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The skin is an immune organ comprised of a large network of antigen-presenting cells such as dendritic cells, making it an attractive target for the development of new vaccines and immunotherapies. Recently, we developed a new innovative and non-invasive vaccination method without adjuvant based on epicutaneous vaccine patches on which antigen forms a dry deposit. Here we describe in mice a method for potentiating the efficacy of our epicutaneous vaccination approach using a minimally invasive and epidermis-limited skin preparation based on laser-induced micro-perforation. Our results showed that epidermal micro-perforation increased trans-epidermal water loss, resulting in an enhancement of antigen solubilization from the surface of the patch, and increased the quantity of antigen delivered to the epidermis. Importantly, this was not associated with an increase in systemic passage of the antigen. Skin micro-perforation slightly activated keratinocytes without inducing an excessive level of local inflammation. Moreover, epidermal micro-perforation improved antigen capture by epidermal dendritic cells and specifically increased the level of Langerhans cells activation. Finally, we observed that epidermal micro-perforation significantly increased the level of the specific antibody response induced by our epicutaneous Pertussis vaccine candidate containing non-adsorbed recombinant Pertussis Toxin and reduced the amount of antigen dose required. Overall, these data confirm the benefit of a minimal and controlled epidermal preparation for improving the effectiveness of an epicutaneous patch-based vaccine, without adversely affecting the safety of the method.

Introduction L’immunotherapie epicutanee (EPIT) constitue une voie therapeutique nouvelle pour l’allergie alimentaire. La peau contient une grande quantite de cellules presentatrice d’antigenes dont les cellules de Langerhans dans l’epiderme et les cellules dendritiques du derme. Le but de cette etude etait de caracteriser les cellules impliquees dans la prise en charge de l’allergene et la dynamique de leur migration vers les ganglions drainant la peau lors de l’application epicutanee chez des souris sensibilisees a l’ovalbumine. Methodes Des souris sensibilisees a l’ovalbumine (OVA) par voie sous-cutanee ont recu un patch (Viaskin®) contenant de l’OVA couple a un fluorochrome (OVA-A488) sur peau intacte ou abrasee, et les cellules ayant capte l’allergene ont ete analysees par cytometrie en flux apres 2, 6, 24, 48 et 72 h dans la peau et les ganglions drainants et comparee a des souris naives (controle). Resultats Apres deux heures d’application, un passage passif important est detecte dans les ganglions drainants apres application sur peau abrasee contrairement a la peau intacte. Apres application sur peau intacte, l’OVA est prise en charge par les cellules de Langerhans dans l’epiderme plus rapidement chez les souris sensibilisees que chez les souris naives. Chez les souris sensibilisees, le nombre de cellules OVA+ dans l’epiderme diminue significativement apres 24 h et augmente transitoirement dans le derme entre 24 et 48 h, suggerant une migration des cellules de Langerhans vers les ganglions drainants. Apres 48 h, une augmentation significative des cellules dendritiques OVA+ est observee dans les ganglions drainants. Les cellules de Langerhans ayant migre dans les ganglions presentent une forte expression de CMH-II et une augmentation de CD86, PD-L1 et de PD-L2. L’abrasion de la peau induit une expression plus importante de CD86 et PD-L1 mais plus faible de PD-L2. Discussion Ces resultats montrent que l’application epicutanee d’allergene sur peau intacte chez des souris sensibilisees permet sa prise en charge par les cellules de Langerhans, leur maturation et leur migration rapide vers les ganglions drainants avec un profil d’activation tolerogene par rapport a l’application sur peau abrasee.

Introduction L’immunotherapie epicutanee sur peau intacte (EPIT) est une voie therapeutique des allergies alimentaires en cours de developpement. Dans les modeles animaux, la desensibilisation obtenue par l’EPIT est maintenue apres arret du traitement (tolerance) et previent de sensibilisations a d’autres allergenes. Le but de ce travail etait d’evaluer, dans un modele de souris sensibilisees, la cinetique des modifications epigenetiques etayant l’effet therapeutique de l’EPIT et l’induction de tolerance. Methodes Des souris BALB/c femelles sensibilisees a l’arachide ont ete traitees par EPIT ou immunotherapie orale (OIT) ou non traitees pendant 8 semaines. Les prelevements de rate et sang ont ete realises aux semaines 1, 2, 4 et 8 du traitement et 8 semaines apres arret du traitement. Un autre panel de groupes de souris a ete analyse apres une phase de sensibilisation a un autre allergene, l’ovalbumine. La methylation de l’ADN a ete analysee par pyrosequencage dans les cellules CD4+ purifiees de la rate et du sang. Resultats Dans les cellules CD4+ (rate et sang), une hypermethylation des ilots CpG associes au promoteur de Gata3 apparait des la 4e semaine d’EPIT, persiste jusqu’a la fin du traitement (p Conclusion L’EPIT comparee a l’OIT conduit a une signature epigenetique unique et stable permettant une regulation negative de l’expression des genes de la voie du Th2 et une activation des cellules T regulatrices. Ces mecanismes seraient impliques dans l’induction de tolerance par EPIT.

Introduction L’allergie a l’œuf est l’une des trois plus frequentes allergies chez l’enfant (Rance F., Clin exp all, 2005). Bien que 40 % des patients allergiques acquierent une tolerance naturelle a l’âge de 5 ans, l’âge de resolution se developpe de plus en plus tardivement et predispose a d’autres maladies atopiques. L’objectif de cette etude est d’evaluer l’efficacite de l’immunotherapie par voie cutanee (EPIT) chez des souris prealablement sensibilisees a l’œuf. Methodes Des souris BALB/c (n = 50) ont ete sensibilisees aux proteines d’œuf par deux injections intra-peritoneales de 10 μg de proteines d’œuf adsorbees avec 2 mg d’Alum a une semaine d’intervalle. Une partie des souris est ensuite traitee par EPIT a differentes doses : 10, 50, 100 ou 250 μg (n = 10/groupe). Des souris n’ont pas ete traitees (n = 10, Sham) et des souris controles n’ont pas ete sensibilisees ni traitees (n = 10, naives). La reponse humorale a ete analysee apres la sensibilisation et a la fin du traitement (anticorps specifiques IgE, IgG1 et IgG2a). A la fin de l’immunotherapie, les souris ont recu 6 gavages de 20 mg de proteines d’œuf puis un test de provocation par voie orale (TPO) a ete realise (gavage de 80 mg de proteines d’œuf). La temperature rectale a ete mesuree 45 minutes apres le challenge. La reponse cellulaire a ete analysee apres stimulation in vitro des splenocytes. Resultats L’immunotherapie par voie epicutanee induit une baisse significative des IgE specifiques a l’œuf ainsi qu’une production significative d’IgG2a pour tous les groupes traites par rapport aux souris non traitees (Sham). Le TPO entraine la survenue de diarrhees ainsi qu’une baisse de temperature chez les souris non traitees ainsi que chez les souris traitees par EPIT aux faibles doses (10 μg et 50 μg). En revanche, les souris traitees aux doses de 100 μg et de 250 μg ne presentent pas ou moins de signes cliniques lors du TPO. Les cytokines de type Th2 ont egalement ete reduites chez les souris traitees par EPIT aux fortes doses. Conclusion Cette etude demontre pour la premiere fois l’efficacite de l’immunotherapie par voie epicutanee contre l’anaphylaxie induite par l’œuf dans un modele de souris allergique.

Introduction Les cellules T regulatrices (Tregs) jouent un role primordial dans les mecanismes d’action de l’immunotherapie specifique. La capacite des Tregs a migrer vers les organes cibles est liee a l’expression de recepteurs specifiques. Le but de cette etude est la caracterisation de l’expression des recepteurs de migration vers la peau (CLA) et le tube digestif (CCR9) par les Tregs induit par l’immunotherapie epicutanee (EPIT) qui constitue une voie therapeutique nouvelle pour le traitement des allergies alimentaires. Methodes Des souris BALB/c femelles sensibilisees a l’arachide par voie orale ont ete traitees par EPIT ou non traitees (NT). Apres 8 semaines de traitement, les souris ont ete sacrifiees afin de prelever la rate, les ganglions mesenteriques (mLNs) et les ganglions inguinaux (iLNs) drainant la peau. Apres extractions des cellules, la proportion de Tregs et l’expression des recepteurs de migration specifique CLA + CCR9– (peau), CLA-CCR9+ (tube digestif) et CLA + CCR9+ (double tropisme) ont ete analyses par cytometrie en flux. Resultats Apres 8 semaines de traitement, la proportion de cellules Tregs CD4 + CD25 + Foxp3+ dans la rate et les iLNs est augmentee par EPIT par rapport au NT ( p p p p Discussion Les Tregs Foxp3+ jouent un role essentiel au cours du traitement de l’allergie alimentaire. Le tropisme a la fois digestif et cutane des Tregs induits par l’EPIT aussi bien dans les ganglions drainant la peau que le tube digestif, fait de cette methode un traitement de choix de l’allergie alimentaire.

Results: In spleen, expression of CCR4 increased on Tregs induced by all 3 therapies whereas the expression of CXCR3, CCR6 and CCR8 increased on EPIT-induced Tregs only. Skin homing receptor (CLA) increased on EPITbut not SLITor OIT-induced Tregs. Gut homing receptor CCR9 increased on EPITand OITbut not SLIT-induced Tregs. Interestingly, 81% of the CCR9+ Tregs induced by EPIT expressed CLA whereas only 43% did after OIT. In iLN, Tregs level increased only after EPIT with induction of CLA+CCR9-(22%) and CLA+CCR9+ (12%) Tregs. In mLN, EPIT and OIT significantly induced CCR9+ Tregs, 25% and 18% of them expressing also CLA in EPIT and OIT respectively.

Results: In splenocytes, a significant hypermethylation in GATA-3 CpG islands was induced by EPIT versus Sham, starting from the 4 of treatment (p

Methods: After sensitization to milk, mice were treated by EPIT or Sham, and 2 weeks later, submitted to a peanut-sensitization procedure. Mice were then intravenously challenged with peanut. In a second experiment, CD4+CD25+ T cells were isolated from spleen of milk-sensitized mice after EPIT or Sham, and transferred into naive mice. Recipient mice were submitted to peanut sensitization and intravenously challenged with peanut. In a third experiment, Tregs were obtained from Foxp3+-gfp mice sensitized to peanut and EPIT-treated, then adoptively transferred. Recipient mice were submitted or not to peanut sensitization before transfer, then all sensitized and IV challenged to ovalbumin. Outcome tools were rectal temperature, hypersensitivity reactions and blood mouse mast cell protease-1 (mMCP1).