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A ancilostomíase é considerada uma doença parasitária negligenciada causada por helmintos nematódeos pertencentes à família Ancylostomatidae. Aproximadamente 740 milhões de pessoas, no mundo, estão infectadas por este parasito. As dificuldades no diagnóstico desta parasitose podem estar relacionadas à reatividade cruzada com outros parasitos, atribuída à complexidade antigênica e proximidade filogenética. Com a finalidade de melhorar o diagnóstico da ancilostomíase humana, este estudo viabilizou a produção inédita de anticorpos IgY específicos ao Ancylostoma ceylanicum, destacando o fato do método ser economicamente viável, de fácil reprodução e com alto grau de rentabilidade de anticorpos. O extrato salino total de larvas filarioides de A. ceylanicum foi avaliado em eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida 8% (SDS-PAGE) para caracterização do perfil proteico e posterior utilização na imunização das galinhas. As amostras purificadas de anticorpos IgY anti-larvas de A. ceylanicum apresentaram concentrações entre 8.370 μg/mL e 4.000 μg/mL. A gema pura apresentou bandas proteicas com peso de ≤ 200, 110, 80, 50 e 20 kDa. As frações P1, P2 e a amostra purificada no HPLC demonstraram bandas com pesos moleculares um pouco abaixo de ≤ 200 kDa, identificando a IgY específica. Os picos da produção de anticorpos IgY anti-larvas de A. ceylanicum ocorreram na 6a, 8a e 16a semanas após imunização. A maior avidez foi detectada na 15ª semana com índice avidez de 67%. Os anticorpos foram capazes de detectar imunocomplexo em 16,6% (5/30) das amostras de soro de indivíduos com ancilostomíase. Em relação a reatividade cruzada entre os parasitos: 10% (3/30) das amostras de soro de indivíduos com estrongiloidíase, 6,7% (2/30) em amostras de soro com outras parasitoses e 0% nos casos negativos. Concluiu-se que o anticorpo IgY anti-larvas de A. ceylanicum pode ser considerado uma possível ferramenta diagnóstica para a ancilostomíase, porém, mais estudos são necessários para o aprimoramento das técnicas. The hookworm infection is considered a neglected tropical disease (NTD) caused by nematodes belonging to Ancylostomatidae family. Approximately 740 million people worldwide are infected with this parasite. Difficulties in the diagnosis may be related to cross-reactivity with other parasites, due to the antigenic complexity and phylogenetic proximity to some species. In order to improve the diagnosis of human hookworm infection, this study enabled the unprecedented production of specific IgY antibodies against Ancylostoma ceylanicum, highlighting the fact that the method is economically feasible, reproducible and has high antibodies profitability. The saline extract of A. ceylanicum filarial larvae was evaluated in one-dimensional electrophoresis to characterize the protein profile and chickens immunization. Samples of purified anti-larvae of A. ceylanicum IgY showed concentrations of 8.370 μg/ml and 4.000 μg/ml. The process of IgY antibodies purification was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis 8% (SDS-PAGE). The pure yolks showed protein bands with apparent molecular weight slightly below ≤ 200, 110, 80, 50 and 20 kDa. The fractions P1 and P2, and the HPLC purified sample showed bands with molecular weights somewhat below ≤ 200 kDa, identifying the specific IgY. The peaks of the production of A. ceylanicum antibodies IgY anti-larvae occurred at 6th, 8th and 16th weeks after the immunizations. The higher avidity was detected at 15th week with 67% content. The antibodies were capable of detecting immunocomplexes in 16.6% (5/30) of serum samples from infected individuals with hookworm, 10% (3/30) of serum samples from individuals with strongyloidiasis, 6.7% (2/30) in serum samples with other parasitosis and 0% in negative cases. It is concluded that the A. ceylanicum IgY antibody anti-larvae can be considered as a possible diagnostic tool for hookworm infection, but more studies are needed to improve the techniques. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Neurocisticercose (NC) é uma infecção parasitária, causada pela forma metacestódea de Taenia solium que acomete o sistema nervoso central. Devido à gravidade do quadro clínico da NC há a necessidade de aperfeiçoar o diagnóstico por meio da busca de fontes antigênicas novas e alternativas. Esse estudo teve como objetivo analisar frações antigênicas de metacestódeos de Taenia saginata, por proteômica e aplicar estes antígenos em plataformas diagnósticas na NC humana. O extrato salino (ES) de metacestódeos de T. saginata foi fracionado por cromatografia de gel filtração (resina Sephacryl S-100) e cromatografia de troca iônica em resinas (carboximetil-sepharose (CM) - trocadora catiônica e dietilaminoetil-sepharose (DEAE) - trocadora aniônica). As frações F1 e F2 (gel filtração) e CMS1, CMS2, DEAES2 e DEAES2 (troca iônica), foram obtidas. O ES e suas frações foram avaliados em eletroforese 1D (F1, F2 e DEAES2) e 2D (DEAES2) para caracterização do perfil proteico e testados por ELISA e/ou immunoblotting (1D e/ou 2D) em amostras de soro e/ou líquor de pacientes com NC (G1), com outras infecções parasitárias ou desordens neurológicas (G2) e indivíduos saudáveis (G3) para detecção de anticorpos IgG. Os parâmetros de diagnóstico: sensibilidade (Se), especificidade (Es), área sob a curva (AUC) e likelihood ratios (LR + e LR-) foram calculados. A identificação de proteínas de interesse foi realizada por espectrometria de massas (MS) após seleção das frações obtidas por ELISA e/ou immunoblotting (1D e/ou 2D). A predição de epítopos de célula B também foi realizada. DEAES2 foi utilizada como sonda para o desenvolvimento de um imunossensor utilizando amostras de líquor. A fração F1 apresentou bandas polipeptídicas de 64-68 kDa. A fração F1 apresentou os melhores parâmetros de diagnóstico, em relação ao ES (Se: 93,3% e 84,4%; Es: 93% e 86%; AUC: 0,990 e 0,928; LR+: 13,42 e 6,07 e LR-: 0,07 e 0,18, respectivamente) no immunoblotting quando esta fração foi testada com pool de amostras do G1 houve um forte reconhecimento. Duas proteínas foram identificadas: enolase [Taenia multiceps] e calreticulina [T. solium], e essas proteínas apresentaram 18 e 10 epítopos de célula B preditos, respectivamente. Duas bandas proteicas foram identificadas em F2 (F2a - 20 kDa e F2b - 15 kDa). A análise por MS identificou duas proteínas: mioglobina [fios taurus] (F2a) e glicoproteína de 8 kDa [T. multiceps] (F2b), que apresentaram três epítopos preditos. O ELISA utilizando a fração F2 apresentou melhores parâmetros de diagnóstico (Se: 80,0%; Es: 90,5%; AUC: 0,954; LR+: 8,42 e LR-: 0,22), em relação ao ES. DEAES2 (64-68 kDa), apresentou parâmetros de diagnóstico similares ao líquido de vesícula de T. solium, em amostras pareadas de soro e líquor. O perfil eletroforético bidimensional revelou 24 spots. Após o immunoblotting 2D, utilizando pool de líquor de pacientes do G1 e G2, dois spots (1-pI 5,4; > 70 kDa e 2-pI 5,4; > 50kDa) foram selecionados para análise por MS. Três proteínas promissoras para o diagnóstico da NC foram identificadas: small heat-shock; putative growth regulator 14-3-3 e calreticulina [T. solium]. O imunossensor imobilizado com DEAES2 apresentou resultados relevantes quando utilizado compósitos de ZnO com Ag2O (ZnO:Ag2), 0,9%. Os resultados de voltametria de pulso diferencial (DPV) revelaram picos de intensidade de corrente elétrica: 1,74 pA (G1) e 1,30 pA (G2). Concluiu-se que importantes proteínas das frações antigênicas obtidas por técnicas cromatográficas foram identificadas com potencial aplicação em plataformas imunodiagnósticas na NC humana. Neurocysticercosis (NC) is a parasitic disease that affects the central nervous system and is caused by Taenia solium metacestodes. Due to the seriousness of the clinical picture on NC there is a need to improve diagnosis through the search of new and alternative antigenic sources. This study aimed to analyze antigenic fractions from Taenia saginata metacestodes by proteomic tools and apply these antigens in diagnostic platforms to human NC. Saline extract (SE) from T. saginata metacestodes was fractionated by: gel filtration (Sephacryl S- 100 resin) and ion exchange (carboximetil-sepharose (CM) - cationic exchanger and dietilaminoetil-sepharose (DEAE) - anionic exchanger) chromatography. Six antigenic fractions were obtained: F1 and F2 (gel filtration) and CMS1, CMS2, DEAES1 and DEAES2 (ion exchange). SE and its fractions were evaluated by 1D (F1, F2 and DEAES2) and 2D (DEAES2) electrophoresis for proteic profile characterization and tested by ELISA and/or immunoblotting (1D and/or 2D) using serum or cerebrospinal fluid (CSF) from patients with NC (G1), other parasitic diseases or neurologic disorders (G2) and healthy individuals (G3) to detect IgG antibodies. Diagnostic parameters: sensitivity (Se), specificity (Sp), area under curve (AUC) and likelihood ratios (LR + and LR-) were calculated. Identification of proteins from interest was done by mass spectrometry (MS), after selection of the best fractions by ELISA and/or immunoblotting (1D and/or 2D). The prediction of B cell epitopes was also done. DEAES2 was also used as a probe to develop an immunosensor using CSF samples. F1 presented proteic bands from 64-68 kDa. F1 achieved the best diagnostic parameters when comparing to ES, (Se: 93.3% and 84,4%; Sp: 93% and 86%; AUC: 0.990 and 0.928; LR+: 13.42 and 6.07 and LR: 0.07 and 0.18, respectively), in immunoblotting when testing this fraction with pool of samples from G1 there was strong recognition. Two proteins were identified: enolase [Taenia multiceps] and calreticulin [T. solium], these proteins presented respectively, 18 and 10 predicted epitopes. Two proteic bands were identified on F2 (F2a - 20 kDa and F2b - 15 kDa). MS analyses identified two proteins: mioglobin [Bos taurus] (F2a) and a 8 kDa glicoprotein [T. multiceps] (F2b), which presented 3 predicted epitopes. ELISA using F2 presented great diagnostic parameters (Se: 80%; Sp: 90,5%; AUC: 0.954; LR+: 8.42 and LR-: 0.22) if compared with ES. DEAES2 (64-68 kDa), presented diagnostic parameters similar to those achieved when testing vesicular fluid from T. solium metacestodes using serum and CSF paired samples. The bidimensional electrophoretical profile revealed 24 spots. After 2D immunoblotting, using pool of CSF samples from patients from G1 and G2 two spots (1-pI 5.4; > 70 kDa and 2-pI 5.4; > 50kDa) were selected for MS analyses. Three promising proteins for NC diagnosis were identified: small heat-shock; putative growth regulator 14-3-3 and calreticulin [T. solium]. The immunosensor using DEAE S2 presented relevant results when using ZnO with Ag2O (ZnO:Ag2), 0,9% composites. Differential pulse voltammetry (DPV) results revealed peaks of electric intensity: 1.74 pA (G1) and 1.30 pA (G2). It can be concluded that important proteins on the antigenic fractions obtained by chromatographic techniques were identified with potential application on immunodiagnostic platforms for human NC. Tese (Doutorado)

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Strongyloides stercoralis, intestinal nematode parasite, infects millions of people. The cross-reactivity in immunodiagnosis is credited to antigenic complexity and glycoproteins. The aim of this study was to evaluate different heterologous antigenic fractions in human strongyloidiasis immunodiagnosis. Saline extract (SE) of infective larvae of S. venezuelensis was fractionated in ion exchange resin (diethylaminoethyl Sepharose - DEAE; fractions named DEAE S1 and DEAE S2 - which interacted with the resin) or gel filtration chromatography (Sephacryl S-100 resin) in F1, F2, F3 and F4. Larvae and SE were treated with sodium metaperiodate (MP) for chemical deglycosylation and verification of changes in carbohydrate content. SE and its fractions were evaluated in one-dimensional electrophoresis to characterize the proteic profile and were tested in serum samples [strongyloidiasis patients (G1), other parasitic infections (G2) and healthy individuals from an endemic area (G3)] for IgG detection and its subclasses by ELISA. Sensitivity (Se), specificity (Sp), area under curve (AUC), likelihood ratio (LR), intermediate range (IR) and valid range proportion (VRP) were calculated as diagnostic parameters. Protein identification by mass spectrometry was made after ELISA-IgG selection. B cell epitope prediction was performed. DEAE S1 and S2 showed protein profiles complementary to ES, with differential polypeptides (DEAE S1 - 21 to < 15 kDa; DEAE S2 - 21 to 50 kDa). DEAE S2 fraction presented higher diagnostic parameters for IgG detection (Se 92%, Sp 93%, AUC 0.981, LR+ 10.75, LR 0.09). Larvae showed distinct localization of carbohydrates and no carbohydrates were detected in SE after MPtreatment. Electrophoretic profiles of polypeptides were similar between SE before and after MP treatment. ELISA sensitivity reached 90 % for MP, Sp 94.6 %, LR+ 16.9, and LR 0.08. Significant interaction between IgG subclasses and extracts was observed for patients with strongyloidiasis (P = 0.02), i.e. reduction in detected levels. F2 gel filtration fraction showed bands of 13, 22, 25, 30, 33, 37, 45, 60, 70 and 140 kDa regions. IR and VRP values were better for ELISA-F2 (IR 23; VRP 98.9 %). ELISA index (EI) median in G1 was higher for SE when compared to F1-F4 fraction (P < 0.0001), however the F2 retained IgG-positive samples (94%). The EI reduction was accompanied by no detection of IgG positive samples in G2 and only F2 showed EI reduction in G3 compared to ES IE (t = 7.020, P < 0.0001). Bands 60 and approximately 33 kDa polypeptide regions from F2 were selected and excised for mass spectrometry analysis. Three homologous proteins of S. ratti were considered with reliable identification: aspartic protease 4 (ASP-4), 14-3-3 zeta and heat shock protein 60 (HSP60). It was concluded that: (1) DEAE fraction S2 was a sensitive and specific source of peptides for IgG detection in human strongyloidiasis diagnosis, (2) chemical deglycosylation overcome cross-reactivity in the control groups, demonstrating the role of carbohydrate residues in the recognition of anti-Strongyloides IgG and its subclasses and (3) F2 obtained after gel filtration, is composed of immunodominant proteins, which will allow definition of epitopes for vaccine protocols and diagnostic assays in human strongyloidiasis. Strongyloides stercoralis, nematódeo parasito intestinal, infecta milhões de pessoas. A reatividade cruzada é limitante para o imunodiagnóstico e é atribuída a complexidade dos preparados antigênicos e às glicoproteínas. Com o objetivo de aprimorar o imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana, este estudo avaliou frações antigênicas heterólogas obtidas de Strongyloides venezuelensis. O extrato salino (ES) de larvas filarioides de S. venezuelensis foi fracionado por cromatografia de troca iônica (resina dietilaminoetil Sepharose DEAE) nas frações DEAE S1 e DEAE S2 que interagiu com a resina ou de gel filtração (resina Sephacryl S-100) nas frações F1, F2, F3 e F4. Larvas íntegras e ES foram tratados com metaperiodato de sódio (MP) para deglicosilação química e verificação de alterações nos carboidratos. O ES e suas frações foram avaliadas em eletroforese unidimensional para caracterização do perfil proteico e testados em amostras de soro [pacientes com estrongiloidíase (G1), com outras infecções parasitárias (G2) e indivíduos saudáveis de área endêmica (G3)] para detecção de IgG e subclasses anti-Strongyloides por ELISA. Sensibilidade (Se), especificidade (Es), area under curve (AUC), likelihood ratio (LR), intermediate range (IR) e valid range proportion (VRP) foram os parâmetros de diagnóstico calculados. A identificação de proteínas de interesse diagnóstico por espectrometria de massa foi realizada após seleção da fração por ELISAIgG. Os epítopos de células B foram preditos. DEAE S1 e DEAE S2 apresentaram perfis proteicos complementares ao do ES, com enriquecimento de polipeptídeos diferencial (DEAE S1 21 a < 15 kDa; DEAE S2 21 a 50 kDa). A fração DEAE S2 obteve elevado valor diagnóstico para a detecção de IgG (Se 92 %, Es 93 %, AUC 0,981, LR+ 10,75, LR− 0,09). Larvas apresentaram marcação modificada para localização de carboidratos e no ES não foram encontrados carboidratos após MP. Os perfis eletroforéticos dos polipeptídeos foram semelhantes entre ES antes e após a adição de MP. Sensibilidade no ELISA atingiu 92,5 %, Es 94,6 %, LR+ 16,9 e LR− 0,08 para MP. Interação significante entre subclasses de IgG e extratos foi demonstrada para pacientes com estrongiloidíase (P = 0,02), com redução nos níveis detectados. A fração F2 teve bandas marcadas nas regiões de 13, 22, 25, 30, 33, 37, 45, 60, 70 e 140 kDa. Os valores de IR e VRP foram melhores para o teste ELISA-F2 (IR 23; VRP 98,9 %). A média do índice ELISA (IE) no G1 foi maior para o ES, quando comparado às frações F1-F4 (P < 0,0001), mas F2 manteve a porcentagem de amostras IgG-positivas (94 %). A redução do IE foi acompanhada da não detecção de IgG em G2. No G3 apenas F2 mostrou redução de IE em relação ao ES (t = 7,020, P < 0,0001). Foram selecionadas e excisadas as bandas de aproximadamente 60 e 33 kDa de regiões polipeptídicas de F2 no gel 1D para análise por espectrometria de massas. Foram consideradas com identificação confiável três proteínas homólogas de Strongyloides ratti: aspartic protease 4 (ASP-4), 14-3-3 zeta e heat shock protein 60 (HSP60). Concluiuse que (1) a fração DEAE S2 demonstrou ser fonte de peptídeos sensíveis e específicos para detecção de IgG no sorodiagnóstico da estrongiloidíase humana, (2) a deglicosilação química do antígeno larval diminuiu a reatividade cruzada/ e os falsos positivos nos grupos controle, demonstrando o papel dos resíduos de carboidratos no reconhecimento da IgG e suas subclasses anti-Strongyloides e (3) F2, obtida após gel filtração, é composta por proteínas imunodominantes que permitirão a definição de epítopos para utilização em ensaios vacinais ou de diagnóstico da estrongiloidíase humana. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Camundongos descendentes de mães esquistossomóticas apresentam, na vida adulta, alterações na resposta imune para o antígeno heterólogo, ovalbumina (OVA). A prévia amamentação em mães esquistossomóticas induziu aumento na produção de anticorpos anti-OVA, enquanto a gestação levou à diminuição. Aqui analisamos nos descendentes de mães esquistossomóticas: a influência da IL-10 na supressão dos anticorpos e a expressão de moléculas co-estimulatórias em resposta à OVA nas células apresentadoras de antígenos (APCs). Além disso, analisamos nestes descendentes após a infecção ou administração i.p. de antígeno solúvel de ovos de S. mansoni (SEA), a presença de células T regulatórias (Tregs) e a intensidade da supressão ou potencialização anti-OVA. Camundongos machos formaram quatro grupos: animais nascidos de mães infectadas e amamentados em mães não-infectadas (MI), animais de mães não-infectadas e amamentados em mães infectadas (AI), animais nascidos/amamentados em mães infectadas (MIAI) e nascidos/amamentados em mães não-infectadas (Controle). Parte destes animais foi depletada da ação da IL-10. Em outra parte, após a imunização com OVA+adjuvante realizou-se a dupla marcação para APCs (CD45R/B220 ou CD11c e CD80/CD86/CD40/HLA-DR), e nas infecções pós-natais, para Tregs (Foxp3). Foi observado que a IL-10 esteve comprometida com a supressão de anticorpos nos camundongos do grupo MI (p

INTRODUCTION: Considering that alternative antigens for diagnosing neurocysticercosis continue to be a challenge because of the increasing difficulty in obtaining parasites from naturally infected pigs for preparation of Taenia solium homologous antigen, the aim of the present study was to evaluate the detergent (D) and aqueous (A) fractions from saline extract of Taenia saginata metacestodes for diagnosing neurocysticercosis. METHODS: Taenia saginata was obtained from naturally infected bovines in the Triângulo Mineiro region, State of Minas Gerais, Brazil. The carcasses came from cold storage units and had been slaughtered in accordance with the inspection technique recommended by the Federal Inspection Service. The D and A fractions were obtained by using Triton X-114 (TX-114). Serum samples were obtained from 40 patients with a diagnosis of neurocysticercosis, 45 with other parasitic diseases and 30 from apparently normal individuals. IgG antibody levels were evaluated using the ELISA and immunoblotting assays. RESULTS: The ELISA sensitivity and specificity were 95% and 73.3%, when using saline extract; 95% and 82.6% for the D fraction; and 65% and 61.3% for the A fraction, respectively. The immunoblotting assay confirmed the ELISA results, such that the D fraction was more efficient than the other extracts, and the 70-68kDa component was immunodominant among neurocysticercosis patients. CONCLUSIONS: These results demonstrated that the D fraction from Taenia saginata metacestodes obtained using TX-114 can be used as a heterologous antigenic fraction in the immunoblotting assay for serologically diagnosing human neurocysticercosis, given its ability to select immunodominant antigens. INTRODUÇÃO: Considerando que antígenos alternativos para o diagnóstico da neurocisticercose (NC) continua sendo um desafio devido ao aumento da dificuldade em se obter parasitas de suínos naturalmente infectados, para a preparação do antígeno homólogo de Taenia solium, o objetivo do presente estudo foi avaliar frações detergente (D) e aquosa (A), do extrato salino de metacestódeo de Taenia saginata para diagnóstico da NC. MÉTODOS: Bovinos, naturalmente infectados com Taenia saginata, procedentes da região do Triângulo Mineiro, Estado de Minas Gerais, Brasil, foram obtidos de frigoríficos e abatidos de acordo com a técnica de inspeção recomendada pelo Serviço de Inspeção Federal. As frações D e A foram obtidas utilizando Triton X-114 (TX-114). Amostras de soro foram obtidas de 40 pacientes com diagnóstico de NC, 45 com diagnóstico de outras doenças parasitárias e 30 de indivíduos aparentemente normais. Níveis de IgG foram avaliados pelos testes ELISA e Imunoblotting. RESULTADOS: A sensibilidade e especificidade do teste ELISA foram 95% e 73,3%, quando utilizado o extrato salino, 95% e 82,6% para fração D, e 65% e 61,3% para a fração A, respectivamente. O ensaio Imunoblotting confirmou os resultados do teste ELISA, sendo a fração D mais eficiente que os outros extratos, observando-se que o componente 70-68kDa se comportou como imunodominante para os pacientes com NC. CONCLUSÕES: Estes resultados demonstraram que a fração D de metacestódeo de Taenia saginata obtida com TX-114 pode ser utilizada como fração antigênica heteróloga pelo Imunoblotting para o diagnóstico sorológico da NC humana, considerando sua habilidade para selecionar antígenos imunodominantes.