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El diagnóstico y manejo de pacientes con citopenias persistentes (anemia, trombopenia y/o neutropenia) representa un gran desafío diagnóstico y un problema de salud. Una proporción mayoritaria de estos pacientes corresponden a Síndromes Mielodisplásicos (SMD) y el resto a citopenias de significado incierto con o sin hematopoyesis clonal. La evidencia actual muestra que el estudio de variantes génicas en pacientes con citopenias o SMD por secuenciación masiva (NGS) contribuye a mejorar el diagnóstico, a la estratificación pronóstica y en la decisión terapéutica. En este proyecto hemos diseñado y validado técnica y clínicamente un panel de NGS para el estudio de pacientes con neoplasias mieloides. Hemos implementado dicho estudio en el workflow diagnóstico de pacientes portadores de citopenias persistente y en SMD. Esto hace que el diagnóstico molecular de estas patologías, como lo realizábamos en forma tradicional (gen por gen), comience ser sustituido por la NGS que permite estudiar en forma simultánea múltiples genes y regiones génicas. Desde el punto de vista clínico iniciamos la caracterización molecular completa de nuestra población de pacientes con citopenias de origen incierto y en pacientes con SMD. Los hallazgos encontrados hasta el momento fueron similares a los publicados en la literatura internacional. En conclusión: contamos en nuestro país con une herramienta diagnóstica validada para el estudio de pacientes con neoplasias mieloides que permitirá conocer mejor el pronóstico, adecuar el tratamiento e identificar nuevos blancos terapéuticos. Agencia Nacional de Investigación e Innovación

Resumen Desde su descubrimiento en el 2019 en China, hasta su expansión global en lo que vivimos hoy en día como una pandemia en su máximo apogeo, la enfermedad del coronavirus del 2019 (COVID 19), provocada por SARS-CoV-2 ha provocado una crisis global, al ser reconocido el 11 de marzo del 2020 como una emergencia de salud pública internacional por la organización mundial de la salud (WHO) [1], y a la fecha ha provocado más de 1 millón de muertes con alrededor de 57 millones de casos confirmados en alrededor de 220 países diferentes [2]. La severidad de la pandemia junto con su rápida expansión global, han puesto en jaque a la comunidad científica que ha producido una cantidad sin precedentes de investigación en muy poco tiempo sobre el virus, con el fin de poder desarrollar vacunas efectivas [3]. Como parte de este gran esfuerzo se ha utilizado tecnología de punta, como la secuenciación de nueva generación, usada para obtener el genoma completo de SARS-CoV-2 y el uso de bases de datos masivas donde se almacena dicho genoma, se analiza y compara con otras variantes para encontrar similitudes y diferencias. Pero hay un problema común con las técnicas usadas. Se puede generar una gran cantidad de información sobre el virus, pero dicha información por sí sola no sirve de mucho, tiene que ser interpretada para darle sentido, encontrarle una función y darle utilidad. Para dicha interpretación el uso de software bioinformático se ha elevado mucho durante la pandemia, debido a que ha permitido automatizar muchos de estos procesos, realizándolos de forma más eficiente y rápida [1, 3]. Gracias a la bioinformática la secuencia entera pudo ser comparada con otros virus para determinar su taxonomía y entender su composición molecular [1]. Posteriormente se usaron algoritmos para identificar posibles mutaciones en las proteínas antigénicas del virus, lo que condijo a realizar pruebas automatizadas de anticuerpos animales en la búsqueda de posibles candidatos para vacunas [4]. Otra manera de aprovechar el poder computacional para realizar análisis masivos ha sido la realización de estudios asociativos utilizando las grandes bases de datos de índole biotecnológica. Esto se ha utilizado extensamente para poder buscar medicamentos ya existentes que puedan tener utilidad para combatir la infección de SARS-CoV-2, haciendo comparaciones a gran escala entre posibles medicamentos que puedan interferir en las interacciones moleculares del virus [5]. También se ha hecho uso de la bioinformática para analizar en paralelo la enorme cantidad de publicaciones que se han realizado sobre el tema. Como se mencionó al inicio, se produjo una enorme cantidad de información sobre el virus en muy poco tiempo, lo que se ve reflejado en una cantidad enorme de artículos publicados en distintas bases de datos. La tarea de ponerse al corriente sobre la investigación ya realizada del virus ha probado ser bastante abrumadora. Es por ello que usando programas de minado de texto y procesamiento de lenguaje se ha logrado facilitar dicha tarea. Se han desarrollado sistemas que permiten la búsqueda, descubrimiento, visualización y el desarrollo de resúmenes automatizados de la literatura disponible sobre el virus. Categorizando la información de forma que sea más fácil consumirla, dichos sistemas, además son constantemente actualizados para perfeccionar el algoritmo de búsqueda, al añadirle más funciones [3]. Como conclusión, se puede ver como el uso programas informáticos aplicados a la biotecnología, han logrado ser automatizados en varias partes del proceso en la investigación del virus, desde el análisis y procesamiento de la gran cantidad de información desarrollada, hasta la búsqueda y categorización de la misma en las bases de datos disponibles. Lo que ha ayudado a acelerar el proceso con el que se desarrolla y aplica nueva información, lo que conduce en el desarrollo temprano de vacunas y tratamientos para acabar con la pandemia., {"references":["Ma, L., Li, H., Lan, J., Hao, X., Liu, H., Wang, X., & Huang, Y. (2021). Comprehensive analyses of bioinformatics applications in the fight against COVID-19 pandemic. Computational Biology and Chemistry, 95, 107599. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2021.107599","Sumon, T. A., Hussain, Md. A., Hasan, Md. T., Hasan, M., Jang, W. J., Bhuiya, E. H., Chowdhury, A. A. M., Sharifuzzaman, S. M., Brown, C. L., Kwon, H.-J., & Lee, E.-W. (2021). A Revisit to the Research Updates of Drugs, Vaccines, and Bioinformatics Approaches in Combating COVID-19 Pandemic. Frontiers in Molecular Biosciences, 7. https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmolb.2020.585899","Cannataro, M., & Harrison, A. (2021). Bioinformatics helping to mitigate the impact of COVID-19 – Editorial. Briefings in Bioinformatics, 22(2), 613-615. https://doi.org/10.1093/bib/bbab063","Chukwudozie, O. S., Duru, V. C., Ndiribe, C. C., Aborode, A. T., Oyebanji, V. O., & Emikpe, B. O. (2021). The Relevance of Bioinformatics Applications in the Discovery of Vaccine Candidates and Potential Drugs for COVID-19 Treatment. Bioinformatics and Biology Insights, 15, 11779322211002168. https://doi.org/10.1177/11779322211002168","Li, X., Yu, J., Zhang, Z., Ren, J., Peluffo, A. E., Zhang, W., Zhao, Y., Wu, J., Yan, K., Cohen, D., & Wang, W. (2021). Network bioinformatics analysis provides insight into drug repurposing for COVID-19. Medicine in Drug Discovery, 10, 100090. https://doi.org/10.1016/j.medidd.2021.100090"]}

[ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) se trata de un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Las mutaciones en la enzima Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son unas de estas alteraciones. Las mutaciones más frecuentes en esta proteína afectan a las posiciones R140 y R172, provocando una ganancia de función con la producción del oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG). A pesar de que ambas inducen la producción de 2-HG, la mutación R172 produce mayor cantidad de oncometabolito, presenta menos concurrencias con otras alteraciones genéticas y se asocia a una peor respuesta a la quimioterapia y un mayor riesgo de recaída. Los modelos de investigación han permitido conocer el papel de las mutaciones genéticas en el desarrollo de la enfermedad. A pesar de ello, es necesario desarrollar nuevos modelos que expresen de forma endógena estas mutaciones para estudiar en profundidad las vías moleculares afectadas. Por todo ello, en esta Tesis se han desarrollado nuevas estrategias de edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9 con el objetivo de desarrollar nuevos modelos in vitro e in vivo de mutaciones implicadas en LMA. Debido a la baja eficiencia de transfección de los plásmidos CRISPR en las líneas celulares leucémicas, el método más empleado para introducir los elementos CRISPR han sido principalmente vectores lentivirales. Para evitar los inconvenientes de este tipo de vectores, en esta Tesis se ha desarrollado una estrategia alternativa para la introducción de la nucleasa Cas9 y los guías CRISPR. El gen codificante de la Cas9 se introdujo en el genoma de células NB4 mediante transducción con lentivirus, generando una línea celular con expresión constitutiva de la nucleasa. Por otro lado, se desarrolló un sistema sencillo de producción de los guías CRISPR mediante PCR con los elementos esenciales para su expresión y la expresión del reportero GFP de forma opcional. Con el objetivo de optimizar la técnica y probar su eficiencia en distintas dianas se modificaron dos genes implicados en LMA. Estos fueron el gen IDH2, en el cuál se buscó introducir la mutación R172, y el gen MYBL2. Finalmente, las eficiencias de edición obtenidas se compararon con el uso de complejos de ribonucleoproteínas CRISPR, muy utilizados por su alta eficiencia. Mientras que los complejos de ribonucleoproteínas presentaron una mayor eficiencia de corte, la eficiencia de edición de la mutación R172 fue similar en ambas estrategias. Mediante secuenciación masiva se confirmó y caracterizó esta edición y se comprobó que la maquinaria de edición no había producido cortes inespecíficos en regiones similares del genoma. Por tanto, la nueva metodología desarrollada permitió editar de forma precisa líneas celulares leucémicas con eficiencias similares a otras técnicas CRISPR más extendidas y sin producir efectos inespecíficos no deseados. Por otro lado, gracias a la gran conservación evolutiva del gen IDH2, los residuos R140 y R172 se encuentran conservados en la proteína idh-2 de Caenorhabditis elegans. Se empleó la estrategia co-CRISPR para desarrollar y seleccionar cepas mutantes con las mutaciones ortólogas a R140 y R172, y una cepa con ambas mutaciones. A pesar de la conservación, no se observó el aumento del oncometabolito 2-HG esperado en las cepas mutantes en comparación con la cepa salvaje control N2. Un estudio exhaustivo de las vías implicadas nos serviría para desarrollar modelos de investigación con las alteraciones moleculares observadas en los pacientes. Para concluir, la estrategia desarrollada de introducción de elementos CRISPR en líneas celulares, junto a los modelos producidos en C. elegans, permitirán en futuros estudios investigar en detalle los efectos moleculares de mutaciones detectadas en pacientes de LMA, su implicación en el desarrollo y pronóstico de la LMA y comprender su papel en la estratificación de los pacientes., [CA] La leucèmia mieloide aguda (LMA) es tracta d'un grup heterogeni de desordres hematològics produïts per alteracions genètiques en les cèl·lules precursores mieloides. Les mutacions en l'enzim Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son d'aquestes alteracions. Les mutacions més freqüents en aquesta proteïna afecten a les posicions R1240 i R172, produint un guany de funció amb la producció de l'oncometabolit D-2-hidroxiglutarat (2-HG). A pesar que ambdues indueixen la producció de 2-HG, la mutació R172 produeix mes quantitat de oncometabolit, presenta menys co ocurrències con altres alteracions genètiques i s'associa a una pitjor resposta a la quimioteràpia i un major risc de recaiguda. Els models d'investigació han permés conéixer el paper de les mutacions genètiques en el desenvolupament de la malaltia. Malgrat això, és necessari desenvolupar nous models que expressen de manera endògena aquestes mutacions per a estudiar en profunditat les vies moleculars afectades. Per tot això, en aquesta Tesis s'han desenvolupat noves estratègies d'edició gènica mitjançant el sistema CRISPR/Cas9 amb l'objectiu de desenvolupar nous models in vitro i in vivo de les mutacions implicades en la LMA. Degut a la baixa eficiència de transfecció dels plasmids CRISPR en les línies cel·lulars leucèmiques, el mètode més emprat per a introduir els elements CRISPR han sigut principalment vectors lentivirals. Per a evitar els inconvenients d'aquesta mena de vectors, en aquesta Tesis s'ha desenvolupat una estratègia alternativa per a la introducció de la nucleasa Cas9 i els guies CRISPR. El gen codificant de la Cas9 es va introduir al genoma de cèl·lules NB4 mitjançant transducció amb lentivirus, generant una línia cel·lular amb expressió constitutiva de la nucleasa. D'altra banda, es va desenvolupar un sistema fàcil de producció dels guies CRISPR mitjançant PCR amb els elements essencials d'expressió i amb l'expressió del reporter GFP de manera opcional. Amb l'objectiu d'optimitzar la tècnica i provar la seua eficiència en diferents dianes es van modificar dos gens implicats en LMA. Aquests van ser el gen IDH2, en el qual es va buscar introduir la mutació R172, i el gen MYBL2. Finalment, les eficiències d'edició obtingudes amb la nova estratègia es van comparar amb l'ús de complexos ribonucleotproteïnes CRISPR, molt utilitzats per la seua alta eficiència. Mentre que els complexos de ribonucleoproteïnes van presentar una major eficiència de tall, l'eficiència d'edició de la mutació R172 va ser similar en les dues estratègies. Mitjançant seqüenciació massiva es va confirmar i caracteritzar aquesta edició i es va comprovar que la maquinària d'edició no havia produït talls inespecífics en regions similars del genoma. D'aquesta manera, la nova metodologia desenvolupada permet editar de manera precisa línies cel·lulars leucèmiques amb eficiències similars a altres tècniques CRISPR més esteses i sense produir efectes inespecífics no desitjats. D'altra banda, gràcies a la gran conservació evolutiva del gen IDH2, els residus R140 i R172 es troben conservats en la proteïna idh-2 de Caenorhabditis elegans. Es va utilitzar l'estratègia co-CRISPR per a desenvolupar i seleccionar ceps mutants amb les mutacions ortòlogues a R140 i R172, i un cep amb dues mutacions. Malgrat l'alta conservació, no es va observar l'augment del oncometabolit 2-HG esperat en els ceps mutants en comparació amb el cep salvatge control N2. Un estudi exhaustiu de les vies implicades ens serviria per a desenvolupar models d'investigació amb les alteracions moleculars observades en els pacients. Per a concloure, l'estratègia desenvolupada d'introducció d'elements CRISPR en línies cel·lulars, al costat dels models produïts en C. elegans permetran en estudis futurs investigar detalladament els efectes moleculars de mutacions detectades en pacients, la seua implicació en el desenvolupament i prognosi de la LMA i comprendre el seu paper en l'estratificació dels pacients., [EN] Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous group of haematological disorders caused by genetic alterations in myeloid precursors. Mutations in the Isocitrate dehydrogenase enzyme are among these alterations. The most frequent mutations in this protein affect R140 and R172 positions, leading to a gain of function with the production of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG). Although both induce the 2-HG production, the R172 mutation generates greater amount of oncometabolite, has fewer co-occurrences with other genetic alterations and is associated with worse chemotherapy response and higher relapse risk. Research models have made possible to study the role of genetic mutations in disease development. Despite this progress, new models with endogenous expression of these mutations are needed to study in depth the molecular pathways involved. Therefore, in this Thesis we have developed new gene editing strategies using the CRISPR/Cas9 system with the aim of developing new in vitro and in vivo models of mutations involved in AML. Regarding in vitro model, due to the low transfection efficiency of CRISPR plasmids in leukemic cell lines, the most commonly method used for introducing CRISPR elements have been mainly lentiviral vectors. To avoid the disadvantages of this type of vectors, in this Thesis we have developed an alternative strategy for introducing Cas9 nuclease and CRISPR guides. The gene encoding the Cas9 was introduced into NB4 genome by lentiviral transduction producing a stable cell line that constitutively express the nuclease. On the other hand, a simple system for the production of CRISPR guides by PCR with essential elements of expression was developed and with GFP reporter expression optionally. In order to optimise the technique and test its efficiency in different targets, two genes involved in AML were modified. These were IDH2 gene, in which R172 mutation was introduced, and MYBL2 gene. Finally, editing efficiencies obtained with the new strategy were compared with CRISPR ribonucleoproteins methodology, widely used for its high efficiency. Whereas ribonucleoprotein complexes showed higher cut efficiencies, the efficiency of edition of R172 mutation efficiency was similar in both strategies. These results were validated and characterized by means of next generation sequencing, and no off-target effects were found. Therefore, the new developed methodology allows precise gene editing in leukemic cell lines with similar efficiencies with other popular CRISPR techniques and without off-target effects. On the other hand, thanks to the high evolutive conservation of IDH2 gene R140 and R172 residues are conserved in Caenorhabditis elegans idh-2 protein. The co-CRISPR strategy was used to produce and select mutant strains with ortholog mutations to R140, R172 and one strain with both mutations. Despite the high conservation, the expected increase in oncometabolite 2-HG concentration was not detected in mutant strains compared to the N2 wild type strain. A comprehensive study of the pathways involved would help us to develop a research model with molecular alterations noticed in patients. In conclusion, the new developed strategy for CRISPR elements introduction in cell lines, together with C. elegans models, will allow an in-depth research of molecular effect of mutations detected in patients, its implication in AML progression and prognosis and understand their role in patient stratification.