Search

Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography/mass spectrometry (UHPSFC/MS) is one of the fastest analytical approaches for high-throughput lipidomic analysis covering a wide range of lipid categories and classes. Lipid class separation and lipid species separation are two main separation modes available for the UHPSFC analysis of lipids. The mechanism of the lipid class separation mode is com-parable to that of hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC). The direct comparison of HILIC -ultrahigh-performance liquid chromatography (HILIC-UHPLC) and UHPSFC shows the applicability of UHPSFC/MS for high-throughput quantitation of both nonpolar and polar lipid classes, the faster analysis time, and comparable reproducibility and sensitivity. The retention mechanism of the lipid species separation mode is comparable to reversed-phase UHPLC, but the nonpolar character of supercritical carbon dioxide (scCO(2)) provides a different selectivity compared to that of conventional RP-UHPLC. The introduction of various hyphenation interfaces to MS broadens the applicability and sensitivity range of UHPSFC/MS using scCO(2) as the main component of the mobile phase. The addition of ionic additives (volatile salts, acids, and bases) to the modifier improves the separation of medium to polar lipids. Furthermore, UHPSFC/MS has also a great potential in the chiral separation of lipids, but the field has not yet been fully explored., Ultravysoko-účinná superkritická fluidní chromatografie / hmotnostní spektrometrie (UHPSFC/MS) je jedním z nejrychlejších analytických přístupů pro vysoce výkonnou lipidomickou analýzu pokrývající širokou škálu kategorií a tříd lipidů. Separace tříd lipidů a separace lipidových druhů jsou dva hlavní separační režimy dostupné pro analýzu lipidů UHPSFC. Mechanismus režimu separace lipidů je srovnatelný s mechanismem hydrofilní interakce kapalinová chromatografie (HILIC). Přímé srovnání HILIC-UHPLC a UHPSFC ukazuje použitelnost UHPSFC/MS pro vysoce výkonnou kvantifikaci nepolárních i polárních lipidových tříd, rychlejší dobu analýzy a srovnatelnou reprodukovatelnost a citlivost. Retenční mechanismus režimu separace lipidových druhů je srovnatelný s reverzní fází UHPLC, ale nepolární charakter superkritického oxidu uhličitého (scCO(2)) poskytuje odlišnou selektivitu ve srovnání s konvenčním RP-UHPLC. Zavedení různých rozhraní dělení do MS rozšiřuje použitelnost a rozsah citlivosti UHPSFC/MS s využitím scCO(2) jako hlavní složky mobilní fáze. Přidáním iontových aditiv (těkavých solí, kyselin a zásad) do modifikátoru se zlepšuje separace středních a polárních lipidů. Dále má UHPSFC/MS také velký potenciál v chirální separaci lipidů.

Pancreatic cancer has the worst prognosis among all cancers. Cancer screening of body fluids may improve the survival time prognosis of patients, who are often diagnosed too late at an incurable stage. Several studies report the dysregulation of lipid metabolism in tumor cells, suggesting that changes in the blood lipidome may accompany tumor growth. Here we show that the comprehensive mass spectrometric determination of a wide range of serum lipids reveals statistically significant differences between pancreatic cancer patients and healthy controls, as visualized by multivariate data analysis. Three phases of biomarker discovery research (discovery, qualification, and verification) are applied for 830 samples in total, which shows the dysregulation of some very long chain sphingomyelins, ceramides, and (lyso) phosphatidylcholines. The sensitivity and specificity to diagnose pancreatic cancer are over 90%, which outperforms CA 19-9, especially at an early stage, and is comparable to established diagnostic imaging methods. Furthermore, selected lipid species indicate a potential as prognostic biomarkers., Rakovina slinivky má nejhorší prognózu ze všech nádorů. Screening nádorových onemocnění tělními tekutinami může zlepšit časovou prognózu přežití pacientů, kteří jsou často diagnostikováni příliš pozdě v nevyléčitelném stadiu. Několik studií uvádí dysregulaci metabolismu lipidů v nádorových buňkách, což naznačuje, že změny v krevním lipidomu mohou doprovázet růst nádoru. Zde ukazujeme, že komplexní hmotnostní spektrometrické stanovení širokého spektra sérových lipidů odhaluje statisticky významné rozdíly mezi pacienty s rakovinou pankreatu a zdravými kontrolami, jak je vizualizováno multivariační analýzou dat. Tři fáze výzkumu v oblasti objevování biomarkerů (objev, kvalifikace a verifikace) jsou aplikovány celkem na 830 vzorků, což prokazuje dysregulaci některých velmi dlouhých řetězců sfingomyelinů, ceramidů a (lyso)fosfatidylcholinů. Senzitivita a specificita k diagnostice karcinomu slinivky břišní je více než 90%, což překonává CA 19-9, zejména v raném stadiu, a je srovnatelná se zavedenými diagnostickými zobrazovacími metodami. Vybrané druhy lipidů navíc indikují potenciál jako prognostické biomarkery.

The chemical derivatization of multiple lipid classes was developed using benzoyl chloride as a nonhazardous derivatization agent at ambient conditions. The derivatization procedure was optimized with standards for 4 nonpolar and 8 polar lipid classes and measured by reversed-phase ultrahighperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The derivatization and nonderivatization approaches were compared on the basis of the calibration curves of 22 internal standards from 12 lipid classes. The new method decreased the limit of detection 9-fold for monoacylglycerols (0.9-1.0 nmol/mL), 6.5-fold for sphingoid base (0.2 nmol/mL), and 3-fold for diacylglycerols (0.9 nmol/mL). The sensitivity expressed by the ratio of calibration slopes was increased 2- to 10-fold for almost all investigated lipid classes and even more than 100-fold for monoacylglycerols. Moreover, the benzoylation reaction produces a more stable derivative of cholesterol in comparison to the easily in-source fragmented nonderivatized form and enabled the detection of fatty acids in a positive ion mode, which does not require polarity switching as for the nonderivatized form. The intralaboratory comparison with an additional operator without previous derivatization experiences shows the simplicity, robustness, and reproducibility. The stability of the derivatives was determined by periodical measurements during a one month period and five freeze/thaw cycles. The fully optimized derivatization method was applied to human plasma, which allows the detection of 169 lipid species from 11 lipid classes using the high confidence level of identification in reversed-phase (RP)-ultra high performance liquid chromatography (UHPLC)/mass spectrometry (MS). Generally, we detected more lipid species for monoacylglycerols, diacylglycerols, and sphingoid bases in comparison with previously reported papers without the derivatization., Chemická derivatizace několika lipidových tříd byla vyvinuta za použití benzoylchloridu jako nerizikového derivatizačního činidla za okolních podmínek. Procedura derivatizace byla optimalizována standardy pro 4 nepolární a 8 polárních lipidových tříd a měřena ultra-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází spojenou s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Přístupy derivatizace a nonderivatizace byly porovnávány na základě kalibračních křivek 22 vnitřních standardů z 12 lipidových tříd. Nová metoda snížila detekční limit 9krát u monoacylglycerolů (0,9-1,0 nmol/ml), 6,5krát pro sfingoidní bázi (0,2 nmol/ml) a 3krát pro diacylglyceroly (0,9 nmol/ml). Citlivost vyjádřená poměrem kalibračních sklonů byla u téměř všech zkoumaných lipidových tříd zvýšena 2krát až 10krát a u monoacylglycerolů dokonce více než 100krát. Navíc benzoylační reakce vytváří stabilnější derivát cholesterolu ve srovnání se snadno zdrojově fragmentovatelnou nonderivatizovanou formou a umožnila detekci mastných kyselin v pozitivním iontovém režimu, který nevyžaduje přepínání polarity jako u nonderivatizované formy. Intralaboratorní srovnání s dalším operátorem bez předchozích zkušeností s derivatizací ukazuje jednoduchost, robustnost a reprodukovatelnost. Stabilita derivátů byla stanovena pravidelným měřením během jednoho měsíce a pěti cykly zmrazení/tání. Optimalizovaná derivatizační metoda byla aplikována na lidskou plazmu, ve které bylo možno detekovat 169 lipidů z 11 lipidových tříd pomocí vysoké úrovně spolehlivosti identifikace v reverzní fázi (RP)-ultra vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC)/hmotnostní spektrometrie (MS). Obecně jsme zjistili více lipidových druhů pro monoacylglyceroly, diacylglyceroly a sfingoidní báze ve srovnání s dříve publikovanými články bez derivatizace.

Early detection of cancer is one of the unmet needs in clinical medicine. Peripheral blood analysis is a preferred method for efficient population screening, because blood collection is well embedded in clinical practice and minimally invasive for patients. Lipids are important biomolecules, and variations in lipid concentrations can reflect pathological disorders. Lipidomic profiling of human plasma by the coupling of ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography and mass spectrometry is investigated with the aim to distinguish patients with breast, kidney, and prostate cancers from healthy controls. The mean sensitivity, specificity, and accuracy of the lipid profiling approach were 85%, 95%, and 92% for kidney cancer; 91%, 97%, and 94% for breast cancer; and 87%, 95%, and 92% for prostate cancer. No association of statistical models with tumor stage is observed. The statistically most significant lipid species for the differentiation of cancer types studied are CE 16:0, Cer 42:1, LPC 18:2, PC 36:2, PC 36:3, SM 32:1, and SM 41:1 These seven lipids represent a potential biomarker panel for kidney, breast, and prostate cancer screening, but a further verification step in a prospective study has to be performed to verify clinical utility., Včasná detekce rakoviny je jednou z nenaplněných potřeb klinické medicíny. Periferní analýza krve je preferovanou metodou pro efektivní populační screening, protože odběr krve je dobře zakotven v klinické praxi a je minimálně invazivní pro pacienty. Lipidy jsou důležité biomolekuly a odchylky v koncentracích lipidů mohou odrážet patologické poruchy. Lipidomická profilace lidské plazmy spojením ultra-vysokoúčinné superkritické kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie je zkoumána s cílem odlišit pacienty s karcinomem prsu, ledvin a prostaty od zdravých kontrol. Průměrná citlivost, specifičnost a přesnost při profilování lipidů byla 85 %, 95 % a 92 % u rakoviny ledvin; 91 %, 97 %, a 94 % pro rakovinu prsu; a 87 %, 95 % a 92 % pro rakovinu prostaty. Není pozorována žádná souvislost statistických modelů se stádiem nádoru. Statisticky nejvýznamnějšími druhy lipidů pro diferenciaci zkoumaných typů nádorů jsou CE 16:0, Cer 42:1, LPC 18:2, PC 36:2, PC 36:3, SM 32:1 a SM 41:1. Těchto sedm lipidů představuje potenciální biomarkerový panel pro screening rakoviny ledvin, prsu a prostaty, ale k ověření klinické užitečnosti musí být proveden další ověřovací krok v prospektivní studii.

We present the LipidQuant 1.0 tool for automated data processing workflows in lipidomic quantitation based on lipid class separation coupled with high-resolution mass spectrometry. Lipid class separation workflows, such as hydrophilic interaction liquid chromatography or supercritical fluid chromatography, should be preferred in lipidomic quantitation due to the coionization of lipid class internal standards with analytes from the same class. The individual steps in the LipidQuant workflow are explained, including lipid identification, quantitation, isotopic correc- tion and reporting results. We show the application of LipidQuant data processing to a small cohort of human serum samples., Představujeme LipidQuant 1.0 pro automatizované zpracování datových pracovních postupů v lipidomické kvantifikaci založené na oddělení lipidové třídy ve spojení s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. Pracovní postupy separace lipidové třídy, jako je hydrofilní interakční kapalinová chromatografie nebo superkritická kapalinová chromatografie, by měly být preferovány v lipidomické kvantifikaci z důvodu koionizace vnitřních standardů lipidové třídy analyty ze stejné třídy. Jednotlivé kroky jsou v pracovním postupu LipidQuant vysvětleny, včetně identifikace lipidů, kvantifikace, izotopické korekce a vykazování výsledků. Ukazujeme aplikaci zpracování dat LipidQuant na malou kohortu vzorků lidského séra.

Studium živých organismů bylo vždy zájmem vědeckých oborů a v dnešní době tomu není jinak. S moderními přístupy se otevírají nové možnosti, což souvisí i se značným rozmachem tzv. "omics" metod, kam patří například genomika, proteomika, metabolomika nebo glykomika. Lipidomika je nejmladším podoborem metabolomiky a zaměřuje se na analýzu lipidů v živých organismech. Lipidy jsou rozsáhlou skupinou přírodních látek, které jsou obsaženy v rostlinách, houbách, bakteriích nebo v těle živočichů, kde plní životně důležité funkce. Hmotnostní spektrometrie je nejpoužívanější technikou v kvalitativní i kvantitativní analýze lipidů. V teoretické části této práce jsou popsány základní poznatky o lipidech, současné názvosloví a biologické funkce v živých organismech. Současně je vysvětlena lipidomická analýza od přípravy vzorků až po nástroje využívané ke zpracování naměřených dat. Zvláštní pozornost je věnována principům chromatografických technik a využití jejich spojení s hmotnostní spektrometrií v lipidomické analýze, kdy jsou kromě výhod a limitací shrnuty také zásady pro kvalitativní a kvantitativní analýzu. Literární rešerše poté ukazuje potenciál lipidů pro diagnostiku různých typů onemocnění a přínos derivatizačních postupů v lipidomické analýze. V experimentální části je diskutován vývoj nových metod pro analýzu lipidů v tělních tekutinách s využitím spojení chromatografických technik a hmotnostní spektrometrie. V této práci jsou použity dva přístupy využívané v lipidomické analýze, separace lipidů dle lipidových druhů pomocí kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi a separace dle lipidových tříd pomocí hydrofilní interakční chromatografie a superkritické fluidní chromatografie. Separace lipidů dle lipidových druhů je aplikována pro kvalitativní popis lidské plazmy s využitím klasického i derivatizačního přístupu, naopak metody založené na separaci dle lipidových tříd jsou využity pro kvantitativní analýzu velkého množství vzorků a pomocí statistických nástrojů jso, The living organisms have always been studied by scientific disciplines, and it is also valid at the present time. New modern approaches open new possibilities, which relates to the considerable expansion of "omics" methods including genomics, proteomics, metabolomics, or glycomics. Lipidomics is the youngest subgroup of metabolomics focusing on the analysis of lipids in living organisms. Lipids are a large group of natural substances, which are contained in plants, fungi, bacteria, or in the body of animals, where they are responsible for essential life functions. Mass spectrometry is the most widely used technique in the qualitative and quantitative analysis of lipids. The theoretical part of this thesis describes the basic knowledge about lipids, systematic nomenclature, and biological functions in living organisms. At the same time, the lipidomic analysis is described from sample preparation to data processing. A special attention is paid to the principles of chromatographic techniques associated with mass spectrometry for lipidomic analysis, and advantages, disadvantages, and principles of qualitative and quantitative analysis are summarized. The review shows the potential of lipids for the diagnosis of various types of diseases and the benefits of derivatization procedures in lipidomic analysis. The experimental part deals with the development of new methods for the analysis of lipids in body fluids by chromatographic techniques coupled with mass spectrometry. Lipidomic analysis follows two chromatographic approaches in this thesis, lipid species separation is achieved by reversed-phase liquid chromatography and lipid class separation by hydrophilic interaction chromatography and supercritical fluid chromatography. Lipid species separation is used for the qualitative analysis of human plasma by nonderivatization and derivatization approaches. On the other hand, the lipid class separation is used for the quantitative analysis of a large number of samples, and s, Fakulta chemicko-technologická, Dokončená práce s úspěšnou obhajobou

Studium živých organismů bylo vždy zájmem vědeckých oborů a v dnešní době tomu není jinak. S moderními přístupy se otevírají nové možnosti, což souvisí i se značným rozmachem tzv. "omics" metod, kam patří například genomika, proteomika, metabolomika nebo glykomika. Lipidomika je nejmladším podoborem metabolomiky a zaměřuje se na analýzu lipidů v živých organismech. Lipidy jsou rozsáhlou skupinou přírodních látek, které jsou obsaženy v rostlinách, houbách, bakteriích nebo v těle živočichů, kde plní životně důležité funkce. Hmotnostní spektrometrie je nejpoužívanější technikou v kvalitativní i kvantitativní analýze lipidů. V teoretické části této práce jsou popsány základní poznatky o lipidech, současné názvosloví a biologické funkce v živých organismech. Současně je vysvětlena lipidomická analýza od přípravy vzorků až po nástroje využívané ke zpracování naměřených dat. Zvláštní pozornost je věnována principům chromatografických technik a využití jejich spojení s hmotnostní spektrometrií v lipidomické analýze, kdy jsou kromě výhod a limitací shrnuty také zásady pro kvalitativní a kvantitativní analýzu. Literární rešerše poté ukazuje potenciál lipidů pro diagnostiku různých typů onemocnění a přínos derivatizačních postupů v lipidomické analýze. V experimentální části je diskutován vývoj nových metod pro analýzu lipidů v tělních tekutinách s využitím spojení chromatografických technik a hmotnostní spektrometrie. V této práci jsou použity dva přístupy využívané v lipidomické analýze, separace lipidů dle lipidových druhů pomocí kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi a separace dle lipidových tříd pomocí hydrofilní interakční chromatografie a superkritické fluidní chromatografie. Separace lipidů dle lipidových druhů je aplikována pro kvalitativní popis lidské plazmy s využitím klasického i derivatizačního přístupu, naopak metody založené na separaci dle lipidových tříd jsou využity pro kvantitativní analýzu velkého množství vzorků a pomocí statistických nástrojů jso, The living organisms have always been studied by scientific disciplines, and it is also valid at the present time. New modern approaches open new possibilities, which relates to the considerable expansion of "omics" methods including genomics, proteomics, metabolomics, or glycomics. Lipidomics is the youngest subgroup of metabolomics focusing on the analysis of lipids in living organisms. Lipids are a large group of natural substances, which are contained in plants, fungi, bacteria, or in the body of animals, where they are responsible for essential life functions. Mass spectrometry is the most widely used technique in the qualitative and quantitative analysis of lipids. The theoretical part of this thesis describes the basic knowledge about lipids, systematic nomenclature, and biological functions in living organisms. At the same time, the lipidomic analysis is described from sample preparation to data processing. A special attention is paid to the principles of chromatographic techniques associated with mass spectrometry for lipidomic analysis, and advantages, disadvantages, and principles of qualitative and quantitative analysis are summarized. The review shows the potential of lipids for the diagnosis of various types of diseases and the benefits of derivatization procedures in lipidomic analysis. The experimental part deals with the development of new methods for the analysis of lipids in body fluids by chromatographic techniques coupled with mass spectrometry. Lipidomic analysis follows two chromatographic approaches in this thesis, lipid species separation is achieved by reversed-phase liquid chromatography and lipid class separation by hydrophilic interaction chromatography and supercritical fluid chromatography. Lipid species separation is used for the qualitative analysis of human plasma by nonderivatization and derivatization approaches. On the other hand, the lipid class separation is used for the quantitative analysis of a large number of samples, and s, Fakulta chemicko-technologická, Dokončená práce s úspěšnou obhajobou

Effects of blood collection tubes, the time period, the sample origin, and the method used on the lipidomic profile are investigated by ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography - mass spectrometry (UHPSFC/MS) and hydrophilic interaction liquid chromatography ultrahigh-performance liquid chromatography - mass spectrometry (HILIC-UHPLC/MS). Heparin plasma samples have been obtained from 99 healthy volunteers at three time points separated by six-month intervals together with one collection for EDTA plasma and serum. Furthermore, lipid concentrations in heparin plasma collected at two different sites are compared. 171 lipid species from eight lipid classes are quantified with UHPSFC/ MS, and 122 lipid species from four lipid classes with HILIC-UHPLC/MS. The accuracy of both methods is monitored by the quantitation error using two internal standards (IS) per individual lipid classes. No significant differences in lipid profiles are observed for different time points and types of collection tubes (heparin plasma, EDTA plasma, and serum). Most pronounced lipid concentration differences are observed for the comparison of NIST SRM 1950 human plasma and mean lipid concentrations of the investigated cohort. Furthermore, differences in lipid concentrations are observed between employed methods (UHPSFC/MS vs. HILIC-UHPLC/MS), which can be compensated by the normalization using NIST SRM 1950 human plasma used as the quality control sample., Účinky zkumavek pro odběr krve, doba, původ vzorku a metoda použitá na lipidomický profil jsou zkoumány pomocí vysokoúčinné superkritické kapalinové chromatografie - hmotnostní spektrometrie (UHPSFC / MS) a kapalinové chromatografie s hydrofilní interakcí - hmotnostní spektrometrie (HILIC-UHPLC / MS). Vzorky heparinové plazmy byly získány od 99 zdravých dobrovolníků ve třech časovýchúsecích oddělených v šestiměsíčních intervalech společně s jedním odběrem EDTA plazmy a séra. Dále jsou srovnávány koncentrace lipidů v heparinové plazmě shromážděné na dvou různých místech. 171 lipidových druhů z osmi lipidových tříd je kvantifikováno pomocí UHPSFC / MS a 122 lipidových druhů ze čtyř lipidových tříd pomocí HILIC-UHPLC / MS. Přesnost obou metod je sledována kvantifikační chybou pomocí dvou vnitřních standardů (IS) na jednotlivé třídy lipidů. Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v lipidových profilech pro různé časové body a typy odběrových zkumavek (heparinová plazma, EDTA plazma a sérum). Nejvýraznější rozdíly v koncentraci lipidů jsou pozorovány při srovnání lidské plazmy NIST SRM 1950 a průměrných koncentrací lipidů ve zkoumané kohortě. Dále jsou pozorovány rozdíly v koncentracích lipidů mezi použitými metodami (UHPSFC / MS vs. HILIC-UHPLC / MS), které lze kompenzovat normalizací pomocí lidské plazmy NIST SRM 1950 použité jako vzorek kontroly kvality.

Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography - mass spectrometry (UHPSFC/MS), ultrahigh-performance liquid chromatography - mass spectrometry (UHPLC/MS), and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) - MS techniques were used for the lipidomic characterization of exosomes isolated from human plasma. The high-throughput methods UHPSFC/MS and UHPLC/MS using a silica-based column containing sub-2 mu m particles enabled the lipid class separation and the quantitation based on exogenous class internal standards in < 7 minute run time. MALDI provided the complementary information on anionic lipid classes, such as sulfatides. The nontargeted analysis of 12 healthy volunteers was performed, and absolute molar concentration of 244 lipids in exosomes and 191 lipids in plasma belonging to 10 lipid classes were quantified. The statistical evaluation of data included principal component analysis, orthogonal partial least square discriminant analysis, S-plots, p-values, T-values, fold changes, false discovery rate, box plots, and correlation plots, which resulted in the information on lipid changes in exosomes in comparison to plasma. The major changes were detected in the composition of triacylglycerols, diacylglycerols, phosphatidylcholines, and lysophosphatidylcholines, whereby sphingomyelins, phosphatidylinositols, and sulfatides showed rather similar profiles in both biological matrices., Ultravysokoúčinná superkritická kapalinová chromatografie - hmotnostní spektrometrie (UHPSFC / MS), ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie - hmotnostní spektrometrie (UHPLC / MS) a laserová desorpce / ionizace (MALDI) - MS byly použity pro lipidomickou charakterizaci exosomů izolovaných z lidské plazmy. Vysokoúčinné metody UHPSFC / MS a UHPLC / MS využívající kolonu na bázi oxidu křemičitého obsahující částice sub-2 um umožnily separaci lipidové třídy a kvantifikaci na základě interních standardů exogenní třídy v době běhu <7 minut. MALDI poskytl doplňující informace o třídách aniontových lipidů, jako jsou sulfatidy. Byla provedena necílená analýza 12 zdravých dobrovolníků a byla kvantifikována absolutní molární koncentrace 244 lipidů v exosomech a 191 lipidů v plazmě patřících do 10 lipidových tříd. Statistické vyhodnocení dat zahrnovalo analýzu hlavních složek, ortogonální částečnou diskriminační analýzu nejmenších čtverců, S-grafy, p-hodnoty, T-hodnoty, násobné změny, míru falešných objevů, krabicové grafy a korelační grafy, které vyústily v informace o lipidech změny v exosomech ve srovnání s plazmou. Hlavní změny byly detekovány ve složení triacylglycerolů, diacylglycerolů, fosfatidylcholinů a lysofosfatidylcholinů, přičemž sfingomyeliny, fosfatidylinositoly a sulfatidy vykazovaly v obou biologických matricích poměrně podobné profily

Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography-mass spectrometry (UHPSFC/MS) has a great potential for the high-throughput lipidomic quantitation of biological samples; therefore, the full optimization and method validation of UHPSFC/MS is compared here with ultrahigh-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC/MS) in hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) mode as the second powerful technique for the lipid class separation. First, the performance of six common extraction protocols is investigated, where the Folch procedure yields the best results with regard to recovery rate, matrix effect, and precision. Then, the full optimization and analytical validation for eight lipid classes using UHPSFC/MS and HILIC-UHPLC/MS methods are performed for the same sample set and applied for the lipidomic characterization of pooled samples of human plasma, human serum, and NIST SRM 1950 human plasma. The choice of appropriate internal standards (IS) for individual lipid classes has a key importance for reliable quantitative workflows illustrated by the selectivity while validation and the calculation of the quantitation error using multiple internal standards per lipid class. Validation results confirm the applicability of both methods, but UHPSFC/MS provides some distinct advantages, such as the successful separation of both non-polar and polar lipid classes unlike to HILIC-UHPLC/MS, shorter total run times (8 vs. 10.5 min), and slightly higher robustness. Various types of correlations between methods (UHPSFC/MS and HILIC-UHPLC/MS), biological material (plasma and serum), IS (laboratory and commercially mixtures), and literature data on the standard reference material show the intra- and inter-laboratory comparison in the quantitation of lipid species from eight lipid classes, the concentration differences in serum and plasma as well as the applicability of non-commercially available internal standard mixtures for lipid quantitation., Vysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie-hmotnostní spektrometrie (UHPSFC / MS) má velký potenciál pro vysokoúčinnou lipidomickou kvantifikaci biologických vzorků; proto je zde úplná optimalizace a validace metody UHPSFC / MS srovnávána s ultravysokoúčinnou kapalinovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií (UHPLC / MS) v režimu hydrofilní interakční kapalinové chromatografie (HILIC) jako druhé výkonné techniky pro separaci lipidových tříd. Nejprve se zkoumá účinnost šesti běžných extrakčních protokolů, kde Folchova metoda přináší nejlepší výsledky s ohledem na míru obnovy, maticový efekt a přesnost. Poté se provede úplná optimalizace a analytická validace pro osm lipidových tříd pomocí metod UHPSFC / MS a HILIC-UHPLC / MS pro stejnou sadu vzorků a použije se pro lipidomickou charakterizaci shromážděných vzorků lidské plazmy, lidského séra a NIST SRM 1950 lidská plazma. Volba vhodných interních standardů (IS) pro jednotlivé lipidové třídy má klíčový význam pro spolehlivé kvantitativní pracovní toky ilustrované selektivitou při validaci a výpočtem kvantifikační chyby s použitím více interních standardů na lipidovou třídu. Výsledky validace potvrzují použitelnost obou metod, ale UHPSFC / MS poskytuje některé výrazné výhody, jako je úspěšná separace nepolárních a polárních lipidových tříd na rozdíl od HILIC-UHPLC / MS, kratší celkové doby běhu (8 vs. 10,5 min ) a mírně vyšší robustnost. Různé typy korelací mezi metodami (UHPSFC / MS a HILIC-UHPLC / MS), biologickým materiálem (plazma a sérum), IS (laboratorní a komerčně dostupné směsi) a literárními údaji o standardním referenčním materiálu ukazují intra- a mezilaboratorní srovnání v kvantifikaci lipidových druhů z osmi lipidových tříd, rozdíly v koncentraci v séru a plazmě, jakož i použitelnost nekomerčně dostupných směsí vnitřních standardů pro kvantifikaci lipidů.

This review summarizes available mass spectrometry (MS) based approaches for the quantitative analysis of lipids in biological samples in the cancer research, which is termed here as oncolipidomics. The methodological part shows possible configurations of stand-alone MS or MS coupled to liquid-phase separation techniques. For the characterization of various lipids with the special emphasis on methods convenient for robust high-throughput lipidomic quantitation of biological samples, such as body fluids, tissues, and cell lines. The critical assessment of lipid species dysregulated in various cancer types is provided with the goal to summarize and generalize the typical up and down regulated lipids associated with the progress of tumor growth and evaluate possible future use of lipidomic analysis in the early cancer diagnosis., Toto review shrnuje dostupné přístupy založené na hmotnostní spektrometrii (MS) pro kvantitativní analýzu lipidů v biologických vzorcích ve výzkumu rakoviny, která je označována jako onkolipidomika. Metodická část ukazuje možné konfigurace samostatných MS nebo MS spojené s technikami separace na kapalných fází. Pro charakterizaci různých lipidů se zvláštním důrazem na metody vhodné pro robustní high-throughput lipidomické kvantifikace biologických vzorků, jako jsou tělní tekutiny, tkáně a buněčné linie. Kritické hodnocení lipidových druhů dysregulovaných u různých typů rakoviny je poskytováno s cílem shrnout a zobecnit typické up and down regulované lipidy spojené s pokrokem růstu nádoru a vyhodnotit možné budoucí použití lipidomické analýzy v časné diagnóze rakoviny.

A simple and sensitive method for the determination of free aliphatic and aromatic amines using derivatives agents (dansyl chloride, 9-fluorenylmethyl chloroformate and 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan) as a labelling reagent by high-performance liq-uid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD) has been developed. Derivatization conditions including reagent concentration, buffer pH, reaction time and temperature were optimized. A fluorescence derivatization - high-performance liquid chromatography (HPLC) method, which enables the femtomole-level detection of analytes, is a powerful tool for the analysis with high sensitivity and selectivity. In recent decades, improvised explosive devices (IEDs) have become an increasing topic of public concern, with high-profile incidents such as the Bali (2002), London transport (2005), Boston Marathon (2013) and Brussels (2016) bombings garnering mass international attention.[1] Although the majority of media coverage has fo-cused on large-scale incidents, there has also been a rise in explosive incidents in-volving smaller devices such as pipe bombs. This is particularly the case in the Unit-ed States, where pipe bombs are considered to make up the vast majority of IED en-counter. These devices can be easily constructed from everyday materials.[2] The mixture nitromethane with amines is applicable for this. Determination of resi-dues after an explosion is important. This method (HPLC-FLD) could be useful for their determination. The proposed method is sensitive and reproducible for the de-termination of aliphatic and aromatic amines., V práci je popsán vývoj metody pro stanovení alifatických aminů pomocí kapalinové chromatografie s využitím citlivé fluorescenční detekce. Je zde popsán způsob derivatizece. Nalezené podmínky byly testovány na reálných vzorcích, které byly získány po odpálení namíchaných směsí.

Tato práce se zabývá stanovením aminů, které by mohly být využívány jako improvizované výbušniny. Aminy byly stanovovány pomoci kapalinové chromatografie s fluorescenčním detektorem. Jelikož samotné aminy nevyzařují fluorescenční záření, byla prováděna jejich derivatizace. K tomuto účelu bylo vybráno derivatizační činidlo 9-(fluorenyl)ethylchloromravenčan, které je vhodné pro primární i sekundární aminy. Problém však představuje fluorescence samotného činidla, proto je třeba nadbytek činidla odstranit. Nadbytečné množství bylo odstraněno extrakcí do hexanu. Pro separaci byly testovány různé kolony. Mobilní fáze byla složena ze směsi acetonitril – 0,03M acetátový pufr (pH 4) a eluce probíhala za izokratických podmínek. Reakční doba derivatizace byla dvě minuty a následná extrakce probíhala po dobu 40 sekund za intenzivního míchání. Průtok mobilní fáze byl optimalizován pro danou metodu. Pro fluorescenční detekci byla emisní vlnová délka 310 nm a excitační vlnová délka 265 nm. Z naměřených dat byly vytvořeny kalibrační grafy, ze kterých byla určena lineární část křivky. Následně byl také určen limit detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ)., This work deals with the determination of amines, which could be used as improvised explosives. Amines were determined by liquid chromatography with fluorimetric detection. As amines are not emitting fluorescence radiation, it was performed their derivatisation. For this purpose a derivatisation agent 9-(fluorenyl)ethylchloroformate was chosen as this is suitable for primary and secondary amines. The problem is then the fluorecence of this agent as such, so its excess needs to be removed. This was realised by hexane extraction. For separation various columns were tested. Mobile phase consists of the mixture of acetonitrile and 0.03M acetate buffer (pH 4) at isocratic elution mode. Reaction time for derivatisation was 2 min and following extraction takes 40 s under vigorous agitation. Mobile flow rate was optimised for used method. For fluorimetric detection the emission wavelength 310 nm and excitation wavelength 265 nm were used. From obtained results a calibration charts were constructed and the linear region was evaluated. Finally, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) were calculated.

Tato diplomová práce se zabývá stanovením aminů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s fluorescenční detekcí. Teoretická část se zabývá popisem aminů, kapalinové chromatografie, derivatizace a příklady stanovení aminů. Experimentální část popisuje výběr vhodných derivatizačních činidel pro stanovení vybraných aminů., This thesis deals with determination of amines by high performance liquid chromatography with fluorescence detection. The theoretical part deals with the description of amines, liquid chromatography, derivatization and examples of the determination of amino compounds. The experimental part describes selection of suitable derivatizing agents for the determination of selected amines., Fakulta chemicko-technologická, Student seznámil členy zkušební komise s obsahem své diplomové práce, ve které se zabýval stanovením aminů pomocí HPLC. Byly přečteny posudky vedoucího a oponenta diplomové práce. Student poté odpověděl na otázky členů zkušební komise.

Tato bakalářská práce se zabývá jaterními nemocemi a současnými trendy v jejich léčbě. V první části bakalářské práce je popsaná anatomie, funkce jater a využívané vyšetřovací metody. Druhá část je zaměřena na konkrétní jaterní onemocnění a nejnovější metody používané při jejich léčbě., This Bachelor's thesis deals with liver diseases and current trends in their treatment. The first part of the thesis describes anatomy, liver function and used methods of examination. The second part focuses on specific liver's diseases and the modern methods used in their treatment., Ústav organické chemie a technologie, Student přednesl obhajobu své bakalářské práce a úspěaně zodpověděl dotazy komise