 7500 T-DNA lines of tomato (Solanum lycopersicum) and related wild species has been obtained in the context of an Insertional Mutagenesis program that is being addressed in collaboration with Dr. Lozano (University of Almería) and Dr. Bolarín (CEBAS, Murcia). The phenotypic characterization of this collection has made possible the detection of 641 affected mutants in characters related to curdling, development, maturation and quality of tomato fruit ortolerance to abiotic stressinwild species. The analysis ofthesemutantsis allowing usto identify some of the genes that control these characters. Recently, advances in plant research have been driven because ofthe implementation of gene editing techniques using CRISPR-Cas. This methodology, which derives from an immune system developed throughout the evolution by archaea and bacteria, allows to incorporate stable and inheritable mutationsin precise places of a gene. In the context of ourInsertion Mutagenesis program, the CRISPR system will confirm whether the cloned gene from a mutant is responsible for its phenotype. The main objective of this Final Grade Work will be to obtain two collections of transgenic tomato plants(cv. Moneymaker) with the CRISPR-Cas9 system. The different phasesrelated to the production of transgenic plants will be addressed and the efficiency of genetic transformation will be determined at different stages of the process. The last goal is to evaluate the editing efficiency of the CRISPR-Cas9 to

[ES] El descubrimiento de nuevos genes implicados en caracteres de interés agronómico puede acelerar el desarrollo de nuevas variedades más eficientes y respetuosas con el medio ambiente. Una de las vías más exitosas para descubrir nuevos genes es el análisis genético de mutantes. En efecto, la identificación y caracterización de un mutante aporta una información valiosa sobre la función del gen mutado, y puede ser el paso previo a la clonación y análisis funcional de dicho gen. En nuestro laboratorio se ha obtenido una colección de más de 7500 líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum) y de especies silvestres relacionadas en el contexto de un programa de Mutagénesis Insercional que se está abordando en colaboración con el Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS, Murcia). La caracterización fenotípica de esta colección ha hecho factible la detección de 641 mutantes afectados en caracteres relacionados con el cuajado, desarrollo, maduración y calidad del fruto de tomate o la tolerancia a estrés abiótico en especies silvestres. El análisis de estos mutantes nos está permitiendo identificar algunos de los genes que controlan estos caracteres. Recientemente, los avances en investigación en plantas se han visto impulsados como consecuencia de la puesta a punto de técnicas de edición de genes mediante CRISPR-Cas. Esta metodología, que deriva de un sistema inmune desarrollado a lo largo de la evolución por arqueas y bacterias, permite incorporar mutaciones estables y heredables en lugares precisos de un gen. En el contexto de nuestro programa de Mutagénesis Insercional, el sistema CRISPR permitirá confirmar si el gen clonado a partir de un mutante es responsable de su fenotipo. El principal objetivo de este Trabajo Final de Grado será obtener dos colecciones de plantas transgénicas de tomate (cv. Moneymaker) con el sistema CRISPR-Cas9. Se abordarán las diferentes fases relacionadas con la obtención de las plantas transgénicas y se determinará la ef, [EN] The discovery of new genes involved in characters of agronomic interest can accelerate the development of new, more efficient, and environmentally friendly varieties. One of the most successful ways to discover new genes is the genetic analysis of mutants. Indeed, the identification and characterization of a mutant provides valuable information on the function of the mutated gene and may be the previous step to cloning and functional analysis of the gene. In our laboratory, a collection of more than 7500 T-DNA lines of tomato (Solanum lycopersicum) and related wild species has been obtained in the context of an Insertional Mutagenesis program that is being addressed in collaboration with Dr. Lozano (University of Almería) and Dr. Bolarín (CEBAS, Murcia). The phenotypic characterization of this collection has made possible the detection of 641 affected mutants in characters related to curdling, development, maturation and quality of tomato fruit ortolerance to abiotic stressinwild species. The analysis ofthesemutantsis allowing usto identify some of the genes that control these characters. Recently, advances in plant research have been driven because ofthe implementation of gene editing techniques using CRISPR-Cas. This methodology, which derives from an immune system developed throughout the evolution by archaea and bacteria, allows to incorporate stable and inheritable mutationsin precise places of a gene. In the context of ourInsertion Mutagenesis program, the CRISPR system will confirm whether the cloned gene from a mutant is responsible for its phenotype. The main objective of this Final Grade Work will be to obtain two collections of transgenic tomato plants(cv. Moneymaker) with the CRISPR-Cas9 system. The different phasesrelated to the production of transgenic plants will be addressed and the efficiency of genetic transformation will be determined at different stages of the process. The last goal is to evaluate the editing efficiency of the CRISPR-Cas9 to

[ES] El descubrimiento de nuevos genes implicados en caracteres de interés agronómico puede acelerar el desarrollo de nuevas variedades más eficientes y respetuosas con el medio ambiente. Una de las vías más exitosas para descubrir nuevos genes es el análisis genético de mutantes. En efecto, la identificación y caracterización de un mutante aporta una información valiosa sobre la función del gen mutado, y puede ser el paso previo a la clonación y análisis funcional de dicho gen. En nuestro laboratorio se ha obtenido una colección de más de 7500 líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum) y de especies silvestres relacionadas en el contexto de un programa de Mutagénesis Insercional que se está abordando en colaboración con el Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS, Murcia). La caracterización fenotípica de esta colección ha hecho factible la detección de 641 mutantes afectados en caracteres relacionados con el cuajado, desarrollo, maduración y calidad del fruto de tomate o la tolerancia a estrés abiótico en especies silvestres. El análisis de estos mutantes nos está permitiendo identificar algunos de los genes que controlan estos caracteres. Recientemente, los avances en investigación en plantas se han visto impulsados como consecuencia de la puesta a punto de técnicas de edición de genes mediante CRISPR-Cas. Esta metodología, que deriva de un sistema inmune desarrollado a lo largo de la evolución por arqueas y bacterias, permite incorporar mutaciones estables y heredables en lugares precisos de un gen. En el contexto de nuestro programa de Mutagénesis Insercional, el sistema CRISPR permitirá confirmar si el gen clonado a partir de un mutante es responsable de su fenotipo. El principal objetivo de este Trabajo Final de Grado será obtener dos colecciones de plantas transgénicas de tomate (cv. Moneymaker) con el sistema CRISPR-Cas9. Se abordarán las diferentes fases relacionadas con la obtención de las plantas transgénicas y se determinará la ef, [EN] The discovery of new genes involved in characters of agronomic interest can accelerate the development of new, more efficient, and environmentally friendly varieties. One of the most successful ways to discover new genes is the genetic analysis of mutants. Indeed, the identification and characterization of a mutant provides valuable information on the function of the mutated gene and may be the previous step to cloning and functional analysis of the gene. In our laboratory, a collection of more than 7500 T-DNA lines of tomato (Solanum lycopersicum) and related wild species has been obtained in the context of an Insertional Mutagenesis program that is being addressed in collaboration with Dr. Lozano (University of Almería) and Dr. Bolarín (CEBAS, Murcia). The phenotypic characterization of this collection has made possible the detection of 641 affected mutants in characters related to curdling, development, maturation and quality of tomato fruit ortolerance to abiotic stressinwild species. The analysis ofthesemutantsis allowing usto identify some of the genes that control these characters. Recently, advances in plant research have been driven because ofthe implementation of gene editing techniques using CRISPR-Cas. This methodology, which derives from an immune system developed throughout the evolution by archaea and bacteria, allows to incorporate stable and inheritable mutationsin precise places of a gene. In the context of ourInsertion Mutagenesis program, the CRISPR system will confirm whether the cloned gene from a mutant is responsible for its phenotype. The main objective of this Final Grade Work will be to obtain two collections of transgenic tomato plants(cv. Moneymaker) with the CRISPR-Cas9 system. The different phasesrelated to the production of transgenic plants will be addressed and the efficiency of genetic transformation will be determined at different stages of the process. The last goal is to evaluate the editing efficiency of the CRISPR-Cas9 to

[ES] El melón es una de las especies hortícolas de mayor relevancia económica. Los cultivares Piel de Sapo, oriundos de la península, son de los más solicitados y apreciados por los consumidores a nivel estatal.El cultivo in vitro de tejidos vegetales proporciona una amplia gama de aplicaciones en la producción y mejora genética de muchas especies cultivadas. No obstante, las diferentes aplicaciones que se derivan del cultivo in vitro requieren del desarrollo de métodos que permitan la regeneración de plantas a partir de explantes o de protoplastos.En melón, la mayor parte de los estudios de cultivo in vitro se han realizado con la variedad Cantaloup, y son muy escasos los que se han llevado a cabo con cultivares Piel de Sapo. En este trabajo de investigación se ha querido avanzar en el conocimiento de los requerimientos culturales y morfogenéticos de diferentes cultivares de melón Piel de Sapo. Los experimentos realizados han permitido identificar el tipo de explante más adecuado para obtener una buena calidad de la respuesta morfogenética. Asimismo, los estudios con diferentes combinaciones de reguladores del crecimiento y métodos de cultivo han posibilitado determinar qué condiciones pueden ser las más adecuadas para la regeneración de plantas. En conjunto, los resultados nos han permitido categorizar los cultivares sobre la base de su respuesta morfogenética in vitro. Por último, se ha podido comprobar que las mejores condiciones de cultivo aplicadas a un método de transformación genética hacen factible la obtención de plantas transgénicas con una elevada eficacia., [EN] Melon is one of the horticultural species of most economic relevance. Christmas melon cultivars, native to the Iberian peninsula, are among the most requested and appreciated by consumers at the Spanish state level. The in vitro culture of plant tissues provides a wide range of applications in the production and genetic improvement of many cultivated species. However, the different applications that are derived from the in vitro culture require the development of methods that allow the regeneration of plants from explants or protoplasts. In melon, most of the in vitro culture studies have been carried out with the Cantaloup variety, and very few have been carried out with Christmas melon cultivars. In this research work it has been wanted to advance in the knowledge of the cultural and morphogenetic requirements of different Christmas melon cultivars. The experiments carried out have made it possible to identify the type of explants most suitable for obtaining a good quality of the morphogenetic response. Also, studies with different combinations of growth regulators and culture methods have made it possible to determine which conditions may be the most suitable for plant regeneration. Overall, the results allowed us to categorize the cultivars based on their in vitro morphogenetic response. Finally, it has been proven that the best growing conditions applied to a genetic transformation method make it possible to obtain transgenic plants with high efficiency., [CA] El meló és una de las espècies hortícoles de major rellevància econòmica. Els cultivars de Meló de tot l'any, oriünds de la península, són dels més sol·licitats i apreciats pels consumidors a nivell estatal. El cultiu in vitro de teixits vegetals proporciona una amplia gama d'aplicacions en la producció i millora genètica de moltes espècies cultivades. No obstant, les diferents aplicacions que deriven del cultiu in vitro requereixen del desenvolupament de mètodes que permeten la regeneració deplantesapartir d'explants o deprotoplasts.Enmeló, lamajorpartdelsestudis de cultiu in vitro s'han realitzat en la varietat Cantaloup, i són molt escassos els que s'han portat a terme amb cultivars de tot l'any. En aquest treball d'investigació, s'ha volgut avançar en el coneixement dels requeriments culturals i morfogenètics de diferents cultivars de meló de tot l'any. Els experiments realitzats han permés identificar el tipus d'explants més adequat per a obtindre una bona qualitat de la resposta morfogenètica. Així mateix, els estudis amb diferents combinacions de reguladors del creixement i mètodes de cultiu han possibilitat determinar quines condicions poden serlesmés adequades perala regeneració deplantes.Enconjunt,els resultats enshanpermés categoritzar els cultivars sobre labase dela seua respostamorfogenètica in vitro.Per últim, s'ha pogut comprovar que les millors condicions de cultiu aplicades a un mètode de transformació genètica fan factible l'obtenció de plantes transgèniques amb una elevada eficàcia.

[ES] El melón es una de las especies hortícolas de mayor relevancia económica. Los cultivares Piel de Sapo, oriundos de la península, son de los más solicitados y apreciados por los consumidores a nivel estatal.El cultivo in vitro de tejidos vegetales proporciona una amplia gama de aplicaciones en la producción y mejora genética de muchas especies cultivadas. No obstante, las diferentes aplicaciones que se derivan del cultivo in vitro requieren del desarrollo de métodos que permitan la regeneración de plantas a partir de explantes o de protoplastos.En melón, la mayor parte de los estudios de cultivo in vitro se han realizado con la variedad Cantaloup, y son muy escasos los que se han llevado a cabo con cultivares Piel de Sapo. En este trabajo de investigación se ha querido avanzar en el conocimiento de los requerimientos culturales y morfogenéticos de diferentes cultivares de melón Piel de Sapo. Los experimentos realizados han permitido identificar el tipo de explante más adecuado para obtener una buena calidad de la respuesta morfogenética. Asimismo, los estudios con diferentes combinaciones de reguladores del crecimiento y métodos de cultivo han posibilitado determinar qué condiciones pueden ser las más adecuadas para la regeneración de plantas. En conjunto, los resultados nos han permitido categorizar los cultivares sobre la base de su respuesta morfogenética in vitro. Por último, se ha podido comprobar que las mejores condiciones de cultivo aplicadas a un método de transformación genética hacen factible la obtención de plantas transgénicas con una elevada eficacia., [EN] Melon is one of the horticultural species of most economic relevance. Christmas melon cultivars, native to the Iberian peninsula, are among the most requested and appreciated by consumers at the Spanish state level. The in vitro culture of plant tissues provides a wide range of applications in the production and genetic improvement of many cultivated species. However, the different applications that are derived from the in vitro culture require the development of methods that allow the regeneration of plants from explants or protoplasts. In melon, most of the in vitro culture studies have been carried out with the Cantaloup variety, and very few have been carried out with Christmas melon cultivars. In this research work it has been wanted to advance in the knowledge of the cultural and morphogenetic requirements of different Christmas melon cultivars. The experiments carried out have made it possible to identify the type of explants most suitable for obtaining a good quality of the morphogenetic response. Also, studies with different combinations of growth regulators and culture methods have made it possible to determine which conditions may be the most suitable for plant regeneration. Overall, the results allowed us to categorize the cultivars based on their in vitro morphogenetic response. Finally, it has been proven that the best growing conditions applied to a genetic transformation method make it possible to obtain transgenic plants with high efficiency., [CA] El meló és una de las espècies hortícoles de major rellevància econòmica. Els cultivars de Meló de tot l'any, oriünds de la península, són dels més sol·licitats i apreciats pels consumidors a nivell estatal. El cultiu in vitro de teixits vegetals proporciona una amplia gama d'aplicacions en la producció i millora genètica de moltes espècies cultivades. No obstant, les diferents aplicacions que deriven del cultiu in vitro requereixen del desenvolupament de mètodes que permeten la regeneració deplantesapartir d'explants o deprotoplasts.Enmeló, lamajorpartdelsestudis de cultiu in vitro s'han realitzat en la varietat Cantaloup, i són molt escassos els que s'han portat a terme amb cultivars de tot l'any. En aquest treball d'investigació, s'ha volgut avançar en el coneixement dels requeriments culturals i morfogenètics de diferents cultivars de meló de tot l'any. Els experiments realitzats han permés identificar el tipus d'explants més adequat per a obtindre una bona qualitat de la resposta morfogenètica. Així mateix, els estudis amb diferents combinacions de reguladors del creixement i mètodes de cultiu han possibilitat determinar quines condicions poden serlesmés adequades perala regeneració deplantes.Enconjunt,els resultats enshanpermés categoritzar els cultivars sobre labase dela seua respostamorfogenètica in vitro.Per últim, s'ha pogut comprovar que les millors condicions de cultiu aplicades a un mètode de transformació genètica fan factible l'obtenció de plantes transgèniques amb una elevada eficàcia.

[ES] El melón es una de las especies hortícolas de mayor relevancia económica. Los cultivares Piel de Sapo, oriundos de la península, son de los más solicitados y apreciados por los consumidores a nivel estatal.El cultivo in vitro de tejidos vegetales proporciona una amplia gama de aplicaciones en la producción y mejora genética de muchas especies cultivadas. No obstante, las diferentes aplicaciones que se derivan del cultivo in vitro requieren del desarrollo de métodos que permitan la regeneración de plantas a partir de explantes o de protoplastos.En melón, la mayor parte de los estudios de cultivo in vitro se han realizado con la variedad Cantaloup, y son muy escasos los que se han llevado a cabo con cultivares Piel de Sapo. En este trabajo de investigación se ha querido avanzar en el conocimiento de los requerimientos culturales y morfogenéticos de diferentes cultivares de melón Piel de Sapo. Los experimentos realizados han permitido identificar el tipo de explante más adecuado para obtener una buena calidad de la respuesta morfogenética. Asimismo, los estudios con diferentes combinaciones de reguladores del crecimiento y métodos de cultivo han posibilitado determinar qué condiciones pueden ser las más adecuadas para la regeneración de plantas. En conjunto, los resultados nos han permitido categorizar los cultivares sobre la base de su respuesta morfogenética in vitro. Por último, se ha podido comprobar que las mejores condiciones de cultivo aplicadas a un método de transformación genética hacen factible la obtención de plantas transgénicas con una elevada eficacia., [EN] Melon is one of the horticultural species of most economic relevance. Christmas melon cultivars, native to the Iberian peninsula, are among the most requested and appreciated by consumers at the Spanish state level. The in vitro culture of plant tissues provides a wide range of applications in the production and genetic improvement of many cultivated species. However, the different applications that are derived from the in vitro culture require the development of methods that allow the regeneration of plants from explants or protoplasts. In melon, most of the in vitro culture studies have been carried out with the Cantaloup variety, and very few have been carried out with Christmas melon cultivars. In this research work it has been wanted to advance in the knowledge of the cultural and morphogenetic requirements of different Christmas melon cultivars. The experiments carried out have made it possible to identify the type of explants most suitable for obtaining a good quality of the morphogenetic response. Also, studies with different combinations of growth regulators and culture methods have made it possible to determine which conditions may be the most suitable for plant regeneration. Overall, the results allowed us to categorize the cultivars based on their in vitro morphogenetic response. Finally, it has been proven that the best growing conditions applied to a genetic transformation method make it possible to obtain transgenic plants with high efficiency., [CA] El meló és una de las espècies hortícoles de major rellevància econòmica. Els cultivars de Meló de tot l'any, oriünds de la península, són dels més sol·licitats i apreciats pels consumidors a nivell estatal. El cultiu in vitro de teixits vegetals proporciona una amplia gama d'aplicacions en la producció i millora genètica de moltes espècies cultivades. No obstant, les diferents aplicacions que deriven del cultiu in vitro requereixen del desenvolupament de mètodes que permeten la regeneració deplantesapartir d'explants o deprotoplasts.Enmeló, lamajorpartdelsestudis de cultiu in vitro s'han realitzat en la varietat Cantaloup, i són molt escassos els que s'han portat a terme amb cultivars de tot l'any. En aquest treball d'investigació, s'ha volgut avançar en el coneixement dels requeriments culturals i morfogenètics de diferents cultivars de meló de tot l'any. Els experiments realitzats han permés identificar el tipus d'explants més adequat per a obtindre una bona qualitat de la resposta morfogenètica. Així mateix, els estudis amb diferents combinacions de reguladors del creixement i mètodes de cultiu han possibilitat determinar quines condicions poden serlesmés adequades perala regeneració deplantes.Enconjunt,els resultats enshanpermés categoritzar els cultivars sobre labase dela seua respostamorfogenètica in vitro.Per últim, s'ha pogut comprovar que les millors condicions de cultiu aplicades a un mètode de transformació genètica fan factible l'obtenció de plantes transgèniques amb una elevada eficàcia.

La biotecnología vegetal se apoya en dos enfoques para introducir y expresar genes heterólogos en plantas: la transformación genética estable y la expresión transitoria utilizando vectores virales. En este artículo docente se revisan las ventajas e inconvenientes de los dos enfoques, haciendo especial hincapié en la expresión transitoria de proteínas a partir de vectores virales de la primera generación que son aquéllos que emplean el virus completo para promover la infección.

Cucumber is one of the most important horticultural species at economic level. Despite its agronomic relevance, there is currently no efficient transformation method available. The problems to obtain transgenic cucumber plants are mainly due to the low morphogenetic response in explants of certain genotypes, poor adequacy of selection methods, decrease in regeneration rate as a consequence of the usual treatments in a transformation experiment and, above all, the high rate of 'escape' plants. Taking into account the existing problems, the first objective of the present work has been the evaluation of the morphogenetic response in cucumber explants and the development of regeneration methods potentially useful in transformation experiments. These studies have been carried out with two commercial cultivars, four pure lines and one line that has been frequently used in cucumber breeding programs. Different types of primary explants have been evaluated to determine which may be the most suitable in a transformation experiment. The influence of the ontogenic state of the seedling on the degree of myxoploidy in cotyledon explants has been studied. Likewise, the ploidy level of regenerated plants from these explants has been determined. Regarding the culture medium, the effect of growth regulators, as well as that of other components, such as silver nitrate or copper sulphate, has been studied. In the context of the second objective, studies on the different stages of the transformation process by co-cultivation of cucumber explants with Agrobacterium tumefaciens have been carried out. Several factors, such as the Agrobacterium strain, how to carry out the phases of inoculation and co-culture, the suitability of different marker genes in the selection process and the influence of different components of the culture medium have been analyzed. Attempts have also been made to infer the causes of the occurrence of 'escape' plants or the formation of chimeras in cucumber transf, El pepino es una de las especies hortícolas más importantes a nivel económico. Pese a su relevancia agronómica, no puede decirse que a día de hoy se disponga de un método de transformación adecuado. Los problemas a la hora de conseguir plantas transgénicas de pepino estriban en la baja respuesta morfogenética en explantes de ciertos genotipos, la escasa adecuación de los métodos de selección, el descenso en la tasa de regeneración debido a los tratamientos habituales en un experimento de transformación y, sobre todo, la alta tasa de escapes. En función de la problemática existente, el primer objetivo del presente trabajo ha sido la evaluación de la respuesta morfogenética en explantes de pepino y el desarrollo de métodos de regeneración potencialmente útiles en experimentos de transformación. Estos estudios se han llevado a cabo con dos cultivares comerciales, cuatro líneas puras y una línea que ha sido utilizada frecuentemente en programas de mejora genética de pepino. Se han empleado distintos tipos de explantes primarios para determinar cuál o cuáles pueden ser los más adecuados en un experimento de transformación. Se ha estudiado la influencia del estado ontogénico de la plántula sobre el grado de mixoploidía en explantes de cotiledón. Asimismo, se ha determinado el nivel de ploidía de las plantas regeneradas a partir de estos explantes. Por lo que respecta al medio de cultivo, además de estudiar el efecto de componentes habituales (e.g. reguladores del crecimiento) se ha evaluado el de otros que no lo son tanto, como el nitrato de plata o el sulfato de cobre. En el contexto del segundo objetivo se han realizado una serie de estudios sobre las etapas del proceso de transformación mediante co-cultivo de explantes de pepino con Agrobacterium tumefaciens. Se han analizado diversos factores, tales como la cepa de Agrobacterium, la forma de llevar a cabo las fases de inoculación y co-cultivo, la adecuación de distintos genes marcadores en el proceso de selección y la, El cogombre és una de les espècies hortícoles més importants a nivell econòmic. A pesar de la seua rellevància agronòmica, no pot dir-se que a hores d'ara es dispose d'un mètode de transformació adequat. Els problemes a l'hora d'aconseguir plantes transgèniques de cogombre consistixen en la baixa resposta morfogenètica en explants de certs genotips, l'escassa adequació dels mètodes de selecció, el descens en la taxa de regeneració degut als tractaments habituals en un experiment de transformació i, sobretot, l'alta taxa de fugues. En funció de la problemàtica existent, el primer objectiu del present treball ha sigut l'avaluació de la resposta en explants de cogombre i el desenvolupament de mètodes de regeneració potencialment útils en experiments de transformació. Estos estudis s'han dut a terme amb dos cultivars comercials de cogombre, tres línies pures i una línia que ha servit de base en programes de millora. S'han empleat distints tipus d'explants primaris per a determinar quin o quins poden ser els més adequats en un experiment de transformació. Pel que fa al mig de cultiu, a més d'estudiar l'efecte de components habituals (e.g. reguladors del creixement) s'ha avaluat el d'altres que no ho són tant, com el nitrat de planta o el sulfat de coure. Així mateix, s'ha analitzat el grau de mixoploidia en alguns explants i l'efecte de certs tractaments sobre el nivell de ploidia de les plantes regenerades. En el context del segon objectiu s'han realitzat una sèrie d'estudis sobre les etapes del procés de transformació per mitjà de co-cultiu d'explants de cogombre amb Agrobacterium tumefaciens. S'han analitzat diversos factors, com ara el cep d'Agrobacterium, la forma de dur a terme les fases d'inoculació i co-cultiu, l'adequació de distints gens marcadors en el procés de selecció i la influència de distints components del mig de cultiu. Així mateix, s'han tractat d'inferir les causes que generen l'aparició de plantes no transgèniques (escape plants) o de quimeres en ex

La biotecnología vegetal se apoya en dos enfoques para introducir y expresar genes heterólogos en plantas: la transformación genética estable y la expresión transitoria utilizando vectores virales. En este artículo docente se revisan las ventajas e inconvenientes de los dos enfoques, haciendo especial hincapié en la expresión transitoria de proteínas a partir de vectores virales de la primera generación que son aquéllos que emplean el virus completo para promover la infección.

La biotecnología vegetal se apoya en dos enfoques para introducir y expresar genes heterólogos en plantas: la transformación genética estable y la expresión transitoria utilizando vectores virales. En este artículo docente se revisan las ventajas e inconvenientes de los dos enfoques, haciendo especial hincapié en la expresión transitoria de proteínas a partir de vectores virales de la primera generación que son aquéllos que emplean el virus completo para promover la infección.

La biotecnología vegetal se apoya en dos enfoques para introducir y expresar genes heterólogos en plantas: la transformación genética estable y la expresión transitoria utilizando vectores virales. En este artículo docente se revisan las ventajas e inconvenientes de los dos enfoques, haciendo especial hincapié en la expresión transitoria de proteínas a partir de vectores virales de la primera generación que son aquéllos que emplean el virus completo para promover la infección.

Cucumber is one of the most important horticultural species at economic level. Despite its agronomic relevance, there is currently no efficient transformation method available. The problems to obtain transgenic cucumber plants are mainly due to the low morphogenetic response in explants of certain genotypes, poor adequacy of selection methods, decrease in regeneration rate as a consequence of the usual treatments in a transformation experiment and, above all, the high rate of 'escape' plants. Taking into account the existing problems, the first objective of the present work has been the evaluation of the morphogenetic response in cucumber explants and the development of regeneration methods potentially useful in transformation experiments. These studies have been carried out with two commercial cultivars, four pure lines and one line that has been frequently used in cucumber breeding programs. Different types of primary explants have been evaluated to determine which may be the most suitable in a transformation experiment. The influence of the ontogenic state of the seedling on the degree of myxoploidy in cotyledon explants has been studied. Likewise, the ploidy level of regenerated plants from these explants has been determined. Regarding the culture medium, the effect of growth regulators, as well as that of other components, such as silver nitrate or copper sulphate, has been studied. In the context of the second objective, studies on the different stages of the transformation process by co-cultivation of cucumber explants with Agrobacterium tumefaciens have been carried out. Several factors, such as the Agrobacterium strain, how to carry out the phases of inoculation and co-culture, the suitability of different marker genes in the selection process and the influence of different components of the culture medium have been analyzed. Attempts have also been made to infer the causes of the occurrence of 'escape' plants or the formation of chimeras in cucumber transf, El pepino es una de las especies hortícolas más importantes a nivel económico. Pese a su relevancia agronómica, no puede decirse que a día de hoy se disponga de un método de transformación adecuado. Los problemas a la hora de conseguir plantas transgénicas de pepino estriban en la baja respuesta morfogenética en explantes de ciertos genotipos, la escasa adecuación de los métodos de selección, el descenso en la tasa de regeneración debido a los tratamientos habituales en un experimento de transformación y, sobre todo, la alta tasa de escapes. En función de la problemática existente, el primer objetivo del presente trabajo ha sido la evaluación de la respuesta morfogenética en explantes de pepino y el desarrollo de métodos de regeneración potencialmente útiles en experimentos de transformación. Estos estudios se han llevado a cabo con dos cultivares comerciales, cuatro líneas puras y una línea que ha sido utilizada frecuentemente en programas de mejora genética de pepino. Se han empleado distintos tipos de explantes primarios para determinar cuál o cuáles pueden ser los más adecuados en un experimento de transformación. Se ha estudiado la influencia del estado ontogénico de la plántula sobre el grado de mixoploidía en explantes de cotiledón. Asimismo, se ha determinado el nivel de ploidía de las plantas regeneradas a partir de estos explantes. Por lo que respecta al medio de cultivo, además de estudiar el efecto de componentes habituales (e.g. reguladores del crecimiento) se ha evaluado el de otros que no lo son tanto, como el nitrato de plata o el sulfato de cobre. En el contexto del segundo objetivo se han realizado una serie de estudios sobre las etapas del proceso de transformación mediante co-cultivo de explantes de pepino con Agrobacterium tumefaciens. Se han analizado diversos factores, tales como la cepa de Agrobacterium, la forma de llevar a cabo las fases de inoculación y co-cultivo, la adecuación de distintos genes marcadores en el proceso de selección y la, El cogombre és una de les espècies hortícoles més importants a nivell econòmic. A pesar de la seua rellevància agronòmica, no pot dir-se que a hores d'ara es dispose d'un mètode de transformació adequat. Els problemes a l'hora d'aconseguir plantes transgèniques de cogombre consistixen en la baixa resposta morfogenètica en explants de certs genotips, l'escassa adequació dels mètodes de selecció, el descens en la taxa de regeneració degut als tractaments habituals en un experiment de transformació i, sobretot, l'alta taxa de fugues. En funció de la problemàtica existent, el primer objectiu del present treball ha sigut l'avaluació de la resposta en explants de cogombre i el desenvolupament de mètodes de regeneració potencialment útils en experiments de transformació. Estos estudis s'han dut a terme amb dos cultivars comercials de cogombre, tres línies pures i una línia que ha servit de base en programes de millora. S'han empleat distints tipus d'explants primaris per a determinar quin o quins poden ser els més adequats en un experiment de transformació. Pel que fa al mig de cultiu, a més d'estudiar l'efecte de components habituals (e.g. reguladors del creixement) s'ha avaluat el d'altres que no ho són tant, com el nitrat de planta o el sulfat de coure. Així mateix, s'ha analitzat el grau de mixoploidia en alguns explants i l'efecte de certs tractaments sobre el nivell de ploidia de les plantes regenerades. En el context del segon objectiu s'han realitzat una sèrie d'estudis sobre les etapes del procés de transformació per mitjà de co-cultiu d'explants de cogombre amb Agrobacterium tumefaciens. S'han analitzat diversos factors, com ara el cep d'Agrobacterium, la forma de dur a terme les fases d'inoculació i co-cultiu, l'adequació de distints gens marcadors en el procés de selecció i la influència de distints components del mig de cultiu. Així mateix, s'han tractat d'inferir les causes que generen l'aparició de plantes no transgèniques (escape plants) o de quimeres en ex

[EN] Alfalfa (Medicago sativa L.), is a forage legume with a significant content of protein, being the most widely cultivated forage around the world. In this species, the protein content decreased during growth processes as well as other resources used by the plant during the flowering process. Alfalfa also contains a lower concentration of condensed tannins or proanthocyanidins (PAs), less than required to remedy the digestive disorder of ruminant livestock causing pasture bloat by production of greenhouse gases as result of the microbial fermentation and the excessive desamination of proteins in the rumen (by-pass effect). These defects on nutrition are reflected in the yield and production of ruminants. Both problematics are difficult to improve by conventional methods. The overall objective of this thesis is to develop molecular tools useful for genetic manipulation of certain traits of agronomic interest in alfalfa, to enhance their nutritional value. At a first step, we have developed an Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation protocol via somatic embryogenesis applicable to various genotypes of alfalfa to produce viable embryos in the 50% of the inoculated explants. Chimaeric plants or scapes were almost not detected because most of the transgenic plants contained the T-DNA with all the transgenes incorporated, having thus the indispensable tool to perform the other two objectives. We have isolated two orthologs of the TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) gene from alfalfa (MsTFL1c and MsTFL1a). Both genes were constitutively expressed in A. thaliana, and later on in alfalfa, to evaluate their possible use as biotechnological tool for the improvement of the nutritional value of this forage legume, producing a delay in the flowering time and thereby an increase of vegetative development. MsTFL1a performs the same functions as TFL1 in Arabidopsis y its overexpression in this plant produces a remarkable delay of flowering time. In alfalfa, its constitutive expres, [ES] La alfalfa (Medicago sativa L.), es una leguminosa forrajera con un importante contenido en proteína, siendo la más cultivada a nivel mundial. En esta especie, los contenidos protéicos se ven mermados por los procesos de crecimiento y los recursos utilizados por la planta en el proceso de floración. Además, la alfalfa contiene una concentración de taninos condensados o proantocianidinas (PAs) muy inferior a la requerida para subsanar el desorden digestivo del ganado rumiante que genera hinchamiento por gases de efecto invernadero o meteorismo y la excesiva desaminación de las proteínas en el rumen producida por las fermentaciones de la flora microbiana ruminal. Ambas problemáticas son difíciles de abordar mediante métodos convencionales de mejora. El objetivo general de esta Tesis es desarrollar herramientas moleculares de utilidad para la manipulación genética de determinados caracteres de interés agronómico en la alfalfa, con objeto de incrementar su valor nutricional. Para ello, hemos puesto a punto un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens vía embriogénes somática aplicable a varios genotipos de alfalfa, que permite la producción de embriones viables capaces de germinar y producir plantas completas en el 50% de los explantes inoculados. Prácticamente no se detectó la presencia de quimeras o escapes ya que la mayoría de las plantas obtenidas contenían el T-DNA con todos los transgenes incorporados, disponiéndose por tanto de la herramienta imprescindible para la realización de los otros dos objetivos. Hemos aislado dos ortólogos del gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) de alfalfa (MsTFL1c y MsTFL1a). Ambos genes se sobreexpresaron constitutivamente en A. thaliana y después en alfalfa para su posible uso como herramienta biotecnológica para producir un retraso en el tiempo de floración y con ello un posible aumento del desarrollo vegetativo. MsTFL1a extiende la fase vegetativa e inflorescente y retrasa la floración en Arabidopsis., [CA] L'alfals (Medicago sativa L.), és una lleguminosa farratgera amb un important contingut en proteïna, sent la més cultivada a nivell mundial. En aquesta espècie, els continguts proteics es veuen desfavorits amb els processos de creixement i els requeriments utilitzats per la planta en el procés de floració. A més, l'alfals conté una concentració de tanins condensats o proantocianidines (PAs) molt inferior a la requerida per a esmenar el desorde digestiu del bestiar remugant que genera unflament per gasos o meteorisme per la producció de gasos d'efecte hivernacle, i l'excessiva desaminació de les proteïnes en el rumen produïda per les fermentacions de la flora microbiana. Ambdós problemàtiques són difícils d'abordar per mitjà de mètodes convencionals de millora. L'objectiu general d'aquesta Tesi és desenvolupar ferramentes moleculars d'utilitat per a la manipulació genètica de determinats caràcters d'interés agronòmic en l'alfals, a fi d'incrementar el seu valor nutricional. Per a això, hem posat a punt un protocol de transformació mediada per Agrobacterium tumefaciens via embriogènesi somàtica aplicable a diversos genotips d'alfals que permet la producció d'embrions viables capaços de germinar i produir plantes completes en el 50% dels explants inoculats. Pràcticament no es va detectar la presència de fugues, ja que la majoria de les plantes obtingudes contenien el T-DNA amb tots el transgens introduïts, tenint per tant la ferramenta imprescindible per a la realització dels altres dos objectius. Es van aïllar i sobreexpressar constitutivament dos ortòlegs del gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) d'alfals (MsTFL1c i MsTFL1a) en A. thaliana i en alfals per al seu possible ús com a ferramenta biotecnològica, procurant un retard en el temps de floració i amb això un augment del desenvolupament vegetatiu. MsTFL1a estén la fase vegetativa i inflorescent i retarda la floració en Arabidopsis. En alfals la seua expressió constitutiva també produïx retard de la floració. No obsta

[EN] Alfalfa (Medicago sativa L.), is a forage legume with a significant content of protein, being the most widely cultivated forage around the world. In this species, the protein content decreased during growth processes as well as other resources used by the plant during the flowering process. Alfalfa also contains a lower concentration of condensed tannins or proanthocyanidins (PAs), less than required to remedy the digestive disorder of ruminant livestock causing pasture bloat by production of greenhouse gases as result of the microbial fermentation and the excessive desamination of proteins in the rumen (by-pass effect). These defects on nutrition are reflected in the yield and production of ruminants. Both problematics are difficult to improve by conventional methods. The overall objective of this thesis is to develop molecular tools useful for genetic manipulation of certain traits of agronomic interest in alfalfa, to enhance their nutritional value. At a first step, we have developed an Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation protocol via somatic embryogenesis applicable to various genotypes of alfalfa to produce viable embryos in the 50% of the inoculated explants. Chimaeric plants or scapes were almost not detected because most of the transgenic plants contained the T-DNA with all the transgenes incorporated, having thus the indispensable tool to perform the other two objectives. We have isolated two orthologs of the TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) gene from alfalfa (MsTFL1c and MsTFL1a). Both genes were constitutively expressed in A. thaliana, and later on in alfalfa, to evaluate their possible use as biotechnological tool for the improvement of the nutritional value of this forage legume, producing a delay in the flowering time and thereby an increase of vegetative development. MsTFL1a performs the same functions as TFL1 in Arabidopsis y its overexpression in this plant produces a remarkable delay of flowering time. In alfalfa, its constitutive expres, [ES] La alfalfa (Medicago sativa L.), es una leguminosa forrajera con un importante contenido en proteína, siendo la más cultivada a nivel mundial. En esta especie, los contenidos protéicos se ven mermados por los procesos de crecimiento y los recursos utilizados por la planta en el proceso de floración. Además, la alfalfa contiene una concentración de taninos condensados o proantocianidinas (PAs) muy inferior a la requerida para subsanar el desorden digestivo del ganado rumiante que genera hinchamiento por gases de efecto invernadero o meteorismo y la excesiva desaminación de las proteínas en el rumen producida por las fermentaciones de la flora microbiana ruminal. Ambas problemáticas son difíciles de abordar mediante métodos convencionales de mejora. El objetivo general de esta Tesis es desarrollar herramientas moleculares de utilidad para la manipulación genética de determinados caracteres de interés agronómico en la alfalfa, con objeto de incrementar su valor nutricional. Para ello, hemos puesto a punto un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens vía embriogénes somática aplicable a varios genotipos de alfalfa, que permite la producción de embriones viables capaces de germinar y producir plantas completas en el 50% de los explantes inoculados. Prácticamente no se detectó la presencia de quimeras o escapes ya que la mayoría de las plantas obtenidas contenían el T-DNA con todos los transgenes incorporados, disponiéndose por tanto de la herramienta imprescindible para la realización de los otros dos objetivos. Hemos aislado dos ortólogos del gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) de alfalfa (MsTFL1c y MsTFL1a). Ambos genes se sobreexpresaron constitutivamente en A. thaliana y después en alfalfa para su posible uso como herramienta biotecnológica para producir un retraso en el tiempo de floración y con ello un posible aumento del desarrollo vegetativo. MsTFL1a extiende la fase vegetativa e inflorescente y retrasa la floración en Arabidopsis., [CA] L'alfals (Medicago sativa L.), és una lleguminosa farratgera amb un important contingut en proteïna, sent la més cultivada a nivell mundial. En aquesta espècie, els continguts proteics es veuen desfavorits amb els processos de creixement i els requeriments utilitzats per la planta en el procés de floració. A més, l'alfals conté una concentració de tanins condensats o proantocianidines (PAs) molt inferior a la requerida per a esmenar el desorde digestiu del bestiar remugant que genera unflament per gasos o meteorisme per la producció de gasos d'efecte hivernacle, i l'excessiva desaminació de les proteïnes en el rumen produïda per les fermentacions de la flora microbiana. Ambdós problemàtiques són difícils d'abordar per mitjà de mètodes convencionals de millora. L'objectiu general d'aquesta Tesi és desenvolupar ferramentes moleculars d'utilitat per a la manipulació genètica de determinats caràcters d'interés agronòmic en l'alfals, a fi d'incrementar el seu valor nutricional. Per a això, hem posat a punt un protocol de transformació mediada per Agrobacterium tumefaciens via embriogènesi somàtica aplicable a diversos genotips d'alfals que permet la producció d'embrions viables capaços de germinar i produir plantes completes en el 50% dels explants inoculats. Pràcticament no es va detectar la presència de fugues, ja que la majoria de les plantes obtingudes contenien el T-DNA amb tots el transgens introduïts, tenint per tant la ferramenta imprescindible per a la realització dels altres dos objectius. Es van aïllar i sobreexpressar constitutivament dos ortòlegs del gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) d'alfals (MsTFL1c i MsTFL1a) en A. thaliana i en alfals per al seu possible ús com a ferramenta biotecnològica, procurant un retard en el temps de floració i amb això un augment del desenvolupament vegetatiu. MsTFL1a estén la fase vegetativa i inflorescent i retarda la floració en Arabidopsis. En alfals la seua expressió constitutiva també produïx retard de la floració. No obsta

En este artículo se explica en qué se basa la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens (actualmente Rhizobium radiobacter), las características del plásmido Ti y cómo se modifica éste para construir vectores que utilizamos en la transformación de plantas.

En este artículo se explica en qué se basa la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens (actualmente Rhizobium radiobacter), las características del plásmido Ti y cómo se modifica éste para construir vectores que utilizamos en la transformación de plantas.

La seroalbúmina humana (HSA) es una importante proteína encargada de regular la presión osmótica y de transportar diferentes ligandos. Cuando existe una disminución acusada de ella en sangre es necesario restituirla mediante transfusiones. Debido a ello existe una alta demanda de ésta proteína, pero faltan métodos de producción comercialmente viables. Es por ello que actualmente se plantea el uso de las plantas como biofactorías. En los últimos años se ha empleado el tabaco (Nicotiana tabacum) como planta modelo en la obtención de proteínas de interés a través de la transformación de cloroplastos. Un estudio previo demostró que la HSA se acumulaba en el estroma de los cloroplastos en forma de cuerpos de inclusión. Como continuación de ese estudio se planteó la idea de realizar construcciones de plantas transformadas con HSA para formar proteínas de coexpresión y de fusión con tiorredoxinas (Trxs) con el fin de potenciar la solubilidad y estabilidad de la proteína dado que resultados similares se habían obtenido en microorganismos recombinantes como Escherichia coli y, conociendo el origen endosimbiótico de los plastidios era de esperar que se produjera un efecto similar. Para ello se realizó un análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (MET) siendo necesaria la preparación previa del material a través de un protocolo eficiente. Éste fue el primero de nuestros objetivos. El segundo objetivo abordado fue el estudio de la expresión de HSA y las Trxs y su correlación con cambios estructurales dentro de los cloroplastos entre las líneas transgénicas. Nuestros resultados indicaron que cuando ambas proteínas se expresaban en forma de una única proteína de fusión, ésta aparecía expresada en mayor cantidad aunque precipitaba formando cuerpos de inclusión. En cambio si ambas proteínas se coexpresaban independientemente, aumentaba su solubilidad y se evitaban dichos cuerpos. Estos resultados demuestran que la coexpresión de HSA con Trxs es una aproximación útil

En este artículo se explica en qué se basa la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens (actualmente Rhizobium radiobacter), las características del plásmido Ti y cómo se modifica éste para construir vectores que utilizamos en la transformación de plantas.

En este artículo se explica en qué se basa la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens (actualmente Rhizobium radiobacter), las características del plásmido Ti y cómo se modifica éste para construir vectores que utilizamos en la transformación de plantas.

La seroalbúmina humana (HSA) es una importante proteína encargada de regular la presión osmótica y de transportar diferentes ligandos. Cuando existe una disminución acusada de ella en sangre es necesario restituirla mediante transfusiones. Debido a ello existe una alta demanda de ésta proteína, pero faltan métodos de producción comercialmente viables. Es por ello que actualmente se plantea el uso de las plantas como biofactorías. En los últimos años se ha empleado el tabaco (Nicotiana tabacum) como planta modelo en la obtención de proteínas de interés a través de la transformación de cloroplastos. Un estudio previo demostró que la HSA se acumulaba en el estroma de los cloroplastos en forma de cuerpos de inclusión. Como continuación de ese estudio se planteó la idea de realizar construcciones de plantas transformadas con HSA para formar proteínas de coexpresión y de fusión con tiorredoxinas (Trxs) con el fin de potenciar la solubilidad y estabilidad de la proteína dado que resultados similares se habían obtenido en microorganismos recombinantes como Escherichia coli y, conociendo el origen endosimbiótico de los plastidios era de esperar que se produjera un efecto similar. Para ello se realizó un análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (MET) siendo necesaria la preparación previa del material a través de un protocolo eficiente. Éste fue el primero de nuestros objetivos. El segundo objetivo abordado fue el estudio de la expresión de HSA y las Trxs y su correlación con cambios estructurales dentro de los cloroplastos entre las líneas transgénicas. Nuestros resultados indicaron que cuando ambas proteínas se expresaban en forma de una única proteína de fusión, ésta aparecía expresada en mayor cantidad aunque precipitaba formando cuerpos de inclusión. En cambio si ambas proteínas se coexpresaban independientemente, aumentaba su solubilidad y se evitaban dichos cuerpos. Estos resultados demuestran que la coexpresión de HSA con Trxs es una aproximación útil

La seroalbúmina humana (HSA) es una importante proteína encargada de regular la presión osmótica y de transportar diferentes ligandos. Cuando existe una disminución acusada de ella en sangre es necesario restituirla mediante transfusiones. Debido a ello existe una alta demanda de ésta proteína, pero faltan métodos de producción comercialmente viables. Es por ello que actualmente se plantea el uso de las plantas como biofactorías. En los últimos años se ha empleado el tabaco (Nicotiana tabacum) como planta modelo en la obtención de proteínas de interés a través de la transformación de cloroplastos. Un estudio previo demostró que la HSA se acumulaba en el estroma de los cloroplastos en forma de cuerpos de inclusión. Como continuación de ese estudio se planteó la idea de realizar construcciones de plantas transformadas con HSA para formar proteínas de coexpresión y de fusión con tiorredoxinas (Trxs) con el fin de potenciar la solubilidad y estabilidad de la proteína dado que resultados similares se habían obtenido en microorganismos recombinantes como Escherichia coli y, conociendo el origen endosimbiótico de los plastidios era de esperar que se produjera un efecto similar. Para ello se realizó un análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (MET) siendo necesaria la preparación previa del material a través de un protocolo eficiente. Éste fue el primero de nuestros objetivos. El segundo objetivo abordado fue el estudio de la expresión de HSA y las Trxs y su correlación con cambios estructurales dentro de los cloroplastos entre las líneas transgénicas. Nuestros resultados indicaron que cuando ambas proteínas se expresaban en forma de una única proteína de fusión, ésta aparecía expresada en mayor cantidad aunque precipitaba formando cuerpos de inclusión. En cambio si ambas proteínas se coexpresaban independientemente, aumentaba su solubilidad y se evitaban dichos cuerpos. Estos resultados demuestran que la coexpresión de HSA con Trxs es una aproximación útil

El empleo de herramientas genómicas ayudará a superar dos de los retos que todavía subsisten en el campo de la mejora molecular (i.e., vía transformación): la identificación de los genes que realmente controlan los caracteres de interés agronómico y la detección de señales de regulación que permitan modular la expresión de los transgenes a nivel espacial y temporal. Entre las vías para lograr tales objetivos, destaca la mutagénesis insercional por T-DNA, que en los últimos años se ha convertido en una herramienta básica para la identificación y etiquetado de genes, así como para el análisis de su función. En efecto, la disrupción de un gen endógeno o la integración del T-DNA en la vecindad del mismo pueden ocasionar la anulación o alteración de función, dando una valiosa información sobre el papel de un cierto gen en un carácter dado. Otra aplicación de la mutagénesis insercional por T-DNA estriba en la detección de elementos de regulación mediante el empleo de los denominados "sistemas trampa" (trapping) que permiten detectar secuencias reguladoras y asignar una función a partir de datos de expresión del delator que mimetiza la expresión del gen endógeno. El aspecto más relevante de estas aproximaciones es que, tras la identificación de un cierto gen, éste queda etiquetado por el T-DNA, lo que facilita su clonación. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido la generación una colección de líneas de inserción por T-DNA en tomate y la identificación de mutantes afectados en caracteres relacionados con el desarrollo. En concreto, se han generado más de 1200 líneas T-DNA y se han obtenido sus descendencias TG2. La caracterización de estas líneas en TG1 ha conducido a la detección de 255 mutantes (de tipo dominante, semidominante o aditivo) afectados en caracteres vegetativos y/o reproductivos. Asimismo, se ha caracterizado una pequeña muestra de progenies TG2 (en concreto 37) lo que ha permitido la identificación de 6 mutantes recesivos.

El empleo de herramientas genómicas ayudará a superar dos de los retos que todavía subsisten en el campo de la mejora molecular (i.e., vía transformación): la identificación de los genes que realmente controlan los caracteres de interés agronómico y la detección de señales de regulación que permitan modular la expresión de los transgenes a nivel espacial y temporal. Entre las vías para lograr tales objetivos, destaca la mutagénesis insercional por T-DNA, que en los últimos años se ha convertido en una herramienta básica para la identificación y etiquetado de genes, así como para el análisis de su función. En efecto, la disrupción de un gen endógeno o la integración del T-DNA en la vecindad del mismo pueden ocasionar la anulación o alteración de función, dando una valiosa información sobre el papel de un cierto gen en un carácter dado. Otra aplicación de la mutagénesis insercional por T-DNA estriba en la detección de elementos de regulación mediante el empleo de los denominados "sistemas trampa" (trapping) que permiten detectar secuencias reguladoras y asignar una función a partir de datos de expresión del delator que mimetiza la expresión del gen endógeno. El aspecto más relevante de estas aproximaciones es que, tras la identificación de un cierto gen, éste queda etiquetado por el T-DNA, lo que facilita su clonación. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido la generación una colección de líneas de inserción por T-DNA en tomate y la identificación de mutantes afectados en caracteres relacionados con el desarrollo. En concreto, se han generado más de 1200 líneas T-DNA y se han obtenido sus descendencias TG2. La caracterización de estas líneas en TG1 ha conducido a la detección de 255 mutantes (de tipo dominante, semidominante o aditivo) afectados en caracteres vegetativos y/o reproductivos. Asimismo, se ha caracterizado una pequeña muestra de progenies TG2 (en concreto 37) lo que ha permitido la identificación de 6 mutantes recesivos.