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Introduction La vaccination est un outil majeur de prevention des maladies infectieuses, mais les mecanismes d’induction des reponses immunitaires par les vaccins restent encore mal compris. Grâce aux nouvelles technologies a haut-debit, la recherche des mecanismes et variabilites interindividuelles des reponses induites par la vaccination s’avere de plus en plus fine. Cependant, les donnees de grande dimension generees, les « omiques », soulevent des defis methodologiques (grand nombre de variables correlees mesurees dans des etudes translationnelles et essais precoces a faible effectif). Actuellement, la metabolomique occupe une place emergente dans la recherche vaccinologique translationnelle. Notre etude visait a utiliser le vaccin contre la fievre-jaune YF-17D dont l’immunogenicite et l’efficacite clinique ont ete maintes fois demontrees, comme modele experimental exploratoire pour etudier l’effet vaccinal sur la dynamique globale des marqueurs metabolomiques et de leurs voies metaboliques au cours du temps. Methodes L’etude a ete menee sur des donnees de 16 volontaires sains adultes recrutes entre 2016 et 2017 dans un centre de medecine des voyages allemand (Bernhard Nocht Institute, Hambourg). Des prelevements sanguins multiples, non a jeun, ont ete realisees avant (J0) et apres (J1, J3 et J28) vaccination. Les 328 marqueurs metabolomiques cibles (amines, lipides positifs et lipides de signalisation) ont ete mesures via une technique de separation-detection des molecules (UHPLC-MS). Les voies metaboliques des marqueurs ont ete definies avec la base de donnees KEGG. Les dynamiques post-vaccinales des marqueurs ont ete analysees avec une methode developpee pour l’analyse de donnees transcriptomiques longitudinales. Elle est basee sur un modele lineaire mixte et comprend un test du score en composante de variance ne necessitant pas d’hypothese distributionnelle des donnees (package Bioconductor ‘dearseq’). Elle permet de detecter simultanement une evolution moyenne (effet fixe) des marqueurs au cours du temps mais aussi au niveau de l’heterogeneite interindividuelle (effet aleatoire). Des modeles par marqueur puis par groupes de marqueurs (voie metabolique), ont ete utilises sur l’ensemble des trois temps de mesure J0, J1 et J3. Un ajustement de la multiplicite des tests a ete realise via la procedure Benjamini-Hochberg (controlant le FDR a 5 %). Une analyse bootstrap a ete realisee pour evaluer la robustesse des resultats. Resultats Les niveaux de six marqueurs metabolomiques lipidiques (quatre triglycerides et deux glycerophospholipides) evoluaient significativement apres vaccination (FDR Conclusion Le vaccin contre la fievre jaune reste un modele experimental performant pour etudier la reponse vaccinale et de nouveaux marqueurs a l’echelle du metabolome. La methode de modelisation utilisee, developpee initialement pour des donnees transcriptomiques, etait adaptee pour cette analyse metabolomique longitudinale. Le modele a pu detecter des variations significatives de certains metabolites post-vaccination malgre l’existence d’un ratio signal/bruit eleve.

Introduction Meme en periode d’urgence epidemique, les essais cliniques randomises restent la meilleure approche pour evaluer l’efficacite d’une intervention. Cependant differents defis methodologiques se posent : pouvoir : – integrer differentes strategies therapeutiques repositionnees ou innovantes adaptees aux connaissances emergentes lors de la conception et a differents stades de l’essai ; – ecarter rapidement celles qui ne se revelent pas prometteuses. Debut 2021, aucun traitement n’est valide dans le traitement precoce de la COVID-19. Pourtant un tel traitement permettrait d’eviter les hospitalisations ou le deces. L’objectif de COVERAGE est d’evaluer la securite et l’efficacite de differents traitements ambulatoires pour diminuer le risque d’aggravation chez des patients fragiles avec facteurs de risque de gravite. Depuis sa mise en place de multiples adaptations ont pu etre effectuees grâce au choix d’un schema flexible. Methodes COVERAGE est un essai multicentrique francais de phase 3, de superiorite, controle randomise, ouvert a plusieurs bras paralleles ( NCT04356495 ). Les patients – âge ≥ 60 ans ou ≥ 50 ans avec des comorbidites (ex : obesite) – presentant une COVID-19 sans critere d’hospitalisation sont randomises (ratio 1) entre differentes strategies experimentales ou une strategie controle. La randomisation est stratifiee sur le centre et d’autres facteurs de stratification peuvent etre definis au cours du temps. Chaque strategie therapeutique peut etre introduite dans tous ou certains centres a une periode calendaire differente dans deux phases successives : d’abord une phase pilote (n = 36) fondee sur un schema de Fleming en une etape destinee a evaluer la tolerance et l’acceptabilite en traitement ambulatoire et a explorer les premiers parametres d’evolution clinique ; puis, une phase d’efficacite (n = 169) comparative utilisant un schema adaptatif multi-bras multi-etape (MAMS) ou chaque bras experimental est compare separement aux participants du bras temoin unique inclus dans la meme periode calendaire pour eviter des biais de selection et de confusion. Trois analyses intermediaires (futilite ± efficacite precoce) et une analyse finale seront effectuees pour le critere principal d’efficacite a j14, apres l’inclusion de 30, 60, et 102 participants en phase d’efficacite. Chaque bras a un minimum de 36 participants (si arret apres la phase pilote) et un maximum de 36 + 169 participants (si arret en fin de la phase d’efficacite). Le nombre total de patients inclus dans l’essai dependra du nombre de bras, des decisions de passage de la phase pilote a la phase d’efficacite pour chaque strategie, et de la duree de l’epidemie. Resultats Depuis mars 2020, plusieurs amendements au protocole ont permis de supprimer ou ajouter des bras, adapter les criteres d’eligibilite et de stratification, effectuer une ouverture multicentrique progressive dans le cadre d’une extension nationale. En novembre 2020, COVERAGE s’est transforme en plateforme nationale dans le cadre de la strategie REACTing pour optimiser les efforts de recherche francais et a obtenu le label priorite nationale de recherche par le CAPNET. Fin janvier 2021, 112 participants etaient inclus et le recrutement continue. Conclusion L’essai COVERAGE a ete construit pour s’adapter aux contraintes de la recherche clinique en periode d’urgence epidemique. Le schema adaptatif permettra d’evaluer la tolerance, la faisabilite ambulatoire et l’efficacite de differentes strategies therapeutiques precoces contre la COVID-19.

Introduction Dans le developpement clinique vaccinal, l’evaluation de la capacite du vaccin candidat a generer des reponses immunitaires est un objectif important. La mesure de l’immunogenicite cellulaire s’effectue en cytometrie de flux multiparametrique permettant la caracterisation de lymphocytes T produisant des cytokines apres stimulation antigenique specifique. L’approche statistique actuellement utilisee pour l’analyse de ces donnees consiste a effectuer une comparaison inter-bras ou intra-bras des pourcentages de cellules produisant une ou des cytokine(s) d’interet, apres soustraction de la reponse observee dans des cellules non-stimulees (NS) de chaque echantillon. Soustraire cette reponse NS vise a analyser la reponse specifique a l’antigene, mais souleve des questions methodologiques liees a l’erreur de mesure, a des biais potentiels et a la puissance statistique. Un modele bivarie modelisant simultanement la reponse NS et la reponse induite par la stimulation specifique (S) permet une evaluation plus valide de l’effet du vaccin dans les essais cliniques vaccinaux. Methodes Nous avons construit un modele lineaire bivarie modelisant simultanement un vecteur de reponse avec deux variables dependantes (reponses NS et S) et l’effet du vaccin comme principale variable explicative. Les performances du modele ont ete evaluees au travers de simulations numeriques avec differents scenarii en termes de biais et de controle des erreurs de type 1 et 2, en comparaison des approches conventionnelles. Nous avons applique ce modele sur les donnees de deux essais vaccinaux contre le VIH (ANRS VRI01 et VRI02 ANRS 149 LIGHT). Les simulations ont ete effectuees sous SAS ; l’implementation du modele sous SAS (proc mixed) et R (package nlme). Resultats Cette nouvelle methode permet de modeliser une relation lineaire entre la reponse NS et les reponses antigeniques, tout en tenant compte de la correlation dans leur erreur de mesure. Le modele garantit un controle de l’erreur de type 1 en toute circonstances et une puissance statistique toujours au moins aussi bonne que l’approche conventionnelle dans tous les scenarii ( Fig. 1 ). Le modele a aussi ete applique sur les essais ANRS VRI01 et VRI02 ANRS 149 LIGHT. Conclusion Cette nouvelle methode permet de prendre en compte toutes les informations disponibles contrairement aux approches conventionnelles, conduisant a des resultats plus robustes et une absence de biais dans l’evaluation de l’immunogenicite vaccinale.

Summary Background Standard first-line antiretroviral therapy for HIV-1 infection includes two nucleoside or nucleotide reverse transcriptase inhibitors (NtRTIs), but these drugs have limitations. We assessed the 96 week efficacy and safety of an NtRTI-sparing regimen. Methods Between August, 2010, and September, 2011, we enrolled treatment-naive adults into this randomised, open-label, non-inferiority trial in treatment-naive adults in 15 European countries. The composite primary outcome was change to randomised treatment before week 32 because of insufficient virological response, no virological response by week 32, HIV-1 RNA concentration 50 copies per mL or higher at any time after week 32; death from any cause; any new or recurrent AIDS event; or any serious non-AIDS event. Patients were randomised in a 1:1 ratio to receive oral treatment with 400 mg raltegravir twice daily plus 800 mg darunavir and 100 mg ritonavir once daily (NtRTI-sparing regimen) or tenofovir–emtricitabine in a 245 mg and 200 mg fixed-dose combination once daily, plus 800 mg darunavir and 100 mg ritonavir once daily (standard regimen). This trial was registered with ClinicalTrials.gov, number NCT01066962. Findings Of 805 patients enrolled, 401 received the NtRTI-sparing regimen and 404 the standard regimen, with median follow-up of 123 weeks (IQR 112–133). Treatment failure was seen in 77 (19%) in the NtRTI-sparing group and 61 (15%) in the standard group. Kaplan-Meier estimated proportions of treatment failure by week 96 were 17·8% and 13·8%, respectively (difference 4·0%, 95% CI −0·8 to 8·8). The frequency of serious or treatment-modifying adverse events were similar (10·2 vs 8·3 per 100 person-years and 3·9 vs 4·2 per 100 person-years, respectively). Interpretation Our NtRTI-sparing regimen was non-inferior to standard treatment and represents a treatment option for patients with CD4 cell counts higher than 200 cells per μL. Funding European Union Sixth Framework Programme, Inserm-ANRS, Gilead Sciences, Janssen Pharmaceuticals, Merck Laboratories.

Introduction Dans le cadre d’un essai clinique vaccinal international de phase II en communaute, les donnees biologiques constituent un element important de l’evaluation a court terme de la tolerance. Un systeme de gestion en temps reel des donnees biologiques a ete mis en place afin de prendre en compte les specificites des sites investigateurs et de permettre une centralisation des donnees. Methodes PREVAC est un essai clinique de phase II, multicentrique, randomise, en double insu, visant a evaluer la tolerance et l’immunogenicite de trois strategies vaccinales anti-Ebola contre placebo. Entre mars 2017 et novembre 2018, 4720 participants ont ete inclus sur six sites en Guinee, au Liberia, au Mali et en Sierra Leone. Afin d’evaluer la tolerance a court terme du vaccin, des prelevements sanguins sont effectues a l’inclusion et en post-vaccination. Les analyses sont realisees le jour meme au sein des laboratoires des sites. Les resultats bruts sont envoyes au centre de traitement des donnees de la plate-forme Euclid/F-CRIN qui gere la base de donnees centralisee de l’essai. Les controles de coherence, l’ajout des valeurs de reference par pays et le calcul des grades de severite (DAIDS, v2.0, 2014) ont ete effectues avec le logiciel SAS 9.4. Les resultats sont integres dans la base de donnees centralisee et retranscrits dans des rapports edites en francais et en anglais mis a disposition des sites (medecins et participants) dans les 24 h ouvrees suivant les prelevements. Deux statisticiens et deux data managers sont impliques pour assurer la continuite de l’actualisation de la base de donnees. Resultats Entre mars 2017 et novembre 2018, les resultats de 8640 prelevements effectues chez 4713 participants ont ete centralises. Les resultats biologiques ont ete rendus disponibles dans les 24 h ouvrees dans 86 % des cas. Pour les resultats traites dans un delai de plus de 24 h, le delai median de rendu etait de 2 jours. Des extractions des grades de severite et des aggravations biologiques ont ete envoyees toutes les semaines aux equipes de monitorage. Conclusion Cette approche, fondee sur l’harmonisation du recueil et la centralisation des valeurs biologiques en temps reel, a permis un suivi de la tolerance biologique des vaccins administres en traitant les resultats sur des delais tres courts permettant l’edition de rapports de resultats personnalises et accessibles tout en prenant en compte les specificites (langage, valeurs normales) des populations concernees ( Fig. 1 ).

Introduction La randomisation d’un essai clinique en double insu doit etre operationnalisee en tenant compte des contraintes logistiques pour maintenir l’impossibilite de discerner l’allocation pour le prochain participant. Dans un essai vaccinal contre Ebola en Guinee, Liberia et Sierra Leone, l’acces permanent aux solutions techniques traditionnelles pour centraliser le processus d’allocation (Internet, repondeur vocal) ne peut etre garanti. Deux procedures de randomisation ont ete considerees, et l’impact sur une sous-etude a ete evalue. Methodes PREVAC est un essai de phase II, multicentrique, randomise, en double-insu, evaluant trois strategies vaccinales versus placebo (cinq bras) selon un ratio 2:1:2:1:1. Quatre sites doivent inclure 4900 participants. La randomisation est stratifiee sur le site. Avant le debut de l’essai, des rouleaux d’etiquettes de codes-barres detachables avec les n° d’identification des seringues (SID) correspondant aux bras sont prepares pour chaque site. Dans les deux procedures, la randomisation a lieu au moment de la vaccination du participant quand le SID est associe a l’identifiant du participant (PID) sur le cahier d’observation. Les vaccins sont reconstitues sur site le jour de la vaccination par un pharmacien sans insu et doivent etre utilisee dans l’heure qui suit. Une premiere methode, similaire a une methode utilisee dans un precedent essai vaccinal contre Ebola au Liberia (PREVAIL I), implique la preparation quotidienne de plusieurs sacs contenant chacun sept seringues etiquetees avec les SID. Cinq rouleaux d’etiquettes de SID, un pour chaque bras, permettent aux pharmaciens de preparer sept seringues qui sont placees dans un sac opaque et tirees au sort lors de la vaccination. Une seconde methode implique l’utilisation d’une application disponible sur un ordinateur en local qui permet aux pharmaciens d’identifier le bras alloue a chaque participant. Avec cette approche, un rouleau unique d’etiquettes de SID est prepare et lorsque qu’un participant se presente pour la vaccination, le pharmacien detache l’etiquette de SID, scanne le code-barres et l’application (independante d’Internet) indique le vaccin a preparer. La sous-etude doit inclure 196 participants sur un site. Sans stratification de la randomisation sur la participation a la sous-etude qui permettait d’assurer un ratio des bras identique entre l’etude principale et la sous-etude, nous avons procede a des simulations afin d’estimer les risques de desequilibres entre les bras pour les deux procedures en testant plusieurs hypotheses (consentement et prevalence du VIH). Resultats Les deux procedures de randomisation satisfont l’impossibilite de discerner a l’avance l’allocation et le maintien ensuite de l’insu. La premiere methode permet une preparation anticipee des seringues et facilite le flux des participants mais comporte un risque de desequilibre si un sac n’est pas completement utilise. La seconde methode permet une flexibilite du nombre de participants a inclure chaque jour et respecte le delai de sterilite des vaccins, mais peut ralentir le flux des participants. La seconde methode a ete adoptee dans l’essai PREVAC. Dans la sous-etude, les simulations montrent un risque de desequilibre quasiment nul pour les deux procedures. Conclusions Cet exemple montre les procedures operatoires a mettre en œuvre pour respecter la randomisation dans un essai de taille importante et leur complexite en presence de contraintes d’utilisation des produits experimentaux et d’etudes ancillaires.

Introduction Les epidemies de maladie a virus Ebola (MVE) surviennent de maniere recurrente et imprevisible depuis plusieurs dizaines d’annees, et la derniere epidemie (2013–2015) a ete d’une ampleur exceptionnelle. Dans ce contexte et en l’absence de therapeutiques specifiques, le developpement de vaccins preventifs a ete accelere. Actuellement, en l’absence de correlat de protection identifie, l’evaluation de l’efficacite des candidats vaccins contre la MVE repose principalement sur la mesure de la reponse anticorps apres vaccination. Cependant, les facteurs influencant cette reponse restent encore peu connus. L’objectif etait de determiner si la reponse anticorps apres vaccination contre la MVE pouvait etre influencee par d’autres facteurs que le type de vaccin, notamment par les caracteristiques des methodes de mesure ou de la population vaccinee. Methodes Nous avons realise une revue systematique de la litterature pour selectionner tous les essais vaccinaux contre la MVE menes chez l’humain ou chez le primate non humain (PNH). Pour chaque groupe de vaccination retrouve dans les etudes selectionnees, nous avons extrait des donnees sur la reponse anticorps et sur les facteurs susceptibles de la faire varier. L’unite statistique etait le groupe de vaccination. Une analyse descriptive a ete menee sur l’ensemble des groupes. Les groupes humains d’au moins huit individus ont ensuite ete inclus dans une analyse d’heterogeneite utilisant un modele de meta-regression lineaire multivariable a intercept aleatoire. L’heterogeneite a ete evaluee graphiquement par un diagramme en foret et quantifiee par un test Q, par la proportion de variation totale due a l’heterogeneite (I2) et par la variabilite expliquee par les facteurs inclus dans le modele (R2). Les analyses ont ete effectuees a l’aide du package metafor du logiciel R. Resultats Au total, 45 etudes ont ete selectionnees, ce qui correspondait a 188 groupes de vaccination (68 groupes humains et 120 groupes de PNH). Le titre d’anticorps variait de 0 a 5,79 log10, avec une moyenne de 3,02 (intervalle de confiance a 95 % (IC95) [2,89 ; 3,15]). Il etait plus eleve chez les PNH que chez les humains : titres moyens de 3,16 (IC95 [2,99 ; 3,33]) versus 2,77 (IC95 [2,59 ; 2,95]). Dans le modele multivariable final incluant 55 groupes humains, le type de vaccin (p

Introduction Avec l’augmentation de la duree de vie, les comorbidites sont devenues une preoccupation majeure chez les patients vivants avec le VIH (PVVIH) traites par des antiretroviraux. Ces comorbidites sont plus frequentes a un âge donne que dans la population generale sans explications claires, excepte pour les complications reliees a la co-infection avec le virus des hepatites et les antiretroviraux. Nous avons mene une etude prospective en etudiant les comorbidites reliees a l’âge et leurs determinants clinico-biologiques. Patients et methodes L’etude SIMBAD a inclus des PVVIH issus de la cohorte ANRS CO3 aquitaine ayant prealablement beneficie d’au moins une mesure osseuse par DEXA. Ces patients ont ete soumis a de tests fonctionnels locomoteurs et neurocognitifs standardises, a nouvel examen DEXA, a une mesure du taux de 25-OH vitamine D, et a une mesure des marqueurs de l’activation immune des lymphocytes T (CD4+/CD8+DR+) et des marqueurs d’immunosenescence (CD4+/CD8+CD57+CD28−). Les resultats des tests fonctionnels ont ete compares a des normes specifiques pour l’âge, utilises dans la population generale. Les correlations entre les differents tests ont ete decrits dans une analyse de composant principal (ACP) et les determinants etudies dans une analyse de regression lineaire multivariables. Resultats Cent neuf patients ont ete etudies : moyenne d’âge 54 ans (DS :9), 80 % d’hommes, 64 % d’homo-bisexuels, 61 % au stade CDC A, et 93 % avec une charge virale VIH-1 indetectable. Le taux moyen de CD4+ etait a 588/mm 3 et le nadir moyen a 279/mm 3 (DS :163). Les resultats des tests etaient significativement differents des normes de la population generale pour la densite minerale osseuse (DMO), le timed-up-and-go test et les tests neurocognitifs ( p > 0,05). Les differences observees etaient modestes et semblaient s’attenuer avec l’accroissement de l’âge. Les alterations les plus marquees etaient observees dans moins de 25 % par domaine (Z-score locomoteur > I2I, 2 Z-scores neurocognitifs > I1I, osteoporose). Les tests des differents domaines etaient correles ( r Les modeles de regression lineaire multivariables de la DMO du col femoral, de la performance des muscles des membres inferieurs, de la fluence verbale et de la vitesse psychomotrice montraient que l’accroissement de l’âge etait le seul determinant significatif. D’autres determinants tels que l’index de masse maigre, la lipoatrophie, le nadir de CD4+ et le traitement par ARV variaient selon les tests. Aucune association n’etait observee concernant le taux de vitamine D ou les marqueurs d’immuno-activation/senescence dans aucun modele de regression. Conclusion Dans cette analyse transversale de l’etude SIMBAD, les modifications de l’os, du muscle et les troubles neurocognitifs semblent etre peu severe et non relies a des marqueurs biologiques chez les PVVIH. Les analyses longitudinales permettront d’etudier plus precisement les relations avec le vieillissement.

Introduction Les evaluations cliniques initiales d’un vaccin candidat contre le VIH se fondent sur sa capacite a generer des reponses immunitaires. Actuellement, la dynamique des marqueurs de reponses immunologiques au vaccin reste mal connue. Une meilleure connaissance de cette dynamique pourrait permettre d’optimiser les mesures dans des futurs essais. Nous faisons l’hypothese que la dynamique de certains marqueurs immunitaires pourrait etre predite a partir de la dynamique d’autres marqueurs. En particulier, une reponse precoce des CD4 auxiliaires (lymphocytes T CD4+ producteurs d’IL-2) pourrait predire la reponse plus tardive des CD8 cytotoxiques (lymphocytes T CD8+ producteurs d’IFN-γ). L’objectif de cette etude etait d’evaluer les dynamiques et correlations entre les CD4 auxiliaires et les CD8 cytotoxiques dans un essai vaccinal prophylactique de phase 2 contre le VIH. Methodes Cette etude etait basee sur les donnees de l’essai clinique vaccinal HVTN protocole 068, qui a evalue deux strategies de primo et revaccination differentes (vaccin rAd5-rAd5 versus ADN-rAd5) chez 66 volontaires sains. Des mesures d’immunogenicite cellulaire (CD4 auxilliaires et CD8 cytotoxiques) ont ete effectuees de facon repetee chez les participants. L’association entre les CD4 auxiliaires et les CD8 cytotoxiques a d’abord ete etudiee aux differents temps de mesure en utilisant des correlations de Spearman. La reponse des CD8 cytotoxiques a ensuite ete modelisee en fonction de la reponse des CD4 auxiliaires afin de tenir compte de la correlation entre ces deux marqueurs dans le bras rAd5-rAd5 en utilisant des modeles a effets mixtes. L’effet du temps a ete introduit dans les modeles sous forme de splines. Un premier modele a inclus comme variable explicative la reponse des CD4 auxiliaires a chaque temps et a ete ajuste sur le temps. Dans un second modele, les CD4 auxiliaires ont ete introduits sous forme de deux variables explicatives, la premiere representant leur evolution de j0 a j7, la seconde la valeur fixe de j14 afin d’etudier plus precisement l’association de la mesure specifique des CD4 auxilliaires a j14 sur l’ensemble de la reponse des CD8 cytotoxiques. Le meilleur modele a ete choisi en fonction du critere d’Akaike. Resultats Des correlations moyennes a fortes (r = 0,50–0,80) etaient observees dans le bras rAd5-rAd5 entre les reponses des CD4 auxiliaires a j14 et des CD8 cytotoxiques au cours de la vaccination. Aucune correlation n’etait retrouvee dans le bras ADN-rAd5. Des modeles de regression ont confirme cette relation dans le bras rAd5-rAd5 en mettant en evidence une association significative entre les CD4 auxiliaires a j14 et la reponse des CD8 cytotoxique consecutive : pour une augmentation de 1,0 % du pourcentage des CD4 auxiliaires a la visite a j14, le pourcentage de CD8 cytotoxiques augmentait de 0,29 % (IC 95 % 0,16–0,42 ; p Conclusion La modelisation des reponses immunitaires au vaccin au cours d’un essai clinique demande des modeles complexes. Dans notre application, la modelisation a souligne le role precoce de la reponse des CD4 auxiliaires dans la reponse cellulaire au vaccin et notamment dans la stimulation et le maintien de la reponse des CD8 cytotoxiques qui permet de lutter contre le virus. Cette approche montre l’interet de la modelisation pour mieux cibler les temps de mesure dans des futurs essais cliniques et predire la reponse vaccinale.