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Defects in autophagy contribute to joint aging and Osteoarthritis (OA). Identifying specific autophagy types could be useful for developing novel treatments for OA. An autophagy-related gene array was performed in blood from non-OA and knee OA subjects from the Prospective Cohort of A Coruña (PROCOAC). The differential expression of candidate genes was confirmed in blood and knee cartilage and a regression analysis was performed adjusting for age and BMI. HSP90A, a chaperone mediated autophagy (CMA) marker was validated in human knee joint tissues, as well as, in mice with aging-related and surgically-induced OA. The consequences of HSP90AA1 deficiency were evaluated on OA pathogenesis. Finally, the contribution of CMA to homeostasis was studied by assessing the capacity to restore proteostasis upon ATG5 -mediated macroautophagy deficiency and genetic HSP90AA1 overexpression. 16 autophagy-related genes were significantly down-regulated in blood from knee OA subjects. Validation studies showed that HSP90AA1 was down-regulated in blood and human OA cartilage and correlated with risk incidence of OA. Moreover, HSP90A was reduced in human OA joints tissues and with aging and OA in mice. HSP90AA1 knockdown was linked to defective macroautophagy, inflammation, oxidative stress, senescence and apoptosis. However, macroautophagy deficiency increased CMA, highlighting the CMA-macroautophagy crosstalk. Remarkably, CMA activation was sufficient to protect chondrocytes from damage. We show that HSP90A is a key chaperone for chondrocyte homeostasis, while defective CMA contributes to joint damage. We propose that CMA deficiency is a relevant disease mechanism and could represent a therapeutic target for OA. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Objectives: Abnormal chondrocyte gene expression promotes osteoarthritis (OA) pathogenesis. A previous RNA-sequencing study revealed that circadian rhythm pathway and expression of core clock gene cryptochrome 2 (CRY2) are dysregulated in human OA cartilage. Here we determined expression patterns and function CRY1 and CRY2.Methods: CRY mRNA and protein expression was analyzed in normal and OA human and mouse cartilage. Mice with deletion of Cry1 or Cry2 were analyzed for severity of experimental OA and to determine genes and pathways that are regulated by Cry.Results: In human OA cartilage, CRY2 but not CRY1 staining and mRNA expression was significantly decreased. Cry2 was also suppressed in mice with aging-related OA. Cry2 knock out (KO) but not Cry1 KO mice with experimental OA showed significantly increased severity of histopathological changes in cartilage, subchondral bone and synovium. In OA chondrocytes, the levels of CRY1 and CRY2 and the amplitude of circadian fluctuation were significantly lower. RNA-seq on knee articular cartilage of wild-type and Cry2 KO mice identified 53 differentially expressed genes, including known Cry2 target circadian genes Nr1d1, Nr1d2, Dbp and Tef. Pathway analysis that circadian rhythm and extracellular matrix remodeling were dysregulated in Cry2 KO mice.Conclusions: These results show an active role of the circadian clock in general, and of CRY2 in particular, in maintaining extracellular matrix (ECM) homeostasis in cartilage. This cell autonomous network of circadian rhythm genes is disrupted in OA chondrocytes. Targeting CRY2 has potential to correct abnormal gene expression patterns and reduce the severity of OA. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Summary: This review is focused on advances in understanding the biology of joint homeostasis and osteoarthritis (OA) pathogenesis mechanisms that have led to proof of concept studies on new therapeutic approaches. The three selected topics include angiogenesis in joint tissues, biomechanics and joint lubrication and mitochondrial dysfunction. This new information represents progress in the integration of mechanisms that control multiple aspects of OA pathophysiology. [Copyright &y& Elsevier]

Summary: Objective: To compare the tensile biomechanical properties of age-matched adult human knee articular cartilage exhibiting distinct stages of degenerative or osteoarthritic deterioration and to determine the relationships between tensile properties and biochemical and structural properties hypothesized to underlie functional biomechanical deterioration. Methods: Age-matched articular cartilage samples, obtained from the lateral and medial femoral condyles (LFC and MFC), exhibited (1) minimal fibrillation, characteristic of normal aging (NLA), (2) overt fibrillation associated with degeneration (DGN), or (3) overt fibrillation associated with osteoarthritis (OA). DGN samples were from knees that exhibited degeneration but not osteophytes while OA samples were from fragments removed during total knee arthroplasty. Cartilage samples were analyzed for tensile properties, cell and matrix composition, and histopathological structure. Results: Differences in tensile, compositional and surface structural properties were indicative of distinct stages of cartilage degeneration, early (OA) advanced (DGN) and late (OA) with early degenerative changes in NLA samples being more advanced in the MFC than the LFC, including higher surface fibrillation, lower intrinsic fluorescence, and lower mechanical integrity. The transition from early to advanced degeneration involved a diminution in mechanical function, surface integrity, and intrinsic fluorescence. The transition from advanced to late degeneration involved an increase in cartilage water content, an increase in degraded collagen, and loss of collagen. Conclusions: These results provide evidence of coordinated mechanical dysfunction, collagen network remodeling, and surface fibrillation. Even in the cartilage of knees exhibiting overt fibrillation but not extensive erosions characteristic of clinical osteoarthritis, most features of advanced cartilage degeneration were present. [Copyright &y& Elsevier]

Objective: To determine the time sequence of biochemical and structural events associated with, and hypothesized to underlie, age-associated tensile weakening of macroscopically normal adult human articular cartilage of the knee.Methods: Macroscopically normal human articular cartilage of the lateral and medial femoral condyles (LFC and MFC) from Young (21-39 yrs), Middle (40-59 yrs), and Old (>/=60 yrs) age donors were analyzed for tensile properties, surface wear, and cell and matrix composition.Results: Variations in tensile, compositional, and surface structural properties were indicative of early, intermediate, and late stages of age-associated cartilage deterioration, occurring at an earlier age in the MFC than the LFC. Differences between Young and Middle age groups (indicative of early-to-intermediate stage changes) included decreased mechanical function in the superficial zone, with a loss of (or low) tensile integrity, and surface wear, with faint striations and mild staining on the articular surface after application of India ink. Differences between Middle and Old age groups (indicative of intermediate-to-late stage changes) included maintenance of moderate level biomechanical function, a decrease in cellularity, and a decrease in matrix glycosaminoglycan content. Tissue fluorescence increased steadily with age.Conclusions: Many of these age-associated differences are identical to those regarded as pathological features of cartilage degeneration in early osteoarthritis. These findings provide evidence for the roles of mechanical wear, cell death, and enzymatic degradation in mediating the progression through successive and distinguishable stages of early cartilage deterioration. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Objective: The aim of this study was to develop high-throughput assays for the analysis of major chondrocyte functions that are important in osteoarthritis (OA) pathogenesis and methods for high-level gene expression and analysis in primary human chondrocytes.Methods: In the first approach, complementary DNA (cDNA) libraries were constructed from OA cartilage RNA and full-length clones were selected. These cDNAs were transferred into a retroviral vector using Gateway Technology. Full-length clones were over-expressed in human articular chondrocytes (HAC) by retroviral-mediated gene transfer. The induction of OA-associated markers, including aggrecanase-1 (Agg-1), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), collagen IIA and collagen X was measured by quantitative real-time polymerase chain reaction (QPCR). Induction of a marker gene was verified by independent isolation of 2-3 clones per gene, re-transfection followed by QPCR as well as nucleotide sequencing. In the second approach, whole cDNA libraries were transduced into chondrocytes and screened for chondrocyte cluster formation in three-dimensional agarose cultures.Results: Using green fluorescent protein (eGFP) as a marker gene, it was shown that the retroviral method has a transduction efficiency of >90%. A total of 40 verified hits were identified in the QPCR screen. The first set of 19 hits coordinately induced iNOS, COX-2, Agg-1 and MMP-13. The most potent of these genes were the tyrosine kinases Axl and Tyro-3, receptor interacting kinase-2 (RIPK2), tumor necrosis factor receptor 1A (TNFR1A), fibroblast growth factor (FGF) and its receptor FGFR, MUS81 endonuclease and Sentrin/SUMO-specific protease 3. The second set of seven hits induced both Agg-1 and MMP-13 but none of the other markers. Five of these seven genes regulate the phosphoinositide-3-kinase pathway. The most potently induced OA marker was iNOS. This marker was induced 20-500 fold by seven genes. Collagen IIA was also induced by seven genes, the most potent being transforming growth factor beta (TGFbeta)-stimulated protein TSC22, vascular endothelial growth factor (VEGF) and splicing factor 3a. This screening assay did not identify inducers of collagen X. The second chondrocyte cluster formation screen identified 14 verified hits. Most of the genes inducing cluster formation were kinases. Additional genes had not been previously known to regulate chondrocyte cluster formation or any other chondrocyte function.Conclusions: The methods developed in this study can be applied to screen for genes capable of inducing an OA-like phenotype in chondrocytes on a genome-wide scale and identify novel mediators of OA pathogenesis. Thus, coordinated functional genomic approaches can be used to delineate key genes and pathways activated in complex human diseases such as OA. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

L'activation du récepteur nicotinique de l'acétylcholine alpha 7 (α7nAChR) (composé de 5 sous-unités codées par le gène Chrna7) par un ligand endogène (Ach) ou exogène (nicotine) atténue la sévérité et la douleur de l'arthrose chez la souris. Sa stimulation pourrait constituer une cible thérapeutique dans l'arthrose chez l'Homme. Cependant, au cours de l'évolution, un duplicat partiel du gène Chrna7, spécifique à l'Homme, appelé CHRFAM7A est apparu. Il fonctionne comme un dominant négatif du α7nAChR in vitro. Les objectifs de cette étude sont de déterminer l'impact de l'expression de CHRFAM7A sur la sévérité histologique et clinique de l'arthrose ainsi que sur la réponse aux agonistes et d'en étudier les mécanismes grâce à l'utilisation de souris transgéniques CHRFAM7A (TgCHRFAM7A). L'arthrose a été induite chez des souris WT et TgCHRFAM7A par déstabilisation du ménisque médial (DMM) ou par injection de monoiodoacétate (MIA) intra-articulaire (IA). La sévérité histologique (score OARSI) et la douleur (filament de von Frey [VF] et mesure de pression au genou) ont été comparées entre les 2 génotypes avant et après induction d'arthrose. Deux jours avant le sacrifice, l'effet antalgique d'une injection intrapéritonéale de nicotine (0,5 et 1 mg/kg) ou de PBS a été évalué à 5, 15, 60 et 180 minutes par VF. Au sacrifice, la capacité de fixation du α7nAChR, l'expression des gènes inflammatoires et l'invasion de macrophages (F4/80+) ont été évaluées dans les ganglions rachidiens (DRG) innervant le genou des souris WT et TgCHRFAM7A avec et sans DMM. Ex-vivo, nous avons comparé l'effet de l'activation IA du α7nAChR par la nicotine (10uM) sur l'expression ARNm de l'IL6 et de MMP3 induite par une injection IA d'IL1-b par le minisque, la synoviale et le cartilage 2 h aprθs injection chez des souris WT et TgCHRFAM7A. De mκme, l'effet anti-inflammatoire de la nicotine a ιtι ιvaluι sur des chondrocytes murins WT et TgCHRFAM7A stimulis par IL1-b. Les souris TgCHRFAM7A ont une arthrose plus sévère que les souris WT dans les 2 modèles utilisés. Cette sévérité accrue peut s'expliquer par une diminution de la réponse aux agonistes puisque l'injection IA de nicotine diminue l'expression de l'IL6 et de la MMP3 induite par l'IL1-b dans le ménisque, la synoviale et le cartilage des souris WT, alors qu'elle n'a aucun effet chez les souris TgCHRFAM7A. De même, la nicotine diminue l'expression d'IL6, de MMP3 et MMP13 induite par l' IL1-b sur des chondrocytes murins WT alors qu'elle n'a pas d'effet sur les chondrocytes TgCHFRAM7A. Les souris TgCHRFAM7A présentent une allodynie mécanique plus importante après DMM et MIA mais elles ont également un seuil douloureux abaissé par rapport aux souris WT en l'absence de DMM ou d'injection de MIA. L'analyse des DRG montre un nombre accru de macrophages associé à une expression accrue dans de la chimiokine fractalkine/CX3CL1 ainsi qu'une perte de capacité de fixation du α7nAChR dans les DRG TgCHRFAM7A par rapport aux WT. Enfin, l'effet antalgique transitoire de la nicotine est détectable et maximal après 5 minutes chez les souris WT avec DMM et MIA, mais il est complètement aboli chez les souris DMM ou MIA TgCHRFAM7A. CHRFAM7A est associé à une sévérité accrue de l'arthrose et détermine les seuils de douleur générale chez les souris. Cet effet est associé à une diminution significative de l'activation du α7nAChR. Le phénotype lié à la douleur pourrait être dû au recrutement accru de macrophages dans le DRG en réponse à l'excès de fractalkine. L'effet thérapeutique des agonistes α7nAChR sur la douleur et sur l'arthrose devrait être évalué chez l'homme en fonction du génotype CHRFAM7A. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

L'Homme est exposé aux polluants ayant des propriétés de perturbateurs endocriniens (PE) dès la vie intra-utérine. Parmi eux, un mix de 15 polluants différents (composants perfluorés, bisphénol A ...) ubiquitaires et retrouvés dans le liquide amniotique de femmes enceintes, est associé à une dysfonction thyroïdienne et à des retards d'acquisition chez les enfants nés de femme exposées [1]. Des données épidémiologiques suggèrent une association entre l'exposition aux polluants et le risque de maladie articulaire [2]. Notre objectif est de déterminer l'effet de ce mix de polluant sur le risque d'arthrose et la fonction chondrocytaire. Des souris femelles C57/B6 ont été exposées au mix de 15 polluants, par l'eau de leur boisson (dose équivalente de bisphénol A [BPA] de 1,5 μg/kg/j) 15 jours avant conception et pendant toute la gestation. Les souriceaux nés ont été exposés de la même manière jusqu'à leur sacrifice à 10 mois (n = 18). Un groupe contrôle de femelles et de souriceaux (n = 18) non exposés a été élevé dans les mêmes conditions. Au sacrifice, une analyse histologique du genou a été réalisée (score OARSI). In vitro, des cultures primaires de chondrocytes murins (n = 7), ont été exposées ou non à différentes doses du mix de polluants pendant 24 h. La toxicité cellulaire a été évaluée par dosage LDH, l'expression de cytokines (interleukine [IL]–6) chimiokines (MCP1) et métalloprotéases (MMP-3) par RT-qPCR et ELISA et le dosage des espèces réactives de l'oxygène (ROS) par un test au Nitroblue tetrazolium (NBT). Une analyse transcriptomique a été réalisée pour déterminer l'ensemble des gènes différentiellement exprimés (DE) entre les chondrocytes exposés (n = 4) ou non (n = 4) au mix (eq. BPA 10 ng/mL) pendant 24 h. Enfin, à 15 minutes de stimulation, nous avons évalué la phosphorylation de la voie de signalisation MAPK p38 par Western Blot. À 10 mois, les mâles exposés aux polluants avaient des scores OARSI supérieurs à ceux des mâles non exposés (3,25 ± 0,31 vs 2,12 ± 0,31 p = 0,02). Cette différence n'a pas été retrouvée chez les femelles. Il n'y avait pas de différence entre les deux groupes concernant le phénotype (poids, taille), la synoviale et l'os sous-chondral. In vitro, le mix de polluants n'a pas induit de toxicité cellulaire direct (LDH). Les chondrocytes stimulés par le mix surexprimaient, par qPCR, des cytokines inflammatoires et métalloprotéases avec un effet-dose : IL6 : + 222 % (p < 0,05) ; MCP 1 : + 155 % (p < 0,05), MMP-3 : +222 % (p < 0,05) pour une dose eq. BPA 10 ng/mL. Des résultats similaires ont été obtenus en ELISA. L'activation pro-inflammatoire a été confirmée puisque le mix induisait une augmentation significative de la phosphorylation de p38MAPK. Parmi les 265 gènes DE entre chondrocytes exposés ou non au mix dans l'analyse transcriptomique, plusieurs voies cellulaires impliquées dans le stress oxydant (comme le métabolisme du glutathion, la voie des pentose et la ferroptose) ont été identifiées. Ceci a été confirmé par test au NBT puisque les chondrocytes exposés au mix produisaient significativement plus de ROS (p < 0,05). L'exposition aux PE induit des altérations précoces du cartilage chez les souris. Ceci pourrait être lié à un effet local pro-inflammatoire et pro-oxydant sur les chondrocytes. [ABSTRACT FROM AUTHOR]