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Doutoramento em Ciências Farmacêuticas PhD in Pharmaceutical Sciences

Doutoramento em Ciências Farmacêuticas PhD in Pharmaceutical Sciences

Mestrado em Controlo de Qualidade MSc in Quality Control Piper betle L., conhecida como bétele, é uma espécie que se desenvolve largamente nos países do Sudeste Asiático, onde as suas folhas são económica e medicinalmente importantes. Para determinar o maior número possível de compostos voláteis e semivoláteis, as folhas foram sujeitas as diferentes processos de extracção, nomeadamente headspace - microextracção em fase sólida (HS-SPME), hidrodestilação e extracção por Soxhlet, e posteriormente analisadas por GC/MS, o que permitiu identificar 50 compostos, distribuídos por várias classes químicas, 23 dos quais foram descritos pela primeira vez. As diferentes técnicas permitiram a extracção de compostos distintos, sendo a HS-SPME aquela com que se obteve o perfil mais completo e com que se determinou maior teor de compostos. Dentro deste processo os melhores resultados foram obtidos utilizando a fibra revestida com divinilbenzeno/polidimetilsiloxano (DVB/PDMS). Considerando que a espécie é vulgarmente mascada, o seu extracto aquoso também foi analisado, tendo sido caracterizados apenas sete compostos, sendo o eugenol o composto principal. A composição em ácidos orgânicos deste extracto foi determinada por HPLC/UV e os ácidos oxálico, aconítico, cítrico, pirúvico, málico, chiquímico, acético e fumárico foram descritos pela primeira vez. O extracto aquoso também revelou capacidade para inibir a acetilcolinesterase de modo dependente da concentração. Piper betle L., popularly known as “Paan”, is a species widely growing in South East Asia, where its leaves are economically and medicinally important. In order to screen the highest possible number of volatile and semi-volatile components, the leaves were subjected to headspace solid-phase microextraction (HS-SPME), hydrodistillation and Soxhlet extraction, prior to their analysis by GC/MS, which allowed the identification of 50 compounds, distributed by several chemical classes, 23 of them described for the first time. The different techniques lead to distinct compounds' extraction, with HS-SPME extracting highest amounts and providing the most complete profile. Within this procedure, best results were obtaine using Divinylbenzene/Polydimethylsiloxane (DVB/PDMS) fibre. Considering the use of the species as masticator, an aqueous extract was also analysed, in which only seven compounds were characterize, being eugenol the main one. The organic acids composition of this extract was determine by HPLC/UV and oxalic, aconitic, citric, pyruvic, malic, shikimic, acetic and fumaric acids are reported for the first time in this species. The aqueous extract also displayed AChE inhibitory capacity, in a concentration-dependent way.

Mestrado em Toxicologia Analítica Clínica e Forense MSc in Analytical, Clinical and Forensic Toxicology

Mestrado em Toxicologia Analítica Clínica e Forense MSc in Analytical, Clinical and Forensic Toxicology

Mestrado em Toxicologia Analítica Clínica e Forense MSc in Analytical, Clinical and Forensic Toxicology

Mestrado em Controlo de Qualidade MSc in Quality Control O principal objectivo do trabalho apresentado na presente dissertação foi a implementação de um sistema “lab-on-valve” (LOV) associado ao conceito de “bead injection” aplicado à extracção em fase sólida de compostos fenólicos presentes em amostras alimentares, seguida pela quantificação através do método de Folin-Ciocalteu. Foi desenvolvido um ciclo analítico automático contendo as principais etapas do processo de extracção em fase sólida, incluindo neste caso também a formação da coluna de adsorvente OASISTM HLB num dos canais do dispositivo LOV. Foi efectuada a avaliação da retenção dos compostos na coluna utilizando o ácido gálhico como composto modelo. Neste caso foi avaliada a influência da composição da matriz da amostra e da solução transportadora usada na remoção da matriz. Também foi avaliada a eficiência da eluição recorrendo a distintos eluentes. A utilização de padrões acidificados com HCl 10 mM, o uso de água com transportador e a utilização da solução eluente composta por metanol 50% (v/v) + hidróxido de sódio 10 mM foram as condições escolhidas para posterior aplicação à amostras. O procedimento automático desenvolvido foi aplicado a outros compostos fenólicos (ácido cafeico, galhato de octilo, quercetina e ácido tânico), a um composto não-fenólico (ácido ascórbico), reactivo e quantificável pelo método de Folin-Ciocalteu, e a amostras de vinho tinto e sumo de laranja. Os resultados obtidos para os compostos testados evidenciaram a retenção selectiva dos compostos fenólicos e a não-retenção do ácido ascórbico, tendo sido possível estimar a contribuição dos compostos fenólicos na capacidade redutora das amostras através do método de Folin-Ciocalteu. The main objective of the work presented in this dissertation was the development of a lab-on valve (LOV) system associating the bead injection concept for application to solid phase extraction of phenolic compounds in food samples, followed by their quantification using the Folin-Ciocalteu method. An analytical cycle comprising the main steps present on solid phase extraction protocols was implemented, including also the on-line formation of OASISTM HLB sorbent column inside one of the channels of LOV device. The retention of phenolic compounds on this sorbent was evaluated using gallic acid as model analyte under different sample matrix and carrier solution compositions. Elution efficiency was also assessed for different eluents. Application to samples was attained using standard solutions prepared in HCl 10 mM, water as carrier and methanol 50% (v/v) + sodium hydroxide 10 mM as eluent. The automatic protocol was applied to several phenolic compounds (caffeic acid, octylgallate, quercetin and tannic acid), to a non-phenolic compound (ascorbic acid), which reacts with and can be quantified by Folin-Ciocalteu method, and also to red wine and orange juice samples. Results obtained showed that phenolic compounds were retained selectively and ascorbic acid was not retained, which allowed the estimation of phenolics contribution to the Folin-Ciocalteu reducing index for antioxidant assessment.

Mestrado em Toxicologia Analítica Clínica e Forense MSc in Analytical, Clinical and Forensic Toxicology

Mestrado em Controlo de Qualidade MSc in Quality Control

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Mestrado em Toxicologia Analítica Clínica e Forense MSc in Analytical, Clinical and Forensic Toxicology

Mestrado em Controlo de Qualidade MSc in Quality Control

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Mestrado em Controlo de Qualidade MSc in Quality Control A 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA; ecstasy ), tal como outras anfetaminas, tem sido considerada por muitos como sendo uma droga segura . No entanto estão descritas na literatura muitas respostas de toxicidade, reacções adversas e mortes relacionadas com a sua ingestão recreativa. Um dos seus efeitos adversos, potencialmente fatal, é a hiponatrémia. Este efeito foi relacionado com alterações na secreção da hormona antidiurética (ADH, AVP ou arginina-vasopressina) desencadeadas pela MDMA. A hiponatrémia foi apontada como causa possível para numerosas intoxicações severas e por vezes fatais decorrentes da ingestão desta droga. Estudos recentes in vivo, em humanos saudáveis do sexo masculino, e in vitro, em hipotálamo isolado de rato, demonstraram que a bioactivação metabólica da MDMA, nomeadamente a desmetilenação seguida pela O-metilação do catecol resultante, é crucial para a libertação da AVP quer in vivo quer in vitro. Para a avaliação da contribuição desta via metabólica para a expressão in vivo do efeito de hiponatrémia causado pela ingestão da MDMA, é crucial quantificar estes metabolitos e relacionar o perfil metabólico com a magnitude do efeito hiponatrémico. Com este objectivo, foi desenvolvido e validado um método de GC-MS/MS para a quantificação da MDMA e dos seus principais metabolitos, metilenodioxianfetamina (MDA), 4-hidroxi-3-metoxianfetamina (HMA) e 4-hidroxi-3-metoximetanfetamina (HMMA), no plasma e na urina. Para melhor compreender a influência da MDMA e da sua bioactivação na secreção da AVP foram realizados estudos in vivo em ratos Wistar machos e fêmeas, aos quais foi administrada MDMA na dose 20 mg/kg. Nos estudos realizados 1 hora após a administração de MDMA foram avaliados os níveis plasmáticos de AVP e as concentrações plasmáticas da MDMA e dos metabolitos MDA, HMA e HMMA. Com estas quantificações foi possível observar, nos ratos de ambos os géneros, o aumento estatisticamente significativo dos níveis de AVP em relação aos animais controlo, ao mesmo tempo que não se detectaram correlações estatisticamente significativas entre os níveis de AVP a MDMA e os metabolitos MDA, HMA e HMMA. Nos estudos realizados 24 horas após a administração de MDMA foram avaliados os níveis plasmáticos e urinários de AVP e as concentrações urinárias de MDMA, MDA, HMA e HMMA. Os resultados destas determinações demonstraram que apesar de não se detectarem diferenças significativas nas concentrações plasmáticas de AVP entre os animais tratados e os animais controlo, existem diferenças estatisticamente significativas para as concentrações urinárias de AVP, verificando-se que os animais tratados com MDMA apresentam concentrações urinárias de AVP superiores. Além disso verificou-se também que os animais tratados excretaram menos urina relativamente à água ingerida, mostrando o efeito anti-diurético desencadeado pela AVP. Neste estudo foram também estabelecidas correlações positivas e estatisticamente significativas entre os níveis de AVP e as concentrações de MDMA, MDA, HMA e HMMA. A correlação com maior significado estatístico foi estabelecida com o metabolito HMMA. Estes resultados permitiram pela primeira vez demonstrar a secreção da AVP em ratos após a administração da MDMA. Com estes estudos foi possível observar, in vivo, não só as alterações da secreção da AVP induzidas pela MDMA mas também as consequências dessas alterações nomeadamente na resposta antidiurética e o envolvimento desta resposta no efeito de hiponatrémia. Finalmente foi possível observar a contribuição da bioactivação metabólica para a secreção de AVP. Estes resultados permitem assim compreender melhor o envolvimento da MDMA e do seu metabolismo na resposta hiponatrémica. Although considered as safe drugs by many, exaggerated responses and deaths have been reported due to 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) abuse. One of the adverse effects associated with ecstasy intoxications is hyponatremia that has been related with a disruption on the release of the antidiuretic hormone (ADH or arginine-vasopressin) and pointed out as the possible cause of numerous severe and fatal intoxications after intake of this drug. Recent in vivo studies with human healthy volunteers and also in vitro studies performed with rat isolated hypothalamus have shown that the metabolic bioactivation of MDMA, namely its demethylenation followed by O-methylation of the resulting cathecol metabolite are crucial for the release of ADH both in vivo and in vitro. For the evaluation of the contribution of this metabolic pathway to the in vivo expression of the hyponatremic effect of MDMA it is crucial to quantify these metabolites, and to relate the metabolic profile with the magnitude of the hyponatremic effect. For this purpose, a GC-MS/MS method was developed to quantify MDMA and its main metabolites: methylenedioxyamphetamine (MDA), 4-hydroxy-3- methoxyamphetamine (HMA) and 4-hydroxy-3-methoxymethamphetamine (HMMA), in plasma and urine. To better understand the influence of MDMA and its metabolic bioactivation in the secretion of AVP in vivo studies were performed with male and female Wistar rats, the MDMA dose tested was 20 mg/kg. In the studies preformed 1 hour after the MDMA administration the plasmatic levels of AVP and the plasmatic concentrations of MDMA, MDA, HMA and HMMA were evaluated. The plasmatic concentrations of AVP obtained with the treated animals were compared with the concentrations obtained with the controls showing a statistically significant increase of AVP levels in the animals treated with MDMA. Correlations between the MDMA, MDA, HMA and HMMA and the AVP plasmatic levels were also preformed. No significant correletions were obtained. In the studies preformed 24 hours after the administration of MDMA the urinary and plasmatic levels of AVP were evaluated. The concentration of MDMA, MDA, HMA and HMMA were determined in plasma and urine. It was also established the ratio between the volume of ingested water and the volume of excreted urine. The plasmatic and urinary AVP concentrations obtained in the treated animals were compared with the concentrations obtained from the controls. This compairison showed significant increases of the urinary AVP levels in the treated animals. The evaluation of the correlations between the urinary concentrations of AVP and the urinary concentrations of MDMA, MDA, HMA and HMMA showed significant correlations between AVP and MDMA, MDA, HMA and HMMA. The evaluation of the ratio between the volume of ingested water and the volume of excreted urine showed that the treated animals excreted less urine in comparison with the ingested water. The studies performed with urines collected 24 hours after MDMA administration have shown significant positive correlations between AVP and the concentrations of MDMA, MDA, HMA and HMMA. The strongest correlation was established between the concentrations of HMMA and AVP. With this study it was possible to confirm the in vivo changes in the AVP secretion profile and relate those changes with the levels of MDMA, MDA, HMA and HMMA. It was also shown for the first time the induction of the secretion of AVP in male and female rats, one hour after the administration of MDMA. The consequent antidiuretic effect can be related with the hiponatremic effect.

Mestrado em Química Analítica Ambiental MSc in Environmental Analytical Chemistry

Mestrado em Controlo de Qualidade MSc in Quality Control O género Juglans compreende cerca de vinte espécies, sendo a espécie Juglans regia L. a de maior importância económica, principalmente pela qualidade dos seus frutos (nozes). A produção das nogueiras é tardia (vários anos após plantação), pelo que a sua identificação e caracterização é de extrema importância, tanto para produtores como em programas de melhoramento de culturas. Assim, é imprescindível o desenvolvimento de métodos rápidos, fiáveis e sensíveis que respondam a esta necessidade. Os marcadores moleculares de ADN têm-se revelado determinantes na caracterização e identificação destas plantas. Têm sido aplicadas diversas técnicas moleculares (isoenzimas, RFLP, RAPD e marcadores ISSR) para avaliação da diversidade e relacionamento genético entre as cultivares de Juglans regia L.. Todavia, os marcadores moleculares SSR, dada a sua elevada precisão e reprodutibilidade, são os escolhidos para a identificação de cultivares, verificação de paternidades e genealogia, origem e relacionamento de germoplasmas. Esta técnica aplica-se também em estudos de autenticidade alimentar. O presente trabalho teve como objectivo principal a caracterização genética de três variedades portuguesas de Juglans regia L. com marcadores moleculares SSR e avaliação do seu relacionamento genético com dezanove cultivares da mesma espécie, originárias de diversos países. Outro objectivo foi a avaliação da autenticidade das cultivares de nozes colhidas em Soure, de nozes comerciais (rotuladas com referência à variedade) e de produtos derivados, através dos mesmos marcadores SSR. Para tal foram testados três métodos extractivos: CTAB, GenElute e Wizard. Os marcadores SSR utilizados neste estudo revelaram ser eficazes na distinção de todas as cultivares estudadas e evidenciaram um caso de sinonímia entre a cultivar Franquette e a cultivar Ronde de Montignac. Através da análise dos dendrogramas obtidos, foi possível associar a cultivar portuguesa Rego com o grupo das cultivares de origem francesa e a cultivar portuguesa Samil com o grupo de cultivares norte-americanas. A terceira cultivar portuguesa em estudo, Arco, revelou-se geneticamente distinta dos restantes genótipos. Relativamente às cultivares internacionais tornou-se evidente a sua distinção em três grupos principais (dendrograma rectangular): o das cultivares norte-americanas, o das cultivares francesas e um outro em que se enquadram duas cultivares francesas, Fernette e Lara, duas norteamericanas, Chico e Chandler e uma portuguesa Samil. Os dendrogramas obtidos evidenciaram também a presença de quatro cultivares claramente distintas da restante população (Arco, Meylannaise, Hartley e Parisienne). Quanto ao estudo de autenticidade realizado, verificou-se uma clara diferença em termos de capacidade extractiva entre os 3 métodos testados. Após escolha do melhor método extractivo, as amostras foram amplificadas com 3 primers pré-seleccionados. Verificou-se que as amostras de nozes comerciais e as recolhidas em Soure originaram produtos de amplificação, enquanto que o mesmo não aconteceu com as amostras correspondentes a produtos derivados, sujeitos a um processamento mais intenso. Foi possível confirmar, por meios moleculares, a informação relativa à variedade de noz indicada no rótulo das embalagens comerciais para a maioria das amostras. The genus Juglans contains about twenty species, all producing edible nuts. Among those, the English or Persian walnut, Juglans regia L., is the most widely cultivated species and the most economically important member of the genus Juglans. The fact that fruit production in walnut starts several years after its planting, makes its identification and characterization important for designing objective and repeatable criteria to breeders and farmers in crop improvement programs. Therefore, the development of rapid, reliable and sensitive methods for the identification and verification of cultivars is essential. Several techniques using molecular markers have been used to examine genetic diversity and relationships among cultivars of Juglans regia L., including isozymes, RFLP, RAPD and ISSR markers. However, the need for accurate cultivar identification and verification of paternity and genealogy, led to the application of SSR or microsatellite markers that are well suited to meet these needs. Microsatellite DNA analysis is generally considered the most powerful method for a number of reasons, including maximum precision and reproducibility. Beside those facts, such techniques are useful for understanding the origins and relationships of germplasms and for providing genetic fingerprints that can be used to test or confirm the identity of plant materials and for food authenticity studies. The present study was undertaken to analyze the effectiveness of microsatellite markers in molecular characterization of three Portuguese cultivars of Juglans regia L. and to assess the genetic relationship between those cultivars and nineteen international ones. Also, this study was designed to check walnuts harvested at Soure, commercial walnuts (labelled with reference to the variety) as well as they by-products authenticity, with SSR molecular markers applied in the genetic characterization. For that purpose, three DNA extraction methods were assayed: CTAB, GenElute and Wizard. SSR markers used in this study had disclosed to be efficient in the distinction between the cultivars studied, and showed up a synonymy case, between cultivars Franquette and Ronde de Montignac. Throughout the analysis of the obtained dendrogram, it was possible to associate the Portuguese cultivar Rego with the group of French origin and Samil with the North-American ones. The other Portuguese cultivar, Arco, showed up to be genetically distinct from the overall genotypes. Concerning the international cultivars, its distinction in three main groups became evident (rectangular dendrogram). The group of North-American origin, the group of French origin and the third one that includes two cultivars of French origin, Fernette and Lara, two cultivars of North-American origin, Chico and Chandler and one of Portuguese origin, Samil. The obtained dendrogram show the presence of four cultivars clearly distinct from the overall population (Arco, Meylannaise, Hartley and Parisienne). In what it concerns to the authenticity study, there was a clear difference between the 3 chosen extraction methods. After the choice of the best extraction method, the samples were amplified with 3 primers previously selected. The results showed that the commercial walnuts as well as the walnuts harvested at Soure amplified, but the same fact wasn t noted with walnut processed by-products. It was possible to check, through molecular techniques, the information described in the labels of commercially walnuts (in what concerns the variety type) for most of the samples.

Mestrado em Controlo de Qualidade MSc in Quality Control O trabalho experimental realizado nesta dissertação divide-se em duas partes. Na primeira, avaliou-se a influência da temperatura e do tempo de armazenamento na composição em aminas biogénicas da gema de ovo, na segunda estudou-se a influência da gema de ovo na fracção volátil e nas características sensoriais de creme de pasteleiro. A metodologia de RP-HPLC/UV, com derivatização por dabsilo, optimizada para a quantificação de aminas biogénicas na gema de ovo, revelou-se adequada para o doseamento de putrescina, cadaverina, histamina, etilamina, propilamina, etanolamina, tiramina, triptamina, espermina, espermidina, feniletilamina. Foi possível estudar o efeito da temperatura e do tempo de armazenamento no teor de aminas biogénicas da gema, ao longo do prazo de validade do ovo. Nas gemas de ovo só foram detectadas cinco das onze aminas biogénicas em estudo: putrescina, cadaverina, propilamina, etilamina e etanolamina. O tempo de armazenamento ao longo do prazo de validade tem efeito significativo no teor das cinco aminas (p0.01. A diminuição significativa do teor de aminas biogénicas ao longo do prazo de validade justificou a aplicação de uma regressão linear múltipla em stepwise para estimar o tempo de armazenamento. Um método de microextracção em fase sólida no headspace acoplado a GC/MS foi optimizado para caracterizar a fracção volátil dos cremes de pasteleiro. O perfil de voláteis de cremes de pasteleiro contendo gemas de ovo foi comparado com o perfil de voláteis de creme de pasteleiro com substituto e com a fracção volátil de cremes de pasteleiro comerciais recolhidos de bolas de Berlim. Um total de 92 compostos voláteis foi identificado no presente estudo. As famílias de compostos voláteis detectados incluíram hidrocarbonetos alifáticos e alicíclicos (26), aldeídos (10), cetonas (10), hidrocarbonetos aromáticos (20), furanos (6), álcoois (12), ésteres (3) e ácidos (5). A análise discriminante dos resultados dos voláteis foi aplicada para prever a origem do creme de pasteleiro. A função obtida permitiu classificar correctamente todas as amostras de acordo com o tipo e origem do creme de pasteleiro. Adicionalmente, efectuou-se a análise descritiva para avaliar o perfil sensorial dos diferentes tipos de creme de pasteleiro. Obtiveram-se diferentes perfis sensoriais para os cremes de pasteleiro de diferentes origens. The experimental work of this thesis is divided in two parts. The first, evaluates the influence of temperature and storage time in the composition of biogenic amines in egg yolk, the second studied the influence of egg yolk in the volatile fraction and sensory characteristics of bakery creams. The RP-HPLC/UV method, using dabsil derivatization, optimized for the determination of biogenic amines in egg yolk, was appropriate quantification putrescine, cadaverine, histamine, etilamine, propilamine, etanolamine, tiramine, triptamine, espermine, espermidine, feniletilamine. The effect of temperature and time of storage in the levels of biogenic amines during egg shelf-life was evaluated. Only five of the eleven biogenic amines under study were detected: putrescine, cadaverine, propilamine, etilamine e etanolamine. Storage time during shelf-life presented a significant effect on the levels of the five amines (p0.01. The significant reduction of biogenic amines during the shelf-life justified the application of a multiple linear regression using stepwise method to estimate the storage time. A headspace solid phase microextraction method coupled to GC/MS was optimized to caracterize the volatile fraction of bakery creams. Volatile profiles of egg bakery creams were compared with the volatile profiles of a bakery cream substitute and with the volatile fraction of commercially available bakery creams collected from bolas de Berlim . A total of 92 volatile compounds were identified in the present study. The groups of detected volatiles were aliphatic and alicyclic hydrocarbons (26), aldehydes (10), ketones (10), aromatic hydrocarbons (20), furans (6), alcohols (12), esters (3) and acids (5). Discriminante analysis of the volatile data was also applied to predict bakery cream origin. The function obtained was able to correctly classify all the samples according to type and origin of bakery cream. Additionally, the sensory descriptive profile of the different types of bakery creams was elaborated. Different sensory descriptive profiles were obtained for bakery creams of different origin.