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International audience; Objective: To identify the molecular basis of a severe systemic autoinflammatory disorder (SAID) and define its main phenotypical features. To functionally assess the sequence variations identified in LYN, a gene encoding a non-receptor tyrosine-kinase.Methods: (i) Targeted next-generation sequencing; (ii) In vitro functional studies of Lyn phosphorylation state and of Lyn-dependent NF-κB activity after expression of recombinant Lyn isoforms carrying different sequence variations.Results: We identified a de novo LYN variation (p.Tyr508His) in a patient presenting since birth with recurrent fever, chronic urticaria, atopic dermatitis, arthralgia, increased inflammatory biomarkers and elevated plasma cytokine levels. We studied the consequences on Lyn phosphorylation state of the Tyr508His variation and of the two LYN variations reported so far (p.Tyr508Phe and p.Tyr508*), and showed that all three variations prevent phosphorylation of residue 508 and lead to autophosphorylation of Tyr397. Additionally, these three LYN variations activate the NF-κB pathway. These results reflect a gain-of-function effect of the variations involving Tyr508 on Lyn activity.Conclusions: This study, which demonstrates the pathogenicity of the first three LYN variations identified in SAID patients, delineates the phenotypic spectrum of a disease entity characterized by an early onset severe inflammatory disease affecting neonates with no family history of SAID. All three variations affect the same tyrosine residue located in the C-terminus of Lyn, thereby underlining the critical role of this residue in the proper regulation of Lyn activity in humans.

A20 est une enzyme d'édition de l'ubiquitine codée par le gène A20 (ou TNFAIP3, tumor necrosis factor a-induced portien 3). A travers son activité E3 ligase et déubiquitinase, A20 régule plusieurs substrats de la voie NF-kappaB, tels que RIP1, NEMO et TRAF6. La protéine A20 joue un rôle central dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité en inhibant cette voie de signalisation. Les premières mutations d’A20 décrites en 2016 conduisaient à une haploinsuffisance, donnant ainsi le nom haploinsuffisance A20 (HA20) à cette maladie auto-inflammatoire (MAI) de transmission autosomique dominante. Le phénotype de HA20 est partiellement chevauchant avec celui de la maladie de Behçet mais se caractérise par un âge de début de maladie précoce ; il associe des accès récurrents de fièvre, des ulcères buccaux et génitaux, une atteinte gastro-intestinale avec diarrhée, des arthralgies ou polyarthrites et des uvéites antérieures bilatérales. Avec plus de 25 mutations tronquantes de A20 rapportées à ce jour, HA20 est une MAI monogénique fréquemment diagnostiquée. Cependant, la signification pathogénique des variations faux-sens de A20 a été peu étudiée est reste difficile à établir. Dans cette étude, nous avons identifié chez six patients indépendants présentant une MAI, cinq nouvelles variations de A20 dont le retentissement fonctionnel a été évalué par des tests cellulaires in vitro : deux variations responsables d’un décalage de cadre de lecture et trois faux-sens. Les deux variations tronquantes c.716dup (p.Ala240Cysfs*14) et c.1504del (p.Arg502Glyfs*195), entraînent une haploinsuffisance due à une dégradation des transcrits A20 par non-sens mRNA decay. La variation faux-sens c.707T>C (p.Leu236Pro) (de classe 3 selon les recommandations de l’American College of Medical Genetics), est responsable d’une dégradation accrue de la protéine mutée (suivi de la stabilité de la protéine et de la dégradation par le protéasome). La baisse d’expression de la protéine A20-Leu236Pro a été par ailleurs confirmée dans les PBMCs provenant des patients. En plus du défaut d’expression, la protéine A20-Leu236Pro présente un défaut fonctionnel avec une moindre suppression de l'activité NF-kappaB que la protéine A20 normale. Quant aux deux autres variations faux-sens identifiées : c.464C>T (p.Thr155Met) et c.237C>G (p.Ser79Arg), de classe 3 également, elles n’étaient responsables d’aucune anomalie dans les tests in vitro utilisés (étude de l’expression de la protéine et de l’activité NF-kappaB). Au total, cette étude souligne l’importance d’évaluer le retentissement fonctionnel des variations faux-sens identifiées dans le gène A20 chez les patients chez qui un diagnostic de HA20 est suspecté : les résultats de ces analyses conditionnent la prise en charge thérapeutique des patients et le conseil génétique.

International audience; Background/Objectives:Van der Woude syndrome (VWS, MIM 119300) is an autosomal dominant cleft lip and/or palate with typical lower lip pits. Most patients carry loss-of-function mutations in IRF6. Upstream open reading frame (uORF)-creating mutations have been reported in four VWS patients. Pathogenic uORFcreating mutations are mostly out-of-frame upstream start codons (uAUG) in the 5’UTR. We searched for IRF6 uORF mutations and assessed the ability to predict the pathogenicity of uORFcreating variations of 5 prediction tools.Methods:We analyzed IRF6 UTR and coding regions in 68 VWS probands. By using a set of 44 reference genes, we assessed 5 in silico tools predicting the probability of ATGs to initiate translation: NetStart, ATGpr, TIS Miner, AltORFev, TIS Predictor. We then assessed the potential pathogenicity of all the theoretical uORFs in IRF6 5’UTR.Results:We have identified two novel uORF-creating mutations (c.-141C>T and c.-162C>T), representing 3% (2/68) of the probands. The 7 carriers of the two families had typical VWS signs. Our in silico analyses revealed a higher accuracy for AI-based tools over those based on Kozak consensus scoring. There are 28 theoretical uAUG-creating SNVs in IRF6 5’UTR. With AI-based tools, the six uAUG identified in VWS patients have high translation initiation site scores; 3 to 4 of the theoretical uAUG-creating SNVs had high scores and could correspond to pathogenic mutations. For the dozen of theoretical SNVs with intermediate scores, predicting pathogenicity remains challenging.Conclusion:As untranslated regions are frequently understudied in NGS strategies, uORF-creating mutations may be underdiagnosed in VWS and in human pathology in general.

International audience; Les Maladies auto-inflammatoires (MAI) sont liées à des anomalies génétiques de facteurs impliqués dans le système immunitaire et caractérisées par des accès inflammatoires fébriles récurrents spontanément résolutifs. LYN code pour une protéine tyrosine kinase, dont l’activation est régulée par l’état de phosphorylation de 2 de ses tyrosines (Y397 et Y508). Dans un modèle murin, le knock-in Y508F conduit à une hyperactivation de Lyn et au développement d’une glomérulonéphrite autoimmune sévère. A ce jour, 2 patients avec une MAI sévère de début néonatal et présentant chacun une variation de novo du dernier exon de LYN (Y508* et Y508F), non explorées sur le plan fonctionnel, ont été rapportés lors de conférences spécialisées. MethodesEtude NGS d’un panel de gènes de MAI chez une patiente présentant une forme néonatale sévère de MAI. Etudes fonctionnelles in vitro des variations LYN : étude de la phosphorylation de Lyn par western blot et activation de la voie NF-kB par essai luciférase dans la lignée HEK293T. ConclusionIl s’agit de la 1ère démonstration de la pathogénicité des 3 variations de LYN rapportées chez l’homme à ce jour, et ce par effet gain-de-fonction.Les 3 variations (Y508H, Y508F et Y508*) affectent le même résidu Tyrosine de la protéine, soulignant le rôle critique de cet acide aminé dans la régulation de l’activité de Lyn.L’analyse fine du phénotype de ce patient et sa comparaison avec le phénotype des 2 précédents patients rapportés permet de définir un spectre phénotypique de cette MAI associée à des variations gain-de-fonction de LYN.

Objective. To determine the molecular and cellular bases of autoinflammatory syndromes in a multigenerational French family with Muckle-Wells syndrome and in a patient originating from Portugal with familial cold autoinflamma-tory syndrome.Methods. Sequencing of NLRP3 exon 3 was performed in all accessible patients. Microsatellite and whole-ge-nome single nucleotide polymorphism genotyping was used i) to test the intrafamilial segregation of the identified var-iant and ii) to look for a founder effect. Functional analyses included the study of i) apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC) speck formation in HEK293T cells (stably expressing ASC–green fluorescent protein and pro-caspase 1-FLAG) transiently expressing the wild-type or mutated NLRP3 protein, ii) levels of IL-1β secreted from transfected THP-1 cells, and iii) inflammasome-related gene expression and cytokine secretion from monocytes isolated from patients in crisis (probands from the two families), related patients out of crisis, and from controls.Results. The same heterozygous mutation (c.1322C>T, p.A441V) located in the NACHT domain, segregating with the disease within the first family, was identified in the two families. This mutation was found to be associated with dif-ferent core haplotypes. NLRP3-A441V led to increased ASC speck formation and high levels of secreted IL-1β. Mono-cyte inflammasome-related gene expression and cytokine secretion, which were within the normal range in patients out of crisis, were found to be differentially regulated between the two probands, correlating with their phenotypic status.Conclusion. These molecular and cellular findings, which indicate a recurrent mutational event, clearly demon-strate the pathogenicity of the p.A441V missense mutation in NLRP3-associated autoinflammatory disease and point to the interest of studying patients’ primary cells to assess disease activity.

National audience; Les taux des protéines serum amyloid A (SAA) sont augmentés par diverses conditions inflammatoires. Chez l’Homme, la famille de protéines SAA comporte les protéines de phase aigüe SAA1/SAA2, connues pour activer de nombreuses cellules immunitaires, et la protéine constitutive SAA4. La synthèse hépatique des protéines SAA1/SAA2 est bien établie mais une expression extra-hépatique est encore débattue, particulièrement dans les macrophages. De plus, des auteurs ont mis en évidence la présence d’ARNm SAA dans des cellules spumeuses de plaques d’athéromes. Nous avons étudié la capacité des monocytes et macrophages dérivés de monocytes humains à exprimer SAA1, SAA2 et SAA4, au niveau transcriptionnel et protéique, tandis que les études précédentes ont principalement investigué des lignées monocytaires. Des monocytes et macrophages dérivés de monocytes de donneurs sains ont été traités par différentes conditions. L’expression des cytokines pro-inflammatoires IL1A, IL1B et IL6 a été étudiée en parallèle de l’expression des gènes SAA. Nous avons mis en évidence l’expression du gène SAA1, et de SAA2 à une moindre mesure, lorsque les cellules sont simultanément traitées par un agent pro-inflammatoire et un agent anti-inflammatoire. L’agent pro-inflammatoire seul n’avait pas d’effet sur l’expression des gènes SAA, bien qu’il induise, comme attendu, l’expression des cytokines pro-inflammatoires, effet amoindri par l’ajout du stimulus anti-inflammatoire. De plus, la polarisation des monocytes en phénotype pro-inflammatoire M1 potentialisait l’expression des gènes SAA, principalement SAA1. Nous avons cependant observé un écart entre les taux d’ARNm SAA et les taux intracellulaires de protéines. Nos résultats montrent que les monocytes et macrophages humains peuvent exprimer les gènes SAA, principalement SAA1, dans un environnement inflammatoire. Les monocytes et macrophages étant des acteurs majeurs de maladies inflammatoires, il est possible d’émettre l’hypothèse que la production de SAA par les monocytes et macrophages peut contribuer à la persistance d’un microenvironnement local inflammatoire et à la formation des plaques d’athéromes.

International audience; Interstitial duplication within the long arm of chromosome 20 is an uncommon chromosome structural abnormality. We report here the clinical and molecular characterization associated with pure 20q13.2 duplication in three unrelated patients. The most frequent clinical features were developmental delay, facial dysmorphism, cardiac malformation and skeletal anomalies. All DNA gains occurred de novo, ranging from 1.1 Mb to 11.5 Mb. Compared with previously reported conventional cytogenetic analyses, oligonucleotides array CGH allowed us to refine breakpoints and determine the genes of interest in the region. Involvement of SALL4 in cardiac malformations and NFATC2 gene disruption in both cardiac and skeletal anomalies are discussed.

International audience; Interstitial duplication within the long arm of chromosome 20 is an uncommon chromosome structural abnormality. We report here the clinical and molecular characterization associated with pure 20q13.2 duplication in three unrelated patients. The most frequent clinical features were developmental delay, facial dysmorphism, cardiac malformation and skeletal anomalies. All DNA gains occurred de novo, ranging from 1.1 Mb to 11.5 Mb. Compared with previously reported conventional cytogenetic analyses, oligonucleotides array CGH allowed us to refine breakpoints and determine the genes of interest in the region. Involvement of SALL4 in cardiac malformations and NFATC2 gene disruption in both cardiac and skeletal anomalies are discussed.