Search

Toxoplasma gondii, hemen hemen her sıcakkanlı hayvanı, kuş türlerini ve insanları enfekte edebilen bir zorunlu hücre içi parazitidir. Toksoplazmozis, immun sistemi sağlam kişilerde asemptomatik ilerlerken, immun sistemi baskılanmış ya da immun yetmezliği olan kişilerde ölüme neden olabilmektedir. Bu sebeplerden dolayı T. gondii'ye karşı geliştirilecek aşı enfeksiyondan korunmak için büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında T. gondii'ye karşı multivalan rekombinant protein aşısı geliştirilmesi amaçlanmıştır.Bu amaçla protein mikroarray taramasıyla belirlenen T. gondii'ye ait 49 aşı adayı antijenik protein; biyoinformatik yöntemler, küçük çaplı ekspresyon ve saflaştırma özelliklerine göre analiz edilmiştir. Analiz sonucunda aralarından altı protein aşı adayı olarak seçilmiş ve ilk kez 6-Valantlı adjuvante rekombinant protein aşı formülasyonu geliştirilmiştir [6-Valant (+) Montanide]. Fareler üç hafta arayla iki kez aşılanmış ve daha sonra uyarılan humoral immun yanıt Western blot ve Rec-ELISA ile, hücresel immun yanıt ise flow sitometri ve sitokin ELISA ile belirlenmiştir. Aşılanan fareler T. gondii Ankara suşu takizoiti ile intraperitoneal yoldan letal dozda enfekte edilerek oluşturulan korunma belirlenmiştir.Sonuçlara göre, aşılama sonrası 6-Valant (+) Montanide aşısı kontrollere göre kuvvetli total IgG yanıtı uyarmıştır (P

Kanser kök hücreleri tümör yapısında çok az oranlarda yer alan kendini yenileme, büyüme, farklılaşma özelliklerine sahip hücrelerdir. Kanser kök hücreleri tümörlerin agresifliğini büyüme faktörlerinden bağımsız hale gelerek, kemoterapi ve radyoterapiye karşı direnç kazanarak, anjiyogenezi uyararak ve metastaz yeteneğine sahip olarak arttırırlar. KKH' sinin malign progresyonuna sebep olabilecek hücresel mekanizmaların ortaya konmasının, kanser biyolojisini ve davranışını anlamakta çok önemli bir basamak olduğu bilinmektedir. KDN (2-keto-3-deoxy- D-glycero-D-galacto-nononic acid/ deamino nörominik asit) sialik asit ailesinin farklı bir türüdür. İnsanda KDN klasik sialik asit analiz yöntemleri ile belirlenemeyecek kadar az miktarda bulunmaktadır. KDN molekülü kanser hücrelerinde normal hücrelere oranla artmış düzeylerde bulunmaktadır.Bu çalışmada hücre kültür ortamına KDN eklenmesi ile artan KDN ekspresyonunun hücrelerin malignite potansiyelini arttırdığını öngörerek insan prostat epitel hücre hattı (RWPE-1) insan prostat kanser hücre hattı(DU145), insan prostat kanser hücre hattından izole edilen CD133+/CD44+ kanser kök hücreleri (KKH) ve bu kök hücreler dışında kalan hücrelerden oluşan 4 ayrı deney grubunda, in vitro koşullarda hücre kültür ortamına farklı konsantrasyonlarda KDN ve KDN' nin prekürsörü olan mannoz eklenmiş ve meydana gelen değişimler sayı-canlılık, apoptozis, hücre döngüsü mekanizmaları yönünden incelenmiştir.Elde edilen veriler ışığında hücre kültür ortamına ilave edilen KDN' nin özellikle DU145 CD133+/CD44+ KKH' lerinde doza ve zamana bağlı olarak canlılığı arttırdığını belirlenmiştir. Bu canlılığın hem deneyin kontrol grubuna göre hem tüm diğer deney gruplarına göre arttığı gözlenmiştir. Aynı grupta KDN' nin doz ve zamana bağlı olarak apoptozisi inhibe ettiği ve hücre döngüsünün G1 fazında hücrelerin akümüle olmasını sağladığı belirlenmiştir. Mannoz ilavesinde hücrelerde görülen değişim, KDN ile benzer etkiyi yalnız DU145 CD133+/CD44+ KKH' lerinde göstermiştir. Bu durum KDN' nin varlığının KKH' lerinde spesifik bir etki gösterdiğini kanıtlar niteliktedir. Cancer stem cell (CSC) is a cell within a tumor that possesses the capacity to self-renew and to generate the heterogeneous lineages by differantiate. CSC increase aggressiveness of tumors by becoming independent of growth factor, resistance to chemotherapy and radiotherapy, ability to stimulating amgiogenesis and metastasis. To understand that malignant progression of CSC, we need to understand celluler mechanism and biology of cancer behavior and that will be the ımportant step of all.Deaminoneuraminic acid (KDN, 2-keto-3-deoxy-Dglycero-D-galacto-nononic acid-deamino norominic acid) is a member of the family of sialic acids. İn human KDN is undetectable by use classıcal analysis methods. KDN molecule is found in increased levels in cancer cells than normal cells.İn this study we hypothesis that KDN-rich media supply in culture that increase the malignant potential of cells. We use human prostate epithelial cell line (RWPE-1), human prostate cancer cell line (DU145), CD133 + / CD44 + cancer stem cells (CSC) which isolated from human prostate cancer cell line and bulk population, those of cells is our four experimental group. We was added different concentration of KDN and mannose which is the prekursor of KDN in culture media were examined effect for count-viability, apoptosis and cell cycle mechanism.Our results showed that the addition of KDN in culture medium is induce viability in spesificly CD133 + / CD44 + CSC. This ınduction was time and dose dependent and compare to all the other experimental groups and control group was determined to increased. Moreover depending on dose and time manner , there is inhibition of apoptosis and significant accumulation of cells in the G1 phase was observed in the CD133 + / CD44 + CSC. Addition of mannose only has shown the similar effect on CD133 + / CD44 + CSC. This case is the evidence of KDN' s specific effects on CSC. 109

Glikoproteinlerin glikozilasyon profilleri, işlevleri üzerinde doğrudan etkilidir. Farklılaşma, yaşlanma ve ölüm mekanizmalarının yanı sıra, pek çok hastalık da glikokonjugatlardaki glikozilasyon değişmeleriyle ve/veya glikanların tanınmasıyla ilgili olarak ortaya çıkmaktadır. Bağışıklık sisteminde temel mekanizma bağışıklık sistem hücrelerinin patojenleri ve parazitleri tanıyarak, tutunup onları yok etmesidir. Hücreler arasındaki tutunma ve tanıma olaylarını, hücrelerde bulunan glikolipitlerin, glikoproteinlerin ve proteoglikanların kısaca glikokonjugatlardaki şeker birimleri ve üzerinde taşıdıkları ek gruplar (sübstütientler) belirler. Bu nedenle çalışmanın amacı; bağışıklık sistem fonksiyonlarında (hücre tanıma-tutunma ve sinyal iletimi gibi) da çok önemli görevleri olan glikanların, denizkestanesi immün sistem hücrelerindeki dağılımını analitik (CapLC-ESI-MS/MS) ve mikroskobik (floresan) yöntemlerle belirlemektir.Çalışma materyali, denizkestanesi P.lividus'un ergin bireylerinden alınan immün sistem hücreleridir. Denizkestanelerinin vücut boşluğundan alınan sölomik sıvı içerisine pıhtılaşmayı engelleyen isosmotik solüsyon (ISO-EDTA) eklenmiştir. İmmün sistem hücrelerindeki glikan profilinin Cap-LC-ESI-MS/MS sistemi ile analizi için örnekler hidroliz, reasetilasyon ve türevlendirme işlemlerinden sonra cihaza verilmiştir. Floresan Mikroskobu ile glikan profilinin belirlenmesi için ise FITC işaretli WGA (Triticum vulgaris agglutinin), WGA-suc (Triticum vulgaris-succsinyl agglutinin), PSL (Polyporus squamosus), HPA (Helix pomatia agglutinin) ve PNA (Arachis hypogaea agglutinin) lektinleri ile hücreler inkübe edilmiş ve floresan ataçmanlı araştırma mikroskobunda fotoğraflanmıştır.İmmün sistem hücrelerinin CapLC-ESI-MS/MS sistemi ile analizi sonucu mannoz, riboz, N-asetilglukozamin, glukoz, N-asetilgalaktozamin, galaktoz, arabinoz, ksiloz ve fukoz monosakkaritleri belirlenmiştir. Pik alanlarının hesaplanmasıyla sırasıyla en fazla glukoz, galaktoz ve fukoz bulunmuştur. İmmün sistem hücre tiplerine göre glikan profilinin belirlenmesi için uygulanan FITC işaretli lektinlerden ß-GlcNAc ve sialik asit (Sia) yapılarına özgün WGA lektin ile ışımalar Sia'ya özgün olmayan WGA-suc lektin ile ışımalara göre daha yoğun olarak belirlenmiştir. Bu bulgu immün sistem hücrelerinde Sia varlığını göstermektedir. 5. Karbonundan asetilli Sia'nın (Neu5Ac), ?-2,6 bağına özgün olan PSL lektinlerle işaretlenme oranları düşüktür. P.lividus'ta Neu5Gc'nin temel Sia olması, bu sonuçla uyumludur. ?-GalNAc yapısına özgün HPA lektinle floresan ışımalar ß-Gal yapısına özgün PNA lektine oranla daha fazladır.Denizkestanesi bağışıklık sisteminde görev alan immün hücrelerinin glikan yapılarının belirlenmesi ve diğer omurgasız ve omurgalı sistemlerle benzerliklerinin açıklanması ile yüksek omurgalıların bağışıklık sisteminin eksik ve karmaşık noktalarının anlaşılması açısından önemlidir.Anahtar Kelimeler: İmmün sistem hücreleri, Sölomosit, Glikanlar, CapLC-ESI-MS/MS, FITC işaretli lektin, Denizkestanesi Paracentrotus lividus The glycosylation profiles of glycoproteins are directly involved in their function. Differentiation, aging and death mechanisms as well as many diseases are associated with the glycosylation modifications of glycoconjugates and/or the recognition of glycans. The essential mechanism within immune systems is the recognition of pathogens and parasites by the immune system cells, which attach to their targets and destroy them. The saccharide units and additional substituents attached to glycolipids, glycoproteins and proteoglycans ?i.e. glycoconjugates-, determine such inter-/intracellular recognitions and bindings. Hence, the aim of this study is to determine the distribution of glycans, which play essential roles within the immune system (inter-/intracellular recognition-binding and signal transduction etc.), on the sea urchin immune system cells via analytical (CapLC-ESI-MS/MS) and microscopic (fluorescence) methods. The study material is the immune system cells obtained from adult sea urchin P.lividus. The coelomic fluid obtained from the body cavity of sea urchins was mixed with an anticoagulant isosmotic solution (ISO-EDTA). In order to analyze the glycan profiles of the immune system cells with the CapLC-ESI-MS/MS system, the samples underwent hydrolyzation, reacetylation and derivatization steps followed by their flow through the device. In order to determine the glycan profile via the fluorescence method, the cells were incubated with FITC conjugated WGA (Triticum vulgaris agglutinin), WGA-suc (Triticum vulgaris-succsinyl agglutinin), PSL (Polyporus squamosus), HPA (Helix pomatia agglutinin) and PNA (Arachis hypogaea agglutinin) lectins and then photographed with a fluorescence microscope. As a result of the CapLC-ESI-MS/MS analysis of immune cells; mannose, ribose, N-acetylglucosamine, glycose, N-acetylgalactosamine, galactose, arabinose, xylose and fucose monosaccharides were detected. A peak-area calculation analysis revealed the most prevalent saccharides as glycose, galactose and fucose respectively. Fluorescence analysis, which was performed in order to determine the cell-specific glycan profiles, came out with higher intensity emission signals obtained from the FITC-conjugated lectin WGA, which is specific to ß-GlcNAc and sialic acid (Sia), in comparison to the emission obtained from the Sia unspecific WGA-suc lectin. This finding indicates the existence of Sia within immune system cells. Staining levels of Sia, which is acetylated on its 5' carbon (Neu5Ac), with PSL lectins specific to ?-2,6 bond are low. This finding is in line with the fact that the Neu5Gc is the main Sia in the P.lividus. Fluorescent emissions from the HPA lectin, which is specific to ?-GalNAc, were detected at a higher level compared to those obtained from the PNA lectin, which is specific to ß-Gal. Determination of the glycan structures of the sea urchin immune system cells and elucidating their similarities among other invertebrate and vertebrate systems is vital in terms of understanding the uncovered complex features of the immune systems of higher vertebrates. Key words: Immune system cells, Coelomocyte, Glycans, CapLC-ESI-MS/MS, FITC conjugated lectin, Sea urchin Paracentrotus lividus 63

Glikokonjugatlar, bütün hücrelerde bulunurlar ve birçok biyolojik olayda iş görürler. Glikokonjugatların yapısındaki glikan zincirlerinin uç şeker molekülü genellikle sialik asittir (Sia). Bu nedenle glikokonjugatların rolleri doğrudan Sia tarafından kontrol edilir, yönlendirilir. Virüsten insana kadar hemen tüm canlılarda yayılış gösteren Sia'nın bitkilerde bulunduğuna ilişkin son bilgiler halen tartışmalıdır. Likenlerde ise böyle bir çalışma bulunmamaktadır.Bu çalışmada, Hypogymnia cinsine ait iki liken türünde (H.tubulosa ve H.physodes) öncelikle Sia'nın belirlenmesi hedeflenmiştir. Bulunması durumunda ardından tipleri, miktarları, kimyasal bağ özelliklerini saptamak amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, incelenecek liken türlerinin öncelikle histolojik yapıları, epon bloklardan alınan yarı ince kesitlerin toluidin mavisi ile boyanmasıyla ışık mikroskobunda incelenmiştir. Sia'nın ve özelliklerinin belirlenmesi için analitik (Cap LC-ESI-MS/MS) ve mikroskobik (ışık mikroskobunda HRP işaretli, transmisyon elektron mikroskobunda altın işaretli lektin uygulamaları ile) yöntemlerden yararlanılmıştır.İncelenen her iki liken türü de heteromerik tallus yapısına sahiptir. Yani, belirgin bir tabakalaşma görülür. Bunlar, dıştan içe doğru epikorteks, korteks, algsi tabaka, medulla ve alt korteks şeklinde sıralanırlar. İki tür arasındaki en önemli fark, korteks tabakasındaki mantar hücrelerinin yapısı ve dağılımındadır. H.tubulosa'da gevşek dağılmış hücreler uzun çıkıntılarla birbirlerine tutunurken, H.physodes'de yoğun hücrelerarası matriks elemanlarıyla birbirlerine yapışmış gibidirler.Sia belirlemeleri için öncelikle Cap LC-ESI-MS/MS ile çalışılmıştır. Neu5Ac ve Neu5Gc standartlarının alıkonma zamanları ile karşılaştırılan liken örneklerinde sadece Neu5Ac saptanmıştır. Miktar hesaplamaları ile de H.tubulosa'nın (1,36 ng/mg) H.physodes'den (0,25 ng/mg) daha fazla Sia içerdiği bulunmuştur. Bu nedenle lektin histokimyası/sitokimyası ile Sia incelemeleri sadece H.tubulosa'da gerçekleştirilmiştir. 0,75µm'lik lowicryl kesitlere HRP işaretli LFA (Limax flavus agglutinin, tüm Sia'lara özgün), MAA (Maackia amurensis agglutinin, ?2-3 bağına özgün) ve SNA (Sambucus nigra agglutinin, ?2-6 bağına özgün) lektinlerin uygulanmasıyla; Sia'lar korteks bölgesi mantar hücrelerinin hücre yüzeyleri ve nukleuslarında en fazla bulunmuştur. ?-2,3 bağlı Sia'lar ?-2,6 bağlı Sia'lardan -özellikle nukleusta- biraz daha fazladır. Lektin sitokimyası için ince lowicryl kesitlere altın işaretli LFA ve LPA (Limulus polyphemus agglutinin, tüm Sia'lara özgün) lektinlerin uygulanmasıyla, Sia'lar mantar hücrelerinin hücre duvarı, hücre zarı, sitoplazma ve özellikle nukleusunda saptanmıştır. Alg hücrelerinde, hücre duvarı ve elektronca yoğun sitoplazmik bölgede az, nukleusta fazladır.Sonuç olarak; bu çalışma analitik ve mikroskobik yöntemlerle, incelenen liken türlerinde Sialik asit (Neu5Ac) bulunduğunu tartışmasız olarak kanıtlamaktadır. Ayrıca Sia bağ tipleri (?-2,3 ve ?-2,6) ve yoğunlukları da belirlenmiştir. Likenlerde bu konudaki ilk çalışma olması bakımından önemlidir. Glycoconjugates are found in all cells and they operate in many biological events. The terminal sugar molecule of glycan chains in glycoconjugates structure is generaly sialic acid (Sia). Therefore the roles of glycoconjugates are directly controlled or regulated by Sia. Sialic acids are found widely spreading in all organism from virus to human however the presence of Sia in plants is stil questionable. There is not any such study in lichens.In this study, firstly determination of Sia in two lichen species (H.tubulosa and H.physodes) is targeted. In case of determining, investigating types, quantities, the properties of the chemical bond is intended. Accordingly, first of all the histological structures of lichen species are examined by staining with tolidin blue in semi thin sections from epon blocks in light microscope. In order to elucidate the properties of Sia, analytical (Cap LC-ESI-MS/MS) and microscopic (labeled with HRP lectin in light microscopy , -gold labeled lectin in transmission electron microscopy ) methods were used.Both lichen species being investigated have heteromerous tallus structure. Namely, a clear stratification is observed. These are arranged inwards as epicortex, cortex, algal layer, medulla and lower cortex. The major difference among two species is the structure and distribution of mycobiont cells in cortex layer. While in H.tubulosa loosely scattered cells hold each other with long projections, in H.physodes they are like dense intercellular matrix elements that are stuck to each other.Cap LC-ESI-MS/MS was used to determine Sia types. When compared retention-times of Neu5Ac and Neu5Gc among the standards and samples, only Neu5Ac was found in lichens. Amount of Sia (1.36 ng / mg) in H.tubulosa contained more than that of (0.25 ng / mg) H.physodes. Therefore, lectin histochemistry/cytochemistry investigations were carried out only with H.tubulosa. Sialic acids were mostly found cell surfaces and nuclei of fungal cell in the cortex area by using lectin applications that lowicryl sections (0.75 µm) with HRP-conjugated LFA (Limax flavus agglutinin, specific for all Sia types) , MAA (Maackia amurensis agglutinin, specific for ?2-3) and SNA (Sambucus nigra agglutinin, specific for ?2-6). ?-2,3 linked Sia's are a little more than ?-2,6 linked Sia's -especially in nucleus. In lectin cytochemistry application, Gold-conjugated LFA and LPA (Limulus Polyphemus agglutinin, all Sia types) lectins were used to thin sections of lowicryl. Sialic acides were determined in fungal cell wall, cell membrane and particularly in nucleus. Sialic acids in cell wall and electron dense cytoplasmic region of algal cells were less found than in the nucleus.As a result, this study proves uncontroversially presence of Sialic acid (Neu5Ac) in lichen species by analytic and microscopic methods. Also, bond types (?-2,3 and ?-2,6) and intensity of Sia were determined. . This study is important due to be first study on this issue for lichens. 61

Glikokonjugatların; hücre tutunması, hücre göçü, hücre farklılaşması, fertilizasyon, gelişim, sinyal iletimi, tümör metastazı ve gelişimi gibi birçok biyolojik olaylarda oldukça önemli rolleri vardır. Protein glikozilasyonu, ökaryotik hücrelerin proteinlerinin çoğunda gözlenen bir posttranslasyonel modifikasyondur. Polipeptid zinciri üzerinde bağlı oldukları amino aside ve oligosakkarit zincirlerine göre proteinlerle bağlantı kuran çeşitli glikan aileleri tanımlanmıştır. Bu çalışmada N- ve O- bağlı glikozilasyonun engellenmesinin embriyonik fare karaciğer gelişimine etkilerinin histolojik olarak incelenmesi ve bu glikozilasyon değişimlerinin gelişim sürecindeki apoptozise etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada mikroskobik olarak histolojik yapının ve apoptozisin incelenmesinin yanı sıra, stereolojik yöntemlerle de apoptotik hücre sayımları yapılmıştır. Ayrıca glikozilasyonun engellenmesine bağlı sialik asit analizi için Kapiler HPLC - ElektroSprey İyonizasyon - Kütle Spektroskopisi (Cap LC-ESI-MS/MS) kullanılmıştır. N- ve O- glikozilasyonun engellenmesi karaciğer gelişiminde çeşitli anormalliklere neden olmuştur. Sinüzoidal alanların yapısı bozulmuş ve doku içinde neredeyse kaybolmuştur. Doku içinde yer yer hücre yığınları oluşmuştur. Ayrıca venlerin bazal tabakalarında da bozulmalar görülmüştür. Glikozilasyonun engellendiği gruplarda apoptozisin azaldığı ve bundan dolayı da apoptozisin doku modellenmesinde etkili olamadığı gözlenmiştir. Yapılan sialik asit analizleri sonucunda ise Neu5Ac ve Neu5Gc'nin miktarlarında belirgin bir farklılık olmadığı ancak, stres durumunda artış gösterdiği bilinen asetilli sialik asit miktarlarının arttığı belirlenmiştir. Sonuç olarak glikozilasyonun engellenmesinin hem embriyonik fare karaciğer gelişiminde hem de gelişim sürecindeki apoptotik mekanizmada olumsuz etkilere neden olduğu görülmüştür.

Erkekte, fertilizasyon potansiyellerinin göstergelerinden biri semen analizidir. Dünya Sağlık Örgütü’ne (WHO, 1999) göre yapılan standart semen analizleri spermlerin sayısı, hareketliliği ve morfolojiyi kapsar. Ancak bir semen analizi sadece geniş teşhis kategorileri sağlamaya yardımcı olur. “Yardımcı Üreme Teknikleri”nden erkek infertilitesinin tedavisinde kullanılan ICSI (intrasitoplazmik sperm injeksiyonu) hareketsiz spermlerde de kullanılmaktadır. Bu durum embriyoda hasarlı DNA’nın oluşmasına yol açabilir. Bu nedenle, ICSI’de kullanılan hasar görmemiş spermatazoon için marker bulmak önemlidir ve ejakule spermatazoonun hücre ölüm mekanizmalarını anlamayı gerektirir. Bu gerekçelere dayanak bu çalışmada semen parametrelerinden konsantrasyon, hareketlik ve morfolojiye göre apoptotik ve nekrotik spermleri belirlemek ve olası değişimlerini istatistiksel olarak değerlendirmek amaçlanmıştır. Bunun için, İzmir Tepecik Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuarına gelen 13 gönüllü hastadan alınan semen örneklerinde Hoechst 33342 ve TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nick end labeling) yöntemleriyle apoptotik, propidium iodide ile nekrotik spermler belirlenmiştir. İstatistiksel değerlendirmeler için, semen parametreleriyle apoptozis ve nekrozis arasındaki korelasyon, %95 güven aralığına göre hazırlanan grafiklerde gösterilmiştir. Ayrıca bu parametrelere göre normal ve düşük düzeyli (WHO’ya göre) iki hasta grubu belirlenerek Student t Testi (%95 güven aralığına göre) uygulanmıştır. Apoptozis belirlemek için kullanılan Hoechst 33342 ve TUNEL yöntemlerinden TUNEL’de sperm hücrelerinin sayısal değerleri daha yüksek bulunmuştur. Semen parametrelerinden; sperm konsantrasyonu ile apoptotik sperm oranları arasında istatistiksel bir ilişki bulunamamıştır. Sperm hareketliliği ve morfolojisi ile apoptozis arasında ise ters bir korelasyon vardır. Sperm hareket yüzdeleri ile sağlıklı morfoloji yüzdeleri azaldıkça, apoptotik sperm sayısı artmaktadır. Propidium iodide ile belirlenen nekrozis ile sperm konsantrasyonu arasında ters bir korelasyon bulunmaktadır. Sperm hareketliliği ve morfolojisi açısından ise farklar istatistiksel olarak anlamlı değildir. Apoptozis ve nekrozis oranları karşılaştırıldığında, nekrotik hücreler apoptotik hücrelere oranla daha fazladır.

V ÖZET GALLERIA MELLONELLA (LEPIDOPTERA)'NIN GELİŞEN TESTİSLERİNDE SİALİK ASİDİN ROLÜ BAYRO, İdil Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi; Yrd. Doç. Dr. Remziye DEVECİ Şubat 2006, 32 sayfa Büyük mum güvesi Galleria mellonella (Lepidoptera)'da testis kılıfının yapısı larvadan ergine çeşitli değişiklikler geçirir. Kılıfın dış tabakası ile testisi dıştan saran dış bazal tabaka pupal dönemden itibaren incelmeye başlar. Larval dokuların pupal dönemde bozulması birçok böcekte gösterilmiştir. Bu bozulmada, böcek kan hücreleri hemosiderin iş gördüğü bildirilmektedir. Otolizis mekanizmasında hemosiderin sadece pupal dönemde yaşlı dokuları tanıyıp yok etmesi, bu reseptörlerin genç hücrelerde maskelenmiş olduğunu düşündürür. Maskelemede iş gören molekülün şeker zincirlerinin genelde uç molekülü olan sialik asitin olabileceği öngörülmüştür. Bunun için normal larva ve sialidaz enzimi ile deneysel olarak yaşlandırılmış larvaların testis dokusu hemositlerle yüzleştirilmiş ve ardından Karnovsky tespit sıvısı ile tespit edilmiştir. Suyun çekilmesi ve epon serilerini takiben epon 812'ye gömülmüştür. Bloklardan ultramikrotomda alman 0.5-1 umTik seri kesitler toluidin mavisi ile boyanarak ışık mikroskobunda incelenmiştir.VI Sialidaz ile yaşlandırılmış larval testislerin çevresinde hemositler, çok sayıda hücre katmanından oluşan bir kapsül şekillendirmiştir. Testis kılıf yüzeyi ile esas olarak iki tip hemosit hücresi bağlantı kurmuştur. Bunlar; granülositler ve plazmatositlerdir. Yuvarlak şekilli granülositler; açık renkli sitoplazmaları içinde koyu renkli grandiler içerirler. Çok sayıda uzantılar ile testis kılıfına tutunurlar ve içeriklerini salarlar. Plazmatositler küçük yuvarlak şekilli koyu sitoplazmalıdır. Kılıf ile yüzleştiklerinde yassılaşarak iğ şeklini alırlar. Bu hücrelere ek olarak az sayıda sferülosit hücresi de kapsülde gözlenmiştir. İri, yuvarlak, açık renk granüller içeren bu hücreler testis kılıfı ile de yüzleşirler. Enzim uygulanmamış larval testis dokusunda hemosiderin testis yakınında bol olarak bulunmasına karşın, testis yüzeyi ile herhangi bir bağlantı oluşturmamıştır. Bu sonuçlara göre; testis kılıfı yüzeyindeki sialik asitler maskeleme görevini üstlenerek genç dönemde testisin hemositlerce tanınmasını engellemektedirler. Anahtar kelimeler: Sialik asit, hemosit, enkapsülasyon, testis, Galleria mellonella VII ABSTRACT THE ROLE OF SIALIC ACID IN DEVELOPING TESTES OF GALLERIA MELLONELLA (LEPIDOPTERA) BAYRO, Idil MSc. in Biology Supervisor: Assist. Prof. Dr. Remziye DEVECİ February 2006, 32 pages The structure of testis sheeth of great wax mouth Galleria mellonella alters from larvae to adult in various forms. Both of external layer and basal lamina that surrounding the outer site of testis start to become thin as from pupal stage. Degenarition of larval tissues in pupal stage has been indicated in many insects before. It has been reported that the hemocytes -insect blood cells- have important roles in this degeneration. In the otolysis mechanism; the hemocytes recognize the aged tissues and remove them only in pupal stage. That case; lead us to think that these receptors are masked on young cells. It is foresighted that the molecule, playing role as a mask, is sialic acid which is usually terminal molecule of sugar residues. Therefore; testis tissue of normal larva and the larva aged with sialidase enzyme experimentally were faced with hemocytes and then, fixed with Karnovsky solution. Immediately following the dehydration in graded ethanols and epon series, the specimens were embedded in Eponvm 812. Serial sections (thickness 0.5-1 urn) were stained with Toluidine Blue and investigated in light microscopy. The hemocytes were shaped an encapsulation formed from many cell layers around the larval testis aged with sialidase. Essentially; two kinds of hemocytes are attached to the surface of the testis sheeth. These are granulocytes and plasmatocytes. The granulocytes which are spherical shape contain dark granules in their cytoplasm. They attach to the testes sheath with many of extensions and they secrete their contents. The plasmatocytes with round shape are small and have got dark cytoplasm. When they adhesive to the testis sheath they flatten and take spindle shape. In addition with these results, a few spherulocytes are observed in encapsulation. These large and spherical cells with their light granules also face to the testis sheath. It is observed that although the hemocytes were near the testis abundantly, there is no connection with the surface of the testis on the larval testis sheeth that is untreated enzyme. According to these results; the sialic acids on the surface of the testis sheeth, prevent the recognition of the testis by the hemocytes in early stage by undertaking the masking function. Keywords: Sialic acid, hemocyte, encapsulation, testis, Galleria mellonella 48

Bu çalışmada, G.mellonella'da üretilen fertil ve steril spermler arasındaki yapısal farklar, ışık ve elektron mikroskobu ile incelenmiştir. Ayrıca, bu iki sperm tipi arasında glikozaminoglikanlar açısından farklılıklar olup olmadığı da farklı konsantrasyonlarda MgCl2 içeren Alcian blue ile histokimyasal boyamalar yapılarak araştırılmıştır.Testisteki fertil ve steril spermatidler ayrı demetler oluştururlar. Fertil spermatidlerin nukleusları demetin anteriorunda, aynı hizada görülür. Steril spermatidlerde ise nukleuslar nukleuslar sperm demeti boyunca dağınıktır. Fertil spermler nukleuslarının uzaması, steril spermler ise nukleuslarını kaybederek testisteki gelişimini tamamlar. Sperm kesesine geçen olgun fertil spermlerin silindirik nukleusları demetin anteriorunda birlikte koyu bir bant oluşturur. Sperm kesesindeki steril spermlerde ise nukleus bulunmaz ve spermler dağınık görülür. Olgun fertil ve steril spermlerde mikrotübüllerden oluşan bir aksonem, kuyruk boyunca uzanır. Olgun fertil spermlerde homojen yapıya sahip iri bir mitokondriyum ayırt edilir. Olgun steril spermlerde ise eşit büyüklükte iki mitokondriyum vardır. Farklı konsantrasyonlarda MgCl2 içeren Alcian blue boyamaları ile fertil ve steril spermlerde glikozaminoglikanların varlığı belirlenmiştir. Bunlardan karboksilli olanlar, sülfatlılara oranla daha boldur. Sülfatlı glikozaminoglikanlardan sadece kondroitin sülfat ve dermatan sülfat, fertil spermlerin baş bölgesinde çok az oranda bulunur, kuyruk bölgesinde ve steril spermlerin tamamında yoktur.