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Neisseria meningitidis serogroup A non-hydrolyzing uridine 5'-diphosphate-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) 2-epimerase (NmSacA) catalyzes the interconversion between UDP-GlcNAc and uridine 5'-diphosphate-N-acetylmannosamine (UDP-ManNAc). It is a key enzyme involved in the biosynthesis of the capsular polysaccharide [-6ManNAcα1-phosphate-]n of N. meningitidis serogroup A, one of the six serogroups (A, B, C, W-135, X, and Y) that account for most cases of N. meningitidis-caused bacterial septicemia and meningitis. N. meningitidis serogroup A is responsible for large epidemics in the developing world, especially in Africa. Here we report that UDP-ManNAc could be used as a substrate for C-terminal His6-tagged recombinant NmSacA (NmSacA-His6) in the absence of UDP-GlcNAc. NmSacA-His6 was activated by UDP-GlcNAc and inhibited by 2-acetamidoglucal and UDP. Substrate specificity study showed that NmSacA-His6 could tolerate several chemoenzymatically synthesized UDP-ManNAc derivatives as substrates although its activity was much lower than non-modified UDP-ManNAc. Homology modeling and molecular docking revealed likely structural determinants of NmSacA substrate specificity. This is the first detailed study of N. meningitidis serogroup A UDP-GlcNAc 2-epimerase.

Einleitung: Sialinsäuren umfassen eine Gruppe von meist terminal gebundenen Aminozuckern, die an einer Vielzahl von biologischen Prozessen wie der Zellerkennung, Zelladhäsion und Proliferation, aber auch an pathologischen Vorgängen, beispielsweise der Virusbindung oder Tumormetastasierung, beteiligt sind. Beim metabolischen Oligosaccharid-Engineering (MOE) werden modifizierte Sialinsäurevorläufer wie N-Propanoylmannosamin (ManNProp) in die zelluläre Sialinsäurebiosynthese eingeschleust, zu modifizierten Sialinsäuren metabolisiert und in Sialoglycane eingebaut. Ziel der Arbeit war die Etablierung eines Zellsystems mit einer nahezu homogenen Population strukturell veränderter Sialinsäuren auf der Zelloberfläche, um den Einfluss modifizierter Sialoglycane auf biologische Vorgänge besser untersuchen zu können. Methoden: Die hyposialylierten Subklone BJA-B K20 und HL60-I zweier hämatopoetischer Zelllinien, die keine UDP-GlcNAc-2-Epimerase, das Schlüsselenzym der Sialinsäure-biosynthese, exprimieren, wurden wie die normal sialylierten Subklone BJA-B K88 und HL60-II mit 10 mM des natürlichen N-Acylmannosamins ManNAc oder des unnatürlichen ManNProp über 72 h inkubiert. Änderungen der Zelloberflächensialylierung und die Inkorporation modifizierter Sialinsäuren wurden mittels HPLC und Durchflusszytometrie bestimmt. Ergebnisse: Nach Inkubation mit ManNProp enthielten die Membranglycoproteine von HL60-I- und BJA-B K20-Zellen einen Anteil von bis zu 85 % modifizierter Sialinsäuren, die HL60-II und BJA-B K88 jedoch nur 15 % bzw. 56 %. Nach N -Acylmannosamin-Behandlung wurde bei den HL60-I-Zellen ein signifikanter Anstieg von Sialyl-Lewis X-Epitopen nachgewiesen. Vergleiche von Änderungen des CMP-Sialinsäure-Gehalts, der Sialyl-Lewis X-Expression sowie der Lektinbindungsmuster von ManNAc- und ManNProp-behandelten Zellen belegen, dass ManNProp von den sonst permissiven Enzymen der CMP-Sialinsäurebiosynthese weniger effizient metabolisiert wurde. Jedoch fanden sich gleichzeitig Hinweise, dass offenbar manche Sialyltransferasen bevorzugt modifizierte CMP- Sialinsäuren übertrugen. In dieser Arbeit konnte außerdem die lange infrage gestellte Aufnahme freier Sialinsäureanaloga gezeigt werden. Sialinsäureanaloga mit Modifikationen an C-5 oder C-9 wurden mit einem Anteil von bis zu 95 % in die Membranglycoproteine von HL60-I- und BJA-B K20-Zellen effizient inkorporiert. Schlussfolgerung: Durch den Einsatz freier Sialinsäureanaloga lässt sich das Spektrum an Modifikationen in Sialoglycanen deutlich erweitern. Die Inkorporation modifizierter N-Acyl-mannosamine sowie freier Sialinsäureanaloga ist abhängig von der Aktivität der UDP- GlcNAc-2-Epimerase. Das hier etablierte und charakterisierte UDP-GlcNAc-2 -Epimerase-defiziente Zellsystem ist daher für ein effizientes MOE besonders gut geeignet., Introduction: Sialic acids comprise a group of usually terminally bound amino sugars, which are involved in a variety of biological processes such as cell recognition, cell adhesion and proliferation but also in pathological processes such as virus binding and tumor metastasis. Modified sialic acid precursors such as N-propanoylmannosamine (ManNProp) are introduced by metabolic oligosaccharide engineering (MOE) into the cellular sialic acid biosynthesis, metabolized to modified sialic acids and incorporated into sialoglycans. Aim of this work was the establishment of a cell system with an almost homogeneous population of structurally altered sialic acids on the cell surface in order to investigate the influence of modified sialoglycans on biological processes. Methods: The hyposialylated subclones HL60-I and BJA-B K20 of two hematopoietic cell lines that do not express UDP-GlcNAc 2-epimerase, the key enzyme of the sialic acid, were incubatetd as well as the normally sialylated subclones BJA-B K88 and HL60-II with 10 mM of the natural N-acylmannosamine ManNAc or the unnatural ManNProp for 72 h. Changes in cell surface sialylation and the incorporation of modified sialic acids were determined by HPLC and flow cytometry. Results: After incubation with ManNProp the membrane glycoproteins of HL60-I and BJA-B K20 cells contained a proportion of up to 85 % of modified sialic acids, but the HL60-II and BJA-B K88 only 15 % and 56 %. After N-acylmannosamine-treatment, a significant increase of sialyl Lewis X epitopes was demonstrated in the HL60-I cells. Comparisons of changes in CMP-sialic acid content, sialyl Lewis X expression and lectin binding patterns of ManNAc- and ManNProp-treated cells demonstrate, that ManNProp was less efficiently metabolized by the enzymes of the otherwise permissive CMP-sialic acid biosynthesis than natural ManNAc. However, also evidence was found that some sialyltransferases apparently prefered to transfer modified CMP-sialic acids. In this work, the long questioned uptake of free sialic acid analogs could also be shown. Sialic acid analogs carrying modifications at C-5 or C-9 were efficently incorprated resulting in a proportion of up to 95 % of modified sialic acids in membrane glycoproteins of HL60-I and BJA-B K20 cells. Conclusions: By using free sialic acid analogs the range of modifications in sialoglycans can be significantly expanded. The incorporation of N-acylmannosamine analogs and free sialic acid analogs depends on the activity of UDP-GlcNAc 2-epimerase. The UDP-GlcNAc 2-epimerase- deficient cell system established and characterized in this study is therefore particularly suitable for efficient MOE.