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Tese de doutoramento em Envelhecimento e Doenças Crónicas, A ramificação pulmonar é um processo complexo caracterizado por interações epitélio-mesênquima e coordenado por vias de sinalização que contribuem para a formação das vias respiratórias. A via de sinalização do Ácido Retinoico (AR) é crucial para o desenvolvimento pulmonar e é particularmente importante para o padrão próximo-distal e a ramificação pulmonar. Os mecanismos moleculares subjacentes aos estadios iniciais do desenvolvimento pulmonar estão bem explorados, no entanto, ainda pouco se sabe quanto ao metabolismo do pulmão embrionário. Existem evidências que sugerem que as interações entre sinalização e metabolismo são essenciais para perceber os processos de desenvolvimento embrionário. O principal objetivo desta tese foi investigar o perfil metabólico associado aos estadios iniciais da ramificação pulmonar e estudar as potenciais interações entre a via de sinalização do Ácido Retinoico e o metabolismo associados à ramificação pulmonar. Na nossa abordagem utilizamos um sistema de cultura de explantes que nos permitiu mimetizar o processo de ramificação pulmonar, usando como modelo o embrião de galinha. O metabolismo associado à ramificação pulmonar foi avaliado aos níveis de transcrito, proteína e metabolitos, através de qPCR, hibridização in situ, western blot e espectroscopia de 1 H-RMN. Os níveis de proliferação foram avaliados através de um ensaio de EdU. A função mitocondrial e capacidade respiratória dos pulmões foram analisadas através de ensaios de elétrodo Clark e Seahorse. Neste estudo descrevemos as alterações metabólicas que ocorrem ao longo do tempo e acompanham o processo de ramificação pulmonar. À medida que a ramificação pulmonar progride, o pulmão adapta-se a um metabolismo glicolítico com produção de lactato e que se assemelha ao metabolismo do tipo Warburg. Mais ainda, a modulação da via de sinalização do AR regula o metabolismo pulmonar. A estimulação da via do AR aumenta a ramificação pulmonar promovendo condições ótimas de crescimento. Por outro lado, a inibição da via do AR parece induzir um metabolismo menos eficiente e que está associado a um fenótipo pulmonar anormal. Em suma, demonstramos que o desenvolvimento pulmonar e o metabolismo estão interligados e descrevemos novas noções sobre a interação entre a sinalização e o metabolismo. Neste estudo destacamos ainda a importância da regulação metabólica durante a ramificação pulmonar e como a sinalização e o metabolismo devem ser controlados por forma a evitar o comprometimento do crescimento pulmonar., Lung branching morphogenesis is a complex process characterized by epithelial-mesenchymal interactions and coordinated by signaling networks that ultimately define the airway conducting system. Retinoic Acid (RA) signaling is a major player in lung development and is particularly important for proximal-distal patterning and branching morphogenesis. The molecular mechanisms involved in early lung development are well explored. However, little is known concerning embryonic lung metabolism. Moreover, growing evidence suggests that signaling-metabolism interactions are essential to understanding developmental processes. The main goal of this thesis was to investigate the metabolic profile associated with the early stages of pulmonary branching and to study potential interactions between the Retinoic Acid signaling pathway and the lung branching metabolism. In our approach, we performed an explant culture system to mimic the process of lung branching morphogenesis and used the chicken embryo as a model. Lung branching metabolism was assessed at the transcript, protein, and metabolite levels by qPCR, in situ hybridization, western blot, and 1 H-NMR spectroscopy. The proliferation status was assessed using an EdU-based assay. Mitochondrial function and the lung respiratory capacity were studied using a Clark-type electrode and a Seahorse analysis. In this study, we described the temporal metabolic changes accompanying early lung branching morphogenesis. As pulmonary branching proceeds, the lung progressively adapts to a glycolytic lactate-based metabolic profile that resembles a Warburg-like metabolism. Moreover, RA signaling modulation regulates lung branching metabolism. While RA signaling stimulation increases lung branching by promoting optimal growth conditions, RA signaling inhibition seems to induce a less efficient metabolism associated with a disease like phenotype. In conclusion, we unveiled that lung development and metabolism are interlinked, and we brought novel insights on the signaling-metabolism interaction. This work highlights the importance of metabolic regulation during lung branching morphogenesis and how signaling and metabolism must be finely tuned to prevent lung growth impairment., Financial support was provided by grants from the Foundation for Science and Technology (FCT) doctoral fellowship (PD/BD/137655/2018), by the projects NORTE-01-0145-FEDER-000013 and NORTE-01-0145-FEDER-000023, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF), ICVS Scientific Microscopy Platform, member of the national infrastructure PPBI - Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122); by National funds, through the FCT - project UIDB/50026/2020 and UIDP/50026/2020.

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Pulmonary development is a complex process that depends on the activation of conserved signaling pathways that regulate cellular processes such as proliferation, differentiation and migration. Retinoic acid (RA) signaling is one of the active pathways during lung organogenesis, since it modulates branching morphogenesis in a dose-dependent manner. It is widely accepted that the cellular events underlying embryonic development require high amounts of energy and nutrients to form new biomass. However, the metabolic changes that occur during lung branching morphogenesis have not been described so far. In this work, we have characterized, for the first time, the metabolic profile of chick lung branching in early stages of development: b1, b2 and b3 (1, 2 or 3 secondary bronchi, respectively). Furthermore, the impact of RA on lung branching metabolism was evaluated. Ex vivo lung explant culture was performed in the presence or absence of RA, and the medium collected to analyze the production/consumption of metabolites associated with glucose catabolism (glucose, lactate, acetate, alanine), by 1 H-NMR. qRT-PCR and in situ hybridization were performed to assess the expression levels and patterns of key enzymes and transporters from glucose catabolic pathway. In normal conditions, the major metabolite variations occur from stage b1 to stage b3. In b3, there is an increase in lactate and acetate production. Still, glucose consumption is maintained from b1 to b3 stage with a concurrent decrease of glucose transporter 3 (glut3) transcript levels, and a decrease in hexokinase 1 (hk1) levels in b3 stage. This phenomenon suggests an increase in the glycolytic efficiency and a shift to lactate production. In fact, we observed a decrease on pyruvate dehydrogenase B (pdhb) and an increase in lactate dehydrogenase A (ldha) expression levels in b3 stage, while lactate dehydrogenase B (ldhb) levels decrease. Embryonic lung expression pattern of glut3, hk1, ldha, ldhb and pdha were characterized suggesting hypothetical interactions between the mesenchymal and epithelial compartments. When b2 lung explants were exposed to RA, glucose consumption, alanine and lactate production decreased. On the other hand, glutamate, glutamine consumption, and acetate production remain unaltered whereas pyruvate production increased. This phenomenon is accompanied by an increase in ldha expression levels. This study describes, for the first time, the temporal metabolic changes associated with chick pulmonary branching. It seems that glycolytic efficiency is increased, with a concurrent metabolic shift from Krebs cycle to lactate production. Furthermore, acetate and lactate are potentially seen as metabolic biomarkers of lung development. On the other hand, RA triggers a metabolic shift where lipids may be potentially seen as source of carbons and energy during RA-induced branching morphogenesis., O desenvolvimento pulmonar é um processo complexo que depende da ativação de vias de sinalização conservadas que regulam diversos processos celulares, nomeadamente proliferação, diferenciação e migração. A via de sinalização do ácido retinoico é uma das vias cruciais na morfogénese pulmonar uma vez que modula a ramificação pulmonar. Sabe-se que durante o desenvolvimento embrionário são necessárias elevadas quantidades de energia e nutrientes para formação de biomassa. No entanto, as alterações metabólicas que ocorrem ao longo do processo de ramificação pulmonar ainda não foram descritas. Neste trabalho, caracterizamos, pela primeira vez, o perfil metabólico da ramificação pulmonar de galinha, em estadios precoces do desenvolvimento: b1, b2 e b3 (1, 2 ou 3 brônquios secundários, respetivamente). Adicionalmente, descrevemos o impacto do ácido retinoico sobre o metabolismo durante a ramificação pulmonar. Realizaram-se cultura de explantes pulmonares em condições normais e na presença de ácido retinoico; os meios de cultura foram analisados, por 1 H-NMR, para determinar a produção/consumo de metabolitos associados ao catabolismo da glucose (glucose, lactato, acetato, alanina). O padrão e os níveis expressão de transcritos de enzimas e transportadores implicados no catabolismo da glucose foram analisados por hibridização in situ e qRT-PCR, respetivamente. O padrão de expressão de glut3, hk1, ldha, ldhb e pdha sugere potenciais interações entre o mesênquima e epitélio pulmonar. A nível de metabolitos, as maiores variações ocorrem entre o estadio b1 e o estadio b3, em condições normais. Em b3, há um aumento da produção de lactato e acetato. No entanto, o consumo de glucose mantém-se de b1 para b3, havendo uma diminuição dos níveis de expressão do transportador de glucose 3 (glut3) e da hexoquinase 1 (hk1) em b3. Este fenómeno sugere um aumento da eficiência glicolítica e uma alteração para um metabolismo que resulta na produção de lactato. Na verdade, verifica se uma diminuição dos níveis de expressão da piruvato desidrogenase B (pdhb) e aumento dos níveis de expressão da lactato desidrogenase A (ldha) no estadio b3, enquanto que os níveis de lactato desidrogenase B (ldhb) diminuem. Quando explantes de pulmões b2 foram expostos, in vitro, a ácido retinoico, o consumo de glucose e produção de alanina e lactato diminuíram. Por outro lado, o consumo de glutamato e de glutamina, bem como a produção de acetato permaneceram inalterados, com um aumento da produção de piruvato. Este fenómeno foi acompanhado por um aumento da expressão de ldha. Neste estudo, são descritas, pela primeira vez, as alterações metabólicas que ocorrem ao longo do tempo, associadas ao processo de ramificação pulmonar de galinha. Durante o processo, a eficiência glicolítica está aumentada e parece haver uma alteração do metabolismo baseado no ciclo de Krebs para o metabolismo de produção de lactato. Assim, o acetato e o lactato são potencialmente biomarcadores do processo de desenvolvimento pulmonar. Por outro lado, o ácido retinoico estimula uma alteração metabólica sendo que os lipídios surgem como fonte de carbono e energia plausível que acompanha a ramificação pulmonar induzida pelo ácido retinoico., The work presented in this dissertation was performed at the Surgical Sciences Research Domain of the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Medicine, University of Minho, Braga, Portugal (ICVS/3B’s – PT Government Associate Laboratory, Braga/Guimarães, Portugal). The work was supported by FEDER funds, through the Competitiveness Factors Operational Programme (COMPETE), and by National funds, through the Foundation for Science and Technology (FCT), under the scope of the Project POCI-01-0145-FEDER-007038; and by the Project NORTE-01-0145-FEDER-000013, supported by the Northern Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the Portugal 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (FEDER).