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National audience; La silice nanoparticulaire amorphe présente un profil toxicologique particulier en termes de cellules cibles. Parmi celles-ci, les cellules phagocytaires spécialisées du système immunitaire inné représentent des types cellulaires particulièrement importants à étudier. En raison de leur capacité phagocytaire, ces cellules vont accumuler la silice qui peut ensuite perturber leur fonctionnement. Ceci peut se traduire, par exemple, par une activation incontrôlée du système immunitaire ou par une diminution des capacités de réponse du système immunitaire, responsable alors d’une plus grande sensibilité aux maladies. En outre, la diversité des usages fait que la silice nanoparticulaire amorphe va se rencontrer dans des environnements chimiques variés et souvent complexes.

Dendritic cells are key immune cells, from immature status in tissue to a mature status in secondary lymphoid organs, particularly after detection of infectious microorganisms. Among all biological functions that regulate those cells, autophagy plays a central role. This is a catabolic cellular mechanism that confine cytosolic components in autophagosome in formation and eliminate them after fusion with a lysosome. While autophagy is commonly study at the time t, it is better to analyze its dynamic, called autophagic flux. During my thesis, I have characterized three important parameters of the autophagic flux: the velocity, the intensity, and the time of transition that allow the formation of autophagosomes. From this characterization, we have shown distinct autophagic flux properties between immatures and matures dendritic cells. This modification occurs during the maturation process of those cells and independently of the maturation signal use. Finally, we have demonstrated that dendritic cells from Crohn disease patients that express the autophagic polymorphism ATG16L1 T300A, loose their ability to adapt their autophagic flux during their maturation. Thus, those results describe a specific autophagic flux signature which depend on the maturation status of primary human dendritic cells and open perspectives in the physiopathology of Crohn disease. Autophagic flux study could be, over time, a prognosis parameter of the evolution and/or personal treatment in this disease., Les cellules dendritiques sont des cellules clés du système immunitaire, passant d’un état immature dans les tissus à un état mature dans les organes lymphoïdes secondaires, notamment, à la suite de la détection de microorganismes infectieux. Parmi les fonctions biologiques régulant ces cellules, l’autophagie joue un rôle essentiel. Ce mécanisme du catabolisme cellulaire séquestre des composants cytosoliques au sein d’autophagosomes néoformés et les dégrade après fusion avec un lysosome. Alors que l’autophagie est généralement étudiée à un instant donné, il convient davantage d’analyser sa dynamique, appelée flux autophagique. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé trois paramètres cruciaux du flux autophagique : la vélocité, l’intensité et le temps de transition nécessaire à la formation d’autophagosomes. A partir de cette caractérisation, j’ai pu montrer que le flux présente des caractéristiques distinctes entre cellules dendritiques immatures et matures. Ce changement s’opère au cours de la maturation de ces cellules et quelle que soit l’origine du signal de maturation. Enfin, nous avons montré que les cellules dendritiques de patients atteints de la maladie de Crohn exprimant le variant autophagique à risque ATG16L1 T300A, perdent leur capacité à moduler le flux au cours de leur maturation. Ainsi, ces résultats décrivent une signature du flux autophagique propre à l’état immature versus mature des cellules dendritiques primaires humaines et ouvrent des perspectives dans la physiopathologie de la maladie de Crohn. L’étude du flux autophagique pourrait, à terme, être un paramètre pronostique de l’évolution et/ou de traitement personnalisés de la maladie.

Dendritic cells are key immune cells, from immature status in tissue to a mature status in secondary lymphoid organs, particularly after detection of infectious microorganisms. Among all biological functions that regulate those cells, autophagy plays a central role. This is a catabolic cellular mechanism that confine cytosolic components in autophagosome in formation and eliminate them after fusion with a lysosome. While autophagy is commonly study at the time t, it is better to analyze its dynamic, called autophagic flux. During my thesis, I have characterized three important parameters of the autophagic flux: the velocity, the intensity, and the time of transition that allow the formation of autophagosomes. From this characterization, we have shown distinct autophagic flux properties between immatures and matures dendritic cells. This modification occurs during the maturation process of those cells and independently of the maturation signal use. Finally, we have demonstrated that dendritic cells from Crohn disease patients that express the autophagic polymorphism ATG16L1 T300A, loose their ability to adapt their autophagic flux during their maturation. Thus, those results describe a specific autophagic flux signature which depend on the maturation status of primary human dendritic cells and open perspectives in the physiopathology of Crohn disease. Autophagic flux study could be, over time, a prognosis parameter of the evolution and/or personal treatment in this disease.; Les cellules dendritiques sont des cellules clés du système immunitaire, passant d’un état immature dans les tissus à un état mature dans les organes lymphoïdes secondaires, notamment, à la suite de la détection de microorganismes infectieux. Parmi les fonctions biologiques régulant ces cellules, l’autophagie joue un rôle essentiel. Ce mécanisme du catabolisme cellulaire séquestre des composants cytosoliques au sein d’autophagosomes néoformés et les dégrade après fusion avec un lysosome. Alors que l’autophagie est généralement étudiée à un instant donné, il convient davantage d’analyser sa dynamique, appelée flux autophagique. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé trois paramètres cruciaux du flux autophagique : la vélocité, l’intensité et le temps de transition nécessaire à la formation d’autophagosomes. A partir de cette caractérisation, j’ai pu montrer que le flux présente des caractéristiques distinctes entre cellules dendritiques immatures et matures. Ce changement s’opère au cours de la maturation de ces cellules et quelle que soit l’origine du signal de maturation. Enfin, nous avons montré que les cellules dendritiques de patients atteints de la maladie de Crohn exprimant le variant autophagique à risque ATG16L1 T300A, perdent leur capacité à moduler le flux au cours de leur maturation. Ainsi, ces résultats décrivent une signature du flux autophagique propre à l’état immature versus mature des cellules dendritiques primaires humaines et ouvrent des perspectives dans la physiopathologie de la maladie de Crohn. L’étude du flux autophagique pourrait, à terme, être un paramètre pronostique de l’évolution et/ou de traitement personnalisés de la maladie.

The unique characteristics of nanomaterials (NMs) are valuable in many industrial and biomedical applications. However, NMs might also give rise to unforeseen toxicity that could adversely affect the biological system specially the immune system. In the immune system as phagocytes can engulf foreign materials therefore they are appropriate for immunotoxicity screening because these cells participate in unspecific and specific immune responses.In this study, we investigated the impact of different NMs, such as gold nanoparticles (AuNPs), neutral lipid nanoparticles (NLCs), cationic lipid nanoparticles (CLCs), and amphiphilic dendrimers (ADs) on primary macrophages (BMDMs) and dendritic cells (BMDCs) by two approaches. In the first approach, we investigated the direct effect of exposure to NMs. In the second approach, we studied the indirect effect by activating the NMs exposed cells with different activators (LPS and IL-4).The study of direct effect of NMs shows that none of the tested NMs altered the phagocytosis capacity. All of the NMs had none or little direct effect on BMDCs activation. In case of BMDMs, AuNPs, CLCs, and ADs significantly decreased cell activation while NLCs did not. The study of cytokine production based on IL-6 and TNF- production, NO production, and cellular metabolism based on the investigation of glycolysis and mitochondrial metabolism also indicated no or little direct effect on BMDCs and BMDMs. However, we have noticed a significant increase in MCP-1 production by CLCs and ADs exposed cells while AuNPs and NLCs did not modulate MCP-1 production. Also, we noted that CLCs and NLCs at high concentrations could slightly increase ROS production while AuNPs and ADs did not modulate ROS production by BMDMs and BMDCs.Investigation of indirect effect of NMs revealed, when NMs exposed cells were challenged with LPS, we have recorded NMs specific modulation in the response of BMDCs based on cell activation, cytokine and chemokine secretion, NO, and ROS production. All NMs showed none or little modification of cellular metabolism of BMDCs. On the other hand, we have recorded a significant alteration in NMs exposed BMDMs upon LPS challenge in response to cell activation, cytokine and chemokine secretion, NO production, and cellular metabolism. However, ROS production remains unaltered in the case of all the NMs exposed BMDMs.The study of in vitro antigen presentation, revealed that exposure to different NMs altered T cell-specific cytokines reflecting alteration in CD4 + T lymphocytes polarization.Overall, these results demonstrate that NMs directly do not modify phagocytic activity, cytokine and chemokine production, NO and ROS production, cellular metabolism, but when instigated with an activation signal like LPS or IL-4, NMs exposed cells respond differently.The outcome of this study enriches the knowledge regarding NMs specific immunotoxicity, which may facilitate the design of nanomaterials that retain their useful properties, but display reduced toxicity (i.e., safety-by-design). This research will also improve our understanding of how different NMs can modulate the immune system, which might help suggest new therapy acting on the immune system such as antiinflammatory drugs or vaccines., Les caractéristiques uniques des nanomatériaux (NM) sont précieuses dans de nombreuses applications industrielles et biomédicales. Toutefois, les MR pourraient également donner lieu à une toLes phagocytes du xicité imprévue qui pourrait nuire au système biologique en particulier au système immunitaire. Les phagocytes du système immunitaire ont la capacité d’ingérer des matériaux étrangers ; ils sont donc appropriés pour l’étude de l’immunotoxicité car ils sont impliqués dans les réponses immunitaires non spécifiques et spécifiques.Dans cette étude, nous avons étudié l’impact de différents nano matériaux (NM), telles que des nanoparticules d’or (AuNPs), des nanoparticules lipidiques neutres (NLCs) ou cationiques (CLCs), et des dendrimères amphiphiliques (ADs) sur les macrophages primaires (BMDMs) et des cellules dendritiques (BMDCs) par deux approches. Dans la première, nous avons recherché les effets directs de l’exposition. Dans la seconde, nous avons étudié les effets indirects sur l’activation du LPS ou de l’IL-4 des cellules exposées aux NMs.Nos résultats concluent que tous les NMs testés n’ont pas modifié la capacité de phagocytose. Une analyse plus approfondie montre que tous les NMs ne montrent aucun, ou peu, effet direct sur l’activation des BMDC. Pour le BMDMs, les AuNPs, les CLCs et les ADs ont considérablement diminué l’activation cellulaire tandis que les NLCs n’ont d’effet. L’étude de la production de cytokine basée sur la production d’IL-6 et de TNF-, de la production de NO et du métabolisme cellulaire basée sur l’étude de la glycolyse et du métabolisme mitochondrial n’a également pas ou peu d’effet direct sur les BMDCs et les BMDMs. Cependant, nous avons remarqué une augmentation significative de la production de MCP-1 par les CLCs et les cellules exposées aux ADs, tandis que les AuNPs et les NLCs n’ont pas d’effet sur la production de MCP-1. De plus, nous avons noté que les CLCs et les NLCs à forte concentration pourraient légèrement augmenter la production de ROS, tandis que les AuNPs et les ADs ne modulaient pas la production de ROS par les BMDM et les BMDC. L’étude des effets indirects de NMs a montré que quand les cellules exposées aux NMs sont stimulées par du LPS, nous avons observé une modulation de la réponse des BMDCs au niveau de l’activation cellulaire, la sécrétion de cytokine et de chimiokine, NO, et la production de ROS. Toutes les NMs n’affectent pas, ou peu, le métabolisme des BMDCs. D’autre part, nous avons enregistré une altération significative chez les BMDMs exposés aux NMs dans leur réponse à l’activation par le LPS au niveau de l’activation cellulaire, la sécrétion de cytokine et de chimiokine, la production de NO et le métabolisme cellulaire. Cependant, la production de ROS reste inchangée dans le cas des BMDMs exposés aux NMs.L’étude in vitro de la présentation d’antigène, a indiqué que l’exposition à différents NMs modifie les cytokines produites par les cellules T, reflétant l’altération de la polarisation des lymphocytes T CD4 +. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que les NMs ne modifient pas directement l’activité phagocytique, la production de cytokine et de chimiokine, la production de NO et de ROS, le métabolisme cellulaire des cellules phagocytaires, mais lorsqu’elles sont confrontées à un signal d’activation comme le LPS ou l’IL-4, les cellules exposées aux NMs réagissent différemment.

The unique characteristics of nanomaterials (NMs) are valuable in many industrial and biomedical applications. However, NMs might also give rise to unforeseen toxicity that could adversely affect the biological system specially the immune system. In the immune system as phagocytes can engulf foreign materials therefore they are appropriate for immunotoxicity screening because these cells participate in unspecific and specific immune responses.In this study, we investigated the impact of different NMs, such as gold nanoparticles (AuNPs), neutral lipid nanoparticles (NLCs), cationic lipid nanoparticles (CLCs), and amphiphilic dendrimers (ADs) on primary macrophages (BMDMs) and dendritic cells (BMDCs) by two approaches. In the first approach, we investigated the direct effect of exposure to NMs. In the second approach, we studied the indirect effect by activating the NMs exposed cells with different activators (LPS and IL-4).The study of direct effect of NMs shows that none of the tested NMs altered the phagocytosis capacity. All of the NMs had none or little direct effect on BMDCs activation. In case of BMDMs, AuNPs, CLCs, and ADs significantly decreased cell activation while NLCs did not. The study of cytokine production based on IL-6 and TNF-a production, NO production, and cellular metabolism based on the investigation of glycolysis and mitochondrial metabolism also indicated no or little direct effect on BMDCs and BMDMs. However, we have noticed a significant increase in MCP-1 production by CLCs and ADs exposed cells while AuNPs and NLCs did not modulate MCP-1 production. Also, we noted that CLCs and NLCs at high concentrations could slightly increase ROS production while AuNPs and ADs did not modulate ROS production by BMDMs and BMDCs.Investigation of indirect effect of NMs revealed, when NMs exposed cells were challenged with LPS, we have recorded NMs specific modulation in the response of BMDCs based on cell activation, cytokine and chemokine secretion, NO, and ROS production. All NMs showed none or little modification of cellular metabolism of BMDCs. On the other hand, we have recorded a significant alteration in NMs exposed BMDMs upon LPS challenge in response to cell activation, cytokine and chemokine secretion, NO production, and cellular metabolism. However, ROS production remains unaltered in the case of all the NMs exposed BMDMs.The study of in vitro antigen presentation, revealed that exposure to different NMs altered T cell-specific cytokines reflecting alteration in CD4 + T lymphocytes polarization.Overall, these results demonstrate that NMs directly do not modify phagocytic activity, cytokine and chemokine production, NO and ROS production, cellular metabolism, but when instigated with an activation signal like LPS or IL-4, NMs exposed cells respond differently.The outcome of this study enriches the knowledge regarding NMs specific immunotoxicity, which may facilitate the design of nanomaterials that retain their useful properties, but display reduced toxicity (i.e., safety-by-design). This research will also improve our understanding of how different NMs can modulate the immune system, which might help suggest new therapy acting on the immune system such as anti-inflammatory drugs or vaccines., Les caractéristiques uniques des nanomatériaux (NMs) sont précieuses dans de nombreuses applications industrielles et biomédicales. Toutefois, les MR pourraient également donner lieu à une toLes phagocytes du xicité imprévue qui pourrait nuire au système biologique en particulier au système immunitaire. Les phagocytes du système immunitaire ont la capacité d'ingérer des matériaux étrangers ; ils sont donc appropriés pour l'étude de l'immunotoxicité car ils sont impliqués dans les réponses immunitaires non spécifiques et spécifiques.Dans cette étude, nous avons étudié l'impact de différents nano matériaux (NM), telles que des nanoparticules d'or (AuNPs), des nanoparticules lipidiques neutres (NLCs) ou cationiques (CLCs), et des dendrimères amphiphiliques (ADs) sur les macrophages primaires (BMDMs) et des cellules dendritiques (BMDCs) par deux approches. Dans la première, nous avons recherché les effets directs de l'exposition. Dans la seconde, nous avons étudié les effets indirects sur l'activation du LPS ou de l'IL-4 des cellules exposées aux NMs.Nos résultats concluent que tous les NMs testés n'ont pas modifié la capacité de phagocytose. Une analyse plus approfondie montre que tous les NMs ne montrent aucun, ou peu, effet direct sur l'activation des BMDC. Pour le BMDMs, les AuNPs, les CLCs et les ADs ont considérablement diminué l'activation cellulaire tandis que les NLCs n'ont d'effet. L'étude de la production de cytokine basée sur la production d'IL-6 et de TNF-a, de la production de NO et du métabolisme cellulaire basée sur l'étude de la glycolyse et du métabolisme mitochondrial n'a également pas ou peu d'effet direct sur les BMDCs et les BMDMs. Cependant, nous avons remarqué une augmentation significative de la production de MCP-1 par les CLCs et les cellules exposées aux ADs, tandis que les AuNPs et les NLCs n'ont pas d'effet sur la production de MCP-1. De plus, nous avons noté que les CLCs et les NLCs à forte concentration pourraient légèrement augmenter la production de ROS, tandis que les AuNPs et les ADs ne modulaient pas la production de ROS par les BMDM et les BMDC.L'étude des effets indirects de NMs a montré que quand les cellules exposées aux NMs sont stimulées par du LPS, nous avons observé une modulation de la réponse des BMDCs au niveau de l'activation cellulaire, la sécrétion de cytokine et de chimiokine, NO, et la production de ROS. Toutes les NMs n'affectent pas, ou peu, le métabolisme des BMDCs. D'autre part, nous avons enregistré une altération significative chez les BMDMs exposés aux NMs dans leur réponse à l'activation par le LPS au niveau de l'activation cellulaire, la sécrétion de cytokine et de chimiokine, la production de NO et le métabolisme cellulaire. Cependant, la production de ROS reste inchangée dans le cas des BMDMs exposés aux NMs.L'étude in vitro de la présentation d'antigène, a indiqué que l'exposition à différents NMs modifie les cytokines produites par les cellules T, reflétant l'altération de la polarisation des lymphocytes T CD4 +.Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que les NMs ne modifient pas directement l'activité phagocytique, la production de cytokine et de chimiokine, la production de NO et de ROS, le métabolisme cellulaire des cellules phagocytaires, mais lorsqu'elles sont confrontées à un signal d'activation comme le LPS ou l'IL-4, les cellules exposées aux NMs réagissent différemment.

Food allergy is a major public health which impacts patients’ quality of life and can cause life-threatening allergic symptoms upon allergen ingestion. Currently, there is no efficacious treatment apart from allergen eviction. In that context, epicutaneous allergen immunotherapy (EPIT) is a potential treatment still in development which aims at re-inducing tolerance (desensitization) in allergic patients through repeated epicutaneous allergen application. Immune mechanisms underlying EPIT efficacy are poorly understood but imply the induction of regulatory T lymphocytes (TREG) and an immune deviation. Thus, my thesis project aimed at (1) identifying the skin dendritic cell (skDC) subsets responsible for EPIT efficacy, and (2) determining which skDC acquire tolerogenic phenotype and functions throughout EPIT treatment. Taking advantage of preclinical mouse models, we demonstrated the requirement of epidermal Langerhans cells (LC) for EPIT efficacy contrary to conventional dermal type 1 DC (cDC1). Besides, the longitudinal monitoring of DC revealed a modulation of their activation status with EPIT. Functionally, after EPIT, LC activated more preferentially TREG at the detriment of TEFF, while cDC2 skewed type 2 T cell response toward type 1 and type 17 profile that may benefit to EPIT-induced desensitization. Those results open new avenues for the development of predictive biomarkers, strategies for improvement and future efficacious personalized medicine, L’allergie alimentaire est un problème majeur de santé publique qui affecte grandement la qualité de vie des patients, principalement des enfants, et peut causer des symptômes sévères voire mortels, lors de l’ingestion de faibles quantités d’un allergène. A l’heure actuelle, le seul traitement efficace est l’éviction de l’allergène. Dans ce contexte, l’immunothérapie allergénique épicutanée (EPIT) est un traitement potentiel qui vise à réinduire une tolérance (désensibilisation) chez les patients allergiques via l’administration répétée sur la peau de l’allergène responsable. Les mécanismes immunitaires sous-jacents à l’efficacité de l’EPIT restent mal compris mais dépendent notamment de l’induction de lymphocytes T régulateurs (LTREG) et d’une déviation immunitaire. Ainsi, mon projet de thèse avait pour objectif d’identifier (1) les populations de cellules dendritiques (DC) cutanées qui conditionnent l’efficacité du traitement, et (2) déterminer quelles DC cutanées acquièrent un phénotype et une fonction tolérogénique au fur et à mesure du traitement. A l’aide de modèles pré-cliniques d’allergie, mes travaux de recherche ont permis d’identifier les cellules de Langerhans (LC) épidermiques comme nécessaires à l’efficacité du traitement, contrairement aux cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (cDC1) dermiques. En outre, l’étude longitudinale du phénotype et des fonctions des DC a mis en évidence que leur état d’activation était modulé avec EPIT. Fonctionnellement, après EPIT, les LC activent préférentiellement des LTREG au détriment des LTEFF., tandis que les cDC2 réorientent la réponse lymphocytaire de type 2 (Th2) vers une réponse type 1 et type 17. Ces résultats ouvrent la voie au développement de biomarqueurs d’efficacité et à des stratégies d’amélioration du traitement pour une médecine personnalisée et plus efficace

Food allergy is a major public health which impacts patients’ quality of life and can cause life-threatening allergic symptoms upon allergen ingestion. Currently, there is no efficacious treatment apart from allergen eviction. In that context, epicutaneous allergen immunotherapy (EPIT) is a potential treatment still in development which aims at re-inducing tolerance (desensitization) in allergic patients through repeated epicutaneous allergen application. Immune mechanisms underlying EPIT efficacy are poorly understood but imply the induction of regulatory T lymphocytes (TREG) and an immune deviation. Thus, my thesis project aimed at (1) identifying the skin dendritic cell (skDC) subsets responsible for EPIT efficacy, and (2) determining which skDC acquire tolerogenic phenotype and functions throughout EPIT treatment. Taking advantage of preclinical mouse models, we demonstrated the requirement of epidermal Langerhans cells (LC) for EPIT efficacy contrary to conventional dermal type 1 DC (cDC1). Besides, the longitudinal monitoring of DC revealed a modulation of their activation status with EPIT. Functionally, after EPIT, LC activated more preferentially TREG at the detriment of TEFF, while cDC2 skewed type 2 T cell response toward type 1 and type 17 profile that may benefit to EPIT-induced desensitization. Those results open new avenues for the development of predictive biomarkers, strategies for improvement and future efficacious personalized medicine; L’allergie alimentaire est un problème majeur de santé publique qui affecte grandement la qualité de vie des patients, principalement des enfants, et peut causer des symptômes sévères voire mortels, lors de l’ingestion de faibles quantités d’un allergène. A l’heure actuelle, le seul traitement efficace est l’éviction de l’allergène. Dans ce contexte, l’immunothérapie allergénique épicutanée (EPIT) est un traitement potentiel qui vise à réinduire une tolérance (désensibilisation) chez les patients allergiques via l’administration répétée sur la peau de l’allergène responsable. Les mécanismes immunitaires sous-jacents à l’efficacité de l’EPIT restent mal compris mais dépendent notamment de l’induction de lymphocytes T régulateurs (LTREG) et d’une déviation immunitaire. Ainsi, mon projet de thèse avait pour objectif d’identifier (1) les populations de cellules dendritiques (DC) cutanées qui conditionnent l’efficacité du traitement, et (2) déterminer quelles DC cutanées acquièrent un phénotype et une fonction tolérogénique au fur et à mesure du traitement. A l’aide de modèles pré-cliniques d’allergie, mes travaux de recherche ont permis d’identifier les cellules de Langerhans (LC) épidermiques comme nécessaires à l’efficacité du traitement, contrairement aux cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (cDC1) dermiques. En outre, l’étude longitudinale du phénotype et des fonctions des DC a mis en évidence que leur état d’activation était modulé avec EPIT. Fonctionnellement, après EPIT, les LC activent préférentiellement des LTREG au détriment des LTEFF., tandis que les cDC2 réorientent la réponse lymphocytaire de type 2 (Th2) vers une réponse type 1 et type 17. Ces résultats ouvrent la voie au développement de biomarqueurs d’efficacité et à des stratégies d’amélioration du traitement pour une médecine personnalisée et plus efficace

Atopic dermatitis (AD) is a chronic cutaneous inflammation driven by T helper 2 cells (Th2) and characterized by a persistent itch. This response relies on Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) production by keratinocytes and T cell orientation by TSLP-stimulated skin dendritic cells (DCs). Here, we propose new strategies to model AD pathogenesis in human systems. We validated vitamin D3 as an initiation stimulus for human TSLP-dependent Th2 (IL-13+) responses in healthy skin explants. In skin DCs and monocyte-derived DCs (MonoDCs), we showed that vitamin D3 provokes marked phenotypic alterations, characterized by CD14 expression. These cells specifically lead to TSLP-independent Th2 (IL-4+) orientation. In parallel, we have constructed a 3D skin model harboring DCs, sensory neurons and keratinocytes, in which we will evaluate whether vitamin D3 and other stimuli may induce Th2 responses, and how this might be regulated by neurons. This approach will help the rational design of AD-specific therapies.; La dermatite atopique (DA) est une maladie cutanée inflammatoire chronique, caractérisée par un infiltrat de lymphocytes T helper 2 (Th2) et une sensation de prurit. Cette réponse est sous influence du Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP), produit par les kératinocytes, qui affecte la capacité des cellules dendritiques (DCs) de la peau à orienter des lymphocytes T. Nous proposons ici de nouvelles stratégies pour modéliser la DA in vitro chez l’homme. Nous avons validé la vitamine D3 pour initier des réponses Th2 TSLP-dépendantes (IL-13+) sur des explants de peau saine. Dans les DCs de peau ou dérivées de monocytes (MonoDCs), nous avons démontré que la vitamine D3 provoque de profonds changements phénotypiques, caractérisés par l’expression du marqueur CD14. Ces cellules conduisent spécifiquement à une orientation Th2 (IL-4+) TSLP-indépendante. En parallèle, nous avons constitué un modèle 3D de peau contenant des DCs, des neurones et des kératinocytes, dans lequel nous évaluerons si la vitamine D3 et d’autres agents peuvent induire une réponse Th2, et si celle-ci peut être influencée par les neurones. Cette étude aidera à la conception de thérapies spécifiques de la DA.

The unique characteristics of nanomaterials (NMs) are valuable in many industrial and biomedical applications. However, NMs might also give rise to unforeseen toxicity that could adversely affect the biological system specially the immune system. In the immune system as phagocytes can engulf foreign materials therefore they are appropriate for immunotoxicity screening because these cells participate in unspecific and specific immune responses.In this study, we investigated the impact of different NMs, such as gold nanoparticles (AuNPs), neutral lipid nanoparticles (NLCs), cationic lipid nanoparticles (CLCs), and amphiphilic dendrimers (ADs) on primary macrophages (BMDMs) and dendritic cells (BMDCs) by two approaches. In the first approach, we investigated the direct effect of exposure to NMs. In the second approach, we studied the indirect effect by activating the NMs exposed cells with different activators (LPS and IL-4).The study of direct effect of NMs shows that none of the tested NMs altered the phagocytosis capacity. All of the NMs had none or little direct effect on BMDCs activation. In case of BMDMs, AuNPs, CLCs, and ADs significantly decreased cell activation while NLCs did not. The study of cytokine production based on IL-6 and TNF- production, NO production, and cellular metabolism based on the investigation of glycolysis and mitochondrial metabolism also indicated no or little direct effect on BMDCs and BMDMs. However, we have noticed a significant increase in MCP-1 production by CLCs and ADs exposed cells while AuNPs and NLCs did not modulate MCP-1 production. Also, we noted that CLCs and NLCs at high concentrations could slightly increase ROS production while AuNPs and ADs did not modulate ROS production by BMDMs and BMDCs.Investigation of indirect effect of NMs revealed, when NMs exposed cells were challenged with LPS, we have recorded NMs specific modulation in the response of BMDCs based on cell activation, cytokine and chemokine secretion, NO, and ROS production. All NMs showed none or little modification of cellular metabolism of BMDCs. On the other hand, we have recorded a significant alteration in NMs exposed BMDMs upon LPS challenge in response to cell activation, cytokine and chemokine secretion, NO production, and cellular metabolism. However, ROS production remains unaltered in the case of all the NMs exposed BMDMs.The study of in vitro antigen presentation, revealed that exposure to different NMs altered T cell-specific cytokines reflecting alteration in CD4 + T lymphocytes polarization.Overall, these results demonstrate that NMs directly do not modify phagocytic activity, cytokine and chemokine production, NO and ROS production, cellular metabolism, but when instigated with an activation signal like LPS or IL-4, NMs exposed cells respond differently.The outcome of this study enriches the knowledge regarding NMs specific immunotoxicity, which may facilitate the design of nanomaterials that retain their useful properties, but display reduced toxicity (i.e., safety-by-design). This research will also improve our understanding of how different NMs can modulate the immune system, which might help suggest new therapy acting on the immune system such as antiinflammatory drugs or vaccines., Les caractéristiques uniques des nanomatériaux (NM) sont précieuses dans de nombreuses applications industrielles et biomédicales. Toutefois, les MR pourraient également donner lieu à une toLes phagocytes du xicité imprévue qui pourrait nuire au système biologique en particulier au système immunitaire. Les phagocytes du système immunitaire ont la capacité d’ingérer des matériaux étrangers ; ils sont donc appropriés pour l’étude de l’immunotoxicité car ils sont impliqués dans les réponses immunitaires non spécifiques et spécifiques.Dans cette étude, nous avons étudié l’impact de différents nano matériaux (NM), telles que des nanoparticules d’or (AuNPs), des nanoparticules lipidiques neutres (NLCs) ou cationiques (CLCs), et des dendrimères amphiphiliques (ADs) sur les macrophages primaires (BMDMs) et des cellules dendritiques (BMDCs) par deux approches. Dans la première, nous avons recherché les effets directs de l’exposition. Dans la seconde, nous avons étudié les effets indirects sur l’activation du LPS ou de l’IL-4 des cellules exposées aux NMs.Nos résultats concluent que tous les NMs testés n’ont pas modifié la capacité de phagocytose. Une analyse plus approfondie montre que tous les NMs ne montrent aucun, ou peu, effet direct sur l’activation des BMDC. Pour le BMDMs, les AuNPs, les CLCs et les ADs ont considérablement diminué l’activation cellulaire tandis que les NLCs n’ont d’effet. L’étude de la production de cytokine basée sur la production d’IL-6 et de TNF-, de la production de NO et du métabolisme cellulaire basée sur l’étude de la glycolyse et du métabolisme mitochondrial n’a également pas ou peu d’effet direct sur les BMDCs et les BMDMs. Cependant, nous avons remarqué une augmentation significative de la production de MCP-1 par les CLCs et les cellules exposées aux ADs, tandis que les AuNPs et les NLCs n’ont pas d’effet sur la production de MCP-1. De plus, nous avons noté que les CLCs et les NLCs à forte concentration pourraient légèrement augmenter la production de ROS, tandis que les AuNPs et les ADs ne modulaient pas la production de ROS par les BMDM et les BMDC. L’étude des effets indirects de NMs a montré que quand les cellules exposées aux NMs sont stimulées par du LPS, nous avons observé une modulation de la réponse des BMDCs au niveau de l’activation cellulaire, la sécrétion de cytokine et de chimiokine, NO, et la production de ROS. Toutes les NMs n’affectent pas, ou peu, le métabolisme des BMDCs. D’autre part, nous avons enregistré une altération significative chez les BMDMs exposés aux NMs dans leur réponse à l’activation par le LPS au niveau de l’activation cellulaire, la sécrétion de cytokine et de chimiokine, la production de NO et le métabolisme cellulaire. Cependant, la production de ROS reste inchangée dans le cas des BMDMs exposés aux NMs.L’étude in vitro de la présentation d’antigène, a indiqué que l’exposition à différents NMs modifie les cytokines produites par les cellules T, reflétant l’altération de la polarisation des lymphocytes T CD4 +. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que les NMs ne modifient pas directement l’activité phagocytique, la production de cytokine et de chimiokine, la production de NO et de ROS, le métabolisme cellulaire des cellules phagocytaires, mais lorsqu’elles sont confrontées à un signal d’activation comme le LPS ou l’IL-4, les cellules exposées aux NMs réagissent différemment.

Human immunity is essentially driven by dendritic cells and T helper cells. When dendritic cells detect a pathogen, they will instruct T helper cells to adopt the adapted phenotype for the specific threat encountered. T helper cells are subdivided in multiple subsets, characterized by particular sets of cytokines. Each T helper subset has specific functions and is involved in the clearance of distinct pathogens. If T helper responses are not precisely regulated, they can become pathogenic, in this case T helper pathways can be considered as potential targets for therapy. In this context, I focused my PhD work on studying T helper cell subset diversity and regulation. First, I demonstrated the ability of TSLP-activated dendritic cell to induce T follicular helper cell polarization. Then I participated in building a mathematical model capable of predicting T helper cell response to dendritic-cell derived signals. This model allowed us to identify the specific role of IL-12p70, in an IL-1 context, to induce IL-17F without IL-17A. Finally, I monitered eight T helper and T follicular helper cell populations in peripheral blood from atopic dermatitis patients treated with Dupilumab, an immunotherapy targeting the IL-4 receptor alpha subunit, and was able to show a correlation between decrease of Th17 cell percentage and improvement of EASI clinical score. Overall, my work on Th phenotype diversity provides key mechanistic insight with potential application in immunotherapy.; Le système immunitaire humain est majoritairement commandé par les cellules dendritiques et les lymphocytes T auxiliaires. Lorsque les cellules dendritiques détectent un pathogène, elles vont instruire les lymphocytes T auxiliaires afin qu’ils adoptent le phénotype approprié à la menace rencontrée. Les lymphocytes T auxiliaires peuvent être divisés en plusieurs sous-populations, caractérisées par la production de cytokines spécifiques. Chaque sous-population de lymphocyte T auxiliaire possède des fonctions propres et est impliquée dans l’élimination de pathogènes distincts. Si les réponses des lymphocytes T auxiliaires ne sont pas finement régulées, ils peuvent devenir pathogéniques, et dans ce cas, considérés comme cibles potentielles pour des thérapies. Dans ce contexte, j’ai concentré mon travail de doctorat sur l’étude de la diversité des sous- populations de lymphocytes T auxiliaires et de leur régulation. Premièrement, j’ai démontré que les cellules dendritiques activées par la TSLP sont capables d’induire la polarisation de lymphocytes T folliculaires. Ensuite, j’ai participé à la construction d’un modèle mathématique capable de prédire la réponse lymphocytaire T auxiliaire en fonction de signaux dérivés des cellules dendritiques. Ce modèle nous a permis d’identifier un rôle spécifique pour l’IL-12p70, dépendant du contexte IL-1, dans l’induction d’IL-17F sans IL-17A. Enfin, j’ai monitoré huit populations de lymphocytes T auxiliaires et folliculaires dans le sang périphérique de patients atteints de dermatite atopique traités par Dupilumab, une immunothérapie ciblant la sous-unité alpha du récepteur de l’IL-4 et j’ai pu montré que la diminution du pourcentage de lymphocytes Th17 correlait avec l’amélioration du score clinique EASI. Globalement, mon travail sur la diversité de phénotypes Th apporte une ressource mécanistique importante, avec une potentielle application en immunothérapie.

Human immunity is essentially driven by dendritic cells and T helper cells. When dendritic cells detect a pathogen, they will instruct T helper cells to adopt the adapted phenotype for the specific threat encountered. T helper cells are subdivided in multiple subsets, characterized by particular sets of cytokines. Each T helper subset has specific functions and is involved in the clearance of distinct pathogens. If T helper responses are not precisely regulated, they can become pathogenic, in this case T helper pathways can be considered as potential targets for therapy. In this context, I focused my PhD work on studying T helper cell subset diversity and regulation. First, I demonstrated the ability of TSLP-activated dendritic cell to induce T follicular helper cell polarization. Then I participated in building a mathematical model capable of predicting T helper cell response to dendritic-cell derived signals. This model allowed us to identify the specific role of IL-12p70, in an IL-1 context, to induce IL-17F without IL-17A. Finally, I monitered eight T helper and T follicular helper cell populations in peripheral blood from atopic dermatitis patients treated with Dupilumab, an immunotherapy targeting the IL-4 receptor alpha subunit, and was able to show a correlation between decrease of Th17 cell percentage and improvement of EASI clinical score. Overall, my work on Th phenotype diversity provides key mechanistic insight with potential application in immunotherapy., Le système immunitaire humain est majoritairement commandé par les cellules dendritiques et les lymphocytes T auxiliaires. Lorsque les cellules dendritiques détectent un pathogène, elles vont instruire les lymphocytes T auxiliaires afin qu’ils adoptent le phénotype approprié à la menace rencontrée. Les lymphocytes T auxiliaires peuvent être divisés en plusieurs sous-populations, caractérisées par la production de cytokines spécifiques. Chaque sous-population de lymphocyte T auxiliaire possède des fonctions propres et est impliquée dans l’élimination de pathogènes distincts. Si les réponses des lymphocytes T auxiliaires ne sont pas finement régulées, ils peuvent devenir pathogéniques, et dans ce cas, considérés comme cibles potentielles pour des thérapies. Dans ce contexte, j’ai concentré mon travail de doctorat sur l’étude de la diversité des sous- populations de lymphocytes T auxiliaires et de leur régulation. Premièrement, j’ai démontré que les cellules dendritiques activées par la TSLP sont capables d’induire la polarisation de lymphocytes T folliculaires. Ensuite, j’ai participé à la construction d’un modèle mathématique capable de prédire la réponse lymphocytaire T auxiliaire en fonction de signaux dérivés des cellules dendritiques. Ce modèle nous a permis d’identifier un rôle spécifique pour l’IL-12p70, dépendant du contexte IL-1, dans l’induction d’IL-17F sans IL-17A. Enfin, j’ai monitoré huit populations de lymphocytes T auxiliaires et folliculaires dans le sang périphérique de patients atteints de dermatite atopique traités par Dupilumab, une immunothérapie ciblant la sous-unité alpha du récepteur de l’IL-4 et j’ai pu montré que la diminution du pourcentage de lymphocytes Th17 correlait avec l’amélioration du score clinique EASI. Globalement, mon travail sur la diversité de phénotypes Th apporte une ressource mécanistique importante, avec une potentielle application en immunothérapie.

In peripherally acquired prion diseases, prions move through several tissues of the infected host, notably in the lymphoid tissue, long before the occurrence of neuroinvasion. Accumulation can even be restricted to the lymphoid tissue without neuroinvasion and clinical disease. Several experimental observations indicated that the presence of differentiated follicular dendritic cells (FDCs) in the lymphoid structures and the strain type are critical determinants of prion extraneural replication. In this context, the report that granulomatous structures apparently devoid of FDCs could support prion replication raised the question of the requirements for prion lymphotropism. The report also raised the possibility that nonlymphoid tissue-tropic prions could actually target these inflammatory structures. To investigate these issues, we examined the capacity of closely related prions, albeit with opposite lymphotropism (or FDC dependency), for establishment in experimentally-induced granuloma in ovine PrP transgenic mice. We found a positive correlation between the prion capacity to accumulate in the lymphoid tissue and granuloma, regardless of the prion detection method used. Surprisingly, we also revealed that the accumulation of prions in granulomas involved lymphoid-like structures associated with the granulomas and containing cells that stain positive for PrP, Mfge-8 but not CD45 that strongly suggest FDCs. These results suggest that the FDC requirement for prion replication in lymphoid/inflammatory tissues may be strain-dependent.

The cancer, one of the main causes of death in the world, can appear in almost any type of tissue, and is characterized by an anarchic proliferation of cells and the establishment of a tolerogenic immune response favouring the tumour growth, leading to low efficiency of drug interventions. Dendritic cells (DCs), real sentinels of the body, seem to play a role in the establishment of both efficient anti-tumoral immune response and tolerance against cancer. Nevertheless, the role of the different DCs subtypes in the tumoral development stays poorly known. During this thesis, I studied different dendritic and lymphocytic cellular actors, their relationships and their involvement in the immune response or tolerance to tumours. During the first part of my thesis, I studied the effect of the artificial modulation of DCs homeostasis on other immune cells and also on anti-tumoral response in vivo in mice. I proved the existence of a paradoxical role of the Flt3-L (FL) cytokine - a growth factor essential to the differentiation and the homeostasis of classical/conventional dendritic cells (cDCs) and plasmacytoid dendritic cells (pDCs) - on the B16 melanoma growth. In fact, its overexpression or absence both lead to a better control of the tumoral development, accompanied by an increased survival of mice. FL deficiency induces, together with the loss of both cDCs and pDCs, a drastic reduction of regulatory T lymphocytes (Tregs) protecting the tumour, and also a global reinforcement of the anti-tumoral adaptive immune response via helper T lymphocytes. Its overexpression induces an increase of the numbers of cDCs and pDCs, and despite a raised presence of Tregs, also a strong intra-tumoral recruitment of activated natural killer (NK) cells, one of the major actors of the anti-tumoral innate response. The study of cDCs-deficient mice allowed me to demonstrate the existence of a DCs-mediated control of the NK cells homeostasis. Furthermore, the combination of both FL treatment and antibody-mediated Tregs depletion has an exacerbated therapeutic effect in mice. Next, using bioinformatic analysis of transcriptomes of 35 different cancer types, I showed that the FL paradox also exists in humans, at least for some cancers, and that gene signatures specific of DCs subsets can be correlated in a paradoxical, beneficial or detrimental manner to survival. In parallel, I evaluated the presence of several immune cells in the tumour infiltrate and their effects on patients survival. Thanks to R language algorithms I developed, I was able to analyse for each studied cancer the immune cell populations-specific gene signatures and the most involved or dysregulated genes and biological functions (pathways) in the control of the 5 years survival of patients. My results indicate that the immune cells of the tumour infiltrate can play, according to the cancer, a beneficial or deleterious role. This immune infiltrate and the associated pathways were generally of bad prognosis in cancers of immune-privileged organs, but on the other hand were beneficial in skin and breast cancers. For each cancer type, I determined the individual impact on survival of several types of immune cells and established correlations between involved pathways and some of these cell populations. Altogether, the results allow to better understand the complex relationships between each cancer and the associated immune infiltrate, and will later lead to help the development of immunotherapeutic strategies more adapted to a given tumour environment, by targeting the immune populations that could really impact the survival of patients.; Le cancer, l'une des principales causes de décès dans le monde, peut apparaître dans presque tout type de tissu, et est caractérisé par la prolifération anarchique de cellules et l'établissement d'une réponse immunitaire tolérogène favorisant la croissance tumorale, rendant souvent toute intervention médicamenteuse peu efficace. Les cellules dendritiques (DCs), véritables sentinelles de l'organisme, semblent jouer un rôle dans l'établissement à la fois d'une réponse anti-tumorale efficace et d'une tolérance face au cancer. Malgré tout, le rôle des différents sous-types de DCs dans le développement tumoral reste mal connu. Au cours de cette thèse, j'ai étudié différents acteurs cellulaires dendritiques et lymphocytaires, leurs relations et leur implication dans la réponse ou la tolérance immunitaire aux tumeurs. Durant la première partie de ma thèse, j'ai abordé l'effet de la modulation artificielle de l'homéostasie des DCs sur les autres cellules immunitaires ainsi que sur la réponse anti-tumorale in vivo chez la souris. J'ai montré qu'il existait un rôle paradoxal de la cytokine Flt3-L (FL) - un facteur de croissance essentiel à la différentiation et à l'homéostasie des DCs dites classiques/conventionnelles (cDCs) et des DCs plasmacytoïdes (pDCs) - sur la croissance du mélanome B16. En effet, sa surexpression ou son absence mènent à un meilleur contrôle du développement tumoral, accompagnées par une survie accrue des souris. L'absence de FL induit, en sus d'une disparition des cDCs et pDCs, une réduction drastique des lymphocytes T régulateurs (Tregs) protégeant la tumeur, ainsi qu'un renforcement général de la réponse immunitaire anti-tumorale adaptative via les lymphocytes T helpers. Sa surexpression induit une augmentation du nombre de cDCs et pDCs, et malgré une présence accrue de Tregs, un fort recrutement intra-tumoral de lymphocytes natural killer (NK) activés, un des acteurs majeurs de la réponse anti-tumorale innée. L'étude de souris déficientes en cDCs m'a également permis de démontrer l'existence d'un contrôle de l'homéostasie des NK par les DCs. De plus, la combinaison d'un traitement par FL et un anticorps déplétant les Tregs a un effet thérapeutique exacerbé chez la souris. Ensuite, par l'analyse bio-informatique de transcriptomes provenant de 35 types de cancers différents, j'ai montré que le paradoxe du FL existe également chez l'Homme, du moins pour certains cancers, et que les signatures géniques spécifiques de sous-populations de DCs peuvent être corrélées de manière paradoxale, bénéfique ou préjudiciable à la survie. En parallèle, j'ai évalué la présence de diverses cellules immunitaires dans l'infiltrat tumoral et leurs effets sur la survie des patients. Grâce aux algorithmes en langage R que j'ai développés, j'ai pu analyser pour tous les cancers étudiés les signatures géniques spécifiques de populations cellulaires immunitaires ainsi que les gènes et fonctions biologiques (pathways) les plus fortement dysrégulés ou impliqués dans le contrôle de la survie à 5 ans. Les résultats indiquent que les cellules immunitaires de l'infiltrat tumoral dans leur ensemble peuvent jouer, selon le cancer, un rôle bénéfique ou délétère. Cet infiltrat et les pathways immunitaires associés se sont révélés généralement de mauvais pronostic dans les cancers des organes dits immuno-privilégiés, mais en revanche bénéfiques dans les cancers du sein et de la peau. Pour chaque type de cancer, j'ai déterminé l'impact individuel sur la survie de différents types de cellules immunitaires et ai établi les corrélations entre les pathways impliqués et certaines de ces populations cellulaires. L'ensemble de ces résultats permet de mieux comprendre les relations complexes entre chaque cancer et son infiltrat cellulaire, et permettra à terme d'aider à développer des stratégies immuno-thérapeutiques plus adaptées à un environnement tumoral donné, en ciblant les populations immunitaires pouvant réellement impacter la survie des patients.

The cancer, one of the main causes of death in the world, can appear in almost any type of tissue, and is characterized by an anarchic proliferation of cells and the establishment of a tolerogenic immune response favouring the tumour growth, leading to low efficiency of drug interventions. Dendritic cells (DCs), real sentinels of the body, seem to play a role in the establishment of both efficient anti-tumoral immune response and tolerance against cancer. Nevertheless, the role of the different DCs subtypes in the tumoral development stays poorly known. During this thesis, I studied different dendritic and lymphocytic cellular actors, their relationships and their involvement in the immune response or tolerance to tumours. During the first part of my thesis, I studied the effect of the artificial modulation of DCs homeostasis on other immune cells and also on anti-tumoral response in vivo in mice. I proved the existence of a paradoxical role of the Flt3-L (FL) cytokine - a growth factor essential to the differentiation and the homeostasis of classical/conventional dendritic cells (cDCs) and plasmacytoid dendritic cells (pDCs) - on the B16 melanoma growth. In fact, its overexpression or absence both lead to a better control of the tumoral development, accompanied by an increased survival of mice. FL deficiency induces, together with the loss of both cDCs and pDCs, a drastic reduction of regulatory T lymphocytes (Tregs) protecting the tumour, and also a global reinforcement of the anti-tumoral adaptive immune response via helper T lymphocytes. Its overexpression induces an increase of the numbers of cDCs and pDCs, and despite a raised presence of Tregs, also a strong intra-tumoral recruitment of activated natural killer (NK) cells, one of the major actors of the anti-tumoral innate response. The study of cDCs-deficient mice allowed me to demonstrate the existence of a DCs-mediated control of the NK cells homeostasis. Furthermore, the combination of both FL treatment and antibody-mediated Tregs depletion has an exacerbated therapeutic effect in mice. Next, using bioinformatic analysis of transcriptomes of 35 different cancer types, I showed that the FL paradox also exists in humans, at least for some cancers, and that gene signatures specific of DCs subsets can be correlated in a paradoxical, beneficial or detrimental manner to survival. In parallel, I evaluated the presence of several immune cells in the tumour infiltrate and their effects on patients survival. Thanks to R language algorithms I developed, I was able to analyse for each studied cancer the immune cell populations-specific gene signatures and the most involved or dysregulated genes and biological functions (pathways) in the control of the 5 years survival of patients. My results indicate that the immune cells of the tumour infiltrate can play, according to the cancer, a beneficial or deleterious role. This immune infiltrate and the associated pathways were generally of bad prognosis in cancers of immune-privileged organs, but on the other hand were beneficial in skin and breast cancers. For each cancer type, I determined the individual impact on survival of several types of immune cells and established correlations between involved pathways and some of these cell populations. Altogether, the results allow to better understand the complex relationships between each cancer and the associated immune infiltrate, and will later lead to help the development of immunotherapeutic strategies more adapted to a given tumour environment, by targeting the immune populations that could really impact the survival of patients., Le cancer, l'une des principales causes de décès dans le monde, peut apparaître dans presque tout type de tissu, et est caractérisé par la prolifération anarchique de cellules et l'établissement d'une réponse immunitaire tolérogène favorisant la croissance tumorale, rendant souvent toute intervention médicamenteuse peu efficace. Les cellules dendritiques (DCs), véritables sentinelles de l'organisme, semblent jouer un rôle dans l'établissement à la fois d'une réponse anti-tumorale efficace et d'une tolérance face au cancer. Malgré tout, le rôle des différents sous-types de DCs dans le développement tumoral reste mal connu. Au cours de cette thèse, j'ai étudié différents acteurs cellulaires dendritiques et lymphocytaires, leurs relations et leur implication dans la réponse ou la tolérance immunitaire aux tumeurs. Durant la première partie de ma thèse, j'ai abordé l'effet de la modulation artificielle de l'homéostasie des DCs sur les autres cellules immunitaires ainsi que sur la réponse anti-tumorale in vivo chez la souris. J'ai montré qu'il existait un rôle paradoxal de la cytokine Flt3-L (FL) - un facteur de croissance essentiel à la différentiation et à l'homéostasie des DCs dites classiques/conventionnelles (cDCs) et des DCs plasmacytoïdes (pDCs) - sur la croissance du mélanome B16. En effet, sa surexpression ou son absence mènent à un meilleur contrôle du développement tumoral, accompagnées par une survie accrue des souris. L'absence de FL induit, en sus d'une disparition des cDCs et pDCs, une réduction drastique des lymphocytes T régulateurs (Tregs) protégeant la tumeur, ainsi qu'un renforcement général de la réponse immunitaire anti-tumorale adaptative via les lymphocytes T helpers. Sa surexpression induit une augmentation du nombre de cDCs et pDCs, et malgré une présence accrue de Tregs, un fort recrutement intra-tumoral de lymphocytes natural killer (NK) activés, un des acteurs majeurs de la réponse anti-tumorale innée. L'étude de souris déficientes en cDCs m'a également permis de démontrer l'existence d'un contrôle de l'homéostasie des NK par les DCs. De plus, la combinaison d'un traitement par FL et un anticorps déplétant les Tregs a un effet thérapeutique exacerbé chez la souris. Ensuite, par l'analyse bio-informatique de transcriptomes provenant de 35 types de cancers différents, j'ai montré que le paradoxe du FL existe également chez l'Homme, du moins pour certains cancers, et que les signatures géniques spécifiques de sous-populations de DCs peuvent être corrélées de manière paradoxale, bénéfique ou préjudiciable à la survie. En parallèle, j'ai évalué la présence de diverses cellules immunitaires dans l'infiltrat tumoral et leurs effets sur la survie des patients. Grâce aux algorithmes en langage R que j'ai développés, j'ai pu analyser pour tous les cancers étudiés les signatures géniques spécifiques de populations cellulaires immunitaires ainsi que les gènes et fonctions biologiques (pathways) les plus fortement dysrégulés ou impliqués dans le contrôle de la survie à 5 ans. Les résultats indiquent que les cellules immunitaires de l'infiltrat tumoral dans leur ensemble peuvent jouer, selon le cancer, un rôle bénéfique ou délétère. Cet infiltrat et les pathways immunitaires associés se sont révélés généralement de mauvais pronostic dans les cancers des organes dits immuno-privilégiés, mais en revanche bénéfiques dans les cancers du sein et de la peau. Pour chaque type de cancer, j'ai déterminé l'impact individuel sur la survie de différents types de cellules immunitaires et ai établi les corrélations entre les pathways impliqués et certaines de ces populations cellulaires. L'ensemble de ces résultats permet de mieux comprendre les relations complexes entre chaque cancer et son infiltrat cellulaire, et permettra à terme d'aider à développer des stratégies immuno-thérapeutiques plus adaptées à un environnement tumoral donné, en ciblant les populations immunitaires pouvant réellement impacter la survie des patients.

National audience

Today several levels of complexity have emerged in the field of T helper cytokines: 1) the important number of distinct cytokines that Th cell can secrete in various combinations; 2) The multiplicity of signals that can act during Th differentiation to define the Th cytokine secretion profiles 3) The associations of these T helper secretion profiles with complex diseases. During my PhD I focused on these three levels of complexity and study the generation of T helper cytokine diversity and its association to breast cancer subtypes using multivariate analysis and statistical modeling. First, I was able to build the first statistical model linking 37 dendritic cell derived signals to 18 T helper cytokines. Using this model to derive in silico predictions, I was able to found a new role for IL-12p70 as a promoter of Th17 differentiation and as a main differential inducer of IL-17F independently of Il-17A in presence of IL-1. Then, studying the associations of the Th cytokine diversity with the different subtypes of human breast cancers, I found that Th17 cytokines were preferentially associated to Triple Negative Breast Cancer (TNBC). I found that TNBC patients with a high Th17 signature had a better survival. In addition, I showed that Th17 can be combined to clinical prognosis assessment scores, such as the Nottingham Prognosis Index, to better stratify TNBC patients in relevant subgroups for survival prognosis assessment.; Aujourd’hui, plusieurs niveaux de complexité ont émergé dans l’étude des phénotypes T CD4 auxiliaires. 1) le nombre important de cytokines différentes pouvant être secrétées par les lymphocytes T CD4. 2) la multiplicité de signaux pouvant agir durant la différenciation des T CD4 pour spécifier leur profile de sécrétion cytokinique. 3) l’association de ces différents profils de cytokines à des pathologies complexes. Au cours de mon doctorat je me suis concentré sur ces trois niveaux de complexité en étudiant la génération de la diversité cytokinique T CD4 et ses associations aux différents sous types de cancer du sein en utilisant des analyses multivariées et des modèles statistiques. Tout d’abord, j’ai pu construire le premier modèle multivarié de la différentiation T CD4 reliant 37 signaux venant de cellules dendritiques à 18 cytokines T CD4. Utilisant ce modèle pour dériver des prédictions, j’ai pu trouver un nouveau rôle à l’IL-12p70 en tant qu’inducteur de différenciation Th17, mais également comme inducteur spécifique d’IL-17F mais pas d’IL-17A lorsqu’il est combiné à l’IL-1. Ensuite, j’ai étudié l’association de ces cytokines T CD4 avec les différents sous types de cancer du sein connus. J’ai pu trouver que les cytokines Th17 étaient préférentiellement associées avec les cancers du sein dits triple négatifs (TNBC). J’ai pu mettre en évidence qu’une forte signature Th17 était associée à une meilleure survie. De plus, en combinant cette signature Th17 à des scores utilisés pour définir le pronostic clinique, tel que l’index pronostic de Nottingham, j’ai pu proposer une nouvelle et meilleure stratification de la survie de ces patients.

The Human Immunodeficiency Virus type I (HIV-I) is mostly degraded in dendritic cells as soon as it enters. Previous work in the team shows that the mechanism of autophagy contributes to viral degradation (virophagy) and promotes innate and adaptive immune responses. Since this virophagy is subsequently inhibited by the virus in dendritic cells, a better understanding of the implementation of this antiviral autophagy is essential in order to promote and above all stabilize cellular defenses. Our results show that DC-SIGN, a C-type lectin receptor (CLR) that recognizes mannosylated or fucosylated carbohydrates, may be involved in the development of this antiviral autophagy. Thus, we show that after recognition of HIV, this receptor induces autophagy and interacts rapidly with several autophagic proteins, some of which are involved in the endosomal pathways. Indeed, we show for the first time the association of the protein Atg9 with the internalized DC-SIGN receptor. The Atg9 protein is an essential factor in the initiation of the autophagic pathway regulating in particular the supply of membranes originating from the plasma membrane for the nucleation of vesicles linked to the autophagic pathway. On the other hand, after a mass spectrometric study of the internalized DC-SIGN receptor interbody, we show that an E3 ligase belonging to the TRIM family, TRIM25, is recruited during endocytosis of the receptor. This protein has been reported to be involved in the regulation of antiviral innate responses from the RIG-I pathogen recognition receptor suggesting an essential function of TRIM25 in innate immune responses. Interestingly, some members of the TRIM family have recently been shown to be essential for the induction of a form of selective autophagy, sometimes antiviral, precision autophagy. In this sense, we show that a complex is formed between the DC-SIGN, Atg9 and TRIM25 receptors, suggesting that autophagy early on engagement of the DC-SIGN receptor could be selective. All these elements constitute a first step for a better understanding of the early stages of the entry of HIV into dendritic cells with the characterization of a selective virophagy induced when a receptor of the innate immunity And which represents a particularly interesting target in order to improve certain therapeutic strategies currently being developed.; Le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type I (VIH-I) est majoritairement dégradé dans les cellules dendritiques dès son entrée. Des travaux précédemment réalisés dans l’équipe montrent que le mécanisme de l’autophagie contribue à la dégradation virale (virophagie) et promeut les réponses immunitaires innées et adaptatives. Etant donné que cette virophagie est par la suite inhibée par le virus dans les cellules dendritiques, mieux comprendre la mise en place de cette autophagie antivirale est primordial afin de pouvoir favoriser et surtout stabiliser les défenses cellulaires. Nos résultats montrent que DC-SIGN, un récepteur lectine de type C (CLR) qui reconnait des carbohydrates mannosylés ou fucosylés, pourrait être impliqué dans la mise en place de cette autophagie antivirale. Ainsi, nous montrons qu’après reconnaissance du VIH, ce récepteur induit l’autophagie et interagit rapidement avec plusieurs protéines autophagiques dont certaines impliquées dans les voies endosomales. En effet, nous montrons pour la première fois l’association de la protéine Atg9 avec le récepteur DC-SIGN internalisé. La protéine Atg9 est un facteur essentiel de l’initiation de la voie autophagique régulant notamment l’apport de membranes issues de la membrane plasmique pour la nucléation de vésicules liées à la voie autophagique. D’autre part, après une étude par spectrométrie de masse de l’intéractome du récepteur DC-SIGN internalisé, nous montrons qu’une E3 ligase faisant partie de la famille des TRIM, TRIM25, est recrutée lors de l’endocytose du récepteur. Cette protéine a été rapportée comme étant impliquée dans la régulation des réponses innées antivirales issues du récepteur de reconnaissance de pathogène (PRR) RIG-I suggérant une fonction essentielle de TRIM25 dans les réponses immunes innées. De manière intéressante, certains membres de la famille TRIM ont été montrés récemment comme étant essentiels pour l’induction d’une forme d’autophagie sélective parfois antivirale, l’autophagie de précision. Dans ce sens, nous montrons qu’un complexe est formé entre le récepteur DC-SIGN, Atg9 et TRIM25, suggérant que l’autophagie mise en place très tôt lors de l’engagement du récepteur DC-SIGN pourrait s’avérer être sélective. L’ensemble de ces éléments constitue une première étape pour une meilleure compréhension des étapes précoces de l’entrée du VIH dans les cellules dendritiques avec la caractérisation d’une virophagie sélective induite lors de l’engagement d’un récepteur de l’immunité innée et qui représente une cible particulièrement intéressante afin d’améliorer certaines stratégies thérapeutiques développées actuellement.

This article belongs to a special issue12ème Congrès Francophone d'Allergologie - 25-28 avril 2017 - Paris, Palais des Congrès; Rôle des cellules dendritiques de la muqueuse digestive dans la tolérance orale

Elimination of cancer cells requires an efficient cytotoxic immune response. In order to obtain such a response, antigens need to be uptaken by dendritic cells (DCs) and correctly presented to effector cells. We developed a strategy based on RNA lipopolyplexes (LPRs): antigenic mRNA is associated with a histidine-polylysine polyplexe and incorporated in a trimannosylated liposome to better target dendritic cells (DCs) in vivo, as DCs express several C-Type lectin receptors that preferentially bind to mannose. Here, we report that trimannosylated LPRs are efficient to target both human and murine DCs. Interestingly, in vivo experiments reveal that trimannosylated LPRs not only target DCs but also induce their recruitment and activation in draining lymph nodes. Furthermore, when combined with mRNA encoding E7 oncoprotein from HPV16, trimannnosylated LPRs trigger specific T-cell response against E7. Finally, when used as therapeutic vaccines in three different tumors models, LPRs promote curative therapeutic responses in E7-expressing TC1 tumor, in OVA-expressing EG7 lymphoma and in MART-1-expressing B16 melanoma, when combined with E7, OVA or MART-1 mRNA, respectively. Altogether, these results comfort us to considerate the use of this strategy for anti-cancer vaccine therapies., L'élimination des cellules tumorales par le système immunitaire repose sur la capacité des cellules dendritiques à correctement présenter l'antigène aux cellules effectrices. Nous avons donc développé une stratégie de vaccination thérapeutique basée sur des lipopolyplexes à ARNm (LPRs) : l'ARNm codant pour l'antigène est associé à un complexe de polylysine histidylée, et incorporé dans un liposome trimannosylé afin de mieux cibler les cellules dendritiques. En effet, les cellules dendritiques expriment largement les lectines de type C, qui sont des récepteurs reconnaissant principalement des résidus mannose. Dans le travail présenté ici, nous montrons que les LPR trimannosylés sont capables de fixer les cellules dendritiques humaines et murines. De manière très intéressante, nous montrons aussi que les LPR trimannosylés injectés chez la souris induisent le recrutement et l'activation de cellules dendritiques dans le ganglion drainant. De plus, quand les LPR trimannosylés vectorisent un ARNm codant pour l'antigène tumoral E7, ils sont capables d'induire une réponse T spécifique d'E7 au niveau systémique. Enfin, les LPRs trimannosylés permettent une réponse thérapeutique lorsqu'ils sont utilisés dans trois différents modèles de tumeurs : le modèle TC1 de carcinome exprimant E7, le modèle B16 de mélanome exprimant MART1 et le modèle EG7 de lymphome exprimant OVA. Cette stratégie apparaît donc prometteuse comme thérapie innovante anti-cancer.

Background and Aims: Regulatory Foxp3(+) CD4(+) T cells [Tregs] have been implicated in the control of colitis in T-cell transfer models, yet their ability to regulate colitis induced by innate immunity and the impact of gut inflammation on their fate and function have been poorly documented.Methods: Colitis was induced by dextran sodium sulphate in DEREG transgenic mice. Tregs ablation and transfer experiments showd that Tregs could limit the severity of colitis in B6 mice.Results: Gut inflammation resulted in increased number of Tregs in mesenteric lymph nodes [MLN] and colon lamina propria [LP], although their frequency decreased due to massive concomitant leukocyte infiltration. This coincided at both sites with a dramatic increase in Ki67(+) Tregs which retained proliferative capacity. Gut inflammation resulted in enhanced suppressive function of Tregs in colon lamina propria and neuropillin-1-[NRP1-] Treg in MLN. Real-time polymerase chain reaction analysis and flow cytometry [using IL10-egfp-reporter mice] showed that compared with NRP1(+) Treg, NRP1-Treg express higher levels of IL-10 transcripts and were enriched in IL10-expressing cells both in the steady state and during colitis. Moreover, Treg conversion in vivo from from naive CD4(+) T cells or Treg precursors was impaired in colitic mice. Finally, gut inflammation caused a decrease in intestinal dendritic cells, affecting both CD103(+) CD11b(+) and CD103(+) CD11b-subsets and affected their Treg conversion capacity.Conclusions: Together, our data indicate that non-specific colon inflammation triggers proliferation and suppressive function of Tregs in the lamina propria and MLN, but impairs their de novo conversion from CD4(+) T cells by intestinal dendritic cells.

A major drawback in therapeutic biological products (BP) use is the development of anti-drug antibodies (ADA) in patients. Among other factors, BP aggregates seems to play a major role in immunogenicity. Moreover, the presence of ADA with high affinity and different isotypes suggest a CD4 T-cell dependent immune response and therefore a pivotal role for antigen presenting cells, such as dendritic dells (DC).In order to determine if BP aggregates participate to DC activation, aggregates form human growth hormone (GH) and antibodies (Rituximab and polyclonal IgG1) were produced and characterized.Their impact was tested on a model of monocytederived dendritic cells (mo-DC).We have shown aggregates were able to induce moDC maturation, as observed with increase of key co-stimulatory and maturation markers (CD40, CD80, CD83, CD86 and HLA-DR), and by increase of pro-inflammatory cytokines and chemokines (IL-6, IL-8, IL-12p40, CCL2, CCL3, CCL4, CXCL10).Using an allogenic model of co-culture, we have shown that moDC stimulated with aggregates were able to induce CD4+ T cells proliferation.Polarization was different following the nature of the protein. GH aggregates were able to induceIFNγ, sign of Th1 response, whereas antibody aggregates induced Th1, Th2, Th17 mix response (with production of IFNγ, IL-5, IL-13 and IL-17).Finally, we started to study intracellular mechanisms involved in moDC activation, by showing that GH aggregates were able to induce p38MAPK, ERK, JNK and NF-κB (p65)phosphorylation. These pathways are involved in CXCL10 expression, which is implicated in Th1 polarization. These results confirmed the immunomodulary effect of protein aggregates on DC and their role as danger signal, inducing an immune response against therapeutic proteins.; Un inconvénient majeur de l’utilisation des protéines thérapeutiques est leur immunogénicité,c'est-à-dire le déclenchement chez les patients d’une réponse immunitaire, avec production d’anticorps (anti-drug antibodies, ADA). Parmi les facteurs contributifs, les agrégats de protéines dans les spécialités administrées pourraient jouer un rôle majeur dans l’immunogénicité. Par ailleurs, la présence d’ADA de haute affinité et de divers isotypes suggère la mise en place d’une réponse immunitaire classique, faisant intervenir les cellules présentatrices d’antigènes et plus particulièrement les cellules dendritiques.Nous avons développé un modèle d’étude de l’impact d’agrégats de protéines sur la maturation de cellules dendritiques, dérivées de monocytes isolés du sang(moDC). Dans ce but, des agrégats d’hormone de croissance (GH) et d’anticorps (Rituximab) ou d’IgG1 polyclonale ont été produits et caractérisés.Nous avons montré que ces agrégats induisent la maturation des moDC, objectivée par une augmentation de l’expression de marqueurs d’activation et de co-stimulation (CD40, CD80,CD83, CD86 et HLA-DR), et par l’augmentation dela production de cytokines et chimiokines proinflammatoires (IL-6, IL-8,IL-12p40, CCL2, CCL3,CCL4 et CXCL10).En utilisant un modèle de co-culture allogénique,nous avons montré que les moDC stimulées par les agrégats induisent la prolifération de lymphocytes TCD4+, dont la polarisation dépendait de la nature de la protéine. Ainsi les agrégats de GH conduisent à une production majoritaire d’IFNγ, signe d’une réponse de type Th1, tandis que les agrégats d’anticorps induisent une réponse mixte, Th1, Th2,Th17 (production d’IFNγ, IL-5, IL-13 et IL-17.Enfin, nous avons commencé l’étude des mécanismes intra cellulaires impliqués dans l’activation des moDC, en montrant que les agrégats de GH induisent la phosphorylation de p38MAPK, ERK, JNK et NF-κB (p65). Ces mêmes voies de signalisation sont impliquées dans l’expression de CXCL10,chimiokine connue pour induire la polarisation Th1.Au final, ces résultats confirment l’effet immunomodulateur des agrégats de protéines sur les cellules dendritiques et précisent leur rôle de signal de danger conduisant à la mise en place d’une réponse immunitaire contre les protéines thérapeutiques.

Session Scientifique 1 : “Immunomodulation”Session Scientifique 1 : “Immunomodulation”; International audience; Impact of food additive (prebiotic) and food contaminant (mycotoxin) in the maternal diet onto the ontogenesis and responsiveness of mucosal immune system. IAD 2016 - 10. Journées du Réseau Français "Immunologie des animaux domestiques"

Corrigendum dans Front Immunol. 2017; 8: 831. The Supplementary Material for this article can be found online at http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2016.00641/full#supplementary-material; The development of influenza A virus (IAV) vaccines, which elicits cross-strain immunity against seasonal and pandemic viruses is a major public health goal. As pigs are susceptible to human, avian, and swine-adapted IAV, they would be key targets of so called universal IAV vaccines, for reducing both the zoonotic risk and the economic burden in the swine industry. They also are relevant preclinical models. However, vaccination with conserved IAV antigens (AGs) in pigs was reported to elicit disease exacerbation. In this study, we assessed whether delivery strategies, i.e., dendritic cell (DC) targeting by the intradermal (ID) or intramuscular (IM) routes, impact on the outcome of the vaccination with three conserved IAV AGs (M2e, NP, and HA2) in pigs. The AGs were addressed to CD11c by non-covalent binding to biotinylated anti-CD11c monoclonal antibody. The CD11c-targeted AGs given by the ID route exacerbated disease. Conversely, CD11c-targeted NP injected by the IM route promoted T cell response compared to non-targeted NP. Furthermore, the conserved IAV AGs injected by the IM route, independently of DC targeting, induced both a reduction of viral shedding and a broader IgG response as compared to the ID route. Our findings highlight in a relevant animal species that the route of vaccine delivery impacts on the protection induced by conserved IAV AGs and on vaccine adverse effects. Finally, our results indicate that HA2 stands as the most promising conserved IAV AG for universal vaccine development.

Erratum inCorrection: Broncho Alveolar Dendritic Cells and Macrophages Are Highly Similar to Their Interstitial Counterparts. [PLoS One. 2017]Correct Name of the funding Statement : Fondation du Souffle; In human medicine, bronchoalveolar lavage is the main non-traumatic procedure allowing an insight into the respiratory Dendritic Cells (DC) and Macrophages populations. However, it has never been demonstrated in a relevant model that alveolar DC subpopulations were comparable to their interstitial counterparts. In a precedent work we observed that respiratory pig DC and Macrophages were more similar to the human ones than to the mouse ones. In the present work, thanks to our animal model, we were able to collect the rare bronchoalveolar DC and compare them to their interstitial counterparts. We observed that DC presented very similar gene-expression patterns in the alveolar and interstitial compartments, validating the study of human bronchoalveolar DC as surrogate of their interstitium counterparts.

A major drawback in therapeutic biological products (BP) use is the development of anti-drug antibodies (ADA) in patients. Among other factors, BP aggregates seems to play a major role in immunogenicity. Moreover, the presence of ADA with high affinity and different isotypes suggest a CD4 T-cell dependent immune response and therefore a pivotal role for antigen presenting cells, such as dendritic dells (DC).In order to determine if BP aggregates participate to DC activation, aggregates form human growth hormone (GH) and antibodies (Rituximab and polyclonal IgG1) were produced and characterized.Their impact was tested on a model of monocytederived dendritic cells (mo-DC).We have shown aggregates were able to induce moDC maturation, as observed with increase of key co-stimulatory and maturation markers (CD40, CD80, CD83, CD86 and HLA-DR), and by increase of pro-inflammatory cytokines and chemokines (IL-6, IL-8, IL-12p40, CCL2, CCL3, CCL4, CXCL10).Using an allogenic model of co-culture, we have shown that moDC stimulated with aggregates were able to induce CD4+ T cells proliferation.Polarization was different following the nature of the protein. GH aggregates were able to induceIFNγ, sign of Th1 response, whereas antibody aggregates induced Th1, Th2, Th17 mix response (with production of IFNγ, IL-5, IL-13 and IL-17).Finally, we started to study intracellular mechanisms involved in moDC activation, by showing that GH aggregates were able to induce p38MAPK, ERK, JNK and NF-κB (p65)phosphorylation. These pathways are involved in CXCL10 expression, which is implicated in Th1 polarization. These results confirmed the immunomodulary effect of protein aggregates on DC and their role as danger signal, inducing an immune response against therapeutic proteins., Un inconvénient majeur de l’utilisation des protéines thérapeutiques est leur immunogénicité,c'est-à-dire le déclenchement chez les patients d’une réponse immunitaire, avec production d’anticorps (anti-drug antibodies, ADA). Parmi les facteurs contributifs, les agrégats de protéines dans les spécialités administrées pourraient jouer un rôle majeur dans l’immunogénicité. Par ailleurs, la présence d’ADA de haute affinité et de divers isotypes suggère la mise en place d’une réponse immunitaire classique, faisant intervenir les cellules présentatrices d’antigènes et plus particulièrement les cellules dendritiques.Nous avons développé un modèle d’étude de l’impact d’agrégats de protéines sur la maturation de cellules dendritiques, dérivées de monocytes isolés du sang(moDC). Dans ce but, des agrégats d’hormone de croissance (GH) et d’anticorps (Rituximab) ou d’IgG1 polyclonale ont été produits et caractérisés.Nous avons montré que ces agrégats induisent la maturation des moDC, objectivée par une augmentation de l’expression de marqueurs d’activation et de co-stimulation (CD40, CD80,CD83, CD86 et HLA-DR), et par l’augmentation dela production de cytokines et chimiokines proinflammatoires (IL-6, IL-8,IL-12p40, CCL2, CCL3,CCL4 et CXCL10).En utilisant un modèle de co-culture allogénique,nous avons montré que les moDC stimulées par les agrégats induisent la prolifération de lymphocytes TCD4+, dont la polarisation dépendait de la nature de la protéine. Ainsi les agrégats de GH conduisent à une production majoritaire d’IFNγ, signe d’une réponse de type Th1, tandis que les agrégats d’anticorps induisent une réponse mixte, Th1, Th2,Th17 (production d’IFNγ, IL-5, IL-13 et IL-17.Enfin, nous avons commencé l’étude des mécanismes intra cellulaires impliqués dans l’activation des moDC, en montrant que les agrégats de GH induisent la phosphorylation de p38MAPK, ERK, JNK et NF-κB (p65). Ces mêmes voies de signalisation sont impliquées dans l’expression de CXCL10,chimiokine connue pour induire la polarisation Th1.Au final, ces résultats confirment l’effet immunomodulateur des agrégats de protéines sur les cellules dendritiques et précisent leur rôle de signal de danger conduisant à la mise en place d’une réponse immunitaire contre les protéines thérapeutiques.

Vaccine adjuvants are able to boost immune response toward antigens when there are simultaneously injected. Some of these adjuvant mimic danger signals, such as Toll like receptors (TLR) agonists or NOD-like receptors agonists, required for dendritic cell (DC) activation. DC are essentiales for adaptative immune response against antigens : they acquire mature phenotype, controlled by MAPK and NF-kB signaling pathway, leading to antigen presentation and specific immune response. The Nrf2/keap1 signaling pathway, mainly involves in xenobiotics detoxication and oxidative stress control, can be activate by TLR agonists, such as LPS (TLR 4 agonist).We showed that R848 (TLR 7/8 agonist) and MDP (NOD2 agonist) could induce Nrf2’s target genes transcription in murines dendritic cells (BMDC). Nrf2 seems also to be part of inflammatory cytokines production in response to LPS or R848 and modulated T lymphocyte proliferation induced by MDP pre-treated BMDC. Moreover, Nrf2 appears to play a role in specific antibodies response against an antigen in mice. . In fact, Tetanus toxoid (TT) injection induces higher titer of antibodies anti-TT in nrf2-/- mice compared to nrf2+/+ mice. This increase is also correlated with more specific B lymphocytes in bone marrow and spleen after TT immunisation.; Les adjuvants vaccinaux permettent d’augmenter la réponse immunitaire dirigée contre un antigène donné. Certains de ces adjuvants miment des signaux de danger, tels que des agonistes des récepteurs de l’immunité, les récepteurs Toll-like (TLR) ou les récepteurs NOD-like (NLR), et permettent une activation des cellules dendritiques (DC). Les DC sont essentielles dans la mise en place d’une réponse adaptative contre un antigène : elles acquièrent un phénotype mature, contrôlé par les voies des MAPK et NF-κB, permettant la présentation de l’antigène aux lymphocyte T et l’initiation d’une réponse spécifique. La voie Nrf2/Keap1, impliquée principalement dans la détoxication des xénobiotiques et le contrôle du stress oxydant, peut être activée en réponse à des agonistes des TLR tels que le LPS (agoniste TLR 4). Nous avons mis en évidence qu’un traitement par le R848 (agoniste TLR7/8) ou le MDP (agoniste NOD2) induit la transcription des gènes cibles de Nrf2 dans les DC murines. Nrf2 participe également à la production de cytokines inflammatoires en réponse au LPS et au R848 et jouet un rôle dans la prolifération lymphocytaire induite par les DC pré-traitées avec le MDP. Par ailleurs, Nrf2 contrôle la réponse anticorps spécifiques de l’antigène chez la souris. L’injection d’anatoxine tétanique induit une production d’anticorps plus élevé chez la souris déficiente nrf2 par rapport aux souris sauvages. Cette augmentation de la production d’anticorps est corrélée avec une augmentation du nombre de lymphocyte B dans la moelle osseuse et la rate.

Mononuclear phagocytes are organized in a complex system of ontogenically and functionally-distinct subsets, that has been best described in mouse and to some extent in human. Identification of homologous mononuclear phagocyte subsets in other vertebrate species of biomedical, economic and environmental interest is needed to improve our knowledge in physiologic and physio-pathologic processes, and to design intervention strategies against a variety of diseases, including zoonotic infections.We developed a streamlined approach combining refined cell sorting and integrated comparative transcriptomics analyses which revealed conservation of the mononuclear phagocyte organization across human, mouse, sheep, pigs and, in some respect, chicken. This strategy should help democratizing the use of omics analyses for the identification and study of cell types across tissues and species. Moreover we identified conserved gene signatures that enable robust identification and universal definition of these cell types. We identified new evolutionarily conserved gene candidates and gene interaction networks for the molecular regulation of the development or functions of these cell types, as well as conserved surface candidates for refined subset phenotyping throughout species. A phylogenetic analysis revealed that orthologous genes of the conserved signatures exist in teleost fishes and apparently not in Lamprey, indicating conservation of the genetic support for mononuclear phagocyte organization throughout jawed vertebrates but likely not in agnathans. Altogether this work provides molecular clues to the definition and functions of mononuclear phagocyte subsets across vertebrates which shall be useful to rigorously identify these cells and to design universal strategies to manipulate them in many target species towards the goal to reach and maintain global health.

Tuberculosis remains an enormous global burden, despite wide vaccination coverage with the Bacillus Calmette-Guérin (BCG), the only vaccine available against this disease, indicating that BCG-driven immunity is insufficient to protect the human population against tuberculosis. In this study we constructed recombinant BCG producing human IL-18 (rBCGhIL-18) and investigated whether human IL-18 produced by rBCGhIL-18 modulates DC functions and enhances Th1 responses to mycobacterial antigens in humans. We found that the costimulatory CD86 and CD80 molecules were significantly upregulated on rBCGhIL-18-infected DCs, whereas the stimulation of DCs with nonrecombinant BCG was less effective. In contrast, both BCG strains decreased the DC-SIGN expression on human DCs. The rBCGhIL-18 increased IL-23, IL-10, and IP-10 production by DCs to a greater extent than nonrecombinant BCG. In a coculture system of CD4+T cells and loaded DCs, rBCGhIL-18 favoured strong IFN-γbut also IL-10 production by naive T cells but not by memory T cells. This was much less the case for nonrecombinant BCG. Thus the expression of IL-18 by recombinant BCG increases IL-23, IP-10, and IL-10 expression by human DCs and enhances their ability to induce IFN-γand IL-10 expression by naive T cells, without affecting the maturation phenotype of the DCs.

Le développement des nanotechnologies fait naître autant d’espoirs que d’inquiétudes. Parmi celles‐ci figure la toxicité des nanoparticules qui est encore mal connue. Cette méconnaissance est entretenue par le fait que les travaux de recherche mènent souvent à des résultats contradictoires. On soupçonne que les nanoparticules puissent affecter le système immunitaire et induire des dysfonctionnements tels que des inflammations chroniques ou des allergies.Le projet de recherche "Innimmunotox" porte sur l’étude de la fonctionnalité de cellules du système immunitaire (des cellules dendritiques et des macrophages), mises en présence de nanoparticules.

Increased prevalence of allergies in early life suggests a deficiency of immune regulation during this period. Oral tolerance is a key immuno-regulatory mechanism in the gut for immune homeostasis. The principal objective of my thesis was to determine in a murine model the mechanisms at the origin of oral tolerance in early life to better prevent allergy development. We found that induction of oral tolerance in early life is effective only from the 3rd week of life. The defect of oral tolerance observed during the first 2 weeks of life is the consequence of a defect in antigen capture and RALDH expression (enzyme which converts retinol in retinoic acid) by mesenteric CD103+ dendritic cells. Serum levels of retinol in neonatal period are very low, and an enrichment of the maternal milk with vitamin A allows to correct this neonatal deficiency as well as the defect of antigen presentation by the CD103+ dendritic cells. This enrichment also allows allergy prevention from the first days of life. To our surprise, while in adult mice, oral tolerance depends on the generation of regulatory T lymphocytes, oral tolerance observed in the 3 week-old mice and in the newborn which received vitamin A, depends on the generation of Th1 lymphocytes. These results demonstrate that vitamin A levels in early life are directly correlated with Th1 differentiation induced by oral administration of allergen, necessary for allergy prevention. This knowledge should now be taken into account for the implementation of allergy prevention strategies, more specific and better adapted to the neonatal period, such as a supplementation with vitamin A.; La constante augmentation des allergies en début de vie suggère une déficience de régulation immunitaire au cours de cette période. La tolérance orale est un mécanisme clé de régulation au niveau de l’intestin pour le maintien de l’homéostasie immunitaire. L’objectif de ma thèse a été de déterminer dans un modèle murin les mécanismes à l’origine de la tolérance orale en début de vie afin de mieux prévenir le développement d’allergies. L’induction de tolérance orale en début de vie n’est efficace qu’à partir de la 3ème semaine de vie. Le défaut de tolérance orale observé au cours des 2 premières semaines de vie est la conséquence d’un défaut de capture de l’antigène et d’expression de la RALDH (enzyme de conversion du rétinol en acide rétinoïque) par les cellules dendritiques CD103+ mésentériques, résultant en une ignorance de l’antigène. Les taux de rétinol sanguins en période néonatale sont très bas, et un enrichissement du lait maternel en vitamine A permet de corriger cette déficience néonatale ainsi que le défaut de présentation antigénique des cellules dendritiques CD103+. Cet enrichissement permet également de prévenir l’apparition de l’allergie dès les premiers jours de vie. De manière surprenante, alors que chez la souris adulte, la tolérance orale dépend de la génération de lymphocytes T régulateurs, la tolérance orale observée chez les souriceaux âgés de 3 semaines et chez les nouveau-nés ayant reçu de la vitamine A, dépend de la génération de lymphocytes Th1.

Preventing untoward immune responses against a specific antigen is a major challenge in different clinical settings such as gene therapy, transplantation, or autoimmunity. Following intramuscular delivery of recombinant adeno-associated virus (rAAV)-derived vectors, transgene rejection can be a roadblock to successful clinical translation. Specific immunomodulation strategies potentially leading to sustained transgene expression while minimizing pharmacological immunosuppression are desirable. Tolerogenic dendritic cells (TolDC) are potential candidates but have not yet been evaluated in the context of gene therapy, to our knowledge. Following intramuscular delivery of rAAV-derived vectors expressing an immunogenic protein in the nonhuman primate model, we assessed the immunomodulating potential of autologous bone marrow-derived TolDC generated in the presence of IL10 and pulsed with the transgene product. TolDC administered either intradermally or intravenously were safe and well tolerated. While the intravenous route showed a modest ability to modulate host immunity against the transgene product, intradermally delivery resulted in a robust vaccination of the macaques when associated to intramuscular rAAV-derived vectors-based gene transfer. These findings demonstrate the critical role of TolDC mode of injection in modulating host immunity. This study also provides the first evidence of the potential of TolDC-based immunomodulation in gene therapy.

Severe sepsis leads to a dysregulated inflammatory response followed by a complex immunosuppressive state that can favor the emergence of nosocomial infections. The cellular and molecular mechanisms that drive the post-infective immunosuppression remain poorly understood. They may involve immune cells that link innate and adaptive immunity such as dendritic cells or innate-like lymphocytes. Furthermore, Toll-like receptors (TLR) are critical determinants of the inflammatory response but their role to the development of sepsis-induced immune dysfunction are unknown. The aim of this research project was to investigate the role of dendritic cells, innatelike T cells and TLR-dependent signalling pathways in the sepsis-induced immunosuppression process. For this purpose, we combined a translational and experimental approach. We assessed dendritic cells blood count in septic patients and showed that the depletion of dendritic cells was associated with the advent of nosocomial infections. We studied 3 populations of innate-like T-cells (γδ lymphocytes, NKT- and MAIT-cells) in septic patients and demonstrated that only the MAIT-cells presented a significant depletion following severe sepsis, the persistence of which was correlated with the advent of nosocomial infection. Last, using knockout mice, we analyzed the relative contribution of TLR2, TLR4 and TLR5 to the host response in a model of late-onset secondary Pseudomonas aeruginosa pneumonia following a sublethal polymicrobial sepsis. We observed that TLR2 deficient mice were specifically protected against the secondary pneumonia through a better bacterial clearance. Our results provide new insights in the pathophysiology of post-infective immunosuppression and suggest potential therapeutic applications., Les infections graves entraînent une dysrégulation de la réaction inflammatoire associée à une immunodépression complexe associée à la survenue d’infections nosocomiales. Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent ces phénomènes demeurent largement incompris. A l’interface entre système immunitaire inné et adaptatif, les cellules dendritiques et les lymphocytes innés pourraient être impliqués dans l’immunodépression post-infectieuse. Par ailleurs, les récepteurs de type Toll (TLR) déterminent l’amplitude de la réponse inflammatoire initiale, mais leur contribution dans le développement de l’immunodépression post-infectieuse n’a pas été établie. Les objectifs de ce projet de recherche étaient d’investiguer le rôle des cellules dendritiques, des lymphocytes de type innés et des voies de signalisation dépendantes des TLRs dans l’immunodépression induite par le sepsis. Nous avons mené ce programme de recherche en combinant une double approche translationnelle et expérimentale. Nous avons étudié la cinétique des cellules dendritiques circulantes chez le patient septique et montré que leur déplétion était associée à la survenue d’infections nosocomiales. L’analyse des trois souspopulations de lymphocytes T innés (lymphocytes γδ, NKT et MAIT) chez le patient septique a montré que seuls les lymphocytes MAIT présentaient une déplétion associée au sepsis sévère, dont la persistance était également corrélée à la survenue d’infections nosocomiales. Enfin, à l’aide de souris knockout nous avons étudié le rôle de TLR2, TLR4 et TLR5 sur la réponse anti-bactérienne dans un modèle murin de pneumonie secondaire à P. aeruginosa à distance d’un sepsis polymicrobien sublétal. Nous avons montré que les souris déficientes pour TLR2 étaient protégées de l’infection secondaire grâce à une meilleure clairance bactérienne. Ce travail introduit des perspectives nouvelles dans la physiopathologie de l’immunodépression post-infectieuse et suggère des applications thérapeutiques potentielles.

Severe sepsis leads to a dysregulated inflammatory response followed by a complex immunosuppressive state that can favor the emergence of nosocomial infections. The cellular and molecular mechanisms that drive the post-infective immunosuppression remain poorly understood. They may involve immune cells that link innate and adaptive immunity such as dendritic cells or innate-like lymphocytes. Furthermore, Toll-like receptors (TLR) are critical determinants of the inflammatory response but their role to the development of sepsis-induced immune dysfunction are unknown. The aim of this research project was to investigate the role of dendritic cells, innatelike T cells and TLR-dependent signalling pathways in the sepsis-induced immunosuppression process. For this purpose, we combined a translational and experimental approach. We assessed dendritic cells blood count in septic patients and showed that the depletion of dendritic cells was associated with the advent of nosocomial infections. We studied 3 populations of innate-like T-cells (γδ lymphocytes, NKT- and MAIT-cells) in septic patients and demonstrated that only the MAIT-cells presented a significant depletion following severe sepsis, the persistence of which was correlated with the advent of nosocomial infection. Last, using knockout mice, we analyzed the relative contribution of TLR2, TLR4 and TLR5 to the host response in a model of late-onset secondary Pseudomonas aeruginosa pneumonia following a sublethal polymicrobial sepsis. We observed that TLR2 deficient mice were specifically protected against the secondary pneumonia through a better bacterial clearance. Our results provide new insights in the pathophysiology of post-infective immunosuppression and suggest potential therapeutic applications.; Les infections graves entraînent une dysrégulation de la réaction inflammatoire associée à une immunodépression complexe associée à la survenue d’infections nosocomiales. Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent ces phénomènes demeurent largement incompris. A l’interface entre système immunitaire inné et adaptatif, les cellules dendritiques et les lymphocytes innés pourraient être impliqués dans l’immunodépression post-infectieuse. Par ailleurs, les récepteurs de type Toll (TLR) déterminent l’amplitude de la réponse inflammatoire initiale, mais leur contribution dans le développement de l’immunodépression post-infectieuse n’a pas été établie. Les objectifs de ce projet de recherche étaient d’investiguer le rôle des cellules dendritiques, des lymphocytes de type innés et des voies de signalisation dépendantes des TLRs dans l’immunodépression induite par le sepsis. Nous avons mené ce programme de recherche en combinant une double approche translationnelle et expérimentale. Nous avons étudié la cinétique des cellules dendritiques circulantes chez le patient septique et montré que leur déplétion était associée à la survenue d’infections nosocomiales. L’analyse des trois souspopulations de lymphocytes T innés (lymphocytes γδ, NKT et MAIT) chez le patient septique a montré que seuls les lymphocytes MAIT présentaient une déplétion associée au sepsis sévère, dont la persistance était également corrélée à la survenue d’infections nosocomiales. Enfin, à l’aide de souris knockout nous avons étudié le rôle de TLR2, TLR4 et TLR5 sur la réponse anti-bactérienne dans un modèle murin de pneumonie secondaire à P. aeruginosa à distance d’un sepsis polymicrobien sublétal. Nous avons montré que les souris déficientes pour TLR2 étaient protégées de l’infection secondaire grâce à une meilleure clairance bactérienne. Ce travail introduit des perspectives nouvelles dans la physiopathologie de l’immunodépression post-infectieuse et suggère des applications thérapeutiques potentielles.

Polymorphonuclear neutrophils (PMN) are innate immune cells rapidly recruited to the inflammatory sites where they play a major role during the acute phase response but also contribute to resolution and repair. They can also modulate the adaptive response by interacting with lymphocytes (Ly) or dendritic cells (DC) via soluble mediators or cell-cell contacts. Activated PMN release Neutrophil Extracellular Traps (NETs) that could play a role in this context. NETs are decondensed chromatin fibers associated with granule and cytoplasmic proteins. As they are mainly involved in host defense against infection, they contribute to some autoimmune and inflammatory diseases. The aim of this work was to evaluate NET effects on DC maturation in an inflammatory context where PMN and DC co-exist, thus bridging innate and adaptive immunity. We first developed a model to induce, isolate and characterize NETs from human PMN. Calcium ionophore A23187 was chosen to induce NETs and the restriction enzyme AluI allowed the recovery of heterogeneous-sized fragments of NETs. Some of their components were quantified (DNA, elastase, histone 3, in particular) and we found that they retained their bactericidal activity. These NETs samples thus constitute a new and important biological tool to study their effects on immune cells or tissues. In the second part of this work, we found that isolated NETs were able to down-regulate LPS-induced moDC maturation as evidenced by the expressions of HLA-DR, CD80, CD83, CD86 and cytokine release (TNFα, Il-6, IL-12, Il-23). Moreover, the presence of NETs during moDC maturation lead to a decrease capacity of these moDC to induce T lymphocyte proliferation and modulated polarization by promoting the production of Th2 cytokines (IL-5 and IL-13) and decreasing Th1 cytokines (INFγ) and Th17 (IL- 17). Interestingly, moDC migration capacity was not modified when moDC maturation was done in the presence of NETs. In summary, these data suggest that NETs could downregulate DC activation. NETs produced by activated PMN could thus participate to the regulation of inflammation.; Les polynucléaires neutrophiles (PN) sont des cellules essentielles au cours de la réponse immunitaire innée ; recrutés rapidement au site inflammatoire où ils participent à la phase aigüe, ils vont aussi contribuer à la résolution de l’inflammation. Ils peuvent en effet moduler la réponse adaptative par interaction avec les lymphocytes (Ly) ou les cellules dendritiques (DC) via des médiateurs solubles ou des interactions cellulaires directes. Les Neutrophil Extracellular Traps (NETs) libérés par les PN activés pourraient jouer un rôle important dans ce contexte. Les NETs sont des filaments de chromatine décondensée associés à des protéines issues principalement des granulations et du cytoplasme. Ils sont essentiels dans la réponse anti-infectieuse mais semblent également impliqués dans la physiopathologie de certaines maladies auto-immunes et inflammatoires. L’objectif de ce travail a été d’évaluer les effets des NETs sur la maturation des DC dans un contexte inflammatoire au cours duquel les PN et les DC peuvent co-exister, assurant ainsi un pont entre immunité innée et immunité adaptative. La première partie de ce travail a consisté à développer un modèle de production, isolement et caractérisation des NETs issus de PN sanguins humains. L’ionophore de calcium A23187 a été choisi pour induire les NETs et l'enzyme de restriction AluI a permis la récupération de fragments de NETs de taille hétérogène. Certains des composants de ces NETs sont quantifiables (ADN, élastase, histone 3 en particulier), et nous avons montré qu’ils conservaient leurs capacités bactéricides in vitro. Ces échantillons de NETs constituent donc un outil biologique standardisé, permettant d’évaluer leurs effets sur des cellules ou des tissus. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons mis en évidence que ces NETs purifiés régulaient négativement la maturation de moDC induites par le LPS (expression de HLA-DR, CD80, CD83, CD86 et production de TNFα, IL-12, IL-6, IL-23). De plus, les NETs diminuent la capacité de ces moDC à induire la prolifération des LyT, et leur polarisation est modulée en favorisant la production de cytokines de type Th2 (IL-5 et IL-13) aux dépens de cytokines de types Th1 (INFγ) et Th17 (IL-17). De manière intéressante, la capacité de migration des moDC activées par le LPS n’est pas modifiée en présence de NETs. En résumé, ces résultats suggèrent que les NETs pourraient jouer un rôle immunorégulateur sur la maturation des moDC dans des conditions inflammatoires. Les NETs produits par les PN activés pourraient ainsi participer à la régulation indispensable de la réponse inflammatoire.

The hemorrhagic fevers caused by Lassa (LASV) and Ebola (EBOV) viruses are important problems of public health in Africa. The immune responses and the pathogenesis associated with these diseases are unknown. NK cells are at the crossroads between the innate and adaptive immune responses through their abilities to secrete cytokines and kill the infected cells. The interactions between NK cells and dendritic cells (DC) or macrophages potentiate the immune responses. This project aims to understand the role of NK cells in the control of viral replication and in the induction of immune responses during LASV and EBOV infection.An in vitro model of coculture of human NK cells with autologous DC or macrophages has been set up. Cell activation, cytokine production, proliferation and NK cell-mediated killing were analyzed after the infection with LASV or EBOV. In addition, NK cell functions in response to LASV were compared with those induced during Mopeia virus (MOPV) infection, closely related to LASV but not pathogenic for humans.Here, we show that LASV- or MOPV-infected macrophages, but not DC, induce the activation of NK cells and the increase of their cytotoxic capacity. This process involves cell contact and type I IFN. However, these cells are neither able to kill the infected cells nor produce IFN-γ. NK cells are activated and are able to kill the infected cells when stimulated by mutated LASV-infected macrophages and DC. Surprisingly, the type I IFN which are secreted in high amounts in response to these viruses are not involved in NK cell activation. EBOV infection does not lead to NK cell activation in the presence of DC. EBOV-infected macrophages induce low NK cell activation without cytokine production or cytotoxicity.These results allow to better understand the immune responses and the mechanisms of pathogenesis associated with Lassa and Ebola hemorrhagic fevers., Les fièvres hémorragiques à virus Lassa (LASV) et Ebola (EBOV) représentent un important problème de santé publique en Afrique. Les réponses immunes et la pathogenèse associées à ces maladies sont peu connues. Les cellules NK ont un rôle important dans la réponse immune innée par leurs propriétés cytotoxiques, mais également dans l’induction des réponses adaptatives par leur production de cytokines et leurs interactions avec les cellules dendritiques (DC) et les macrophages. Ce projet s’attache à comprendre le rôle des cellules NK dans le contrôle de la réplication virale et dans l’induction des réponses immunitaires au cours de ces infections. Un modèle in vitro de coculture de cellules NK humaines avec des DC et macrophages autologues a été développé. L’activation des cellules NK et leurs fonctions ont été analysées après l’infection par LASV et EBOV. Par ailleurs, les réponses des cellules NK en réponse à LASV ont été comparées avec celles induites lors de l’infection par le virus Mopeia (MOPV), très proche de LASV mais non pathogène pour l’homme. Les macrophages, mais pas les DC, infectés par LASV ou MOPV induisent l’activation et l’augmentation des capacités cytotoxiques des cellules NK. Toutefois, les cellules NK ne sont pas capables de lyser les cellules infectées et ne produisent pas d’IFN-γ. Les cellules NK s’activent et sont capables de lyser les cellules infectées en présence de macrophages mais également de DC infectés par des LASV mutants. Cependant, les IFN de type I sécrétés en grande quantité en réponse à ces virus ne sont pas impliqués dans l’activation des cellules NK. L’infection par EBOV n’induit qu’une très faible activation des cellules NK en présence de DC ou macrophages et ne conduit pas à la sécrétion de cytokines, ni à la modification du potentiel cytotoxique.Ces résultats permettent d’améliorer la compréhension des réponses immunes et des mécanismes de pathogenèse mis en place lors des fièvres hémorragiques Lassa et Ebola.

Dendritic cells initiate adaptive immune responses, leading either to control cancer by effector T cells or to exacerbate cancer by regulatory T cells that inhibit IFN-γ-mediated Th1-type response. Dendritic cells can also induce Th17-type immunity, mediated by IL-17A. However, the controversial role of this cytokine in cancer requires further investigations. We generated dendritic cells from peripheral blood monocytes to investigate lifespan, phenotype and chemoresistance of dendritic cells, treated with IL-17A with or without IFN-γ. Studying the expression of Bcl-2 family members, we demonstrated that dendritic cells constitutively express one pro-survival Bcl-2 member: MCL1. Immature dendritic cells were CD40(low)HLADR(low) CD1a(+) MCL1(+), did not express CD14, CD68 or BCL2A1, and displayed a short 2-day lifespan. IL-17A-treated DC exhibited a semi-mature (CD40(high) HLADR(low)) pre-M2 (CCL22(+) CD206(+) CD163(+) IL1RN(+) IL-10(-) CXCL10(-) IL-12(-)) mixed (CD1a(+) CD14+ CD68(+)) macrophage-dendritic cell phenotype. They efficiently exerted mannose receptor-mediated endocytosis and did not produce superoxide anions, in the absence of TLR engagement. Interestingly, IL-17A promoted a long-term survival of dendritic cells, beyond 12 days, that correlated to BCL2A1 induction, a pro-survival Bcl-2 family member. BCL2A1 transcription was activated by NF-κB, downstream of IL-17A transduction. Thus, immature dendritic cells only express MCL1, whereas IL-17A-treated dendritic cells concomitantly expressed two pro-survival Bcl-2 family members: MCL1 and BCL2A1. These latter developed chemoresistance to 11 of the 17 chemotherapy agents tested. However, high doses of either vinblastine or cytarabine decreased MCL1 expression and induced dendritic cell death. When IL-17A is produced in vivo, administration of anti-IL-17A biotherapy may impair dendritic cell survival by targeting BCL2A1 expression. Consequently, depending on the effector or regulatory role of dendritic cells, blocking IL-17A, may be either dangerous or beneficial for cancer outcomes, thus contributing to the apparent controversy around the role of IL-17A in cancer.

Despite widespread usage of β-adrenergic receptor (AR) agonists and antagonists in current clinical practice, our understanding of their interactions with the immune system is surprisingly sparse. Among the AR expressed by dendritic cells (DC), β2-AR can modify in vitro cytokine release upon stimulation. Because DC play a pivotal role in CD8+ T cell immune responses, we examined the effects of β2-AR stimulation on MHC class I exogenous peptide presentation and cross-presentation capacities. We demonstrate that β2-AR agonist-exposed mature DC display a reduced ability to cross-present protein Ags while retaining their exogenous peptide presentation capability. This effect is mediated through the nonclassical inhibitory G (Gαi/0) protein. Moreover, inhibition of cross-presentation is neither due to reduced costimulatory molecule expression nor Ag uptake, but rather to impaired phagosomal Ag degradation. We observed a crosstalk between the TLR4 and β2-AR transduction pathways at the NF-κB level. In vivo, β2-AR agonist treatment of mice inhibits Ag protein cross-presentation to CD8+ T cells but preserves their exogenous MHC class I peptide presentation capability. These findings may explain some side effects on the immune system associated with stress or β-agonist treatment and pave the way for the development of new immunomodulatory strategies.

How tick bite prevent dendritic cells from triggering an appropriate immune response? Development of an in vitro model for the study of dendritic cell immunosuppression. 9. Colloque du réseau français d’Immunologie des Animaux Domestiques (IAD)

International audience; Neisseria meningitidis is a human pathogen responsible for life-threatening inflammatory diseases. Meningococcal penicillin-binding proteins (PBPs) and particularly PBP2 are involved in bacterial resistance to b-lactams. Here we describe a novel function for PBP2 that activates human and mouse dendritic cells (DC) in a time and dose-dependent manner. PBP2 induces MHC II (LOGEC50 = 4.7 mg/ml60.1), CD80 (LOGEC50 = 4.88 mg/ml60.15) and CD86 (LOGEC50 = 5.36 mg/ml60.1). This effect was abolished when DCs were co-treated with anti-PBP2 antibodies. PBP2-treated DCs displayed enhanced immunogenic properties in vitro and in vivo. Furthermore, proteins co-purified with PBP2 showed no effect on DC maturation. We show through different in vivo and in vitro approaches that this effect is not due to endotoxin contamination. At the mechanistic level, PBP2 induces nuclear localization of p65 NF-kB of 70.765.1% cells versus 1262.6% in untreated DCs and needs TLR4 expression to mature DCs. Immunoprecipitation and blocking experiments showed that PBP2 binds TLR4. In conclusion, we describe a novel function of meningococcal PBP2 as a pathogen associated molecular pattern (PAMP) at the host-pathogen interface that could be recognized by the immune system as a danger signal, promoting the development of immune responses.

Différentes sous-populations de cellules dendritiques (CD) induisent des réponses immunitaires qui sontqualitativement différentes. Chez la souris, deux sous-populations des CD sédentaires qui se trouvent dans letissu lymphoïde organisé, et qui sont distinguées par l’expression ou non du marqueur CD8a, ont été impliquéesrespectivement dans l’induction des réponses T helper 1 (Th1) ou Th2. De plus, les CD CD8a+ semblent jouer unrôle majeur dans l’initiation des réponses des lymphocytes T CD8+ aux antigènes viraux au cours de diversesinfections virales. Ces considérations sont moins bien explorées pour des vecteurs vaccinaux dérivés des virus.Malgré une transduction ex vivo des CD peu efficace, les vaccins vectorisés dérivés des adénovirus humains desérotype 5 (Ad5) induisent d’excellentes réponses immunitaires, caractérisées par une forte orientation Th1, chezl’homme et chez la souris. A présent on ne sait pas si l’Ad5 interagit avec des sous-populations des CD demanière différentielle, de façon à influer sur la qualité des réponses immunitaires induites. Ces informations sontrequises pour optimiser les interactions entre les vaccins dérivés de l’Ad5 et des sous-populations de CD, defaçon à amplifier les réponses immunitaires et même à induire des effecteurs immunitaires qui sont les plusappropriés pour le pathogène ciblé.Pour aborder cette question, nous avons exploré les interactions entre des vecteurs dérivés d’Ad5 et des souspopulationsCD8a+ et CD8a- des CD de la rate murine. A l’aide de vecteurs munis des transgènes qui codent laprotéine marqueur « green fluorescent protein » ou l’antigène modèle ovalbumine, différentes étapes(attachement du vecteur, expression du transgène, présentation d’antigène par les molécules du CMH classe I etactivation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques d’antigène) dans la séquence d’événements qui suitl’administration d’un vecteur vaccinal et conduit à l’induction des réponses immunitaires ont été étudiées dans lessous-populations CD8a+ or CD8a- de CD murines.Bien que dans les expériences menées ex vivo et in vivo les CD CD8a+ and CD8a- aient capté un vecteur dérivéde l’Ad5 avec la même efficacité, l’expression du transgène et la présentation d’un antigène codé par letransgène par les molécules du CMH classe I ont été plus efficaces dans les CD CD8a+. De plus, aprèstransduction in vivo et ex vivo avec un vaccin dérivé d’Ad5, les lymphocytes T CD8+ spécifiques d’antigène ontété activés plus efficacement par les CD CD8a+ que par les CD CD8a-.En conclusion, une meilleure expression d’antigène et une meilleure présentation par le CMH classe I dans lesCD CD8a+ pourraient contribuer à une activation préférentielle des lymphocytes T CD8+ spécifiques d’antigènepar les CD CD8a+ transduites par l’Ad5.

National audience

n° national de thèse : 2011PA077022; Vaccine vectors derived from human adenovirus serotype 5 (Ad5) elicit robustimmune responses (IR) directed against the antigen encoded by the transgene in diversemammalian species. The induced IR exhibits a pronounced T helper (Th) 1 orientation, andAd5-based vectors are recognized as a leading vaccine platform for induction of CD8+ Tlymphocyte responses. Much, however, remains to be learned as regards how these vectorsinteract with professional antigen presenting cells (APC) to induce adaptive IR. Dendriticcells (DC) are professional APC endowed with the ability to prime naïve T lymphocytes,and are thus seminal in adaptive IR. DC are able to distinguish different classes ofpathogens, and induce IR that are proportional to the perceived risk and appropriate, asregards the nature of the immune effectors deployed, for the pathogen in question. Thisplasticity is related to the existence of distinct DC subsets, such as the CD8α+ and CD8α-DC subsets that are specialised in presentation of exogenous antigen by class I and class IIpathways, respectively. At present, however, the relative contribution of different DCsubsets to the initiation of adaptive IR by Ad5-based vaccines is unknown. This informationis needed to optimise interactions between Ad5-based vaccines and DC subsets, so as toamplify immune responses and even selectively elicit pathogen-appropriate IR.To this end, we have explored how Ad5-based vectors interact with murine splenicDC. First, we have investigated the interaction of Ad5-based vectors with CD8α+ or CD8α-DC subsets. Although in both ex vivo and in vivo experiments CD8α+ and CD8α- DC subsetscaptured an Ad5-based vector to a similar extent, transgene expression and subsequent MHCclass I display of a transgene-encoded antigen were more efficient in CD8α+ DC. Moreover,following in vivo and ex vivo transduction with an Ad5-based vaccine, antigen-specificCD8+ T lymphocytes were more efficiently activated by CD8α+ DC than by CD8α- DC.Second, we have studied how Ad5 is captured by mucosal DC in situ, after intestinal loopinoculation of Ad5. Preliminary data have indicated that Ad5 is efficiently translocated tothe subepithelial tissue via specialized M cells present in follicle-associated epithelium andINTRODUCTION: The Adenovirus16captured by mucosal DC in gut-associated lymphoid tissue. Conjugates of Ad5 withsecretory IgA are to be tested to improve stability of Ad5 in the intestinal milieu andenhance breaching of the mucosal barrier. Last, in an attempt to improve the tropism ofvaccine vectors, chemically or metabolically biotinylated Ad have been coupled vianeutravidin to either biotinylated antibodies or natural ligands directed against endocytoticreceptors present at the surface of DC. Preliminary experiments that have been performedusing murine bone marrow DC have shown that retargeting can improve attachment,transgene expression and MHC class I presentation of transgene-encoded antigen. Thisstrategy could be exploited to improve delivery of transgene-encoded antigen to selected DCsubsets, so as to amplify IR or elicit pathogen-appropriate IR.

Monitoring changes in immune cell populations such as lymphocytes, monocytes and dendritic cells (DC) during infectious diseases like human immunodeficiency virus (HIV) or its counterpart in rhesus monkeys (SIV) is crucial. Thanks to recent technological advances in flow cytometry, it is now possible to measure and analyze simultaneously up to 14 individual parameters at the single cell level.The goal of this work is to develop 2 multicolor flow cytometry panels comprising of 12 antibodies, allowing measuring simultaneously the main immune cells population, respectively in humans and rhesus monkeys. After 2 years of development and optimization, we can now measure precisely all the main actors of the immune system, that is CD4+ and CD8+ T lymphocytes, B lymphocytes, NK and NKT cells, the 3 monocyte subsets, and all the dendritic cell subsets known today, by using a multicolor flow cytometry approach. This assay is done on whole blood, it is rapid to do, it does not involve a cell isolation technique, and it requires only a minimum amount of blood. Moreover, the analysis of each population is much more precise because of a minimum contamination between different cell populations. The advantage of this work is to study interactions between different cell populations of immune cells during HIV infection in humans, or SIV infection in monkeys, or potentially other diseases, and in particular to better understand the important role that dendritic cells might play in disease progression., Le suivi des changements dans les populations de cellules immunitaires tels que les lymphocytes, monocytes et cellules dendritiques (DC) au cours de maladies infectieuses comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) chez l’homme ou son équivalent chez le singe (VIS) est crucial. Grâce aux récentes avancées technologiques en cytométrie en flux, il est maintenant possible de mesurer et d’analyser simultanément jusqu'à 14 paramètres individuels à l’échelon cellulaire. L'objectif de ce travail consiste en la mise au point de 2 panels multicouleurs de 12 anticorps permettant d'analyser simultanément les principales populations de cellules immunitaires, respectivement chez l’humain et le macaque rhésus. Au terme de ce travail, il est maintenant possible de mesurer précisément tous les principaux acteurs du système immunitaire, à savoir les lymphocytes T CD4+ et T CD8+, les lymphocytes B, les cellules NK et NKT, les sous-populations de monocytes, et toutes les sous-populations de cellules dendritiques connues à ce jour, en utilisant une approche multiparamétrique de cytométrie en flux. Ce protocole d’analyse est réalisé sur du sang total, il est rapide, il n’implique pas de technique d’isolation cellulaire, et requiert une quantité minimum de sang. De plus, l’analyse de chaque population cellulaire est plus précise grâce à une contamination minimum entre les populations séparées. L’intérêt de ce travail est d’étudier les interactions entre les différentes populations de cellules immunitaires durant l’infection par VIH chez l’homme, ou VIS chez le singe ou potentiellement d‘autres maladies, et en particulier de mieux comprendre le rôle important que les cellules dendritiques jouent dans la progression de ces maladies.

Monitoring changes in immune cell populations such as lymphocytes, monocytes and dendritic cells (DC) during infectious diseases like human immunodeficiency virus (HIV) or its counterpart in rhesus monkeys (SIV) is crucial. Thanks to recent technological advances in flow cytometry, it is now possible to measure and analyze simultaneously up to 14 individual parameters at the single cell level.The goal of this work is to develop 2 multicolor flow cytometry panels comprising of 12 antibodies, allowing measuring simultaneously the main immune cells population, respectively in humans and rhesus monkeys. After 2 years of development and optimization, we can now measure precisely all the main actors of the immune system, that is CD4+ and CD8+ T lymphocytes, B lymphocytes, NK and NKT cells, the 3 monocyte subsets, and all the dendritic cell subsets known today, by using a multicolor flow cytometry approach. This assay is done on whole blood, it is rapid to do, it does not involve a cell isolation technique, and it requires only a minimum amount of blood. Moreover, the analysis of each population is much more precise because of a minimum contamination between different cell populations. The advantage of this work is to study interactions between different cell populations of immune cells during HIV infection in humans, or SIV infection in monkeys, or potentially other diseases, and in particular to better understand the important role that dendritic cells might play in disease progression.; Le suivi des changements dans les populations de cellules immunitaires tels que les lymphocytes, monocytes et cellules dendritiques (DC) au cours de maladies infectieuses comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) chez l’homme ou son équivalent chez le singe (VIS) est crucial. Grâce aux récentes avancées technologiques en cytométrie en flux, il est maintenant possible de mesurer et d’analyser simultanément jusqu'à 14 paramètres individuels à l’échelon cellulaire. L'objectif de ce travail consiste en la mise au point de 2 panels multicouleurs de 12 anticorps permettant d'analyser simultanément les principales populations de cellules immunitaires, respectivement chez l’humain et le macaque rhésus. Au terme de ce travail, il est maintenant possible de mesurer précisément tous les principaux acteurs du système immunitaire, à savoir les lymphocytes T CD4+ et T CD8+, les lymphocytes B, les cellules NK et NKT, les sous-populations de monocytes, et toutes les sous-populations de cellules dendritiques connues à ce jour, en utilisant une approche multiparamétrique de cytométrie en flux. Ce protocole d’analyse est réalisé sur du sang total, il est rapide, il n’implique pas de technique d’isolation cellulaire, et requiert une quantité minimum de sang. De plus, l’analyse de chaque population cellulaire est plus précise grâce à une contamination minimum entre les populations séparées. L’intérêt de ce travail est d’étudier les interactions entre les différentes populations de cellules immunitaires durant l’infection par VIH chez l’homme, ou VIS chez le singe ou potentiellement d‘autres maladies, et en particulier de mieux comprendre le rôle important que les cellules dendritiques jouent dans la progression de ces maladies.

Classical antitumoral therapies are basically perceived as a direct and lytic action of the chosen therapeutic agent against tumor cells. Nevertheless, growing evidence indicates that some anticancer strategies can work through the action of the immune system. Imatinib Mesylate (IM), a targeted drug, helped us to unravel some mechanisms of action of a natural killer sub-population: the "Interferon-producing Killer dendritic Cells" (IKDC). Thoses cells possess anti-tumoral lytic capacities, synergistically amplified by IM and interleukine (IL)-2, under the dependency of IL-15, and also antigen-presenting capability. Those cells are capable of TRAIL-mediated lysis and of antigen uptake, processing and presentation to naives T cells., Les thérapies antitumorales sont classiquement conçues comme une action directe et mortelle de l'agent thérapeutique contre les cellules tumorales. Mais des indices toujours plus nombreux indiquent également que certaines stratégies anticancéreuses peuvent mobiliser le système immunitaire des patients cancéreux. Nous verrons ici comment un médicament ciblé, l'Imatinib Mesylate (IM), a permis de révéler certains modes d'actions d'une sous-population de cellules tueuses naturelles : les Interferon-producing Killer Dendritic Cells (IKDC). Ces cellules possèdent des propriétés lytiques anti-tumorales amplifiées de manière synergique par l'IM et l'interleukine (IL)-2 sous la dépendance de l'IL-15, ainsi que des propriétés de présentation de l'antigène. Ces cellules sont ainsi capables de lyser par TRAIL et de prendre en charge un antigène soluble pour le présenter efficacement à des lymphocytes T naïfs.

International audience; Mycolactone is a polyketide toxin produced by Mycobacterium ulcerans (Mu), the causative agent of the skin disease Buruli ulcer (BU). Surprisingly, infected tissues lack inflammatory infiltrates. Structural similarities between mycolactone and immunosuppressive agents led us to investigate the immunomodulatory properties of mycolactone on dendritic cells (DCs), the key initiators and regulators of immune responses. At noncytotoxic concentrations, phenotypic and functional maturation of both mouse and human DCs was inhibited by mycolactone. Notably, mycolactone blocked the emigration of mouse-skin DCs to draining lymph nodes, as well as their maturation in vivo. In human peripheral blood-derived DCs, mycolactone inhibited the ability to activate allogeneic T cell priming and to produce inflammatory molecules. Interestingly, production of the cytokines interleukin (IL) 12, tumor necrosis factor alpha, and IL-6 was only marginally affected, whereas production of the chemokines macrophage inflammatory protein (MIP) 1alpha, MIP-1beta, regulated on activation, normal T cell expressed and secreted, interferon gamma-inducible protein 10, and monocyte chemoattractant protein 1 was abolished at nanomolar concentrations. Importantly, mycolactone endogenously expressed by Mu mediated similar inhibitory effects on beta-chemokine production by DCs. In accordance with the histopathological features of BUs, our results suggest that bacterial production of mycolactone may limit both the initiation of primary immune responses and the recruitment of inflammatory cells to the infection site. Moreover, they highlight a potential interest in mycolactone as a novel immunosuppressive agent.

National audience

Les biotechnologies, si elles s’inscrivent dans le cadre d’un développement durable conciliant enjeux économiques et éthiques, semblent promises à une forte croissance. La mise en place d’un cadre statistique international devrait accompagner leur essor, facilitant le suivi et les comparaisons. Les études réalisées font le constat d’un retard de la France et plus globalement de l’Europe par rapport aux États-Unis.Le CNRS via son implication dans le Genopole® d’Évry, ses partenariats industriels, son soutien à la création de sociétés et le dynamisme de ses laboratoires est un acteur important de ce domaine où « le continuum formation, recherche et innovation » se trouve être un facteur clé pour réussir.Pour l’industrie pharmaceutique, les biotechnologies sont considérées comme une source fondamentale d’innovation appliquée aux différents stades de l’élaboration d’un médicament :génomique structurale et fonctionnelle, thérapie génique, pharmaco-génomique... Elles tendent vers le développement de traitements ciblés, plus efficaces, moins toxiques et adaptés à chacun.La recherche dans ces différentes thématiques nécessite une approche multidisciplinaire et la mise en place de partenariats entre les acteurs. Le CNRS de part sa taille et ses prédispositions devrait au niveau français et européen jouer un rôle majeur.