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Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, 21 de fevereiro de 2018, Universidade dos Açores. A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida por ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), é uma doença autossómica dominante causada pela expansão de motivos repetitivos CAG no exão 10 do gene ATXN3, localizado em 14q32.1. O tamanho das repetições é o principal condicionante da idade de manifestação e severidade da doença. Os alelos normais têm um comportamento estável, mantendo-se inalterado o número de repetições aquando da mitose e da meiose. Todavia, na DMJ, à semelhança do que acontece noutras doenças de poliglutamina (poliQ), os alelos expandidos apresentam instabilidade somática e intergeracional. O papel dos mecanismos de reparação do DNA na instabilidade das repetições permanece por esclarecer. Os principais objectivos da presente dissertação foram: (1) caracterizar a instabilidade somática e intergeracional em sujeitos DMJ açorianos; (2) analisar a associação entre as variantes PMS2 g.26796 C>A (rs1805323), ERCC6 g.19868 G>A (rs2228528) e FAN1 g.3228531 C>G (rs3512) e a instabilidade somática e intergeracional; (3) analisar a associação entre as variantes referidas em (2) e a idade de início da DMJ. No presente estudo foram utilizadas amostras de DNA de 54 sujeitos DMJ. Para o estudo da instabilidade intergeracional usaram-se 50 amostras de DNA de sangue (num total de 31 transmissões). Para o estudo do mosaicismo somático utilizaram-se 26 amostras de DNA de sangue e 26 amostras de DNA de mucosa bucal, representando 26 indivíduos. A determinação das repetições CAG no alelo expandido do gene ATXN3 foi efectuada utilizando PCR convencional e TP-PCR (Triplet repeat primed PCR), seguidas de análise de fragmentos por electroforese capilar. As amostras foram genotipadas para as variantes alélicas dos genes PMS2, ERCC6 e FAN1 por sequenciação de Sanger. Para a análise da instabilidade somática, após o cálculo dos genótipos obtidos por AF, foi calculada a diferença entre o tamanho da repetição CAG obtido a partir do DNA extraído das 26 amostras de sangue e do DNA extraído de mucosa bucal, para cada indivíduo (CAGexp (sangue) – CAGexp (mucosa bucal)). A partir da análise do padrão de picos obtido na TP-PCR, determinou-se o índice de mosaicismo (IM). O genótipo obtido por PCR convencional foi utilizado para classificar as transmissões em estáveis e instáveis, calculando-se a diferença no número de repetições CAG entre o descendente e o progenitor (CAGexp (descendente) – CAGexp (progenitor)). A presença/ausência de instabilidade somática e intergeracional foi correlacionada com as variantes alélicas ERCC6 g.19868 G>A, FAN1 g.3228531 C>G e PMS2 g.2696 C>A. Cinquenta por cento dos indivíduos não apresentam mosaicismo somático nos 2 tecidos estudados. O valor médio de IM para cada um dos tecidos foi semelhante, apesar de ligeiramente superior no sangue, indicando uma maior instabilidade neste tecido relativamente ao epitélio da mucosa bucal. Das transmissões estudadas, 70% foram instáveis e 30% estáveis, sendo que nas instáveis 66,7% corresponderam a expansões e 33,8% a contracções. Não foi observada nenhuma associação entre as variantes ERCC6 g.19868 G>A e FAN1 g.3228531 C>G e a instabilidade somática e intergeracional. De acordo com a correlação genótipo-fenótipo efectuada entre o gene FAN1 e a idade de início da DMJ observou-se que os doentes FAN1*GG apresenta uma idade significativamente mais tardia que os doentes FAN1*CC. Este resultado está de acordo com o previamente reportado numa série extensa de doentes com várias doenças de poliQ. A confirmação do papel do FAN1 na patogénese da DMJ permitirá compreender a interligação da via de reparação de Fanconi Anemia, na qual o gene FAN1 está envolvido, e a patogénese molecular da DMJ, assim evidenciando um potencial papel desta via enquanto alvo terapêutico. ABSTRACT: Machado-Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is an autosomal dominant disease and is caused by an abnormal number of CAG repeats in exon 10 of the ATXN3 gene, located on 14q32.1. Age at onset and severity of the disease is mainly explained by the size of the CAG motifs in the expanded allele. Normal alleles present a stable behavior, in which the number of repeats remains unchanged in mitotic and meiotic divisions. However, in MJD, similarly to the observed in other poliQ diseases, alterations in the size of the expanded alleles present mitotic and meiotic instability. The role of DNA repair in the instability of CAG repeats remains to be clarified. The main goals of the present dissertation were: (1) characterize the somatic and intergenerational instability in Azorean MJD subjects; (2) analyze the association between PMS2 g.26796 C> A (rs1805323), ERCC6 g.19868 G> A (rs2228528) and FAN1 g.3228531 C> G (rs3512) and somatic and intergenerational instability; (3) analyze the association between the variants mentioned in (2) and the age at onset in MJD. In the present study, a total of DNA samples from 54 MJD subjects were used; DNA from 50 blood samples (for a total of 31 transmissions) and from 26 blood and buccal swab samples were used in the intergenerational and somatic instability analysis, respectively. The number of CAG repeats in the ATXN3 gene expanded allele was determined using conventional PCR and TP-PCR (Triplet repeat primed PCR), followed by fragment analysis by capillary electrophoresis (FA). Allelic variants of the PMS2, ERCC6 and FAN1 genes were genotyped by Sanger sequencing. The difference between the size of the CAG repeats in blood and in buccal swab samples (CAGexp (blood) - CAGexp (buccal swab)) as well as the calculation of the mosaicism index (MI) by TP-PCR were used to characterize somatic instability. The difference between the number of CAG repeats in the offspring and in the transmitting parent (CAGexp (offspring) - CAGexp (transmitting parent)) was calculated to characterize intergeracional instability. The presence/absence of the alelic variants ERCC6 g.19868 G> A, FAN1 g.3228531 C> G and PMS2 g.2696 C> A was correlated with somatic and intergeracional instability. Somatic instability was not observed in 50% of the individuals analyzed. Furthermore, although slightly higher in the blood, MI was similar in both tissues. Seventy percent of the transmissions were unstable and from this 66,7% were expansions and 33,8% were contractions. These findings are in accordance with previous reports for MJD. Associations between ERCC6 g.19868 G> A and FAN1 g.3228531 C> G variants and somatic and intergenerational instability were not observed. Genotype/phenotype analysis revealed that patients presenting FAN1*GG have a significantly late onset than patients with FAN1*CC, a result in accordance with a previous larger study including patients with polyQ diseases. The confirmation of FAN1 as MJD modifier will allow to understand the link between Fanconi Anemia repair mechanisms, in which FAN1 is involved, and MJD pathogenesis, thus evidencing the potential of this pathway as a therapeutic target.