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The specific ways in which T cells self-regulate their migratory behaviors during various physiological processes, including immune activation, interstitial migration or immune synapses, greatly depend on cell mechanical properties and the mechanical constraints of the extracellular environment. During aging, changes across immune T cells overall contribute to a decrease in immunological competence, a progression broadly referred to as immunosenescence. The aging-dependent decline of T-cell competence has been mostly studied in terms of differentiation, proliferation, receptor expression, genetic and epigenetic alterations or metabolism. Yet, the question of how aging can affect biophysical markers of T cells potentially involved in cell migration remains an open question with partial answers. Characterizing the mechanical phenotype of primary T cells during aging of individuals has been at the center of this thesis project. To tackle such a large question, a first step was to investigate the links between Tcell mechanical properties and morphological characteristics of intracellular components, by performing multiple measurements on the same cells. Based on the results of this first study, showing that the relative nuclear size can account for variations of T-cell stiffness, a second step was to analyze whether aging prompted biophysical and biomolecular changes in T-cell phenotypes. This thorough analysis represents, to our knowledge, a first longitudinal study of biophysical, morphological, phenotypical and functional analysis (spontaneous migratory behavior) of the kind in primary mouse T cells (CD4+ and CD8+ T cells, in both naive and memory state). Several biophysical parameters that correlated with an age-related decline of T-cell migration were identified, including cell stiffness, DNA-methylation, Lamin B1 thickness and relative nuclear size. Based on these biophysical and biomolecular parameters, an estimation of chronological age was also developed, which represents another innovative aspect of this work. Finally, a biophysical model was proposed to explain the age-related changes of T cells. Several methodological and experimental enhancements were developed in the thesis to address current limitations of the methods and models based on micropipette aspiration (MA) for the analysis of cellular mechanics. In order to quantify mechanical properties at the cellular scale, MA has traditionally been considered a standard for the quantification of suspended cells. However, there are some drawbacks in the MA approach that require to be addressed in order to improve its efficiency and applicability, including the absence of an fully automated analysis, together with the inexistent use of the technique to investigate cells with rigid walls, such as infectious fungal cells, due to the lack of experimental and computational techniques appropriate for this sizable challenge. This dissertation addresses some of these limitations by developing a user-friendly ‘all-in-one’ routine for the image processing of MA microscopy data, a novel approach to quantitatively study multiple parameters on the same cells, and a novel methodology to probe cell mechanics for quantification of the effect of external pressure on the growth of fungal cell. Overall, these advances contribute to the acquisition of mechanophenotypic data which previously could not be obtained by applying the MA technique. ----------RESUMEN---------- La migración de los linfocitos T (o células T) desempeña un papel fundamental en múltiples procesos biológicos, tales como la activación celular, la transmigración endotelial, o la sinapsis inmunológica en caso de infección. Las células T desarrollan todos estos procesos mediante la autorregulación de sus propiedades mecánicas, de acuerdo con los estímulos mecánicos que perciben en el ambiente extracelular. Esta tesis se enmarca en el campo del efecto del envejecimiento sobre los linfocitos T. Con la edad, la gran mayoría de animales manifiesta un declive en su competencia inmunológica, un fenómeno al que se le denomina “inmunosenescencia”. Según las teorías científicas del campo del envejecimiento, la immunosenescencia se produce por la acumulación de cambios moleculares disfuncionales en distintas células inmunes, incluyendo los linfocitos T. En particular, el deterioro funcional de los linfocitos T con la edad se ha medido típicamente mediante marcadores de diferenciación, proliferación, expresión de receptores, alteraciones genéticas, epigenéticas o del metabolismo. Sin embargo, todavía se desconoce en buena medida si el envejecimiento conlleva simultáneamente cambios en las propiedades mecánicas de las células T, y si estos cambios suponen a su vez alteraciones disfuncionales en la migración celular. Esta tesis aborda, principalmente, el problema de los cambios en células T por envejecimiento desde una perspectiva biofísica. Para investigar este problema, en la primera parte de la tesis se realizaron múltiples medidas biofísicas en los mismos linfocitos T. Estas medidas nos permitieron analizar si existían correlaciones significativas entre el comportamiento mecánico celular y un conjunto de características morfológicas de varios componentes intracelulares. Los resultados de este primer estudio revelaron que las variaciones del tamaño relativo del núcleo permitían explicar satisfactoriamente las variaciones en rigidez de los linfocitos T. En base a estos resultados, en la segunda parte de la tesis se realizó un análisis longitudinal, para cuantificar los cambios mecánicos, microstructurales y funcionales que se producían en los linfocitos T con la edad. Con esta tesis se ha conseguido desarrollar la primera investigación longitudinal de linfocitos T primarias de ratón (CD4+ y CD8+, en estado virgen y memoria), que aborda simultáneamente una caracterización biofísica, morfológica, fenotípica y funcional (i.e. capacidad de migración espontánea). Tras analizar todos los parámetros del estudio longitudinal, se identificaron algunos que tenían una correlación significativa con la pérdida de la capacidad de migración espontánea de linfocitos T con la edad. Los parámetros con correlaciones más significativas fueron la rigidez celular, la metilación del ADN, el grosor de la lámina B1 y el tamaño relativo del núcleo. Como parte de este estudio, se utilizaron los parámetros medidos en modelos de regresión linear de una y dos variables para estimar la edad de los individuos. Finalmente, en esta tesis se ha propuesto un modelo biofísico para explicar los cambios que tienen lugar en los linfocitos T durante el envejecimiento. Para llevar a cabo los estudios biofísicos descritos anteriormente, en esta tesis se han desarrollado varias mejoras metodológicas y experimentales de la técnica de aspiración con micropipeta (MA, por sus siglas en inglés). La técnica de MA se ha utilizado habitualmente para cuantificar las propiedades mecánicas de células en suspensión. A pesar de ser una técnica ampliamente utilizada en el campo de la mecánica celular, todavía presenta una serie inconvenientes técnicos que limitan su potencial. Por ejemplo, no es una técnica completamente automatizada, lo cual limita su eficiencia, y no permite estudiar células demasiado rígidas, como las células de planta o de hongos, con paredes celulares y crecimiento longitudinal. Estudiar el comportamiento mecánico de este tipo de células puede ser relevante para, por ejemplo, impedir el desarrollo de infecciones fúngicas letales en individuos inmunodeprimidos. Por ello, en este trabajo se desarrollaron una serie de mejoras técnicas de la técnica de MA, incluyendo una rutina numérica para analizar automáticamente las imágenes de los ensayos de MA, una metodología original para estudiar múltiples parámetros biofísico a nivel de célula única, y una metodología original para investigar el efecto de la presión externa sobre el crecimiento de células de hongos. Estos avances, en general, contribuyen a optimizar la técnica de MA en términos de eficiencia, precisión y rango de aplicaciones.

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