Computational methods to calculate free-energy differences are of high interest in computer-aided drug discovery. Rigorous free-energy methods are based on molecular dynamics (MD) simulations. Chapter 1 provides a short overview of the fundamental concepts of MD. Chapters 2 - 4 describe developments in the area of free-energy calculation. In Chapter 2, the software package Ensembler for toy model simulations is introduced. Ensembler can be used to rapidly develop prototypes for method development or teach theoretical backgrounds of simulation techniques. An application example showcases how Ensembler can be used to execute and compare different free-energy methods with onedimensional models. Chapter 3 provides a categorization of the existing approaches on how the end-states can be represented in relative free-energy calculations. Next, an algorithm is introduced for selecting (locally) optimal distance restraints to link molecules in a linked dual topology approach. The introduced algorithm can handle scaffold hopping-like transformations and is extended for multi-state methods. The performance of the approach is demonstrated in relative hydration free-energy calculations. In Chapter 4, the refined automated RE-EDS pipeline is presented, containing multiple methodological changes and tricks to ensure sufficient sampling of all end-states. The improved pipeline is applied to scaffold hopping-like transformations to showcase the capabilities of the methodology. In Chapter 5, the Python API PyGromosTools is introduced.The API provides functionality to modify GROMOS files, to set up and perform MD simulations, and to analyze the resulting data. Considerations regarding the code style and the code structure are discussed. Finally, usage examples are provided to show how simulations can be set up and executed with PyGromosTools. Chapter 6 explores the conformational behavior of pairs of semipeptidic macrocycles with a single stereo center change and its relationship with the observed passive membrane permeability. A particular interest is to rationalize a “permeability cliff” related to the stereocenter. We construct a hypothesis based on extensive MD simulations supported by NMR studies. Finally, we will conclude the thesis with an outlook in Chapter 7 for the different topics covered in this work., Zusammenfassung Die computergestützte Berechnung von Freie Energiedifferenzen ist ein grundlegender Bestandteil der in silico Wirkstoffentwicklung. Rigorose Methoden zur Freie Energieberechnung basieren auf Molekulardynamik-Computersimulationen (MD-Simulationen). Kapitel 1 beinhaltet eine Zusammenfassung der grundlegenden Konzepte von MD-Simulationen. Die darauf folgenden Kapitel 2 - 4 beschreiben Entwicklungen im Bereich computergestützter Freie Energieberechnung. In Kapitel 2 wird das Softwarepaket Ensembler vorgestellt. Dieses kann verwendet werden, um schnell einfache Modelle für die Methodenentwicklung oder für Lehrzwecke zu generieren. In einem eindimensionalen Modellansatz werden verschiedene computergestützte Freie Energieberechnungsmethoden verwendet und miteinander verglichen. Kapitel 3 beinhaltet eine Einordnung für Systemrepräsentationen in relativen Freie Energieberechnungsmethoden. Zudem wird ein Algorithmus vorgestellt, der mehrere Moleküle mittels (lokal) optimaler Distanzdefinitionen für verknüpfte duale Topologien verbindet. Der entwickelte Algorithmus kann mit komplexen Ligandtransformationen, wie sie bei "Scaffold hopping'' vorkommen, umgehen. Die Mächtigkeit des Algorithmus' wird am Beispiel der Berechnung von Hydratisierungsenergie-Differenzen aufgezeigt. In Kapitel 4 werden Fortschritte in der RE-EDS Methodik präsentiert, welche auf Modifizierungen im automatischen Optimierungsprozess beruhen. Diese Modifizierungen stellen in erster Linie eine ausreichende Repräsentation jedes Endzustandes in der Simulation sicher. Die verbesserte Pipeline wird auf ein komplexes Liganden-Protein System angewandt, um das Potential der Methode aufzuzeigen. In Kapitel 5 wird die Python-Programmierschnittstelle (API) PyGromosTools vorgestellt. Die API ermöglicht den Zugriff auf GROMOS-Dateien, die Generierung von GROMOS-Systemen, die Durchführung von Simulationen sowie die Analyse der generierten Daten. Die Funktionalität der API wird anhand mehrerer Anwendungsbeispiele verdeutlicht. Kapitel 6 untersucht das konformationelle Verhalten von Paaren von semipeptidischen Makrozyklen, die sich in einem chiralen Zentrum unterschreiben, und verknüpft dieses mit der gemessenen passiven Membranpermeabilität. Die Änderung des chiralen Zentrums führte in einem Makrozyklenpaar zu einer starken Veränderung der Membrangängigkeit. Die Resultate der Computersimulationen werden mittels NMR-Messungen experimentell validiert. Das letzte Kapitel rekapituliert die Dissertation und gibt einen Ausblick auf mögliche Weiterentwicklung der Dissertationsthemen.