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347 p. Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory neurological disease whose underlying cause remains uncertain and can be influenced by different environmental and genetic factors. We have studied two MS-susceptibility genes, IL22RA2 and IL12A, to better understand their regulation and relationship to MS. We demonstrated that the IL22RA2 gene gives rise to three isoforms in monocyte-derived dendritic cells (moDCs).. We also found that CD14++/CD16+ intermediate monocytes produced higher levels of IL22RA2 mRNA than classical and non-classical monocytes. Using transfected human cell lines, we demonstrated that the protein product of IL22RA2 variant 1 (IL22RA2v1), the IL-22BP isoform 1 (IL-22BPi1), was poorly secreted and largely retained in the endoplasmic reticulum (ER). We performed interactome analysis to uncover the mechanism underlying the ER retention of IL-22BPi1 and identified ER chaperones GRP78, GRP94, GRP170 and calnexin as main interactors. Structure-function analysis revealed that, like IL-22BPi2, IL-22BPi1 binds to the substrate-binding domain of GRP78 as well as to the middle domain of GRP94, and thus, we have demonstrated the domain of interaction of IL-22BPi1 and IL-22BPi2 with GRP78 and GRP94. Upon silencing of IL22RA2 expression in moDC, GRP78 levels were significantly reduced, suggesting that native IL22RA2 expression naturally contributes to upregulated GRP78 levels in these cells. Finally, we demonstrated that another variant apart from the canonical IL12A was expressed in moDCs and in different immune and epithelial cells lines. Altogether, our work highlights the relevance of the study of splicing variants of MS susceptibility genes for a better understanding of the effect of the genetic factors in the disease.

La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es capaz de causar una enfermedad hepática crónica que puede derivar en cirrosis y cuyo curso se altera por la coinfección con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La enfermedad puede progresar hasta cirrosis avanzada, desarrollando hipertensión portal clínicamente significativa (HPCS). En este trabajo, hemos caracterizado alteraciones moleculares ocurrentes en pacientes coinfectados por el VHC y el VIH durante la cirrosis avanzada, que abarcan tanto marcadores plasmáticos, como alteraciones metabólicas y transcriptómicas. En primer lugar, los marcadores plasmáticos de inflamación IP-10, IL-8, IL-6 y OPG, los de disfunción endotelial, sVCAM-1 y sICAM-1, y de riesgo trombótico como el dímero D, se encontraron más elevados en aquellos pacientes con una cirrosis más severa. En segundo lugar, los estadios avanzados de cirrosis se relacionaron con cambios en el perfil metabolómico. Por un lado, se encontraron aumentados los ácidos grasos, ácidos biliares, aminoácidos aromáticos y azufrados, derivados del butirato, fosfolípidos oxidados, y aquellos metabolitos relacionados con la energía y con la fermentación bacteriana. Por otro lado, las lisofosfatidilcolinas (LPC) y las lisofosfatidiletanolaminas, los aminoácidos ramificados y los metabolitos del ciclo del ácido tricarboxílico disminuyeron. Además, los pacientes con cirrosis avanzada monoinfectados por el VHC y los coinfectados por VHC/VIH no presentaron grandes diferencias, tanto a nivel de biomarcadores plasmáticos como de alteraciones metabólicas. En tercer lugar, los pacientes con alto riesgo de desarrollar HPCS (LSM ≥ 25 kPa) fueron caracterizados por una firma de expresión génica diferencial que englobaba 38 transcritos sobreexpresados y 22 infraexpresados. Por último, las distintas alteraciones moleculares estudiadas permitieron distinguir subgrupos de pacientes con interés clínico. La combinación de IL-6 e IP-10 y, separadamente, la de los metabolitos ácido glicólico, LPC (16: 0) y ácido taurocólico diferenció a aquellos pacientes con cirrosis descompensada. Además, los transcritos STAG3L2 y MDK mostraron buena capacidad para discriminar a los pacientes en alto riesgo de desarrollar HPCS. En conjunto, este trabajo permite ampliar el conocimiento de los procesos subyacentes durante el curso de esta enfermedad y abre la puerta para nuevos desarrollos que faciliten y mejoren el manejo de estos pacientes.

El síndrome antifosfolipídico (SAF) es una enfermedad autoinmune con diversas formas de presentación clínica como las trombosis y los abortos de repetición. En la actualidad no se disponen de unos criterios diagnósticos para la enfermedad, aunque si de unos criterios clasificatorios diseñados con finalidades de investigación. En dichos criterios se considera que un paciente para ser clasificado como SAF debe tener, además de manifestaciones clínicas, al menos una de las siguientes pruebas de laboratorio positivas: anticoagulante lúpico, anticuerpos anti cardiolipina o anti β 2 glicoproteína I (aB2GP1) de isotipo IgG o IgM. Estas pruebas son conocidas como anticuerpos antifosfolipídicos (aFL). Pacientes con manifestaciones clínicas del síndrome en ausencia de estas pruebas de laboratorio son considerados como “SAF seronegativo”. En este trabajo proponemos que esto pudiera suceder tanto a la falta de optimización en las técnicas de detección utilizadas en el laboratorio, como a la presencia (y no determinación) de otros aFL actualmente no incluidos en los criterios de clasificación. Para cumplir con este objetivo reunimos un total de 921 controles sanos y 2 cohortes de pacientes de 4487 y 1020 respetivamente en el Laboratorio de Autoinmunidad del Servicio de Inmunología del Hospital Universitario 12 de Octubre (Madrid, España). En la primera cohorte determinamos 2 aFL no incluidos en los criterios de clasificación: los aB2GPI de isotipo IgA y los anticuerpos antifosfatidilserina/protrombina (aFS/PT). En la segunda de estas cohortes comparamos 2 métodos diagnósticos automatizados. Como resultado obtuvimos que la contribución de los aB2GPI de isotipo IgA y aFS/PT es independiente, equiparable e incluso mayor a la de los anticuerpos incluidos en los criterios de clasificación de Sídney. Incluso al ser analizados por manifestaciones clínicas específicas. También observamos que la comparabilidad y uniformidad entre las diferentes pruebas disponibles para la detección de los aFL incluidos en los criterios es baja.

197 p. Las células "natural killer" (NK) son un componente clave del sistema inmunitario innato y una de sus funciones es reconocer y eliminar células malignas. El trasplante autólogo de precursores hematopoyéticos (TASPE) es un tratamiento establecido en todo el mundo para muchos tumores hematológicos, incluyendo el mieloma múltiple (MM). Se ha descrito que la reconstitución temprana de las células NK tras el TASPE tiene un papel muy importante en el pronóstico de los pacientes con MM. El objetivo principal de este trabajo ha sido estudiar los cambios en las subpoblaciones de células NK durante su reconstitución tras un TASPE en pacientes diagnosticados con MM. En esta tesis doctoral, en primer lugar, observamos que la expresión del receptor NKp80 en la superficie de las células NK no se veía alterada en diferentes condiciones y que, además, era más específico que el marcador CD16 tradicionalmente usado para identificar las células NK CD56neg. Además, mediante el uso de la citometría de flujo y el análisis del trascriptoma mediante secuenciación de ARN (ARN-seq), demostramos que las células NK experimentan un cambio tanto fenotípico como a nivel de perfil de expresión génica tras el TASPE. De este modo, los experimentos de ARN-seq demostraron que las células NK adquieren un fenotipo similar al de las células NK deciduales. Por último, descubrimos que la frecuencia de células NK con el fenotipo NKG2A-CD57+ se asocia al pronóstico de pacientes con MM sometidos a TASPE.

La infección por HTLV-2 ha sido estudiada, en gran medida, en individuos que conviven con el VIH-1 en su organismo, y se ha demostrado que es capaz de producir un retraso en la progresión a SIDA. El presente trabajo doctoral ha partido de una extensa población de personas infectadas por el VIH-1 que siguen una revisión médica en el Hospital Ramón y Cajal de Madrid, España. La población consta de 1716 pacientes en seguimiento, cuyos historiales sanitarios han sido tomados desde la base de datos facilitada por el personal clínico que evalúa el seguimiento de cada uno. La población en estudio se ha clasificado en dos grandes subpoblaciones: una de ellas está integrada por individuos VIH-1+ con coinfección por HTLV-2 (denominada subpoblación HT2+ o coinfectados); y la otra está representada por individuos infectados VIH-1+ sin infección por HTLV-2 (subpoblación HT2- o monoinfectados). Diversos estudios se han llevado a cabo para analizar la influencia que ejerce el HTLV-2 sobre la infección por VIH-1. Entre ellos, se ha visto que la actividad citolítica, tanto celular (citotoxicidad ejercida por linfocitos T CD8+) como soluble (citoquinas en plasma), es mayor en la subpoblación HT2+ que en la subpoblación HT2-, analizadas por medio de técnicas de inmunoanálisis. Hay una estrecha relación entre la adquisición de HTLV-2 y la adicción a drogas por vía parenteral. Casi la totalidad de los pacientes de la subpoblación HT2+ está representada por personas que fueron adictas a sustancias administradas por vena y ese mismo porcentaje corresponde a individuos que presentan anticuerpos frente al virus de la Hepatitis C (VHC), estableciéndose una correspondencia entre la vía parenteral y las infecciones por VHC y HTLV-2. La medida de la carga proviral VIH-1 alcanza unos niveles inferiores en presencia de infección por HTLV-2, estudiado mediante Real Time-qPCR (RT-qPCR). Se ha estudiado, en la base de datos de los historiales clínicos de los pacientes, el posible desarrollo tumoral y la tasa de supervivencia en presencia y ausencia de HTLV-2, y se muestra que hay un menor número de individuos con cáncer en la clasificación de coinfectados que en la de monoinfectados, especialmente en el caso de hepatocarcinomas. A nivel celular, el ratio entre los linfocitos T CD4+ y CD8+ es menor en presencia de infección por HTLV-2 que en monoinfectados. Todo ello parece indicar que el HTLV-2 tiene la propiedad de proteger de manera importante a los individuos que han sido infectados por este virus, frente a la enfermedad del SIDA, retrasando su evolución, y esto lo hemos podido observar, por ejemplo, en la reducción de la integración del VIH-1 en sus células diana, en el incremento de la actividad citolítica defendiendo al organismo de la acción del VIH-1, y se ha visto una menor cantidad de desarrollo de tumores, aunque los pacientes permanecen en estado de salud delicado. Los principales objetivos de este trabajo son evaluar: si la infección por el HTLV-2 modula determinadas características inmunovirológicas; la respuesta citotóxica soluble (mediado por perforinas y granzimas) y celular (mediado por actividad de linfocitos T CD8+); el bloqueo en la integración del VIH-1 en sus células diana; y la protección frente al desarrollo de tumores en individuos infectados por el VIH-1. Palabras clave: VIH-1, SIDA, HTLV-2, carga proviral VIH-1, actividad citolítica.

El objetivo del estudio es determinar si en pacientes con diagnóstico de Síndrome mielodisplásico (SMD) clasificados por IPSS-R como muy bajo riesgo, bajo riesgo o riesgo intermedio, existe una correlación pronóstica entre poblaciones linfoide de progenitores B, y los linfocitos CD4, CD8 y NK, obtenidos por citometría de flujo en la médula ósea al momento del diagnóstico, y la supervivencia libre de progresión (SLP) hacia un estado de SMD con exceso de blastos-2 o leucemia mieloide aguda. Para ello se estudiaron 82 pacientes con diagnóstico y seguimiento en el Hospital Ramón y Cajal (Madrid, España) entre los años 2006-2016. Se obtuvo una población con 7.3%, 58.5% y 34.2%, de porcentaje de pacientes en los grupos muy bajo, bajo y riesgo intermedio, respectivamente, con un promedio global de progresión a leucemia de 26.2 meses. Para ello se utilizó un median split analysis y el estudio de conglomerados. Con ello se obtuvo que existía un riesgo 2 veces mayor de progresión a estadios avanzados, con una depleción de progenitores B menor al 0.1% (HR de 2.04, con un IC955: 1.11-3.57) y con una cifra de linfocitos NK menor a 2.8% (HR de 2.06, con un IC95: 1.25-3.39). Con los linfocitos CD4 y CD8 se observó que la depleción de éstas poblaciones mostraba una tendencia a progresión más rápida pero sin un resultado estadísticamente significativo. Adicionalmente, el estudio de conglomerados mostró que la depleción de progenitores B, linfocitos CD4, CD8 y NK, está asociada a menor SLP.

[ES] El MM sigue siendo en la actualidad una enfermedad incurable en la mayoría de los pacientes, lo que supone observar recaídas sucesivas tras una primera línea. El objetivo de tratamiento es, por una parte, alcanzar la mejor y más profunda respuesta posible, y mantenerla a largo plazo, para prevenir recaídas y prolongar la supervivencia global. En ese sentido, el sistema inmune tiene un papel clave en el pronóstico del MM, bien porque muchas estrategias se dirigen a potenciarlo o bien porque un sistema inmune lo más sano posible o que se recupere con el tratamiento permitirá un mejor control de la enfermedad. En este estudio, se ha propuesto evaluar el papel del sistema inmune en dos situaciones diferentes: candidatos a ASCT y no candidatos. - Candidatos a ASCT: La administración de altas dosis de quimioterapia y ASCT se considera el estándar de tratamiento en los pacientes con MM que son candidatos a ello. Tras ASCT, diferentes estrategias como la consolidación y el mantenimiento se han intentado estandarizar para profundizar hasta la mejor respuesta posible y mantenerla en el tiempo, con el objetivo de lograr un incremento de la supervivencia. Se considera que la respuesta alcanzada aproximadamente en el día +100 desde el ASCT es la máxima respuesta que se alcanza con dicho procedimiento, por lo que las mejorías en la respuesta que se observan a partir de este momento y bajo consolidación y/o mantenimiento se deben al efecto beneficioso del tratamiento post-ASCT. Sin embargo, algunos estudios sugieren que puede haber pacientes respondedores tardíos que mejoran espontáneamente su respuesta más allá del día +100 post-ASCT, lo cual podría poner en duda la utilidad o necesidad del tratamiento post-ASCT. Por tanto, se considera que el tiempo para evaluar la respuesta es el día +100, pero hipotetizamos que un potencial restablecimiento inmune tras el ASCT, podría inducir respuestas más allá de este momento y, podría interferir en la evaluación de la eficacia de otros tratamientos, como el mantenimiento. - No candidatos a ASCT: En el momento actual, estos pacientes reciben tratamiento hasta la progresión de la enfermedad. Cada vez más se utilizan tratamientos como IMiDs y anti-CD38, en los cuales, la presencia de un sistema inmune preservado puede ser clave para su eficacia. Una de las manifestaciones de la disfunción del sistema inmune es la inmunoparesia (disminución de las inmunoglobulinas policlonales). Nuestra hipótesis es que la utilización de un posible biomarcador del funcionamiento del sistema inmune, como es la inmunoparesia, y, más importante su recuperación durante el tratamiento, podría afectar a la eficacia de estos u otros tratamientos e influir en el pronóstico de estos pacientes. Hipotéticamente, la presencia de inmunoparesia al diagnóstico se relacionaría con peor pronóstico y, al mismo tiempo, la recuperación de la misma durante el tratamiento debería impactar de forma positiva en el pronóstico de los pacientes, como reflejo de una mejor funcionalidad del sistema inmune para el control de la enfermedad. En base a lo anteriormente expuesto, se determinan los siguientes objetivos específicos: - Con respecto a los pacientes candidatos a ASCT • Determinar la tasa de mejoría de respuesta tardía (más allá del día +100) en pacientes con mieloma múltiple que han recibido trasplante autólogo. • Determinar los factores que se puedan relacionar con una mejoría de respuesta tardía post trasplante. • Determinar el impacto pronóstico de la respuesta tardía en supervivencia frente a aquéllos en que no se produce. - Con respecto a los pacientes no candidatos a ASCT • Determinar la frecuencia de inmunoparesia al diagnóstico en los pacientes no candidatos a trasplante autólogo. • Determinar los factores que se asocian con la aparición de inmunoparesia al diagnóstico. • Determinar el impacto pronóstico de la inmunoparesia al diagnóstico en los pacientes con mieloma múltiple no candidatos a trasplante autólogo. • Determinar la tasa de normalización de las inmunoglobulinas policlonales durante el tratamiento o tras la finalización del mismo, en los pacientes con mieloma múltiple no candidatos a trasplante autólogo. • Determinar los factores evolutivos que se relacionan con la normalización de las inmunoglobulinas policlonales. • Determinar el impacto pronóstico de la normalización de las inmunoglobulinas policlonales.

El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia de células B caracterizada por la expansión y acumulación de células plasmáticas (CPs) patológicas en la médula ósea (MO). El MM constituye el 1% de todas las neoplasias y supone el 10% de las hemopatías malignas. En las últimas dos décadas se han logrado importantes avances en el tratamiento del MM, principalmente con la introducción de inhibidores del proteosoma, fármacos inmunomoduladores y anticuerpos monoclonales (mAb). Sin embargo, el MM sigue siendo una enfermedad altamente resistente dada su propensión a la heterogeneidad clonal y su compleja interacción con el microambiente medular. Son necesarias estrategias terapéuticas novedosas capaces de revertir la resistencia a los tratamientos de primera y otras líneas. Nos propusimos investigar los mecanismos de acción de isatuximab (mAb anti-CD38) y EM801 (anticuerpo biespecífico BCMAxCD3) mediante cultivos con los fármacos, utilizando tanto líneas celulares como muestras primarias de MO de pacientes con MM. Isatuximab es un mAb IgG1κ, que reconoce específicamente un epítopo concreto de CD38. Inicialmente, hemos investigado un efecto directo de este mAb, sobre el receptor CD38, concluyendo que isatuximab no tiene efecto directo sobre las líneas de MM con baja o alta expresión de CD38. Además, este mAb no produce una liberación significativa de la molécula de la superficie de las CPs. A continuación hemos evaluado diferentes mecanismos de acción responsables del efecto de isatuximab. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo se proclama como mecanismo efector más relevante por el cual elimina las CPs mielomatosas, siendo las células NK la subpoblación más importante para la acción inequívoca del fármaco. Los mecanismos de fagocitosis celular y citotoxicidad dependiente de complemento solo ocurrirían en pacientes con una densidad de CD38 muy elevada en sus CPs, mostrando de esta manera una asociación directa entre los niveles de expresión y los mecanismos desarrollados por el fármaco. Además, isatuximab induce depleción significativa de precursores B, basófilos y células NK. Por último demostramos que isatuximab se une tanto al receptor FcγRIII como a CD38 presente en la superficie de células NK, provocando una activación y posterior depleción de estas células. EM801 es una IgG asimétrica, bivalente para BCMA y monovalente para CD3ε. Con este diseño, se produce una unión preferencial de las CPs con los linfocitos T. Inicialmente, hemos demostrado que la molécula BCMA se expresa de modo selectivo en las CPs, estando ausente en el resto de poblaciones leucocitarias. A continuación, mediante microscopia de fluorescencia y fuerza atómica, hemos verificado que EM801 produce una unión estrecha y selectiva de la CP y el linfocito T. Esta unión provoca una activación de los linfocitos T con expresión de marcadores de activación como son CD69 y CD25. Además, mediante ELISA, hemos observado una secreción significativa de interferón gamma, granzima B y perforina. La eficacia del fármaco se demostró en cultivos de MO de 43 pacientes con MM, obteniendo una lisis significativa en el 79% de los casos. Además, se estudió la toxicidad que podría tener EM801 sobre otras células de la MO, no observando una muerte relevante en células B, T, NK ni neutrófilos. Por último, hemos testado EM801 en un modelo de xenoinjerto subcutáneo en ratones NOG, observando regresión tumoral en 6 de 9 ratones tratados. En el modelo animal de mono cynomolgus, utilizado para evaluar la actividad del fármaco en un ambiente autólogo, se corroboró la lisis significativa de CPs, así como una disminución en los niveles de IgG e IgM. En estos animales, se observó un aumento ligero y transitorio de citoquinas, que regresaba a niveles basales tras 24 horas de la inyección del fármaco, con lo que podemos concluir que EM801 muestra un perfil de toxicidad aceptable y un perfil farmacocinético que permitiría su administración semanal.

201 p. Las moléculas CD300 se expresan en la superficie de células del sistema inmunitario. Estos receptores modulan numerosos procesos inmunológicos y se ha descrito que tienen un papel importante en la inmunopatogenia de distintas enfermedades, incluyendo infecciones virales. El objetivo principal de este trabajo ha sido investigar la expresión, regulación de la expresión y función de los receptores CD300 en distintas células inmunitarias de individuos sanos, y estudiar cómo esto se altera durante la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1. En esta tesis doctoral, observamos que el patrón de expresión de los receptores CD300 es distinto entre poblaciones y subpoblaciones de células inmunitarias, así como entre adultos y recién nacidos. Además, describimos que la activación de los monocitos mediada por CD300c y CD300e es menor en recién nacidos que en adultos. En el contexto de la infección por VIH-1, en primer lugar observamos que la expresión de las moléculas CD300e y CD300f en monocitos de pacientes infectados por VIH-1 bajo cART se asocia con el número de linfocitos T CD4+ y una mayor producción de TNF en respuesta al LPS, pero no en pacientes vacunados con la vacuna frente al VIH-1 MVA-B. También descubrimos que la expresión del receptor CD300a está alterada en las células NK CD56neg en pacientes infectados por VIH-1 no tratados y que este receptor inhibe la degranulación y la producción de citoquinas mediada a través del receptor CD16 en células NK de pacientes infectados por VIH-1. Después, observamos que la expresión del receptor CD300a está alterada también en linfocitos T CD4+ de pacientes infectados por VIH-1 y que su expresión se asocia con marcadores de progresión de la enfermedad. Por último, demostramos que el CD300a identifica una población de linfocitos T CD4+CD45RA- con una mayor susceptibilidad a la infección por VIH-1.

The Group of Researchers on Human Reproduction from Universidad de Oriente has a research line that assesses the effects of mercury on the male reproductive system, using an animal model susceptible to the metal. Lesions induced by necrosis and apoptosis related to alterations in testosterone synthesis have been demonstrated. Injuries involve an autoimmune response to germ cells and an increased Th1 activity at baseline and 7 months of treatment. Since mercury is able to generate “danger” signals, the expression of stress proteins (hsp) in germ cells and the immune system have been studied, which are increased in the treated animals. The results obtained until now support the hypothesis that mercury at subtoxic doses is capable of inducing direct damage and humoral and cell-type responses, causing damage to the seminiferous epithelium, through several means, which could prevent the fertilization in the long term.

La gripe pandémica causó una gran morbilidad durante la temporada 2009-2010 y en determinados pacientes en edades medias de la vida, causó neumonía viral primaria que en algunos casos requirió ingreso en la UCI. Nuestro grupo de investigación objetivó, en los pacientes más graves (aquellos que necesitaban de ventilación mecánica), niveles elevados de citocinas y quimiocinas pro-inflamatorias en plasma, acompañando a la presencia de infiltrados neumónicos. Esta tesis pretende comprobar el papel de la inflamación en la patogénesis de la infección por el virus de la gripe pandémica de 2009, utilizando un modelo de ratón C57BL6 infectado y un grupo de ratones control. El análisis de expresión génica a nivel pulmonar mediante microarrays de transcriptoma completo demostró la presencia de una marcada activación de genes de la inmunidad innata a día 5 post-infección, coincidiendo con la existencia de infiltrados neumónicos extensos, infiltración celular intensa en el pulmón y replicación viral activa. Este programa transcriptómico relacionado con la inmunidad innata se normalizó a día 10, coincidiendo con la desaparición de los infiltrados neumónicos y del virus. En este trabajo se diseccionó a nivel molecular las rutas de señalización celular alteradas a nivel pulmonar tras la infección por este virus, lo cual será útil para diseñar modelos de inmunomodulación de estas rutas en el futuro. En conclusión, la inducción de una reacción exacerbada de la inmunidad innata/inflamación se asocia con la génesis de la neumonía tras la infección por el virus de la gripe pandémica de 2009, pero también parece ser necesaria para eliminar el mismo., Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología

La neumonía adquirida en la comunidad es una de las patologías que causa más morbimortalidad a nivel mundial, aproximadamente el 10% de los pacientes con neumonía desarrollan enfermedad grave que requiere el ingreso en UCI. Un tercio de las neumonías son producidas por virus, siendo el más frecuente el virus de la gripe, aunque los nuevos métodos de diagnóstico molecular están permitiendo diagnosticar cada vez más neumonías causadas por virus distintos al gripal (rinovirus, virus respiratorio sincitial, etc.) En el año 2009 apareció un nuevo virus gripal, el virus A/H1N1pdm09, el cual causo una pandemia durante la temporada 2009-10 y en la temporada siguiente se estacionalizó siendo el responsable de la epidemia anual gripal en Europa. En este trabajo se reclutaron pacientes con neumonía viral grave durante la temporada postpandémica (2010-2011) con el objetivo de estudiar el papel que juega el sistema inmune en la gravedad y mortalidad de la neumonía vírica grave, así como analizar los factores diferenciales según la etiología de la neumonía. Para lograr estos objetivos se midieron los niveles de diversas citoquinas, de todos los isotipos de inmunoglobulinas y de todas las subclases de la IgG en el plasma de los pacientes. Los pacientes con neumonía gripal grave presentan frecuentemente inmunosupresión previa. Los niveles de citoquinas en el plasma de los pacientes se encuentran elevados mientras que por el contrario, sus niveles de inmunoglobulinas están disminuidos. Dentro de las inmunoglobulinas, la IgM y la IgG2 juegan un papel protector, ya que los pacientes con menores niveles de estas inmunoglobulinas muestran menor tiempo de supervivencia. Además los niveles de IgM en plasma son un factor predictor de mortalidad. La neumonía grave por virus distintos al gripal ha sido escasamente estudiada. Este trabajo ha permitido definir importantes características sobre los pacientes afectados por esa patología, como son que presentan mayor edad que los pacientes infectados por el virus gripal y un peor estado basal con numerosas comorbilidades, pese a lo cual la tasa de mortalidad es muy inferior a la de la neumonía gripal. Por primera vez se han identificado dos citoquinas, MCP-1 y MIP-1ß, y una inmunoglobulina, IgA, cuyos niveles permiten diferenciar si el paciente está infectado por el virus de la gripe u otro virus., Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina legal y Forense

213 p. El objetivo de este trabajo consiste en la caracterización de ANKRD55, un gen de función desconocida asociado a la esclerosis múltiple (EM). Para ello, por un lado, se realizó un análisis basado en DNA y expresión génica que consistió en la identificación de la principal fuente celular de ANKRD55 en PBMC, donde los resultados mostraron que los tres transcritos de ANKRD55 se expresaron de forma única y elevada en los linfocitos T CD4+. Además, el genotipo de riesgo para la variante intrónica asociada a EM mostró niveles significativamente más altos de dos transcritos de ANKRD55 en células T CD4+. A continuación, utilizando el sistema CRISPR/deadCas9 se analizaron 5 variantes de DNA presentes en ANKRD55 por su posible actividad enhancer, donde se observó que la región que contiene la variante rs71624119 regula la expresión de uno de los tres transcritos de ANKRD55. Por otro lado, mediante el análisis basado en proteína, se estudió la localización subcelular y la red de interacciones proteína-proteína de ANKRD55. Se observó que la localización intracelular de la forma endógena de ANKRD55 era principalmente nuclear en células inmunes y no inmunes, mientras que las formas recombinantes se encontraban tanto en el núcleo como en orgánulos membranosos y citosol de las líneas celulares HEK293 y HeLa. A través de la inmunoprecipitación (IP) de una de las formas recombinantes de ANKRD55 y análisis mediante espectrometría de masas, se identificaron 158 proteínas en el extracto proteico total y 22 en extracto nuclear que interaccionan con ANKRD55, de las cuales ocho se validaron por microscopía confocal e IP y posterior immunoblot.

El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad inflamatoria crónica y recurrente, de afectación multisistémica, que afecta fundamentalmente a la piel, las articulaciones, riñones y membranas serosas. Su etiología es desconocida, pero se cree que es consecuencia del fallo de los sistemas reguladores del sistema inmune, produciéndose autoanticuerpos dirigidos contra antígenos celulares del propio organismo. El diagnóstico se apoya en el cumplimiento de una serie de criterios de clasificación que incluye datos clínicos, inmunológicos y analíticos. Gracias al mejor conocimiento de los fenómenos autoinmunes, el LES ha dejado de ser considerado como una enfermedad rara, con infinidad de posibilidades en el campo de la investigación. Conclusiones: 1. Las pacientes con LES tienen mayor HTA nocturna e HTA nocturna aislada. 2. La VOP y la ERC se asociaron de forma independiente con la HTA nocturna. Hubo una tendencia a la asociación de la duración de la enfermedad con la HTA nocturna, aunque sin llegar a ser estadísticamente significativa. 3. La VOP y el SLEDAI se asociaron de forma independiente con el patrón no dipper. La enfermedad renal crónica tendió a asociarse al patrón no dipper, aunque sin llegar a ser estadísticamente significativa. 4. El índice de concordancia entre el diagnóstico de HTA en la consulta y por MAPA fue modesto tanto en el grupo de las pacientes con LES como en los controles. 5. Las pacientes con LES tuvieron cifras significativamente mas altas de PAS nocturna, PAD nocturna y PAM nocturna. No hubo diferencias en cuento a las mediciones diurnas y de 24 horas. 6. Las pacientes con LES tuvieron mayor carga tensional media, pero no hubo diferencias en el porcentaje de pacientes con carga tensional. 7. Las pacientes presentaron de forma significativa mayor patrón no dipper. Las pacientes también tuvieron menor porcentaje de descenso nocturno de la presión arterial. No hubo diferencias significativas en cuento a los patrones dipper extremo ni raisser. 8. Las pacientes con LES presentaron mayor HTA verdadera. No hubo diferencias estadísticamente significativas en cuento a HTA de bata blanca e HTA enmascarada., Tesis Univ. Granada.

OBJETIVOS. 1. Determinar el papel de los mecanismos autoinmunes en la patogenia de la fibromialgia. Evaluar la presencia de anticuerpos anti-serotonina, anticuerpos anti-gangliósidos y otros autoanticuerpos en sangre periférica de pacientes con fibromialgia y controles sanos así como analizar la variación de estos anticuerpos en función del estado clínico de los pacientes. 2. Evaluar la presencia de disbalances entre citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias y estudiar la asociación de los polimorfismos genéticos de estas citoquinas con la susceptibilidad y manifestaciones clínicas de la fibromialgia. 3. Analizar el polimorfismo de los genes KIR y HLA de clase I y clase II en pacientes con fibromialgia y controles sanos con el objetivo de conocer su posible asociación con la susceptibilidad y manifestaciones clínicas de la enfermedad. METODOLOGÍA Determinación de anticuerpos IgG e IgM anti-serotonina: ELISA tipo sándwich y anticuerpos anti-Gangliósidos mediante dot-blot. Los niveles de serotonina en suero se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La determinación de citoquinas en suero se realizó con tecnología Luminex, con la excepción del TGF-β1 que se realizó mediante ensayo ELISA tipo sándwich. El polimorfismo de los genes de las citoquinas se determinó mediante un ensayo de discriminación alélica con sondas Taqman específicas. El estudio del polimorfismo VNTR del gen de la IL-4 se realizó PCR convencional empleando cebadores específicos para amplificar la región de interés El tipaje de los genes HLA-A, B, C, y KIR se realizó mediante las técnicas de PCR-SSO y PCR-SSP. CONCLUSIONES: 1. Los niveles de serotonina se encuentran disminuidos en el suero de los pacientes con FM pero no parecen asociarse con la severidad de las manifestaciones clínicas. 2. La prevalencia de anticuerpos anti-serotonina IgG e IgM y los niveles séricos de estos anticuerpos se encuentran aumentados en pacientes con FM respecto a la población sana. 3. La prevalencia de anticuerpos anti-serotonina IgG e IgM es mayor en pacientes de FM con niveles de ansiedad moderada, severa o grave que en pacientes con niveles de ansiedad leve, lo que sugiere una asociación de estos anticuerpos con formas más severas de la enfermedad. 4. Los niveles séricos de las citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias estudiadas son similares en pacientes con FM y en la población sana. 5. Los SNPs de los genes de las citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias estudiadas no parecen asociarse con la susceptibilidad al desarrollo de FM. 6. El genotipo AA del SNP rs16944 del gen de la IL-1β se asocia con una manifestación grave o muy grave de la enfermedad según el test FIQ en pacientes con FM, por el contrario, la presencia del genotipo GA de este SNP se asocia con una manifestación más leve de la enfermedad. 7. El genotipo AA del SNP rs1143634 del gen de la IL-1β se asocia con una manifestación moderada o grave de la FM según el test CGI. 8. El genotipo 3R/3R de la región VNTR del gen de la IL-4 se asocia con una peor calidad de vida en pacientes con FM, por el contrario el genotipo 2R/3R se asocia a una mejor calidad de vida de los mismos. 9. El genotipo GG del SNP rs1800469 del gen del TGF-β se asocia a una mejor calidad de vida de los pacientes con FM, por el contrario el genotipo AG se asocia con niveles de ansiedad severa o grave en estos pacientes. 10. El polimorfismo de los genes KIR y HLA no se asocia con la susceptibilidad a desarrollar FM ni con las manifestaciones clínica de la misma. 11. Este trabajo confirma que la FM, además de estar condicionada por factores genéticos, desde el punto de vista inmunológico puede tener mecanismos etiopatogénicos diferentes como son los fenómenos autoinmunes o los fenómenos de desregulación de los mecanismos inflamatorios, hecho que puede tener relevancia clínica a la hora de evaluar adecuadamente a los pacientes así como para poder diseñar tratamientos más personalizados. OBJECTIVES 1. Determine the role of autoimmune mechanisms in the pathogenesis of fibromyalgia. To evaluate the presence of anti-serotonin antibodies, anti-ganglioside antibodies and other autoantibodies in peripheral blood of patients with fibromyalgia and healthy controls, as well as to analyze the variation of these antibodies according to the clinical status of patients. 2. Evaluate the presence of imbalances between pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines and to study the association of cytokine genetic polymorphisms with the susceptibility and clinical manifestations of fibromyalgia. 3. To analyze the polymorphism of KIR and HLA class I and class II genes in fibromyalgia patients and healthy controls in order to investigate their potential association with the susceptibility and clinical manifestations of the disease. METHODOLOGY The determination of anti-serotonin IgG and IgM antibodies was performed bysandwich ELISA, and the determination of anti-Ganglioside antibodies was performed by dot-blot. Serum levels of serotonin were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Serum cytokine determination was performed using Luminex technology, with the exception of TGF-β1 that was performed by sandwich ELISA. The cytokine gene polymorphisms were determined by allelic discrimination assay, with specific Taqman probes and alternatively by Sanger sequencing. The study of the IL-4 gene VNTR polymorphism was performed by conventional PCR using the specific primers to amplify the region of interest. Typing of the HLA-A, B , C, and KIR genes was performed using PCR-SSO and PCR-SSP techniques. CONCLUSIONS: 1. Serotonin levels are decreased in the serum of FM patients but doesn´t appear to be associated with the severity of clinical manifestations. 2. The prevalence and serum levels of IgG and IgM anti-serotonin antibodies are increased in patients with FM compared to the healthy population. 3. The prevalence of IgG and IgM anti-serotonin antibodies is higher in FM patients with moderate or severe anxiety levels than in patients with mild anxiety levels, suggesting an association of these antibodies with more severe forms of the disease. 4. Serum levels of the studied pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines are similar in patients with FM and in healthy population. 5. SNPs of the studied pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine genes doesn´t appear to be associated with susceptibility to FM development. 6. The AA genotype of the IL-1β gene SNP rs16944 is associated with a severe or very severe manifestation of the disease according to the FIQ test in patients with FM, by contrast, the presence of GA genotype in this SNP is associated with a milder manifestation of the disease. 7. The AA genotype of the IL-1β gene SNP rs1143634 is associated with a moderate or severe manifestation of FM according to the CGI test. 8. The 3R/3R genotype of the IL-4 gene VNTR region is associated with a worse quality of life in patients with FM., by contrast the 2R/3R genotype is associated with a better quality of life. 9. The GG genotype of the TGF-β gene SNP rs1800469 associated with a better quality of life in patients with FM, by contrast the AG genotype is associated with severe anxiety levels in these patients. 10. KIR and HLA genes polymorphism is not associated with the susceptibility and clinical manifestations of FM. 11. This work confirms that FM is conditioned by genetic factors, but also may be related to immunological factors such as autoimmune phenomena or a deregulation of inflammatory mechanisms, which may be relevant for an adequate clinical assessment of patients as well as for the design personalized treatments

Estudio de cohorte prospectivo, multicéntrico, de pacientes coinfectados por VIH /VHC procedentes de 9 centros sanitarios en la región de Castilla la Mancha tratados con agentes antivirales directos (AADs) de segunda generación. Se incluyeron todos los pacientes con ARN del VHC sérico detectable naïves a AADs de segunda generación (se incluyeron aquellos que habían fracasado a terapias con boceprevir y/o telaprevir). Nuestros objetivos fueron: evaluar la eficacia y la seguridad de los AADs y compararla con datos procedentes de ensayos clínicos y estudios observacionales; identificar los factores asociados al fracaso terapéutico y analizar la evolución de la fibrosis y los factores asociados a una disminución de la rigidez hepática medida por elastografía. Recogimos variables demográficas, biológicas, analíticas y elastográficas basales y en visitas sucesivas. La elastografía hepática se realizó mediante FibroScan®. El objetivo primario fue la evaluación de la respuesta viral sostenida (RVS) en la semana 12 después de finalizar el tratamiento. Se realizaron análisis por intención de tratar (AIT) y por datos observados (ADO). Se utilizaron modelos bivariables y multivariables para ajustar los efectos de los factores de confusión. Los modelos se desarrollaron a partir de variables significativas del análisis bivariable (p

En los últimos años se ha avanzado en el conocimiento del proceso patogénico que ocurre en la afectación vasculítica renal, implicando a nuevos mecanismos de daño molecular y celular. Entre ellos destaca el papel de los macrófagos como células efectoras con un rol primario en el proceso patogénico. Los estudios histológicos han demostrado que los macrófagos CD163 son el tipo de célula infiltrante predominante en las biopsias de pacientes con vasculitis, donde parecen infiltrar en estadios precoces de la enfermedad. Modelos experimentales han analizado la presencia de CD163 soluble (CD163s) en la orina de ratas a las que se les ha inducido vasculitis, demostrando concentraciones elevadas al mes de la inmunización con ANCA-MPO. Estos hallazgos posicionan al CD163s como un posible biomarcador de actividad vasculítica y la medición de las concentraciones urinarias de CD163s durante el seguimiento de pacientes con vasculitis asociada a ANCA (VAA) podría ser de utilidad para la monitorización de la respuesta al tratamiento, la identificación de actividad vasculítica residual y el diagnóstico de recidiva renal. Partiendo de esta hipótesis, estudiamos los niveles urinarios de CD163s en una cohorte prospectiva de 24 pacientes incidentes con brote de vasculitis renal, un grupo control de 23 pacientes con vasculitis renal en remisión, y un grupo control de 20 sujetos sanos. En los pacientes incidentes se realizaron determinaciones de CD163su al debut de la enfermedad y posteriormente cada 3 meses hasta el final del seguimiento. El CD163 soluble urinario (CD163su) se analizó mediante ELISA y los valores fueron normalizados según concentración de creatinina urinaria. Se identificó la aparición de recaídas durante el seguimiento estudiando los cambios en las concentraciones del CD163su en estos pacientes y su correlación con otros parámetros de actividad vasculítica Los 24 pacientes con brote renal de vasculitis mostraron al diagnóstico unos niveles elevados de CD163su en comparación con los pacientes en remisión y los controles sanos. Las concentraciones de CD163su decrecieron progresivamente tras el tratamiento en todos los enfermos que alcanzaron remisión, mientras que permanecieron elevados a pesar del tratamiento cuando no existió respuesta al mismo. En los pacientes que presentaron una recaída renal se produjo una elevación significativa de las concentraciones de CD163su con respecto a los valores previos. Un incremento absoluto de 20 ng/mmol o un incremento relativo del 20% con respecto a las concentraciones previas de CD163su permitió discriminar la presencia de recaída renal de la vasculitis con una sensibilidad del 100%, y una especificidad del 89,3% para los cambios absolutos y del 87,5% para los cambios relativos. El AUC del cambio absoluto y relativo de las concentraciones de CD163su con respecto al valor previo para discriminar una recaída renal fue de 0.9679 (IC 95% 0,915-1.000; p=0.001) y 0,9571 (IC 95% 0,9032-1,000, p=0,001), respectivamente. Las concentraciones de CD163su se correlacionaron con el valor del score BVAS al 6º mes (r=0,737, p=0,006) y al 12º mes (r=0,804, p=0,005), demostrando la capacidad del CD163su para monitorizar actividad vasculítica. Nuestros resultados posicionan al CD163su como un biomarcador fiable y preciso para monitorizar la respuesta al tratamiento, identificar actividad vasculítica residual y diagnosticar la presencia de recaídas renales durante el seguimiento de pacientes con VAA

Tesis de maestría en ciencias de la salud Giardia lamblia es un organismo unicelular flagelado causante de giardiasis. La infección se produce por la contaminación fecal-oral, siendo ésta una de las parasitosis gastrointestinales más frecuentes en todo el mundo. Existen 8 genotipos de G. lamblia. Las cepas pertenecientes a los genotipos A y B son los principales responsables en las infecciones en humanos y otros mamíferos. En la actualidad, los mecanismos por los cuales G. lamblia ocasiona daño al hospedero no son del todo comprendidos, así como el efecto que tienen las proteínas inmunogénicas sobre el intestino delgado. Para poder entender estos mecanismos, una herramienta que no es de utilidad es por medio de análisis histopatológicos. Para ello, en el presente trabajo, se obtuvieron muestras del intestino delgado, suero y heces de ratones C3H/HeJ infectados con las cepas WB y GS, pertenecientes los genotipos A y B de G. lamblia respectivamente, así como la cepa GS-5G8+, la cual expresa altos niveles de la proteína inmunogénica 5G8. La patología de la infección fue analizada en cortes histológicos empleando las tinciones hematoxilina-eosina; para la caracterización de las células en tejido intestinal, se utilizaron ensayos de inmunohistoquímica; finalmente se evaluó la respuesta inmune humoral mediante ELISA. Los resultados muestran que, durante la giardiasis, células mononucleares se infiltran en la lámina propia de los ratones infectados con los genotipos A y B de Giardia. El aumento de este infiltrado se debe a linfocitos B y T CD4 en la zona efectora de la respuesta inmune en tejido intestinal de ratones infectados con las cepas WB, GS, y GS-5G8 + a los 14 días post-infección. No se encontraron diferencias en alteraciones histopatológicas ocasionadas por los genotipos A y B de Giardia bajo las condiciones con las cuales se llevó a cabo este estudio. Además, se observó un aumento de anticuerpos específicos de isotipo IgA local en todos los grupos evaluados, mientras que IgG sistémica específica contra Giardia solo fue encontrada en las muestras de ratones infectados con la cepa GS-5G8+ Finalmente, estos anticuerpos tuvieron la capacidad de reconocer a la proteína 5G8 de Giardia. En conclusión, la infección por los genotipos A y B de Giardia induce un proceso inflamatorio agudo, caracterizado por un infiltrado celular en mucosa intestinal. Por otra parte, la respuesta inmune humoral de los ratones infectados con la cepa GS-5G8+, perteneciente al genotipo B, va dirigida en parte a la proteína 5G8. Universidad de Sonora. División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Programa de Maestría en Ciencias de la Salud. 2018

Reducción alta, Univ. de Granada. Leída en 1989, La transmisión vertical de la hepatitis b es una de las causas más importantes de la transmisión y mantenimiento de la infección en el mundo. Actualmente es posible su prevención identificando a las gestantes de riesgo y aplicando inmunoprofilaxis a los recién nacidos. Material y método: se han estudiado 4450 gestantes determinando el ag hbs. En todas aquellas con aghbs (+) se realizaron el resto de marcadores en los rn hijos de portadora se aplico la pauta de inmunoprofilaxis. conclusiones: 1) justificamos el screening de aghbs en gestantes porque la prevalencia en Granada es de 1'53% y la mayoría de las portadoras no tienen antecedentes de riesgo. 2) los marcadores del rn en cordón son menos fiables que los realizados en talón. Los achbc y achbc hasta los 12 meses son pasivos. 3) la eficacia de la inmunoprofilaxis queda probada. 4) la revacunación de los niños sometidos a inmunoprofilaxis puede plantearse

El Factor XII (FXII) continúa siendo un elemento desconocido y enigmático a pesar de ser una molécula pleiotrópica y de estar implicado en diversos sistemas como coagulación, inflamación, fibrinólisis y complemento. Para obtener nueva información sobre esta proteína, decidimos estudiar 3 patologías con presencia de moléculas de FXII aberrantes. La caracterización de dicho FXII aberrante podría aportar nueva información molecular, bioquímica, funcional y patológica. En primer lugar, identificamos fortuitamente, un paciente con leucemia aguda que presentaba todo su FXII plasmático 5 KDa mayor que el FXII silvestre. La base congénita de este defecto se demostró al observar el mismo FXII en su hermano. Sin embargo, la secuenciación completa del gen F12 no identificó ninguna alteración molecular que explicara el FXII aberrante. Además, ante ciertas condiciones (activación con sílica o dextrán sulfato (DXS); incremento del % de SDS, o purificación del FXII por cromatografía de afinidad), se detectaba el FXII silvestre. Este resultado sugiere que el FXII aberrante podría explicarse por una interacción casi covalente del FXII silvestre con un péptido de 5 KDa. La purificación y análisis proteómico del FXII aberrante sugirió que podría ser un péptido de GRIP1. De hecho, la secuenciación completa del exoma identificó una mutación en este gen que compartían los dos hermanos. Funcionalmente, el FXII aberrante parece ser menos sensible a la activación con dosis bajas de sílica y DXS, lo que podría contribuir a explicar las casi nulas complicaciones que ha presentado el paciente a lo largo de un extenso y agresivo tratamiento oncológico que incluyó dos trasplantes alogénicos. En segundo lugar, estudiamos 58 pacientes con desórdenes congénitos de glicosilación (CDGs). Demostramos que este defecto no provoca deficiencia de FXII, pero si la aparición en plasma de una forma de FXII hipoglicosilada. Las características de la cadena pesada del FXII tras su activación demostró que todo el FXII hipoglicosilado carece del N-glicano localizado en posición Asn414. La expresión recombinante de variantes mutadas en células de insecto afectando a los dos sitios de N-glicosilación descritos en el FXII confirmó que la ausencia de N-glicano en Asn230 es clave para el correcto plegamiento y/o secreción de la molécula. Además, el FXII hipoglicosilado parece más sensible a su activación y a la generación de calicreína. Por último, nuestro proyecto reclutó 33 pacientes con angioedema hereditario tipo III (FXII-HAE) portadores de la variante patogénica p.Thr309Lys. Esta patología es hasta la fecha la única claramente asociada con variantes patogénicas en el gen del F12. Todos menos 3 portadores de esta mutación presentaban dos formas de FXII en plasma. El tamaño del FXII aberrante no podía justificarse por un defecto de O-glicosilación como se había propuesto. De hecho, la forma recombinante mutada, también expresada en células de insecto, tenía el mismo tamaño que la forma silvestre. Los estudios realizados sugirieron que esta forma aberrante podría ser resultado de un procesamiento alternativo del exón 9. El FXII aberrante tanto el plasmático como el recombinante, era más sensibilidad a activarse ante menores estímulos, generando calicreína, pero sin causar activación de la coagulación. En conclusión, el estudio del FXII aberrante en diferentes patologías nos ha permitido conocer la complejidad de esta proteína, sus interacciones y la repercusión que una modificación postraduccional, como la glicosilación, tiene en su secreción y funcionalidad. Factor XII (FXII) remains an unknown and enigmatic element despite being a pleotropic molecule and being involved in various systems such as coagulation, inflammation, fibrinolysis and complement. To obtain information about this protein, we decided to study 3 patterns with the presence of aberrant FXII molecules. The characterization of this aberrant FXII could provide new molecular, biochemical, functional and pathological information. First, we identified a patient with acute leukemia who presented all of his FXII in plasma 5 KDa greater than the wild FXII. The congenital basis of this defect was demonstrated by observing the same FXII in his brother. However, the complete sequencing of the F12 gene did not identify any molecular alteration that would explain the aberrant FXII. In addition, under certain conditions (activation with silica or dextran sulfate (DXS), increase in SDS %, or purification of FXII by affinity chromatography), wild FXII was detected. This result suggests that aberrant FXII could be explained by an almost covalent interaction of wild FXII with a 5 KDa peptide. The purification and proteomic analysis of the aberrant FXII suggests that it could be a GRIP1 peptide. In fact, the complete sequencing of the exome identifies a mutation in this gene shared by the two brothers. Functionally, aberrant FXII seems to be less sensitive to activation with low doses of silica and DXS, which could contribute to explain the almost zero complications that the patient has presented throughout an extensive and aggressive oncological treatment that included two allogeneic transplants. Second, we studied 58 patients with congenital glycosylation disorders (CDGs). This defect does not cause FXII deficiency but the appearance in plasma of a hypoglycosylated form of FXII. The characteristics of the heavy chain of FXII after its activation showed that all the hypoglycosylated FXII lacks the N-glycan located in position Asn414. The recombinant expression of mutated variants in insect cells affecting the two N-glycosylation sites described in FXII confirms that the absence of N-glycan in Asn230 is key for the correct folding and/or secretion of the molecule. In addition, hypoglicosylated FXII seems more sensitive to its activation and to the generation of kallikrein. Finally, our project included 33 patients with hereditary angioedema type III (FXII-HAE) carrying the p.Thr309Lys mutation. Until now, this pathology is clearly associated with mutations in the F12 gene. All patients, except 3 who were carriers of this mutation, presented two forms of FXII in plasma. The size of the aberrant FXII could not be justified by a defect in O-glycosylation as proposed. In fact, the mutated recombinant form, also expressed in insect cells, had the same size as the wild type. The studies carried out suggest this aberrant form could be the result of an alternative processing of exon 9. The aberrant FXII, both plasma and recombinant, is more sensitive to activation in response to lower stimulation, generating kallikrein but without causing coagulation activation. In conclusion, the study of aberrant FXII in different pathologies has allowed us to know the complexity of this protein, its interactions and the repercussion that a post-translational modification, such as glycosylation, has on its secretion and functionality.

Hemos estudiado un total de 59 pacientes críticos, (32 politraumatizados y 27 quemados), así como una población sana control de 32 sujetos. Las edades oscilaban entre 15 y 75 años y la gravedad clínica estaba medida en Trauma Score y porcentaje de superficie corporal quemada. Ninguno de los pacientes recibió transfusión sanguínea previa al estudio ni drogas esteroideas. Las infecciones, eran con frecuencia la causa de muerte tardía en pacientes politraumatizados y quemados. El origen de las mismas, parecía relacionarse con la depresión de las defensas inmunitarias, en estos pacientes, a las pocas horas del accidente. Los enfermos, presentaban una linfopenia inicial en las primeras 24 – 48 horas del trauma o lesión térmica, al compararlos con los individuos sanos controles. La linfopenia, afectaba en números absolutos a las subpoblaciones linfocitarias CD3, CD 4 y CD8 siendo proporcional a la gravedad del traumatismo y no relacionada con la extensión de la quemadura. Los valores absolutos de linfocitos B, no sufrían modificaciones, en los primeros momentos tras el accidente, aunque se observaba un descenso de los niveles de IgG estadísticamente significativo (p = 0.001). El sistema monocítico/macrofágico, mostraba una disminución de la capacidad fagocítica en ambos grupos de pacientes y estadísticamente significativo con respecto al grupo sano control. La determinación de los valores de la proteína C reactiva, exhibía en todo momento, cifras elevadas en ambos grupos de pacientes inmediatamente después de la agresión (traumática o térmica). El descubrimiento de las citoquinas (TNF, IL 1β, gamma interferon… etc), como factores solubles, secretados por las células activadas y sus funciones en las reacciones inflamatorias inespecíficas e inmunitaria específica, nos llevaba a pensar, en el importante papel que estos factores solubles jugaban en el normal funcionamiento del sistema inmune, de tal manera, que un desequilibrio en la producción de citoquinas o en el tipo de la misma, podía conducir a alteraciones metabólicas, de la coagulación, del sistema temoregulador y del sistema inmune entre otros. El trauma y la quemadura, eran estímulos suficientemente fuertes como para provocar la liberación e citoquinas TNF e IL 1, y estas, a su vez, eran capaces de inducir cambios importantes en el fenotipo celular, fue así como encontrábamos que aunque existía linfopenia en las primeras 24 – 48 horas tras el trauma y lesión térmica, los linfocitos estaban activados y esto se ponía de manifiesto, con la presencia o aumento de expresión de marcadores de activación-adhesión (CD25, CD69 y CD71; CD11c, CD49a y CD54 respectivamente) en sus membranas. Concomitantemente a estos marcadores de activación, se observaba un moderado incrementos de linfocitos que mostraban simultáneamente los antígenos CD4+ y CD8+, sobretodo en los pacientes quemados. Dichas células CD4+ CD8+, a pesar de estar relacionadas con la activación, no expresaban los antígenos CD25 ni CD71. Así pues, el traumatismo y las quemaduras se acompañaban de una activación de los linfocitos que podría guardar relación con la intensidad de aquellos. La evolución de las cifras de linfocitos periféricos, en las semanas posteriores al accidente, dependía de la evolución clínica de los pacientes. Observábamos que los pacientes que experimentaban una mejoría clínica, mostraban un incremento en las cifras de linfocitos CD3+, CD4+ y CD8+. La mejoría clínica, se acompañaba asimismo de un restablecimiento de la función fagocítica, de un ascenso de los niveles de IgG y de una disminución de los valores de proteína C reactiva. Por el contrario, en quienes evolucionaban mal o no sobrevivían, se observaba una disminución sostenida de las cifras de IgG en suero y valores elevados de proteína C reactiva. Nosotros pensamos que todos estos cambios, estaban producidos por una liberación excesiva de citoquinas. Luego, parece razonable concluir que la linfopenia es motivada por un secuestro de las células en el endotelio vascular y otros tejidos inflamados y dañados, debido a la alta densidad de moléculas de adhesión exhibidas por las membranas celulares de los enfermos, que hacen, que los linfocitos se adhieran a estos lugares y sólo más tarde, con la recuperación del sujeto, y la posible disminución de citoquinas, la densidad de estas moléculas vaya disminuyendo y los linfocitos pasen nuevamente al torrente circulatorio. La linfopenia, no es por consiguiente la causa de la inmunodeficiencia, sino más bien el resultado o la consecuencia de cambios en la concentración de citoquinas, que son genuinamente, el origen de la depresión en las defensas orgánicas y del fracaso multiórgano. Creemos que en un futuro, no muy lejano, se diagnosticaran en cada paciente individual las alteraciones de defensa específicas, lo que facilitará el conocimiento de su situación inmunológica actual y pronóstico. De este modo, estaremos en mejor disposición de instaurar modalidades profilácticas y terapéuticas que podrían contribuir a la mejora de la respuesta inmune en aquellos sujetos víctimas de accidentes. Las infecciones siguen constituyendo la principal causa de muerte tardía después de traumatismos graves y quemaduras severas. La razón de esta inmunodeficiencia sigue siendo desconocida. En el presente trabajo nos hemos planteado estudiar la influencia directa de los traumatismos graves y las quemaduras sobre el sistema inmunitario, para poder conocer el mecanismo por el cual los pacientes son especialmente vulnerables a las infecciones. Para ello, nos hemos marcado los siguientes objetivos: 1) Determinar el perfil inmunológico inicial, característico de los enfermos críticos y su relación con la gravedad clínica inicial. 2) Conocer el cortejo inmunológico que acompaña a los pacientes a lo largo de la evolución de su cuadro patológico y su posible relación con el pronóstico. 3) Por último, valorar la influencia que el estado inmunitario tiene sobre la existencia de pacientes clínicamente muy graves, pero que sobreviven, así como de pacientes con altas posibilidades de sobrevivir, de acuerdo a criterios estrictamente clínicos, pero que sin embargo fallecen.

[eng] Psoriasis is an inflammatory immune-mediated skin disease that usually occurs in individuals with genetic susceptibility in conjunction with environmental triggers. Circulating effector memory skin-tropic CLA+ T cells have been shown to participate in the development of several immune cell-mediated cutaneous diseases, due to its selective recruitment into the skin and the subsequent rapid effector response upon cognate antigen recognition. Several studies point to the capacity of recirculation of CLA+ T cells between skin and blood, which suggests that in skin diseases implying chronicity, such as psoriasis, the study of circulating CLA+ T cells could constitute peripheral cellular biomarkers and thus providing a tool for translational evaluation of current pathology status. In this regard, we proposed an ex vivo model that uses isolated memory CLA+ T cells from patient’s blood and then are cultured together with autologous epidermal cells, in order to match more accurately a proper intercellular interaction in the cutaneous context of skin lesions. Once established the cellular basis, this experimental approach is completed by the activation with a clinical relevant trigger, the Streptococcus pyogenes. Based on this antigen-specific innate stimulus, the study of the circulating memory CLA+ T-cell subset as a potential carrier of disease-associated information, has allowed the characterization of different aspects of psoriasis disease. Such activation induces, among others, high levels of IL-17 response by CLA+ T cells, which is predominant in case of guttate psoriasis, and correlates with IL-17-regulated transcripts levels in keratinocytes as well, resembling a psoriatic-associated gene expression pattern. Interestingly, IL-17A have been shown to be the key disease-associated cytokine responsible of psoriasis severity in patients. Therefore, the finding of a CLA+ T-cell-selective production of IL-9, which in turn is necessary for optimal production of IL-17A from CLA+ T cells, upon activation with S. pyogenes, suggests a significant Th17-supportive role from other less-characterized skin-homing T-cell lineages in psoriasis. Additionally, we have found a synchronicity in guttate psoriasis-derived CLA+T-cell ex vivo responses to S. pyogenes, the rate of streptococcal exposure (ASO) and disease severity (PASI), thereby supporting that clinical outcomes can be reflected by peripheral CLA+ T cells following encounter of an antigen that initially triggered the disease. However, the assessment of the relation of S. pyogenes-exerted effector function in plaque psoriasis-derived samples with their clinic status, has still to be elucidated. Finally, the early determination of the IL-17-targeted gene ZC3H12A, which encodes for the ribonuclease MCPIP1, in keratinocytes, through strep-induced production of IL-17A by the CLA+/Epi coculture, led to the succeeding characterization of its aberrant, and rapid IL-17A-induced, expression in psoriatic lesions and epidermal cells, respectively, where its ribonuclease activity could be modulating other altered-expressed genes. Overall, psoriatic-associated events can be reproduced ex vivo in a CLA- and SE-dependent manner and provides a tool to expand knowledge and understanding of immune responses in psoriasis., [spa] La mayoría de los avances en psoriasis han tenido lugar a través de investigación traslacional. Los linfocitos T circulantes con tropismo cutáneo (CLA+) constituyen biomarcadores celulares para el estudio de enfermedades cutáneas mediadas por células T. El estudio de dichas células periféricas puede aportar información traslacional relevante, por ejemplo, a través del análisis de sus respuestas al ser activadas con desencadenantes asociados a la enfermedad, como el Streptococcus pypogenes, la faringitis por el cual está asociada a la aparición de psoriasis en gotas, y al empeoramiento de la psoriasis en placa. Las células T circulantes CLA+ de pacientes con psoriasis en gotas, en presencia de células epidérmicas autólogas y de un extracto de S. pyogenes (SE), producen una respuesta efectora predominante de tipo Th17 (IL-17A). Otros mediadores relevantes, como el IFN-gamma y la IL-9, también son producidos en este modelo. Curiosamente, se ha observado un pico temporal común entre los niveles de ASO en sangre, de PASI (severidad), y la cantidad de citoquinas producidas por los linfocitos T CLA+. El cocultivo de células T CLA+ y células epidérmicas (CLA+/Epi), provenientes de pacientes con psoriasis en placa, también responden al SE, y producen IL-17A, IFN-gamma e IL-9, ésta última siendo necesaria para la producción óptima de los niveles de IL-17A, tanto en gotas como en placas. Sin embargo, todavía queda por dilucidar qué tipo de relación existe entre la respuesta efectora ex vivo y los aspectos clínicos de estos pacientes. Finalmente, debido a que la IL-17A en psoriasis constituye la citoquina clave responsable de la severidad en la enfermedad, es importante estudiar genes en células cutáneas cuya expresión esté regulada por IL-17A. Así mismo, hemos determinado que la expresión del gen ZC3H12A es inducida en queratinocitos por la IL-17A, y que su producto proteico, la ribonucleasa MCPIP1, se localiza de forma anormal en la epidermis de las lesiones psoriáticas, donde probablemente podría afectar la expresión de otros genes. En conjunto, se han podido estudiar diferentes aspectos de la psoriasis a través del estudio de las células T CLA+ circulantes en respuesta a un estímulo asociado a la enfermedad.

Un hecho característico de la cirrosis hepática es la susceptibilidad incrementada a la infección por bacterias de origen entérico. Las bases patogénicas de esta alteración pudieran ser anomalías en la función de diversas poblaciones del sistema inmune (SI) que se han descrito en la cirrosis, tanto a nivel local, en el intestino, como a nivel sistémico. Sin embargo, son escasos los estudios que han caracterizado los cambios inmunológicosa nivel peritoneal, a pesar que la peritonitis bacteriana espontánea (PBE) es la infección más frecuente y característica de la cirrosis. Tampoco se han estudiado las alteraciones producidas, tanto a nivel peritoneal como sistémico, tras la inducción de peritonitis bacteriana (PBI), y que podrían explicar la incapacidad del SI para contener la diseminación de las bacterias en la cirrosis. Con el objeto de responder a estos interrogantes, analizamos la traslocación bacteriana (TB) y la diseminación de bacteriasen un modelo experimental de cirrosis biliar, caracterizamos las alteraciones de las células del SI a nivel peritoneal y sistémico, y evaluamos el efecto de la PBI en los parámetros anteriormente mencionados. La hipótesis defendida en esta Tesis Doctoral establece que la cirrosis se asocia a un estado crónico de inflamación del SI, tanto a nivel peritoneal como sistémico, que es consecuencia del estímulo bacteriano persistente, que podría dar lugar a una incapacidad de las células inmunitarias de responder a la infección, y que favorecería la diseminación bacteriana. Entre los resultados más relevantes de este estudio destacanque las ratas con cirrosis sufren una mayor tasa de TB y una mayor diseminación de bacterias después de la PBI, además de una alteración de las células del SI tanto en la circulación sistémica como en la cavidad peritoneal, que provoca una hipersensibilidad del SI en ambos compartimentos. Las conclusiones de esta Tesis Doctoral son: i) la TB y ladiseminación sistémica de bacterias intestinales y exógenas tras la PBI está aumentada en la cirrosis biliar experimental, lo que traduce un defecto en la función del SI;ii) la cirrosis se asocia a un estado persistente de inflamación del SI, tanto peritoneal como sistémico, caracterizado por un aumento en la concentración de citoquinas proinflamatorias y expansión de células inmunitarias activadas; iii) en la cirrosis biliar experimental existe una hipersensibilidad del SI peritoneal y sistémico al estímulo bacteriano, que paradójicamente se asocia a una incapacidad para expandir simultáneamente el compartimento monocitario.

El virus de la Fiebre del Valle del Rift (RVFV) es un flebovirus zoonótico transmitido por mosquitos que afecta a los rumiantes causando abortos y hepatitis aguda con necrosis multifocal. Los síntomas de la RVF varían desde el síndrome gripal hasta la retinitis y la encefalitis. En esta tesis, mostramos la susceptibilidad leve-subaguda de las ovejas Ripollesas de 9-10 semanas de edad a la infección por RVFV. Cuatro aislamientos virales diferentes de brotes de campo se replicaron de forma eficiente in vivo tras la inoculación subcutánea experimental, detectándose viremia y diseminacion viral dependientes del aislado de RVFV. Se demostró la transmisión horizontal a un cordero centinela no infectado. La infección en corderos únicamente causó pirexia transitoria, aunque se observó opacidad corneal ("ojo azul") en 3 de 16 ovejas inoculadas subcutáneamente. En una aproximación preliminar, se investigó el tejido formolado y parafinado procedente de estos animales afectados por la opacidad corneal mediante histopatología y qRT-PCR, para su caracterización. En cuatro corderos infectados se diagnosticó uveítis anterior con endotelitis linfoplasmocítica. Para evaluar la protección conferida por una única dosis subcutánea de una vacuna de virus Ankara modificado (MVA) que codifica las glicoproteínas Gn y Gc de RVFV en corderos, se inmunizaron 3 grupos de 6 a 7 corderos de 5-7 semanas de edad de la siguiente manera: Un grupo vacunal (denominado rMVA-GnGc), un segundo grupo control vectorial (vector MVA) y un tercer grupo control no vacunado (solución salina). Catorce días más tarde, todos los animales se sometieron a un desafío subcutáneo con 105 TCID50 del aislamiento virulento RVFV 56/74 y se evaluó la eficacia de la vacuna usando puntos finales estándar. Dos corderos (uno del grupo vacunado y uno del control vectorial) sucumbieron al desafío, mostrando lesiones hepáticas características. Los corderos de los grupos control vectorial y control no vacunado fueron febriles de los días 2 a 5 después del desafío (pc) mientras que los del grupo rMVA-GnGc mostraron un único pico de pirexia al día 3 pc. Se detectó ARN de RVFV en ambos hisopados nasal y oral de los días 3 a 7 pc en algunos corderos de los grupos control vectorial y no vacunado, pero no se pudo detectar diseminación viral en los corderos supervivientes vacunados. Caracterizamos patológicamente la nueva lesión ocular detectada en un abordaje secundario. Se seleccionaron 2 grupos de 5 corderos por grupo (n = 10) de la base de datos histórica de infecciones experimentales de RVFV realizadas en el Centro de Investigación en Sanidad Animal (España, NBS3), en base a sus datos clínicos, viremia y diagnóstico de lesiones ocular y hepática. Se caracterizó la uveítis anterior diagnosticada (8 de 10) con endotelitis linfoplasmocítica (2 de 10). CD3, CD20 e infiltrados inflamatorios mononucleares positivos a la lisozima se observaron en ojos parafinados RVFV-positivos. El marcaje positivo de CD20 sólo se observó en los infiltrados en uvea anterior. También se diagnosticó una nueva retinitis T dependiente (CD3 positivo) en 5 de 10 corderos infectados con RVFV. Se desarrolló un protocolo de inmunoquímica contra RVFV basado en un anticuerpo monoclonal murino. En conclusión, la raza Ripollesa se infecta fácilmente con RVFV sin manifestaciones clínicas evidentes. Un modelo de desafío con corderos de 5 a 10 semanas de edad ha demostrado ser eficaz para testar vacunas. Se sugiere que una sola dosis de la vacuna rMVA-GnGc puede ser suficiente para reducir la diseminación de RVFV y la duración de la viremia, pero no proporciona inmunidad estéril ni protección contra la enfermedad. Hasta donde sabemos, esta es la primera descripción patológica de uveítis anterior con lesión retiniana en un modelo ovino, muy parecida a las lesiones oculares humanas., Rift Valley Fever Virus (RVFV) is a mosquito-borne zoonotic phlebovirus that primarily affects ruminants by causing abortions and acute hepatitis with multifocal necrosis as major findings. Human RVF symptoms range from flu-like syndrome to retinitis and encephalitis. The increasing interest in RVFV deserve revisiting experimental sheep infection. In this thesis, we show the susceptibility of 9–10 weeks old European sheep (Ripollesa breed) to RVFV infection, showing a mild, subacute form of disease. Four different viral isolates from field outbreaks efficiently replicated in vivo after subcutaneous experimental inoculation, and consistent viral loads in blood and RVFV-isolate dependent virus shedding were detected, showing horizontal transmission to a noninfected, sentinel lamb. RVFV infection caused transient pyrexia in old lambs and no other clinical symptoms were observed, although corneal opacity (“blue eye”) was found in 3 out of 16 subcutaneously inoculated sheep. To better characterize this corneal opacity, in a preliminary approach, formalin-fixed paraffin wax-embedded tissue from these ocular condition-affected animals was investigated by histopathology and quantitative real time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Anterior uveitis with lymphoplasmacytic endotheliitis was diagnosed in these four RVFV-infected lambs. To evaluate the protection conferred by a single subcutaneous dose of a modified vaccinia virus Ankara (MVA) vectored vaccine encoding the RVFV glycoproteins Gn and Gc in lambs, 3 groups of 6 to 7 Ripollesa lambs of 5–7 weeks old were immunized as follows: one group received the vaccine (termed rMVA-GnGc), a second group received an MVA vector (vector control) and a third group received saline solution (non-vaccinated control). Fourteen days later, all animals were subcutaneously challenged with 105 TCID50 of the virulent RVFV isolate 56/74 and vaccine efficacy assessed using standard endpoints. Two lambs (one from the vaccine group and one from the vector control group) succumbed to RVFV challenge, showing characteristic liver lesions. Lambs from both the vector control and non-vaccinated groups were febrile from days 2 to 5 post challenge (pc) while those in the rMVA-GnGc group showed a single peak of pyrexia at day 3 pc. RVFV RNA was detected in both nasal and oral swabs from days 3 to 7 pc in some lambs from the vector control and non-vaccinated groups, but no viral shedding could be detected in the surviving lambs vaccinated with rMVA-GnGc. We characterize pathologically the new ocular detected condition in a secondary approach. Two groups of five lambs per group were selected (n=10) from the historical database of RVFV experimental infections performed in Center of Research in Animal Health (Spain, NBS3 facility) in the basis of their clinical data, viremia and diagnosed ocular and hepatic lesions (two previous experiments). The previously diagnosed anterior uveitis (8 out of 10) with lymphoplasmacytic endotheliitis (2 out of 10) was characterized. CD3, CD20 and lysozyme-positive mononuclear inflammatory infiltrates were observed in RVFV-positive paraffin-embedded eyes. CD20 labelling was only observed in infiltrates in anterior uvea. A novel T-cell dependent retinitis was also diagnosed in 5 out of 10 RVFV-infected lambs based on CD3-positive labelling. An immunochemistry protocol based on a murine monoclonal antibody was developed at CReSA BLS2 facility. In conclusion, Ripollesa sheep are readily infected with RVFV without apparent clinical manifestations. A 5-10 weeks old Ripollesa breed challenge model has proven to be effective in vaccine testing because of its susceptibility to virus. It is suggested that a single dose of the rMVA-GnGc vaccine may be sufficient to reduce RVFV shedding and duration of viremia but does not provide sterile immunity nor protection from disease. To our knowledge, this is the first pathological description of RVFV-related anterior uveitis with retinal injury in a RVFV-challenge sheep model, resembling ocular human lesions.

[EN]Graft versus host disease (GVHD) is a common complication of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), an established and potentially curative treatment for malignant and benign hematological disorders. As a part of this treatment, lymphocytes are introduced within an immunocompromised host, where they are able to recognize host antigens as foreign. This recognition has a beneficial effect, termed graft versus leukemia (GVL), which allows destruction of malignant cells and reduces the probability of relapse. However, the morbidity and mortality caused by GVHD limits the use of this treatment in a wide number of disorders. Separation of GVL and GVHD has been tried without success, given that the same immune mechanism is involved in both cases. Ocular involvement is present in 60-90 % of GVHD patients. This ocular GVHD (oGVHD) affects the ocular surface and lacrimal glands, as well as the Meibomian glands, leading to tear film instability. Hence, corneal tissues are exposed to stressful conditions that lead to the loss of the characteristic immune privilege of this part of the eye. The most frequent complication in oGVHD is dry eye, a multifactorial disease characterized by hyperosmolarity of the tear film and inflammation, with damage to the ocular surface. The consequences include the disruption of epithelial barrier, irritation and impaired vision. Although problems derived from oGVHD do not often include loss of vision, they are one of the main causes of deterioration of quality of life. As the treatment of oGVHD is palliative, usually based in tear substitutes, it is necessary to explore new treatments to improve the prognostic of this debilitating disease. Suppression of immune response has shown some good results, but medications like tacrolimus are not recommended for long-term use and some patients just do not respond to treatment. Mesenchymal stromal cells (MSC) are being used in medical trials as reparative treatment, given their ability to limit tissue destruction and enhance repair in various diseases. MSC, which were first described as resident cells in the bone marrow, have a great differentiation potential. In the last years, their immune-modulatory effects have received special attention and they are being used in a number of immune-mediated diseases with promising results. The goal of this thesis is to advance in the knowledge of GVHD events in the eye and explore the therapeutic potential of MSC in corneal damage caused by oGVHD, using a well stablished murine model of the disease. Material and methods Bone marrow and splenic cells from C57BL/6J mice (H2b) were used to induce GVHD in BALB/c mice (H2d) that received total body irradiation (TBI) as conditioning regimen (GVHD mice). No manipulated mice (Control mice) or mice that received only bone marrow cells after TBI (BM mice) served as controls. A group of mice with GVHD were treated with human MSC (hMSC) at day 10 post-transplantation by subconjunctival injection in the right eye (GVHD+MSC eyes). Systemic GVHD and oGVHD were monitored weekly, using previously stablished scoring systems. Tear condition was evaluated through tear osmolarity and tear volume assessment. Finally, we analyzed corneal damage and inflammation using immunofluorescence in sections and qPCR techniques. Transcription factor Pax6 and the corneal envelope protein SPRR1B where analyzed as markers of squamous metaplasia. Inflammation was studied through detection in the cornea of CD3, a marker of T lymphocytes, and expression of TNF-α and IL-1β. Gene expression of MMP9 was also analyzed in mice corneas, as this protease is involved in epithelial barrier disruption. In addition, we performed experiments with a human corneal-limbal epithelial (HCLE) cell line. These cells were exposed to TNF-α and IL-1β for 48 h and the effect in MMP9 levels were analyzed by PCR and gel zymography. PAX6 expression was also evaluated in these cells. Finally, we explored the possibility that MSC were able to engraft in the cornea. For this purpose, hMSC were transfected with a lentiviral vector to express green fluorescent protein (GFP). Hence, the presence of hMSC in corneal tissue was analyzed by immunofluorescence with antibodies against GFP and human mitochondria. In addition, we performed PCR to detect the possible expression of human GAPDH, which would demonstrate the presence of hMSC in the cornea. Results and discussion In the present work we have validated the use of the TearLab osmolarity System in mice. Readings with this system were similar to those obtained with other methods and we obtained good values for intraclass correlation coefficient (ICC), suggesting a good reliability of the procedure. Two forms of GVHD were noticed, because of the use of two different doses of splenic cells to induce the disease. Mice transplanted with 5 x 106 splenocytes (5M) developed a more severe GVHD, where the treatment with MSC had no visible effect. Among the corneal alterations caused by the GVHD, thinning of the epithelium and loss of Pax6 was common. In the most serious cases, total loss of Pax6 in epithelial cells and epithelial thickening was observed, a characteristic of the pathological process of squamous metaplasia. Furthermore, we saw evidence of severe inflammation, with T cell invasion in almost all corneas analyzed. Transplantation with 4 x 106 splenocytes (4M) resulted in a milder form of GVHD. These mice showed an improvement when they were treated with MSC as reflected by a better evolution of the ocular disease score. Tear osmolarity was increased and tear volume was decreased in GVHD mice compared with BM mice. These are evidences that a process of ocular dryness takes place in this model of GVHD. In contrast, BM and GVHD+MSC eyes showed similar values in both parameters. A thinner epithelium was also observed in 4M mice, which was not affected by the treatment with MSC. However, detection of Pax6 in corneal epithelium showed a similar pattern in GVHD and Control mice, and its gene expression was enhanced in GVHD corneas. In contrast, Pax6 was reduced in GVHD+MSC corneal sections and a non-statistically significant decrease was observed in gene expression. As Pax6 loss has been proposed as a marker for squamous metaplasia, we analyzed SPRR1B to know if keratinization was occurring. Our results showed an increase in SPRR1B staining in GVHD eyes that was lower in GVHD+MSC mice, which demonstrate that corneal keratinization is less frequent after treatment with hMSC. These results indicate, also, that variations in the expression of Pax6 do not always correlate with the appearance of keratinizing proteins. Immune cell invasion also occurred in 4M mice, as shown by the presence of CD3+ cells in the cornea of GVHD mice. Interestingly, no GVHD+MSC cornea presented CD3+ cells. Gene expression of IL-1β was augmented in some non-treated eyes but not in any treated one. TNF-α expression was highly increased in all corneas but in Control and GVHD+MSC. These results demonstrate that hMSC exerted an anti-inflammatory effect in the cornea of mice with GVHD. As TNF-α was increased also in MO mice, we used animals that only received the TBI to know if irradiation was underlying this effect. Our results confirmed this, as well as the effect of irradiation on Pax6 expression, which was also increased in these TBI mice. The presence of hMSC in the cornea of treated mice was determined by the immunodetection with antibodies against GFP and human mitochondria. Only two 5M animals, strongly affected by the disease exhibited positive staining for both markers. No staining was found in 4M mice neither by immunofluorescence nor by PCR detection of the transcript for human GAPDH. Therefore, MSC do not migrate to the cornea and the observed effects might be brought about by an action at distance. Given the important role of MMP9 in epithelial barrier disruption, we analyzed its expression in the cornea of our animals. We found a decrease in MMP9 expression in MO and GVHD corneas, compared to Control group, but not in GVHD+MSC corneas. Since our results were contrary to what was observed in previous studies, we also performed experiments with HCLE cells, to know if the exposure to inflammatory cytokines could explain the decrease in MMP9 expression. These cells were exposed to TNF-α and IL-1β for 48 h and the effect in MMP9 levels were analyzed by PCR and gel zymography. The results point to a complex regulation of the expression of MMP9, given that the presence of IL-1β results in a decrease in gene expression but an increase in extracellular active MMP9. In summary, we found that the use of MSC could be an effective treatment in oGVHD, as some of its more relevant consequences were reverted or avoided. MSC-treated mice showed better results in tear film measurements, and they had fewer keratinization features. More importantly, inflammation was reduced, decreasing the expression of TNF-α and avoiding T-cell infiltration. However, the treatment had no effect in a more severe form of GVHD, generated with a higher dose of splenic cells. The observed effects were not attributable to migration of MSC to corneal tissue.

Tesis de maestría en ciencias de la salud El protozoario G. lamblia es el parásito causal de giardiasis, infección parasitaria que se produce por la contaminación fecal/ oral en un medio de higiene precario, siendo una de las enfermedades intestinales humanas más comunes en todo el mundo. Las manifestaciones clínicas de esta infección varían desde el estado de portador asintomático hasta llegar a desarrollar un cuadro de diarrea severa, dolor abdominal, náuseas, malabsorción de nutrientes y pérdida de peso. En la actualidad, el tratamiento farmacológico contra la giardiasis llega a ser efectivo, sin embargo, tiene algunas limitantes importantes, como la inducción de efectos secuendarios y la probable inducción de cepas resistentes. No se cuenta con una vacuna contra G. lamblia en humanos, esto es en gran medida por los limitados conocimientos que se tienen de la respuesta inmune durante la enfermedad. Para lograr desarrollar esta, primeramente se deben identificar, caracterizar, purificar o sintetizar los antígenos que confieren inmunogenicidad a la vacuna. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre antígenos inmunogénicos de G. lamblia es limitado. Por esta razón, es importante entender los mecanismos inmunológicos que controlan y erradican la infección por este parásito intestinal. El presente estudio se enfocó en la caracterización e identificación de la proteína inmunogénica 5G8 de G. lamblia a través de la técnica analítica de espectrometría de masas y el posterior análisis por herramientas bioinformáticas, así como también la caracterización parcial de la respuesta inmune celular contra este antígeno. La proteína 5G8 se aisló mediante una cromatografía de afinidad a partir de un lisado de trofozoítos de G. lamblia. La proteína 5G8 aislada (~ 71 kDa) fue analizada mediante espectrometría de masas. Se identificaron dos proteínas con masas moleculares relativas de ~ 28 kDa y ~ 38 kDa pertenecientes a la familia de Proteínas Variables de Superficie (VSPs). El análisis bioinformático permitió identificar un constructo, el cual fue traducido en una sola cadena polipeptídica compuesta de 607 aminoácidos y una masa molecular de ~ 61 kDa. Adicionalmente, al evaluar la respuesta inmune celular, se observó una proliferación celular significativamente más alta (p < 0.05) en esplenocitos estimulados con la proteína 5G8 aislada y el lisado de trofozoítos de G. lamblia comparada con los que fueron estimulados con una proteína irrelevante utilizada como control negativo (HEL). Por otro lado, el porcentaje de expresión del marcador CD69 como indicativo de activación temprana en estos esplenocitos, se mostró más elevado en las células que estuvieron en contacto con el extracto proteico total y la proteína 5G8 de G. lamblia comparado con los esplenocitos con la proteína utilizada como control negativo (HEL). Por último, el análisis de modelado molecular in silico proporcionó un acercamiento al posible sitio de unión e interacciones moleculares entre los péptidos inmunodominantes de la proteína 5G8 y las moléculas del MHC-II (haplotipo I-Ak). El resultado mostró una distribución uniforme y compacta del péptido con mayor inmunodominancia (67-81 aa) en la cavidad, favoreciendo su posible interacción con aminoácidos de los bolsillos del MHC-II (haplotipo I-Ak). En conclusión, nuestros datos sugieren que la proteína 5G8 es una VSP (~ 71 kDa) codificada por un solo gen. Esta proteína puede inducir una respuesta inmune celular en esplenocitos de ratones infectados y re-infectados G. lamblia. Las interacciones químicas que se favorecen entre péptidos inmunodominantes con aminoácidos de los bolsillos del MHC-II nos permiten profundizar en el conocimiento de epítopes potenciales que desencadenan una respuesta inmune celular, los cuales podrían considerarse como blanco de futuros estudios. La caracterización bioquímica e inmunológica de antígenos inmunogénicos proporcionará una mejor comprensión de la interacción G. lamblia-hospedero, y será importante para el desarrollo de estrategias de control eficaces contra la giardiasis. Universidad de Sonora. División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Programa de maestría en ciencias de la salud 2016.

INTRODUCCIÓ: La malaltia pneumocòccica invasiva (MPI) pot tenir una elevada morbimortalitat, condicionada pel pneumococ i per factors de l’hoste com els receptors Toll-like (TLRs) i la seva via de senyalització intracel·lular comuna Toll-IL1R (TIR). El desenvolupament d’una MPI greu (MPIG) podria estar condicionat per polimorfismes genètics (SNPs) en regions crítiques de la via de senyalització comuna TIR. Aquests SNPs podrien influenciar també l’evolució i el pronòstic de la MPI. La determinació de la pèrdua d’expressió de la L-selectina (CD62L) “in vivo” en la superfície dels granulòcits podria ser útil en l’avaluació de la via de senyalització TIR en pacients amb MPIG. OBJECTIUS: Descriure els SNPs en proteïnes de la via de senyalització TIR (IRAK1, IRAK4, IRAKM i MyD88) en pacients amb MPIG. Determinar si aquests SNPs s’associen a la presència de MPIG. Determinar si aquests SNPs condicionen l’evolució dels pacients amb MPIG. Analitzar si la determinació de CD62L “in vivo” és útil com a cribratge inicial de les variacions de funció de la via de senyalització TIR en pacients amb MPIG. METODOLOGIA: Estudi prospectiu observacional de casos i controls. Casos: 60 pacients amb MPI i síndrome de resposta inflamatòria sistèmica. Controls: 120 pacients sense infecció aguda ni antecedent d’infecció greu. Criteris d’exclusió: immunodeficiència coneguda. Variables independents: 1) freqüències genotípiques i al·lèliques dels SNPs rs1059701, rs1059702, rs1059703 (IRAK1); rs1624395, rs1370128 (IRAKM); rs1141168, rs4251513, rs1461567 (IRAK4); rs7744, rs6853 (MyD88). 2) Nivell d’expressió de CD62L en superfície de neutròfils, limfòcits i monòcits en fase aguda de la infecció i en fase basal. Altres variables: demogràfiques, antecedents personals i dades evolutives clíniques, analítiques i microbiològiques de la MPIG. RESULTATS: Associació significativa entre la presència de MPIG i: rs1059701-CC (IRAK1) [p=0,0067, OR 1,430 (IC95%: 1,140-1,795)], rs4251513-CC (IRAK4) [p15000/mmc i rs1059702- noTT (IRAK1) [p=0,0460, OR 7,500 (IC95%: 1,862-30,214)], pleuropneumònia i rs1624395-G (IRAKM) [p=0,0147, OR 1,834 (IC95%: 1,230-2,736)] i rs1370128-C (IRAKM) [p=0,0055, OR 2,060 (IC95%: 1,367-3,105)], seqüeles i rs4251513-noGG (IRAK4) [p=0,0010, OR 7,066 (IC95%: 2,645-18,872)], exitus i rs6853-noAA (MyD88) [p=0,0054, OR 16,086 (3,336- 77,574)] i rs6853-G (MyD88) [p=0,0064, OR 8,388 (IC95%: 2,472-28,455)]. Estudi d’expressió de CD62L : només s’han obtingut dades completes en 21 pacients. Entre els 3 grups cel·lulars, diferències significatives en el grup de monòcits entre fase aguda i basal (p=0,0343). En els monòcits, diferències significatives en rs4251513-CG (IRAK4) entre fase aguda i basal (p=0,0391). CONCLUSIONS: Alguns SNPs d’IRAK1, IRAK4 i MyD88 estan associats a un risc incrementat de desenvolupar MPIG en comparació amb la població general. Altres SNPS d’IRAK1, IRAKM, IRAK4 y MyD88 condicionen l’evolució de la MPIG. La identificació de SNPs que predisposin a malalties infeccioses greus com la MPIG podria ajudar a estratificar els pacients i dissenyar tractaments específics. Nous estudis amb mida mostral major podrien ajudar a entendre les conseqüències funcionals d’aquestes associacions a través de la determinació dels nivells de CD62L en monòcits abans i després de la MPIG., INTRODUCTION: Invasive pneumococcal disease (IPD) may have high morbidity and mortality, conditioned by pneumococcus and host factors such as Toll-like (TLRs) receptors andtheir common intracellular signaling pathway Toll-IL1R (TIR). Development of severe IPD (SIPD) could be conditioned by genetic polymorphisms (SNPs) in critical regions of the common signaling pathway TIR. These SNPs could also have influence on the evolution and prognosis of IPD. Determination "in vivo" of loss of expression of L-selectin (CD62L) on surface of granulocytes could be useful in the evaluation of the TIR signaling pathway in patients with SIPD. OBJECTIVES: To describe SNPs in proteins of the TIR signaling pathway (IRAK1, IRAK4, IRAKM and MyD88) in patients with SIPD. To determine whether these SNPs are associated with presence of SIPD. To determine whether these SNPs condition the evolution of patients with SIPD. To analyze if determination of CD62L "in vivo" is useful as an initial screening of variations in function of TIR signaling pathway in patients with SIPD. METHODS: Observational prospective case-control study. Cases: 60 patients with IPD and systemic inflammatory response syndrome. Controls: 120 patients without acute infection nor history of severe infection. Exclusion criteria: known immunodeficiency. Independent variables: 1) Genotypic and allelic frequencies of SNPs rs1059701, rs1059702, rs1059703 (IRAK1); rs1624395, rs1370128 (IRAKM); rs1141168, rs4251513, rs1461567 (IRAK4); rs7744, rs6853 (MyD88). 2) Level of expression of CD62L on surface of neutrophils, lymphocytes and monocytes in acute phase of infection and in basal phase. Other variables: demographic, personal history and clinical, analytical and microbiological evolutionary data of SIPD. RESULTS: Significant association between presence of SIPD and: rs1059701-CC (IRAK1) [p = 0.0067, OR 1,430 (IC95%: 1,140-1,795)], rs4251513-CC (IRAK4) [p 15000 / mmc and rs1059702- noTT (IRAK1) [p = 0.0460, OR 7,500 (IC95%: 1,862-30,214)], pleuropneumonia and rs1624395-G (IRAKM) [p = 0.0147, OR 1,834 (IC95%: 1,230-2,736)] and rs1370128-C (IRAKM) [p = 0.0055, OR 2,060 (IC95%: 1,367-3,105)], sequelae and rs4251513-noGG (IRAK4) [p = 0.0010, OR 7,066 (IC95%: 2,645-18,872)], exitus and rs6853-noAA (MyD88) [p = 0.0054, OR 16,086 (3,336-77,574)] and rs6853-G (MyD88) [ p = 0.0064, OR 8,388 (IC95%: 2,472-28,455)]. CD62L expression study: complete data were obtained in 21 patients. Among the 3 cell groups, significant differences in group of monocytes between acute and basal phase (p = 0.0343). In monocytes, significant differences in rs4251513-CG (IRAK4) between acute phase and basal phase (p = 0.0391). CONCLUSIONS: Some SNPs from IRAK1, IRAK4 and MyD88 are associated with an increased risk of developing SIPD compared to general population. Other SNPS from IRAK1, IRAKM, IRAK4 and MyD88 condition the evolution of SIPD. Identification of SNPs that predispose to serious infectious diseases such as SIPD could help stratify patients and design specific treatments. New studies with a larger sample size could help to understand functional consequences of these associations through the determination of CD62L levels in monocytes before and after SIPD.

La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) se trata de un desorden de etiología desconocida en el que intervienen múltiples factores, tanto en el comienzo de la enfermedad como en la aparición de brotes, siendo los más importantes los factores ambientales (como el tabaco, la dieta, el estilo de vida, el tratamiento farmacológico o la apendicectomía), la flora comensal presente en el intestino y el componente genético del individuo. Hasta la fecha se han descrito más de 160 loci de susceptibilidad frente a la EII, la mayoría de ellos compartidos por la CU y la EC. Los productos codificados por los genes incluidos en estos loci intervienen en múltiples procesos como la producción de citoquinas, la respuesta inmunitaria innata, la autofagia, la respuesta al estrés oxidativo, el mantenimiento de la integridad de la barrera epitelial, la respuesta inmunitaria adaptativa y la actividad antimicrobiana. La hipótesis con más peso actualmente es que la EII está causada por una respuesta inmunitaria excesiva frente a la flora comensal en individuos genéticamente predispuestos. Tanto en el caso de la CU como de la EC se ha observado una alteración del diálogo entre flora comensal y sistema inmunitario así como de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa. En el caso de la CU predomina una respuesta Th2 en la mucosa intestinal mientras que en la EC las respuestas predominantes son Th1 y Th17 fundamentalmente. El principal objetivo de esta tesis doctoral es estudiar la posible relación entre variantes de genes que codifican para moléculas directamente implicadas en la respuesta inmunitaria y la EII. En este trabajo se estudian los genes HLA, (relacionados con la presentación antigénica), MICA (sensor de estrés y daño celular), NOD2 y TLRs (receptores de reconocimiento de patrones claves en el diálogo con la flora comensal)., Tesis Univ. Granada. Programa Oficial de Doctorado en: Bioquímica y Biología Molecular

163 páginas. -- Tesis doctoral. Universidad de Valladolid. Instituto de Biología y Genética Molecular-CSIC. Leída, 18-12-2015, Las citocinas IL-12 p70 e IL-23 polarizan la respuesta inmune a los tipos Th1 y Th17. Estas citocinas comparten una subunidad, la IL-12 p40 (gen IL12/23B) y difieren en una subunidad específica, la IL-12 p35 (gen IL12A) en la IL-12 p70, y la IL-23 p19 (gen IL23A) en la IL-23. La regulación del balance IL-12 p70/IL-23 es relevante en infecciones fúngicas invasivas y enfermedades autoinmunes. La transcripción de IL23A se regula por una combinación de c-Rel con coactivadores como ATF2, que se activa por fosforilación complementaria, dependiente de PKC y MAPKs, de las Thr-71 y Thr-69. Los receptores de patrones fúngicos Dectin-1 y Dectin-2 inducen la producción de LTB4, cisteinil-leucotrienos y PAF que contribuyen a la fosforilación de ATF2. La transcripción de IL12A se reprime por el estímulo fúngico zimosano mediante la desacetilación dependiente de NAD+ de las histonas del promotor de IL12A por SIRT1, reduciendo la accesibilidad de c-Rel.

El rápido desarrollo de la Inmunología durante el pasado y presente siglo, ha hecho que la Inmunología sea actualmente la ciencia que más interrelación tiene con otras disciplinas del campo de la Biología y de la Biomedicina en general. Su carácter multidisciplinar hace que se integre y se complemente a la perfección con multitud de disciplinas biomédicas. Por otro lado, cada día aumenta el número de enfermedades en las que se reconoce que la participación del sistema inmunitario, es la causa, o contribuye de forma importante al proceso patológico. Precisamente, durante el curso 2013-2014, ha empezado a impartirse por vez primera la asignatura de Inmunología Aplicada e Inmunopatología, del Area de Inmunología del cuarto curso de Grado en Biología, que a la vez que analiza las múltiples aplicaciones de la Inmunología en distintos campos de la Biotecnología y la Biomedicina, estudia con detalle aspectos diagnósticos, pronósticos y terapéuticos de las principales enfermedades de base inmunológica. Con esta red, pretendemos aprovechar la experiencia acumulada durante el pasado año con la asignatura de Inmunología General, impartida en tercer curso del Grado en Biología, para asegurar la adecuada coordinación entre el profesorado de las dos asignaturas actuales y fomentar el trabajo en equipo, buscando con ello cumplir con las competencias previstas descritas en las guías docentes de ambas asignaturas.

Tesis inédita presentada en la Universidad Europea de Madrid. Facultad de Ciencias Biomédicas. Programa de Doctorado en Biomedicina y Ciencias de la Salud, La enfermedad arterial periférica (EAP) es una enfermedad arterial inflamatoria crónica que se inicia con la pérdida de las funciones homeostáticas del endotelio. Esta disfunción endotelial se ha asociado con una disminución de la bioactividad del óxido nítrico (NO). En este contexto, los anticuerpos anti-beta2-glicoproteína I (ABGPI) se encuentran elevados en la EAP e inducen una sobreexpresión de moléculas de adhesión y de citoquinas proinflamatorias por el endotelio. El patrón de activación endotelial sustentado por los ABGPIs es similar al obtenido tras la activación de los receptores Toll-Like (TLR) del sistema inmune. Los subtipos TLR2 y TLR4 se han asociado de forma consistente con la aterosclerosis. El objetivo principal de esta tesis es el de investigar una hipotética asociación entre los títulos de ABGPI y la expresión génica de los receptores pro-aterogénicos TLR2 y TLR4 del sistema inmune presentes en las células endoteliales, tras la exposición de un cultivo celular a suero de pacientes con EAP seropositivos para ABGPI. Métodos: Compendio de cinco artículos originales. Los tres primeros estudios fueron observacionales y se realizaron en humanos. Su objetivo fue el de identificar una eventual relación entre los ABGPIs circulantes y los eventos patogénicos primarios de la EAP. Se incluyeron pacientes con EAP y sujetos sanos control pareados con los casos. Se determinó la dilatación braquial mediada por flujo (DBMF) como estimador de la función endotelial. El metabolismo del NO fue evaluado a través de la determinación de los niveles de nitritos plasmáticos. Se midieron los niveles de proteína c-reactiva y el recuento de células blancas periféricas. Los ABGPIs fueron detectados en suero mediante inmunofluorescencia indirecta. Los dos últimos estudios fueron experimentales y se llevaron a cabo usando suero humano no fraccionado y un cultivo de células endoteliales de aorta humana. El objetivo de estos estudios fue el de investigar una posible relación entre los títulos de ABGPI y la expresión génica de los receptores pro-aterogénicos TLR2-TLR4 y de sus efectores intracelulares MyD88-IRAK1, tras la estimulación del cultivo celular con suero de pacientes con EAP seropositivos para el autoanticuerpo. Resultados: En los estudios en humanos se observó que los títulos de ABGPIs circulantes se encuentran elevados en pacientes con EAP. Los títulos de ABGPI se asociaron con una menor DBMF y con unos mayores niveles de nitritos plasmáticos y de proteína c-reactiva. El recuento de monocitos fue mayor en pacientes con altos títulos de ABGPI. Los estudios realizados en cultivo celular demostraron que la estimulación de células endoteliales sanas con suero humano seropositivo para ABGPI obtenido de pacientes con EAP, induce un aumento de la expresión génica del receptor TLR4 y de su molécula de señalización celular MyD88 por las células endoteliales. Conclusiones: Los ABGPIs circulantes se encuentran elevados en pacientes con EAP y se asocian con la disfunción endotelial, la alteración del metabolismo del NO y el proceso inflamatorio que acontece desde las fases iniciales de la enfermedad. Además, la actividad transcripcional de TLR4 y de su proteína de diferenciación mieloide (MyD88) en el cultivo de células endoteliales se relaciona con los títulos de los ABGPIs presentes en el suero de los pacientes con EAP. Estos hallazgos sugieren una novedosa vía de activación de la aterosclerosis en pacientes con EAP. [Resumen Teseo], UEM