Search

RENAL TRANSPLANT HASTALARINDA BKV SPESİFİK İMMÜN YANITIN ELISPOT YÖNTEMİ İLE ÖLÇÜLMESİBKV, böbrek nakil hastalarında geri dönüşü olmayan allograft hasarına neden olabilen en sık viral etkenlerden biridir. BKV seroprevalansı sağlıklı bireylerde %90'lara ulaşmaktadır. Asemptomatik seyreden ve genellikle erken çocukluk döneminde geçirilen primer enfeksiyonun ardından BKV böbrek ve ürotelyal hücrelerde latent olarak kalır. İmmün sistemi sağlam bireylerin %10-40'ında reaktivasyon ve asemptomatik virüriler görülebilir. BKV böbrek transplant hastalarında immün supresyonla birlikte kendi kendini sınırlayan reaktivasyonlara neden olabilir veya BKVN oluşturabilir. BKVN nakilden sonraki ilk yılda hastaların %1-10'unda görülür ve bu hastaların %50-90'ında greft kaybına neden olur. Çalışmamızda Prof. Dr. Tuncer Karpuzoğlu Organ Nakli Enstitüsünde böbrek nakli yapılan 31 olgudan nakilden önce ve nakli takiben +1 ay, +3 ay ve +6 ay sonra kan örnekleri alındıktan sonra PKMN izole edildi ve saklandı. PKMN'de BKV spesifik T hücre sıklığı ELISPOT yöntemi kullanılarak araştırıldı. Hastaların plazma veya idrar BKV viral yük tayinleri gerçek zamanlı PZR ile ölçüldü. Nakilden sonra 7. ayda reaktivasyon gelişen bir hasta da çalışmaya dahil edildi ve reaktivasyon sonrası toplam 4 kez BKV spesifik T hücre yanıtları ölçüldü.Çalışmaya dahil edilen hastaların tüm örneklerinde BKV spesifik T hücre yanıtı ölçülebilir düzeyde bulundu. Kontrol grubunun ortalama spot sayıları ile hastaların transplantasyon öncesi elde edilen spot sayıları arasında anlamlı fark saptanmadı. Hastaların BKV spesifik immün yanıtları karşılaştırıldığında, yanıtın immün supresyonun en yoğun olduğu 1. ayda en düşük olduğu saptandı. İzlem sırasında reaktivasyon gelişen hastalarla; reaktivasyon gelişmeyen hastaların nakil öncesi spot sayıları arasında fark gözlenmedi. İzlem süresince 8 hastada reaktivasyon gelişti. Reaktivasyon gelişen ve BKV DNA'ları 2 ve 3 kez bakılan 2 hastada reaktivasyon zamanında BKV spesifik T hücre yanıtının düştüğü ve immün yanıtta artışın BKV viral yükünde azalma veya temizlenme ile uyumlu olduğu gözlendi. Sonuç olarak, böbrek nakil hastalarında idrar veya kanda BKV DNA yükleri ile eş zamanlı olarak, BKV spesifik immün yanıtın ELISPOT yöntemi kullanılarak izlenmesinin, BKV reaktivasyonunun prognozu ile ilgili ön bilgi verebileceği böylece BKVN gelişiminin önlenebileceği ve tedavi sırasında immün yanıtta oluşan değişikliklerin değerlendirilebileceği düşünülmektedir.Anahtar sözcükler: BKV, Böbrek Nakli, Hücresel İmmünite, ELISPOT. MEASURING OF BKV SPECIFIC IMMUNE RESPONSE BY ELISPOT METHOD IN RENAL TRANSPLANT PATIENTSBKV is one of the most frequent viral agents causing irreversible allograft failure in kidney translant patients. The seroprevalence of BKV reaches up to 90% in healthy population. After primary infection which is asymptomatic and occurs generally in early childhood, BKV remains latent in renal and urothelial cells. In 10-40% of immunocompetent individuals, reactivation and asymptomatic viruria can be seen. In renal transplant patients, BKV can cause self limited BKV reactivation or BK virus nephritis. After renal transplantation, BKV nephritis occurs in 1-10% of patients and leads to graft loss in 50-90% of them. In our study, after blood samples from 31 cases who had renal transplantation in Prof. Dr. Tuncer Karpuzoğlu Organ Nakli Enstitüsü were collected before transplantation and +1, +3, +6 months following transplantation, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated and cryopreserved. In PBMC, BKV specific T cell frequency was analyzed bu using ELISPOT method. Plazma or urine viral loads of patients were measured by real time PCR. A patient who developed reactivation 7 months after transplantation was included in the study and BKV specific T cell responses were measured 4 times in total after reactivation. All the samples from patients included in the study had detectable levels of BKV specific T cell response. Mean spot numbers obtained from the patients prior to transplantation were not significantly different from the mean spot numbers of the control group. When BKV specific immune responses of patiens were compared, it was found that immune response was lowest in the first month in which immune suppression was highest. No difference was observed in the pretransplantation spot numbers between the the patients who developed reactivation and who did not have reactivation during the monitorization. Eight patients developed reactivation during the monitorization. In the two patients who had reactivation, with 2 and 3 BKV DNA results each, it was observed that BKV specific T cell immunity decreased during reactivation and increase in the immune response was correlated with the decrease or clearance of BKV viral load. In conclusion, it is thought that monitorization of BKV specific immune response by using ELISPOT method with plasma or urine BKV DNA viral loads in renal transplant patients can give us predictive information about prognosis of BKV reactivation, hence leading to prevention of BKVN development and evaluation of changes in immune responses during therapy. Key words: BKV, Renal Transplantation, Cellular Immunity, ELISPOT. 97

1. ÖZET Klinik Örneklerden Soyutlanan Ânaerop Bakterilerde p-Iaktamaz Aktivitesî ve Antibiyotik Direncinin Belirlenmesi Anaerop bakterilerde identifikasyon ve duyarlılık sonuçları tedavi başladıktan günler sonra sonuçlandığından, sağaltıma genellikle ampirik olarak başlanmaktadır. Bu sebeple, klinik laboratuvarlarda anaeropların antibiyotik duyarlılıkları rutin olarak yapılmadığından, referans merkezleri tarafından belirli aralıklarla yapılan testlerle antibiyotik direnç paternlerini izlemek önemlidir. Çalışmamızda klinik örneklerden soyutlanan 27 anaerop bakterinin gram reaksiyonu, koloni morfolojisi ile Vitek cihazı ve `An-iden t diskleri ile identifikasyonları yapılmıştır. Bunun yanında tüm suşların amoksisilin klavulanat, siprofloksasin, sefoksitin, imipenem, klindamisin ve metronidazole duyarlılıkları referans yöntem olan agar dilüsyon ve E test ile belirlenmiştir. NCCLS standartları doğrultusunda çalışılan agar dilüsyon sonuçları ile üretici firma önerilerine göre uygulanan E test sonuçları karşılaştırmıştır. İki yöntemde de besiyeri olarak K vitamini ve hemin eklenmiş Brucella agar kullanılmıştır. Ayrıca suşların (3-laktamaz aktiviteleri de nitrosefin çubukları kullanılarak araştırılmıştır, vitek otomatizasyon sistemi ile suşların altısı B. uniformis, üçü B. fragilis, ikisi B. ureolyticus, ikisi S. ovatus, biri B. vulgatus, biri B. eggerthîi, biri Ö. caccae, ikisi P. melaninogenica, biri P. buccae, biri P. oris, ikisi C. perfringens, ikisi C. tertium, ikisi C. sporogenes ve biri P. anaerobius olarak tanımlanmıştır. Vitek sistemi ile tüm suşlarda %85.7, Bacteroides türlerinde %93.8 tutarlılığa sahip `An-idenf disklerinin, Bacteroides türlerini tanımlamada yüksek oranda başarılı olduğu saptanmıştır. Hastanemizde soyutlanan suşlar genel olarak metronidazol, imipenem, amoksisilin klavulanat, sefoksitin, klindamisin ve siprofloksasine sırası ile %100, %96.3, %88.9, %81.5, %81.5, %48.1 oranlarında duyarlı bulunmuştur. Anaerop izolatların duyarlılıkları göz önüne alındığında, her iki yöntem arasındaki tutarlılık IVİİK değerleri ±2 dilüsyon sınırları içinde ele alındığında %88.6, kategoriler ele alındığında ise %95.8 olarak belirlenmiştir.Sonuç olarak anaerop bakterilerin tanımlanmasında özellikle kısıtlı olanakların bulunduğu laboratuvarlarda `An-idenf disklerin kullanılabileceğini düşünmekteyiz. Hastanemiz açısından izolatların sonuçları değerlendirildiğinde metronidazol ve imipenemin en etkin ilaçlar oldukları saptanmıştır. Bunların yanında bulgularımız doğrultusunda anaerop bakterilerin antibiyotik duyarlılıklarının rutin olarak araştırılmasında, referans yöntem ile uyumlu sonuçlar veren E test yönteminin uygun, pratik ve güvenilir bir yöntem olduğunu söyleyebiliriz. Anahtar kelimeler: Anaerop bakteriler, Antibiyotik duyarlılığı, p-laktamaz, E test, agar dilüsyon 2. SUMMARY Determination of p-lactamase Activity and Antibiotic Resistance Rates in Anaerobic Bacteria Isolated From Clinical Specimens In general empiric therapy is used in anaerobic infections, because precise identifications and susceptibility results of anaerobic bacteria are usually generated days after therapy has been initiated. Because antibiotic susceptibility testing of anaerobes is not generally routinely performed in clinical laboratories, periodic monitoring of resistance patterns in reference laboratories is esentially important. In our study, we identified 27 anaerobic bacteria which were isolated from clinical specimens with gram reaction, colony morphology, `An-idenf disks and Vitek system. Susceptibilities of all our isolates to amoxicillin/clavulanate, ciprofloxacin, cefoxitin, imipenem, clindamycin and metronidazole were also determined by reference agar dilution and E test methods. Results obtained by agar dilution method which was performed as recommended by NCCLS were compared with results of E test, performed according to the manufacturer's instructions. In both methods Brucella agar supplemented with vitamin K and hemin was used as media. Then we tested B-lactamase production of our isolates by using nitrocefin sticks. Vitek system identified 6 of isolates as B. uniformis, 3 as B. fragilis, 2 as B. ureolyticus, 2 as B. ovatus, 1 as B. vulgatus, 1 as B. eggerthii, 1 as B. caccae, 2 as P. melaninogenica, 1 as P. buccae, 1 as P. oris, 2 as C. perfringens, 2 as C. tertium, 2 as C. sporogenes and 1 as P. anaerobius. It was clear that `An-idenf disks were highly successful for identification of Bacteroides species with an agreement rate of 93.75%. `An-idenf disk results agreed with Vitek findings with a rate of 85.7% for all species. Susceptibility rates of anaerobic bacteria isolated from our hospital to metronidazole, imipenem, amoxicillin/clavulanate, cefoxitin, clindamycin and ciprofloxacin were 100%, 96.3%, 88.9%, 81.5%, 81.5%, 48.1%, respectively. The agreement of MICs by both methods was found to be 88.6% within two-fold dilutions while categorical agreement was 95.8%.As a result, we conclude that `An-idenf disks are useful for identification of anaerobic bacteria especially in small laboratories. According to the susceptibility rates of our isolates, metronidazole and imipenem were found to be the most active agents. According to our findings, we can say that suitable, practical and reliable E test, which gives consistent results with the reference test, may be an alternative method for routine susceptibility testing of anaerobic bacteria. Key words: Anaerobic bacteria, antibiotic susceptibility, p-lactarnase, E test, agar dilution 69

Klinik Örneklerde DFS Paterninin ve Anti-DFS70 Antikorunun AraştırılmasıANA sistemik otoimmün romatizmal hastalıklar için (SARD) tanı, takip ve prognozda yol göstericidir. ANA tanımlanmasında IIF yöntemi altın standart yöntem olup, tarama amaçlı kullanılmaktadır. Hücrenin hangi yapısına karşı antikor oluştuğu ise doğrulama testleri ile belirlenmektedir. DFS paterni de dahil olmak üzere ANA'nın duyarlı bir tarama testi sonrası yüksek özgüllüğe sahip bir doğrulama testi ile doğrulanması önerilmektedir. Bu yaklaşıma refleks test yöntemi adı verilmektedir. Anti-DFS70 antikor varlığında doğrulamada sıklıkla ELISA, LIA gibi yöntemler kullanılmakla birlikte, son yıllarda hem DFS paterninin tanınmasındaki zorlukların önüne geçmek için hem de doğrulamanın tek basamakta yapılabilmesi için yeni IIF yöntemleri geliştirilmeye çalışılmıştır.Biz bu çalışmada ortada HEp-2 hücresi, yanında bulunan DFS70 antijeni içeren Dotların bir araya getirilmesiyle oluşan CytoBead (Generic Assays, Germany) yöntemini, rutin iki basamaklı test stratejisi ile karşılaştırdık. Çalışmamızda rutin uygulamada ANA IIF testinde yoğun ince benekli çıkan örnekler, doğrulama yöntemi olarak LIA testi ile çalışılmıştır. IIF ve LIA sonuçlarına göre dört gruba ayrılan 479 örnek, CytoBead IIF yöntemi ile, bunların arasından seçilen 264 örnek ELISA testi ile çalışılmıştır.IIF yöntemi ile DFS paterni saptanan 329 örneğin sadece %54.4'ü CytoBead HEp-2 testi ile pozitif saptanmıştır. IIF (+) LIA (+) ELISA (+) olan 106 örnekte CytoBead HEp-2+Dot testi 105'ini (%99.1) pozitif olarak bularak oldukça yüksek bir oran vermiştir. Sonuç olarak, CytoBead IIF yöntemi ile hem yoğun ince benekli patern tanımlanabilmekte, hem de tarama ve doğrulama tek basamakta yapılabilmektedir. Böylelikle daha maliyet etkin bir yaklaşım sunmaktadır. CytoBead HEp-2 hücre substratının geliştirilmesi ile yakın bir gelecekte rutin tanıda yerini alabileceği düşünülmektedir. Anahtar Sözcükler: Anti-DFS70, AARD, CytoBead Investigation of DFS Pattern and Anti-DFS70 Antibody in Clinical SamplesANA is a guide in the diagnosis, follow-up and prognosis of systemic autoimmune rheumatic diseases (SARD). The IIF method is the gold standard method for the identification of ANA and is used for screening purposes. The nature of the antibody against the cell is determined by confirmatory tests.It is recommended that the ANA, including the DFS pattern, should be verified with a highly specific confirmatory test after a sensitive screening test. This approach is called reflex test method. Although methods such as ELISA and LIA are often used to confirm the presence of anti-DFS70 antibodies, new IIF methods have been developed in recent years in order to prevent the difficulties in the recognition of the DFS pattern and to carry out the confirmatory test in a single step. In this study, we compared the CytoBead (Generic Assays, Germany) method with the HEp-2 cell and the Dot with DFS70 antigen, to the routine two-step test strategy. In our study, the samples which were DFS pattern in ANA IIF test in routine practice were studied with LIA test as a confirmatory method. Four hundred seventy nine samples were divided into four groups according to the results of IIF and LIA. They were studied by CytoBead IIF method and 264 among them were studied by ELISA.Only 54.4% of 329 samples with DFS pattern determined by IIF method were found positive by CytoBead HEp-2 test. In 106 samples with IIF (+) LIA (+) ELISA (+), CytoBead HEp-2 + Dot test found 105 (99.1%) positive and gave a very high ratio.Conclusively, both the scanning of DFS pattern the and verification of anti-DFS70 antibody and can be done in one step With the CytoBead IIF method. Thus, it offers a more cost-effective approach. With the development of CytoBead HEp-2 cell substrate it is thought that it will be able to take its place in routine diagnosis in the near future.Key Words: Anti-DFS70, AARD, CytoBead 100