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The first hematopoietic stem cells (HSCs) emerge in the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) region in the vertebrate embryo. This process takes place during a short developmental period, between days 10.5 and 12.5 in the mouse embryo. More specifically, HSCs arise from so-called hemogenic aortic endothelial cells in the ventral region of the dorsal aorta. In order to better characterize the hematopoietic microenvironment of the AGM, we explored the molecular signature of the tissues surrounding the dorsal aorta by combining approaches of laser microdissection, DNA chips and bioinformatics analyses. This study showed that the Ntrk2 and Ntrk3 genes, encoding two neurotrophin receptors (the TRKB and TRKC proteins), are preferentially expressed in the cells underlying the dorsal aorta. The main objective of my project is to comprehensively map the neurotrophin-mediated pathway in AGM using single-cell molecular biology, imaging and transcriptomic approaches. My results suggest that 1) TRKB and TRKC receptor expression is dynamic along the anteroposterior axis of the mouse embryo, 2) TRKB+ and TRKC+ populations exhibit phenotypic and molecular differences, and 3) the Expression of genes encoding neurotrophins (Bdnf, Ntf3 and Ntf5) is heterogeneous and associated with neural (Bdnf), mesenchymal (Bdnf, Ntf3 and Ntf5) and smooth muscle (Bdnf) cells. My results also support the existence of a population of neuro-mesenchymal cells in the subaortic region. Functional approaches are now being considered to study the functional role of the neurotrophin-mediated pathway in aortic hematopoiesis., Les premières cellules souches hématopoïétiques (CSH) émergent dans la région Aorte-Gonades-Mésonéphros (AGM) chez l’embryon de vertébrés. Ce processus se déroule au cours d’une courte période développementale, entre les jours 10,5 et 12,5 chez l’embryon de souris. Plus précisément, les CSH naissent à partir de cellules endothéliales aortiques dites hémogéniques dans la région ventrale de l’aorte dorsale. Afin de mieux caractériser le microenvironnement hématopoïétique de l’AGM, nous avons exploré la signature moléculaire des tissus entourant l’aorte dorsale en combinant des approches de microdissection laser, de puces à ADN et d’analyses bioinformatiques. Cette étude a montré que les gènes Ntrk2 et Ntrk3, codant deux récepteurs aux neurotrophines (les protéines TRKB et TRKC), sont préférentiellement exprimés dans les cellules sous-jacentes à l’aorte dorsale. Mon projet a pour objectif principal de cartographier de façon approfondie la voie médiée par les neurotrophines dans l’AGM à l’aide d’approches de biologie moléculaire, d’imagerie et de transcriptomique à l’échelle cellule unique. Mes résultats suggèrent que 1) l’expression des récepteurs TRKB et TRKC est dynamique le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon de souris, 2) les populations TRKB+ et TRKC+ présentent des différences phénotypiques et moléculaires et 3) l’expression des gènes codant les neurotrophines (Bdnf, Ntf3 et Ntf5) est hétérogène et associée à des cellules neurales (Bdnf), mésenchymateuses (Bdnf, Ntf3 et Ntf5) et musculaires lisses (Bdnf). Mes résultats renforcent également l’existence d’une population de cellules neuro-mésenchymateuses dans la région sous-aortique. Des approches fonctionnelles sont maintenant envisagées pour étudier le rôle fonctionnel de la voie médiée par les neurotrophines dans l’hématopoïèse aortique.

Developmental cell death plays an important role in the construction of functional neural circuits. In vertebrates, the canonical view proposes a selection of the surviving neurons through stochastic competition for target-derived neurotrophic signals, implying an equal potential for neurons to compete. Here we show an alternative cell fitness selection of neurons that is defined by a specific neuronal heterogeneity code. Proprioceptive sensory neurons that will undergo cell death and those that will survive exhibit different molecular signatures that are regulated by retinoic acid and transcription factors, and are independent of the target and neurotrophins. These molecular features are genetically encoded, representing two distinct subgroups of neurons with contrasted functional maturation states and survival outcome. Thus, in this model, a heterogeneous code of intrinsic cell fitness in neighboring neurons provides differential competitive advantage resulting in the selection of cells with higher capacity to survive and functionally integrate into neural networks., Programmed cell death is an important part of tissue development, and traditionally it is considered that neuronal death is a stochastic process in response to neurotrophic factor deprivation. Here the authors show that for TrkC+ proprioreceptors, which neurons die is predetermined molecularly by how much TrkC is present, as well as by a gene expression signature.

International audience; Cutaneous spindle-cell neoplasms in adults as well as children represent a frequent dilemma for pathologists. Along this neoplasm spectrum, the differential diagnosis with CD34-positive proliferations can be challenging, particularly concerning neoplasms of fibrohistiocytic and fibroblastic lineages. In children, cutaneous and superficial soft-tissue neoplasms with CD34-positive spindle cells are associated with benign to intermediate malignancy potential and include lipofibromatosis, plaque-like CD34-positive dermal fibroma, fibroblastic connective tissue nevus, and congenital dermatofibrosarcoma protuberans. Molecular biology has been valuable in showing dermatofibrosarcoma protuberans and infantile fibrosarcoma that are characterized by COL1A1-PDGFB and ETV6-NTRK3 rearrangements respectively. We report a case of congenital CD34-positive dermohypodermal spindle-cell neoplasm occurring in a female infant and harboring a novel KHDRBS1-NTRK3 fusion. This tumor could belong to a new subgroup of pediatric cutaneous spindle-cell neoplasms, be an atypical presentation of a plaque-like CD34-positive dermal fibroma, of a fibroblastic connective tissue nevus, or represent a dermatofibrosarcoma protuberans with an alternative gene rearrangement.

Glioblastoma multiform (GBM), a primary brain tumor that is the most common and the most aggressive. It’s characterized by a high degree of hypoxia and a resistance to therapy because of its adaptation capacities including autophagy. This degradation process allows recycling of cellular components to produce precursors for anabolism and ATP. We have studied the hypoxia-induced autophagy in three human GBM cell lines, the U87MG, M059K and M059J. We have found a survival hypoxia-induced autophagy that was efficient in all cell lines. Indeed, we observed an accumulation of autophagosomes when we inhibited the autophagic flux with chloroquine (CQ). Treatment with CQ or interference of Beclin1 or Atg5 expression by specific siRNA in GBM cells significantly decreased their metabolic activity and growth. However, we did not detect PARP cleavage by western blotting. Thus, we verified the neurotrophic signaling as another survival pathway by which GBM cells resist to hypoxia. After hypoxia, the transcription level of TrkC FL (full length), TrkC-T1 (truncated TrkC) and the NT-3 (the TrkC ligand) significantly increases in the U87MG cell lines, as far as the translation level of TrkC FL and TrkC-T1. When we explored the TrkC FL signaling pathway, there was an increase in the phosphorylation level of p38. After inhibition of this MAPK, we observed PARP cleavage, which was particularly important in hypoxia conditions. This cleavage was further enhanced upon CQ treatment. The autophagy inhibition using either CQ, siBeclin1 or siAtg5, increases TrkC FL and T1 expression, suggesting that in the absence of autophagy, cells would adapt by increasing TrkC signaling.Finally, we have verified for hypoxic (BNIP3) and autophagic (LC3) markers on tumor sections from patients with GBM. We confirmed the hypoxic character of GBM, and showed important autophagy activation, after autophagosomes quantification. In comparison with cavernoma (benign brain tumor), patients with GBM showed a significant increase in TrkC and NT-3 expression, highlighting the importance of neurotrophic signaling in GBM tumor cell survival., Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive. Il s’agit d’une tumeur capable de survivre même dans des conditions d’oxygénation faible ou hypoxie. En effet, les cellules cancéreuses du GBM activent des voies de survie en réponse à cette privation de dioxygène, dont l’autophagie. Il s’agit d’un mécanisme catabolique conduisant à la dégradation des constituants cellulaires, générant ainsi des précurseurs pour l’anabolisme cellulaire ainsi que de l’ATP. Nous avons étudié l’activation de l’autophagie en réponse à l’hypoxie, dans trois lignées cellulaires de GBM humain, les U87MG, les M059K et les M059J. Une autophagie de survie est activée dans les trois lignées cellulaires, en réponse à l’hypoxie. L’inhibition du flux autophagique par la chloroquine (CQ), induit une accumulation des autophagosomes, soulignant ainsi l’efficacité du processus. L’inhibition de l’autophagie par la CQ ou par des siRNA spécifiques dirigés contre les transcrits de Beclin1 ou d’Atg5, entraîne une diminution significative de l’activité métabolique cellulaire, ainsi qu’un retard de prolifération. Toutefois, nous n’avons pas détecté de mort apoptotique dépendante des caspases. Nous avons donc étudié une deuxième voie de signalisation de survie cellulaire, la signalisation neurotrophique. Une augmentation significative des transcrits de TrkC FL et T1 (TrkC tronqué) ainsi que de leur ligand, la NT-3 a été observée dans les cellules U87MG cultivées en hypoxie. De même, le taux de production des protéines TrkC FL et T1 a significativement augmenté en hypoxie. L’augmentation de l’expression du TrkC FL était accompagnée par une augmentation de sa phosphorylation et de celle de la p38 MAPK. L’inhibition de cette dernière par siRNA induit un clivage de la PARP, qui est d’autant plus important suite à l’ajout de la CQ. Ces effets étaient plus marqués au niveau des cellules cultivées en hypoxie. L’inhibition de l’autophagie par la CQ, augmente l’expression de TrkC FL et la phosphorylation de la p38, ce qui suggère qu’en absence de l’autophagie, les cellules s’adapteraient en augmentant la signalisation du TrkC.La recherche des zones hypoxiques et autophagiques sur des coupes de tumeurs issues de patients atteints de GBM, confirme le caractère hypoxique de cette tumeur, et montre une induction du processus autophagique. En comparaison avec le cavernome (tumeur cérébrale bénigne), les patients atteints de GBM montrent une augmentation significative de l’expression de TrkC et de NT-3, ce qui renforce l’importance de la signalisation neurotrophique dans la survie des cellules de GBM.

The neurotrophin receptor TrkC was recently identified as a dependence receptor, and, as such, it triggers apoptosis in the absence of its ligand, NT-3. Indeed cells that express these receptors are thought to be dependent on ligand availability for their survival, a mechanism that inhibits uncontrolled tumor cell proliferation and migration. TrkC, as a classic tyrosine kinase receptor, is generally considered to be a proto-oncogene. We show that TrkC expression is down-regulated in a large fraction of human colorectal cancers, mainly through promoter methylation. Moreover, we show that TrkC silencing by promoter methylation is a selective advantage for colorectal cell lines to limit tumor cell death. Furthermore, reestablished TrkC expression in colorectal cancer cell lines is associated with tumor cell death and inhibition of in vitro characteristics of cell transformation, as well as in vivo tumor growth. Together, these data support the conclusion that TrkC is a colorectal cancer tumor suppressor. TrkC triggers apoptosis in the absence of its ligand NT-3 : the molecular mechanism for apoptotic engagement involves the double cleavage of the receptor's intracellular domain, leading to the formation of a proapoptotic fragment (TrkC KF). We show that TrkC KF interfacts with Cobra1, a putative cofactor of BRCA1, and that Cobra1 is required for TrkC-induced apoptosis. Cobra1 shuttles TrkC KF to the mitochondria, where it promotes apoptosome-dependent apoptosis. Thus, we propose that, in the absence of NT-3, the proteolytic cleavage of TrkC leads to the release of a killer fragment that triggers mitochondria-dependent apoptosis via the recruitment of Cobra1, Le récepteur à neurotrophine TrkC a été identifié comme étant un récepteur à dépendance : en l'absence de son ligand NT-3, il déclenche l'apoptose. En effet, la survie des cellules qui expriment ces récepteurs dépend de la disponibilité en ligand, un mécanisme qui inhibe la prolifération incontrôlée et la migration des cellules tumorales. TrkC, en tant que récepteur à tyrosine kinase, est généralement considéré comme un proto-oncogène. Or nous montrons que l'expression TrkC est diminuée dans une grande fraction des cancers colorectaux humains, principalement par méthylation du promoteur de TrkC. En outre, ce mécanisme confère un avantage sélectif aux lignées cellulaires colorectales pour inhiber la mort des cellules tumorales. De plus, la réexpression de TrkC dans les lignées tumorales colorectales est associée à la mort des cellules tumorales et à l'inhibition in vitro des caractéristiques de transformation cellulaire, et in vivo de la croissance tumorale. Ensemble, ces données permettent de conclure que TrkC est un gène suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal. Le mécanisme moléculaire par lequel TrkC déclenche l'apoptose implique le clivage de son domaine intracellulaire, ce qui libère un fragment pro-apoptotique (TrkC KF). Nous montrons que TrkC KF interagit avec Cobra1, un cofacteur de BRCA1, et que Cobra1 est nécessaire à l'apoptose induite par TrkC. Cobra1 conduit TrkC KF à la mitochondrie, où il favorise l'apoptose apoptosome-dépendante. Ainsi, nous proposons qu'en l'absence de NT-3, le clivage protéolytique de TrkC conduit à la libération d'un fragment tueur qui déclenche l'apoptose mitochondriale, via le recrutement de Cobra1

The neurotrophin receptor TrkC was recently identified as a dependence receptor, and, as such, it triggers apoptosis in the absence of its ligand, NT-3. Indeed cells that express these receptors are thought to be dependent on ligand availability for their survival, a mechanism that inhibits uncontrolled tumor cell proliferation and migration. TrkC, as a classic tyrosine kinase receptor, is generally considered to be a proto-oncogene. We show that TrkC expression is down-regulated in a large fraction of human colorectal cancers, mainly through promoter methylation. Moreover, we show that TrkC silencing by promoter methylation is a selective advantage for colorectal cell lines to limit tumor cell death. Furthermore, reestablished TrkC expression in colorectal cancer cell lines is associated with tumor cell death and inhibition of in vitro characteristics of cell transformation, as well as in vivo tumor growth. Together, these data support the conclusion that TrkC is a colorectal cancer tumor suppressor. TrkC triggers apoptosis in the absence of its ligand NT-3 : the molecular mechanism for apoptotic engagement involves the double cleavage of the receptor's intracellular domain, leading to the formation of a proapoptotic fragment (TrkC KF). We show that TrkC KF interfacts with Cobra1, a putative cofactor of BRCA1, and that Cobra1 is required for TrkC-induced apoptosis. Cobra1 shuttles TrkC KF to the mitochondria, where it promotes apoptosome-dependent apoptosis. Thus, we propose that, in the absence of NT-3, the proteolytic cleavage of TrkC leads to the release of a killer fragment that triggers mitochondria-dependent apoptosis via the recruitment of Cobra1, Le récepteur à neurotrophine TrkC a été identifié comme étant un récepteur à dépendance : en l'absence de son ligand NT-3, il déclenche l'apoptose. En effet, la survie des cellules qui expriment ces récepteurs dépend de la disponibilité en ligand, un mécanisme qui inhibe la prolifération incontrôlée et la migration des cellules tumorales. TrkC, en tant que récepteur à tyrosine kinase, est généralement considéré comme un proto-oncogène. Or nous montrons que l'expression TrkC est diminuée dans une grande fraction des cancers colorectaux humains, principalement par méthylation du promoteur de TrkC. En outre, ce mécanisme confère un avantage sélectif aux lignées cellulaires colorectales pour inhiber la mort des cellules tumorales. De plus, la réexpression de TrkC dans les lignées tumorales colorectales est associée à la mort des cellules tumorales et à l'inhibition in vitro des caractéristiques de transformation cellulaire, et in vivo de la croissance tumorale. Ensemble, ces données permettent de conclure que TrkC est un gène suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal. Le mécanisme moléculaire par lequel TrkC déclenche l'apoptose implique le clivage de son domaine intracellulaire, ce qui libère un fragment pro-apoptotique (TrkC KF). Nous montrons que TrkC KF interagit avec Cobra1, un cofacteur de BRCA1, et que Cobra1 est nécessaire à l'apoptose induite par TrkC. Cobra1 conduit TrkC KF à la mitochondrie, où il favorise l'apoptose apoptosome-dépendante. Ainsi, nous proposons qu'en l'absence de NT-3, le clivage protéolytique de TrkC conduit à la libération d'un fragment tueur qui déclenche l'apoptose mitochondriale, via le recrutement de Cobra1

The neurotrophin receptor TRKC was initially shown to induce apoptosis in settings of lackof its ligand, NT-3. This cell death was described to be important in the regulation of neuronalsurvival during sympathetic nervous system formation and finally it was linked with severaltypes of cancer. During my thesis I focused on the molecular characterization of the signaling cascade leadingto TRKC-induced apoptosis. Importantly, in order to kill, TRKC is double-cleaved bycaspases in its intracellular domain releasing a pro-apoptotic fragment, named TRKC KF(Killer Fragment). Using a yeast two-hybrid screen we identified several potential interactingpartners for TRKC KF. Initially, i focused on COBRA1, a cofactor of BRCA1.I show here that COBRA1 is requisite for TRKC-induced cell death both in vitro and in vivo,on primary neurons. COBRA1 seems to stabilize and accumulate TRKC KF at themitochondria, where TRKC KF induces the activation of BAX and therefore cytochrome crelease. Therefore, it looks that TRKC-induced cell death is dependent on the intrinsicpathway of apoptosis. During my thesis, I also took part in two projects characterizing the role of TRKC as aconditional tumor suppressor in neuroblastoma and colon cancer. We showed that inneuroblastoma tumors the pro-apoptotic function of TRKC is impaired due to an autocrineproduction loop of NT-3, which can be targeted as a therapeutic strategy. In colon cancer, wedescribed another mechanism by which tumor cells evade TRKC-induced apoptosis, morespecifically a loss of TRKC expression due to promoter hypermethylation, Le récepteur à neurotrophine TRKC a initialement été montré comme induisant la mortcellulaire par apoptose en l’absence de son ligand, NT-3. Cette mort cellulaire a tout d’abordété décrite comme étant importante dans la régulation de la survie neuronale, pendant laformation du système nerveux sympathique. Plus tard, elle a été montrée comme étantimpliquée dans différents types de cancer.Au cours de ma thèse, je me suis concentré sur la caractérisation moléculaire de la cascade designalisation conduisant à l’induction de l’apoptose par TRKC. Afin d’induire l’apoptose, ledomaine intracellulaire de TRKC est clivé par les caspases en deux sites, ce qui entraine lagénération d’un fragment pro-apoptotique, TRKC KF (Killer Fragment). Plusieurs partenairespotentiels de TRKC KF ont été identifiés lors d’un crible double-hybride. Initialement, je mesuis focalisé sur l’un d’eux, COBRA1, un cofacteur de BRCA1.Je montre ici que COBRA1 est requis pour la mort cellulaire induite par TRKC, à la fois invitro et in vivo, dans des neurones primaires. COBRA1 semble stabiliser et accumuler TRKCKF à la mitochondrie, où TRKC KF entraine l’activation de BAX et ensuite le relargage ducytochrome c. En conclusion, il semblerait que la mort cellulaire induite par TRKC estdépendante de la voie apoptotique intrinsèque. J’ai aussi pris part à deux autres projets décrivant le rôle de TRKC comme un suppresseur de tumeur potentiel dans le neuroblastome et le cancer colorectal. Nous avons montré dans leneuroblastome que la fonction pro-apoptotique de TRKC est invalidée par une boucleautocrine de production de NT3, qui peut être ciblée lors d’une approche thérapeutique. Dansle cancer colorectal, nous avons décrit un second mécanisme par lequel les cellules tumoraleséchappent à l’apoptose induite par TrkC. Il s’agit d’une perte de l’expression de TrkC due àune hypermethylation du promoteur.

The neurotrophin receptor TRKC was initially shown to induce apoptosis in settings of lackof its ligand, NT-3. This cell death was described to be important in the regulation of neuronalsurvival during sympathetic nervous system formation and finally it was linked with severaltypes of cancer. During my thesis I focused on the molecular characterization of the signaling cascade leadingto TRKC-induced apoptosis. Importantly, in order to kill, TRKC is double-cleaved bycaspases in its intracellular domain releasing a pro-apoptotic fragment, named TRKC KF(Killer Fragment). Using a yeast two-hybrid screen we identified several potential interactingpartners for TRKC KF. Initially, i focused on COBRA1, a cofactor of BRCA1.I show here that COBRA1 is requisite for TRKC-induced cell death both in vitro and in vivo,on primary neurons. COBRA1 seems to stabilize and accumulate TRKC KF at themitochondria, where TRKC KF induces the activation of BAX and therefore cytochrome crelease. Therefore, it looks that TRKC-induced cell death is dependent on the intrinsicpathway of apoptosis. During my thesis, I also took part in two projects characterizing the role of TRKC as aconditional tumor suppressor in neuroblastoma and colon cancer. We showed that inneuroblastoma tumors the pro-apoptotic function of TRKC is impaired due to an autocrineproduction loop of NT-3, which can be targeted as a therapeutic strategy. In colon cancer, wedescribed another mechanism by which tumor cells evade TRKC-induced apoptosis, morespecifically a loss of TRKC expression due to promoter hypermethylation, Le récepteur à neurotrophine TRKC a initialement été montré comme induisant la mortcellulaire par apoptose en l’absence de son ligand, NT-3. Cette mort cellulaire a tout d’abordété décrite comme étant importante dans la régulation de la survie neuronale, pendant laformation du système nerveux sympathique. Plus tard, elle a été montrée comme étantimpliquée dans différents types de cancer.Au cours de ma thèse, je me suis concentré sur la caractérisation moléculaire de la cascade designalisation conduisant à l’induction de l’apoptose par TRKC. Afin d’induire l’apoptose, ledomaine intracellulaire de TRKC est clivé par les caspases en deux sites, ce qui entraine lagénération d’un fragment pro-apoptotique, TRKC KF (Killer Fragment). Plusieurs partenairespotentiels de TRKC KF ont été identifiés lors d’un crible double-hybride. Initialement, je mesuis focalisé sur l’un d’eux, COBRA1, un cofacteur de BRCA1.Je montre ici que COBRA1 est requis pour la mort cellulaire induite par TRKC, à la fois invitro et in vivo, dans des neurones primaires. COBRA1 semble stabiliser et accumuler TRKCKF à la mitochondrie, où TRKC KF entraine l’activation de BAX et ensuite le relargage ducytochrome c. En conclusion, il semblerait que la mort cellulaire induite par TRKC estdépendante de la voie apoptotique intrinsèque. J’ai aussi pris part à deux autres projets décrivant le rôle de TRKC comme un suppresseur de tumeur potentiel dans le neuroblastome et le cancer colorectal. Nous avons montré dans leneuroblastome que la fonction pro-apoptotique de TRKC est invalidée par une boucleautocrine de production de NT3, qui peut être ciblée lors d’une approche thérapeutique. Dansle cancer colorectal, nous avons décrit un second mécanisme par lequel les cellules tumoraleséchappent à l’apoptose induite par TrkC. Il s’agit d’une perte de l’expression de TrkC due àune hypermethylation du promoteur.