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Isovaleryl coenzyme A (IV-CoA) is an important precursor for iso-fatty acids and lipids. It acts in the development of myxobacteria, which can produce this compound from acetyl-CoA through alternative IV-CoA biosynthesis (aib). A central reaction of aib is catalyzed by AibA/AibB, which acts as a cofactor-free decarboxylase despite belonging to the family of CoA-transferases. We developed an efficient expression system for AibA/AibB that allowed the determination of high-resolution crystal structures in complex with different ligands. Through mutational studies, we show that an active-site cysteine previously proposed to be involved in decarboxylation is not required for activity. Instead, AibA/AibB seems to induce an intramolecular decarboxylation by binding its substrate in a hydrophobic cavity and forcing it into a bent conformation. Our study opens opportunities for synthetic biology studies, since AibA/AibB may be suitable for the production of isobutene, a precursor of biofuels and chemicals. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Isovaleryl ‐ Coenzym A (IV ‐ CoA) ist eine wichtige Vorstufe für Isofettsäuren und Lipide, die in Myxobakterien essentiell für die Entwicklung sind. Myxobakterien können IV ‐ CoA aus Acetyl ‐ CoA über eine alternative IV ‐ CoA ‐ Biosynthese (aib) herstellen. Die zentrale Reaktion in aib wird durch die kofaktorfreie Decarboxylase AibA/AibB katalysiert. Wir entwickelten ein effizientes Expressionssystem für AibA/AibB, das die Bestimmung hochaufgelöster Kristallstrukturen im Komplex mit verschiedenen Liganden ermöglichte. Durch Mutation zeigen wir, dass ein Cystein, das als katalytisch wichtig beschrieben wurde, für die enzymatische Aktivität nicht benötigt wird. Stattdessen scheint AibA/AibB eine intramolekulare Decarboxylierung zu induzieren, indem es das Substrat in eine gebogene Konformation in der hydrophoben Tasche zwingt. Da AibA/AibB in der Produktion von Isobuten, einem Vorläufer für Biotreibstoff, eingesetzt werden könnte, eröffnet unsere Arbeit neue Wege in der synthetischen Biologie. Kraftstoff durch Enzyme? Für die Decarboxylase AibA/AibB wird anhand von Strukturstudien und biochemischen Analysen ein von der Geometrie und dem hydrophoben Charakter des aktiven Zentrums abhängiger, intramolekularer Decarboxylierungsmechanismus postuliert. Die Ergebnisse eröffnen Möglichkeiten für die synthetische Biologie, da AibA/AibB für die bakterielle Produktion von Isobuten, einem Vorläufer von erneuerbarem Biokraftstoff, geeignet ist. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Myxopyronins (MXN) and corallopyronins (COR) are structurally related α-pyrone antibiotics from myxobacteria that represent a highly promising compound class for the development of broad-spectrum antibacterial therapeutic agents. Their ability to inhibit RNA polymerase through interaction with the “switch region”, a novel target, distant from previously characterized RNA polymerase inhibitors (e.g. rifampicin), makes them particularly promising candidates for further research. To improve compound supply for further investigation of MXN, COR and novel derivatives of these antibacterial agents, establishment of an efficient and versatile microbial production platform for myxobacterial α-pyrone antibiotics is highly desirable. Here we describe design, construction and expression of a heterologous production and engineering platforms for MXN and COR to facilitate rational structure design and yield improvement approaches in the myxobacterial host strain Myxococcus xanthus DK1622. Optimization of the cultivation medium yielded significantly higher production titers of MXN A at around 41-fold increase and COR A at around 25-fold increase, compared to the standard CTT medium. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Ripostatin is a promising antibiotic that inhibits RNA polymerase by binding to a novel binding site. In this study, the characterization of the biosynthetic gene cluster of ripostatin, which is a peculiar polyketide synthase (PKS) hybrid cluster encoding cis- and trans-acyltransferase PKS genes, is reported. Moreover, an unprecedented mechanism for phenyl acetic acid formation and loading as a starter unit was discovered. This phenyl-C2 unit is derived from phenylpyruvate (phenyl-C3) and the mechanism described herein explains the mysterious loss of one carbon atom in ripostatin biosynthesis from the phenyl-C3 precursor. Through in vitro reconstitution of the whole loading process, a pyruvate dehydrogenase like protein complex was revealed that performs thiamine pyrophosphate dependent decarboxylation of phenylpyruvate to form a phenylacetyl- S-acyl carrier protein species, which is supplied to the subsequent biosynthetic assembly line for chain extension to finally yield ripostatin. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Ripostatin ist ein vielversprechendes Antibiotikum, welches die RNA ‐ Polymerase an einer neuen Bindestelle hemmt. Im Mittelpunkt dieser Studie steht die Charakterisierung der Ripostatin ‐ Biosynthese, die durch eine ungewöhnliche, sowohl auf trans ‐ als auch cis ‐ Acyltransferasen beruhenden hybriden Polyketidsynthase getrieben wird. Im Besonderen beschreiben wir einen bisher unbekannten Mechanismus zur Bildung einer Phenylessigsäure ‐ Starteinheit, welche durch die Decarboxylierung von Phenylpyruvat gebildet wird. Die Entstehung dieser Starteinheit konnte in vitro rekonstituiert werden, was einen Mechanismus offenlegte, der dem des Pyruvatdehydrogenase ‐ Komplexes ähnlich ist. Dieser enyzmatische Prozess entfernt ein einzelnes Kohlenstoffatom aus Phenylpyruvat in einer Thiaminpyrophosphat ‐ abhängigen Decarboxylierung. Die dabei letztlich gebildete Phenylacetyl ‐ S ‐ acyl ‐ Spezies dient als Starteinheit der Ripostatin ‐ Biosynthese. Ein Pyruvatdehydrogenase ‐ ähnlicher Proteinkomplex, der Phenylpyruvat als Substrat verwendet, wurde in der Ripostatin ‐ Biosynthese identifiziert. In ‐ vitro ‐ Rekonstitution und vollständige biochemische Charakterisierung des Phenylpyruvatdehydrogenase ‐ Komplexes zeigten, wie Phenylessigsäure aus Phenylpyruvat entsteht. Zudem erklärt der Mechanismus den Verlust eines Kohlenstoffatoms in der Ripostatin ‐ Biosynthese ausgehend von der Phenyl ‐ C3 ‐ Vorstufe. [ABSTRACT FROM AUTHOR]