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Additional file 2: Supplementary table 1. Frequency of cytokine+ cells amongst peripheral blood mononuclear cells from leprosy patients, household contacts and healthy controls upon in vitro culture.

Additional file 1: Supplementary figure 1. Establishment of Cut-offs to segregate subjects with low or high Biomarker INDEX.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais PROQUALI (UFJF) -

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O diagnóstico precoce da hanseníase é uma importante estratégia para interromper a cadeia de transmissão do M. leprae e prevenir a incapacidade física. No entanto, o diagnóstico é essencialmente clínico e, em muitos casos, os sintomas são sutis e às vezes passam desapercebidos até mesmo pelos especialistas. Os exames de baciloscopia e histopatologia auxiliam no diagnóstico clínico, na categorização espectral e no tratamento da doença. Nas regiões onde a endemicidade é maior, métodos sorológicos e moleculares devem ser utilizados, principalmente entre os contatos domiciliares, para identificar contatos de pacientes com possibilidades de adoecimento. Nesse sentido, propusemos traçar o perfil clínico, sociodemográfico e laboratorial dos indivíduos com suspeição de hanseníase atendidos no CREDENPES. Amostras de raspado dérmico auricular dos participantes do estudo foram coletadas e conservadas em álcool a 70%. Posteriormente, extraiu-se e quantificou-se o material genético. Em seguida realizou-se a qPCR tendo como alvo o gene RLEP (Elementos repetitivos) para identificação da presença de DNA do M. leprae. nas referidas amostras. Foram analisadas amostras de 411 indivíduos. Desse total, 158 foram classificados como casos e 253 como indivíduos com suspeição para hanseníase. Verificou-se um número significativo de casos com idade entre 40 a 69 anos (n=85), sendo que 58,86% foram do sexo masculino e 83,87% apresentaram qPCR positiva, indicando a presença de DNA de M. leprae nas amostras de raspado dérmico coletadas. Quanto à escolaridade, entre os que tinham 1ª a 4ª série incompleta, a reação qPCR foi positiva em 89,66%. A maioria dos casos notificados foi classificada como multibacilar (63,92%). Entretanto, o teste qPCR foi positivo em 75,44% dos casos classificados como paucibacilares e 86,14% dos casos multibacilares. Em relação aos indivíduos com suspeição de hanseníase, das 253 amostras coletadas, 100% apresentaram índice bacilar negativo (IB=0. Entretanto, os resultados do teste qPCR indicaram que 120 amostras (47,43%) eram positivas para o gene RLEP. Esses resultados reforçam a necessidade da implementação de métodos laboratoriais mais sensíveis para o diagnóstico da hanseníase. Além disso, vale destacar a identificação de dois casos de pacientes (forma clínica virchowiana e dimorfa) com IB zero e resultados de qPCR positivos. Os dados obtidos em nosso estudo indicam a possibilidade de adoecimento daqueles indivíduos encaminhados ao CREDENPES, com suspeição de hanseníase, que apresentaram resultados positivos para DNA de M. leprae na qPCR, embora com IB zero. Early diagnosis of leprosy is a vital strategy to interrupt the chain of transmission of M. leprae and prevent physical disability. However, the diagnosis is essentially clinical, and, in many cases, the symptoms are subtle and sometimes go unnoticed even by specialists. Bacilloscopy and histopathology exams help in the clinical diagnosis, spectral categorization, and treatment of the disease. In regions where endemicity is higher, serological and molecular methods should be used, especially among household contacts, to identify contacts of patients with the possibility of becoming ill. In this sense, we proposed to trace the clinical, sociodemographic, and laboratory profiles of individuals with suspected leprosy treated at CREDEN-PES. Ear dermal scraping samples from study participants were collected and preserved in 70% alcohol. Subsequently, the genetic material was extracted and quantified. Then, the qPCR assay was performed targeting the RLEP gene (Repetitive Elements) to identify the presence of M. leprae DNA. in said samples. Samples from 411 individuals were analyzed. Of this total, 158 samples were classified as cases and 253 as individuals with suspected leprosy. A significant number of patients aged between 40 and 69 years (n=85), with 58.86% being male and 83.87% presenting positive qPCR, indicating the presence of M. leprae DNA in the dermal scraping samples collected. As for education, among those who had incomplete 1st to 4th grade, the qPCR reaction was positive at 89.66%. Most of the reported cases were classified as multibacillary (63.92%). However, the qPCR test was positive in 75.44% of the patients classified as paucibacillary and 86.14% of the multibacillary cases. Regarding individuals with suspected leprosy, of the 253 samples collected, 100% had a negative bacillary index (BI=0. However, the results of the qPCR test indicated that 120 samples (47.43%) were positive for the RLEP gene. Our results reinforce the need to implement more sensitive laboratory methods to diagnose leprosy. In addition, it is worth highlighting the identification of two cases of patients (lepromatous and borderline clinical form) with zero BI and positive qPCR results. The study indicates the possibility of illness in those individuals referred to CREDENPES with suspected leprosy, who presented positive results for M. leprae DNA in the qPCR, although with BI zero.

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Hanseníase, doença milenar e estigmatizante apresentou em 2017, prevalência global de 192.713 casos, sendo o Brasil o segundo país com maior número de casos novos. As ações de controle estão baseadas no diagnóstico, tratamento e vigilância dos contatos. Entretanto, essa enfermidade exige abordagens mais inovadoras para o real controle. Sabe-se que infecções causadas por parasitos bem como deficiências de micronutrientes podem coexistir com a hanseníase em áreas endêmicas no Brasil. Infecções crônicas por helmintos e má nutrição parecem estar associadas à supressão da resposta imunológica. Dessa forma, propõe-se determinar fatores de risco associados à hanseníase em um grupo de estudo considerando variáveis sócio-demográficas, imunológicas, hematológicas, parasitológicas (S. mansoni) e nutricionais. Foram incluídos 3 grupos, casos (com hanseníase PB, MB, n=79), contatos (assintomáticos, convivência com paciente, n=97) e controle negativo (assintomáticos sem história de hanseníase, n=81), atendidos nas ESF de Gov. Valadares e Limeira de Mantena. Foram aplicados questionários estruturados e após coleta de sangue e fezes foram realizados exames laboratoriais para avaliação da reatividade sorológica (IgG4Swap), determinação do perfil imunológico, hemograma e quantificação de micronutrientes. Foram aplicados diferentes testes estatísticos para análise. Destacou-se o baixo grau de escolaridade dos participantes. 75% (33) dos co-infectados apresentavam nível básico de escolaridade e apenas 7,9% (14) do grupo controle (contatos e controle negativo) possuíam ensino superior. 70% dos contatos residiam com o doente e 68% dos co-infectados não tinham hábito de tratar água para consumo. Não foi mostrada associação entre hanseníase da forma clínica multibacilar e esquistossomose, entretanto constatamos uma forte correlação ente hanseníase e infecção pelo S. mansoni com um aOR de 3,37 comparando o grupo de casos e controles e ainda mais forte, um aOR de 8,33 comparando casos e contatos. Provavelmente, nossa limitação em constatar associação entre a forma multibacilar e esquistossomose se deve ao pequeno número de casos com IB positivo, e também o pequeno número de participantes com esquistossomose ativa e ainda apresentando baixa carga parasitária. No painel de citocinas verificou-se que IL-10, citocina imunoreguladora, apresentou associação com o grupo de infectados pelo S. mansoni, bem como com o grupo co-infectado x controle negativo (estimulo ML) e mono infectado (SE, PHA e ML). A IL-4 também apresentou associação com o grupo co-infectado x contato (SE) e monoinfectado (ML). Esses dados reforçam a presença de citocinas imunoreguladoras e relacionadas à resposta Th2 no grupo co-infectado. Uma correlação positiva entre perfil de citocinas próinflamatórias (IL-17, IFN-γ, TNF-α, IL-6 e IL-2) e grupo controle foi constatada, como também com o mono-infectado. Associação das quimiocinas IL-8 e IP-10 com o mono-infectado foi detectada. Indivíduos co-infectados apresentaram concentrações inadequadas de vitamina D. Concentrações adequadas de vitamina A foram observadas nos grupos controle negativo e contato. A deficiência de ferro associada a uma dieta pouco diversificada, juntamente com coinfecção, podem ser a causa da anemia observada em 55% dos indivíduos do grupo co-infectado que apresentaram parâmetros hematológicos (hemácia, hemoglobina, hematócrito) abaixo dos valores normais. Acreditamos que a continuidade desses estudos e o acompanhamento dos contatos são relevantes para melhor delinear fatores de risco. Leprosy, an age-old and stigmatizing disease presented in 2018 a global prevalence of 184.212 cases, with Brazil being the second country with the highest number of new cases. Control actions are based on the diagnosis, treatment and surveillance of contacts. However, this disease requires more innovative approaches to real control. It is known that infections caused by parasites as well as micronutrient deficiencies can coexist with leprosy in endemic areas in Brazil. Chronic helminth infections and malnutrition appear to be associated with suppression of the immune response. Thus, it is proposed to determine risk factors associated with leprosy in a study group considering socio-demographic, immunological, hematological, parasitological (S. mansoni) and nutritional variables. Three groups were included, cases (with leprosy PB, MB, n = 79), contacts (asymptomatic, history of living with the patient, n = 97) and negative control (asymptomatic without history of leprosy, n = 81), attended at ESF in Gov. Valadares and Limeira de Mantena. Structured questionnaires were applied and after collection of blood and feces, laboratory tests were carried out to assess serological reactivity (IgG4- Swap), determine the immunological profile, blood count and micronutrient quantification. Different statistical tests were applied for analysis. The low level of education of the participants was highlighted. 75% (33) of the co-infected individuals had a basic level of education and only 7.9% (14) of the control group (contacts and negative control) had higher education. 70% of the individuals in the contact group lived with the patient and 68% of the individuals in the co-infected group were not in the habit of treating drinking water. There was no association between leprosy of the multibacillary clinical form and schistosomiasis, however we found a strong correlation between leprosy and infection by S. mansoni with an aOR of 3.37 comparing the group of cases and controls and even stronger, an aOR of 8, 33 comparing cases and contacts. Probably, our limitation in finding an association between leprosy in the multibacillary form and schistosomiasis is due to the small number of cases with positive BI and also the small number of participants with active schistosomiasis and still presenting low parasitic burden. In the cytokine panel, it was found that IL-10, an immunoregulatory cytokine, was associated with group of infected individuals (S. mansoni) as well as with the co-infected group x negative control (ML stimulus) and mono infected (SE, PHA and ML). IL-4 was also associated with the co-infected x contact (SE) and mono-infected (ML) group. These data reinforce the presence of immunoregulatory and Th2-related cytokines in the co-infected group. Furthermore, through logistic regression, a positive correlation between pro-inflammatory cytokine profile (IL-17, IFN-γ, TNF-α, IL-6 and IL-2) and control group was found. When the group of co-infected and mono-infected was compared, an association of these cytokines with the mono-infected was detected. An association of chemokines IL-8 and IP-10 with the group of mono-infected was observed. Co-infected had inadequate concentrations of vitamin D, and adequate concentrations of vitamin A were observed in the negative control and contact groups. Iron deficiency associated with a poorly diversified diet, together with co-infection, may be the cause of anemia seen in 55% of individuals in the co-infected group who had hematological parameters (red blood cells, hemoglobin and hematocrit) below normal values. We believe that the continuity of these studies and the monitoring of contacts are relevant to better delineate risk factors.

Neste trabalho foram preparados, caracterizados e avaliadas as atividades larvicida e citotóxica dos compostos de inclusão formados entre as benzoilfeniluréias (novaluron - NOV e diflubenzuron - DIF) e avermectina (abamectina - ABA) com β-ciclodextrina (βCD). A presença de alterações nos espectros na região do infravermelho e nos perfis térmicos dos compostos de inclusão em relação aos seus precursores e misturas mecânicas sugeriram a ocorrência de interação entre esses compostos e a βCD. Os dados termodinâmicos obtidos por titulação calorimétrica isotérmica permitiram verificar a formação de compostos de inclusão com estequiometria 1:1, sendo os processos espontâneos e com valores bem distintos para as constantes de formação. As análises dos espectros de ressonância magnética nuclear das amostras sugerem que a inclusão ocorre através do grupo 1,1,2-trifluoro-2-trifluoro-metóxietóxi, do grupo fenila ou do anel benzofurânico para compostos de inclusão com NOV, DIF e ABA, respectivamente. Dados de espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta demonstram que em todos os compostos de inclusão ocorrem alterações no tamanho das partículas em suspensão em relação aos precursores. Além disso, foi possível verificar através do perfil dos gráficos de solubilização que os compostos de inclusão, com exceção do NOV, apresentam maior solubilização quando comparados com as substâncias puras. Com base nas informações da caracterização em suspensão, o sólido caracteriza-se como um nanoprecipitado hidrofóbico instável com possibilidade de agregação. Com relação aos ensaios biológicos foi observado que em todas as análises os valores de dose letal a 50% das larvas de Aedes aegypti (DL50) ou porcentagem de inibição de emergência em 50% de sua população (% IE50) foram menores que 1 ppm, demonstrando a elevada ação inseticida desses compostos. A avaliação da atividade larvicida nos estádios L4 para a benzoilfenilureias e seus compostos de inclusão demonstrou-se pouco efetiva, porém sugeriu a possibilidade de maior atividade larvicida do composto de inclusão com NOV em relação ao seu precursor. Além disso, o teste de inibição de emergência para as benzoilfenilureias possibilitou confirmar o mecanismo de ação desses compostos durante o ciclo de vida do mosquito, verificar a relação direta entre dose e mortalidade, observar atraso no desenvolvimento das fases do mosquito nas amostras tratadas em relação ao controle e constatar a redução do valor de %EI50 para os compostos de inclusão. Nos experimentos nos estádios L1 e L4 para ABA e seu composto de inclusão foi verificada maior fragilidade do estádio L1 em relação ao L4 e a redução da DL50 para o composto de inclusão em todos os experimentos. Esses dados demonstram a maior atividade larvicida dos compostos de inclusão em relação às substâncias livres. Na avaliação de toxicidade através do ensaio do MTT em células de fibroblastos WI26UA4, foi confirmada que NOV e DIF e seus compostos de inclusão apresentaram baixa toxicidade, enquanto que a ABA e seu composto de inclusão apresentaram moderada toxicidade. Também foi verificado que os valores nos quais se observam elevada citotoxicidade em humanos são bem superiores aos necessários para causar a mortalidade das larvas, demonstrando a seletividade e segurança dessas nanocomposições. Desta forma, a estratégia de preparar os compostos de inclusão resultou em um aumento da atividade larvicida em todas as situações testadas, demonstrando que esta pode ser uma alternativa promissora no controle do mosquito Aedes aegypti. In this work the inclusion compounds formed between benzoylphenylureas (novaluron - NOV and diflubenzuron - DIF) and avermectin (abamectin - ABA) with β-cyclodextrin (βCD) were prepared, characterized and evaluated their larvicide and cytotoxic activities. Changes in the infrared spectra and thermal profiles of the inclusion compounds in relation to mechanical mixtures and precursors suggested the occurrence of interaction between those compounds and the βCD. Thermodynamic data obtained by isothermal titration calorimetry allowed verifying the formation of inclusion compounds with stoichiometry 1: 1, and the spontaneous processes and distinct values for the formation constant. The analysis of the nuclear magnetic resonance spectra of the samples suggests that inclusion via 1,1,2-trifluoro-2-trifluoromethoxy- ethoxy group, the phenyl group, or benzofuran ring for inclusion compounds with NOV, DIF and ABA, respectively. The dynamic light scattering and zeta potential data from inclusion compounds demonstrated changes in the size of the particles in suspension in relation to precursors. Moreover, it was possible to verify by solubilization curves that inclusion compounds have greater solubility compared with the pure substances, except of NOV. Based on suspension data, the solid is characterized as an unstable hydrophobic nanoprecipitated with possibility of aggregation. In relation to biological assays, the lethal dose values to 50% of the larvae of Aedes aegypti (LD50) or emergency inhibition percentage at 50% of its population (% IE50) were less than 1 ppm for all compounds, demonstrating the high insecticidal activity of them. The evaluation of larvicidal activity in the L4 stage to benzoylphenylureas and their inclusion compounds proved to be ineffective, suggesting a probable increase in the larvicidal activity of the inclusion compound with NOV compared to its precursor. Furthermore, the emergence inhibition assay for benzoylphenylureas allowed to confirm the mechanism of action of these compounds during the mosquito’s life cycle, to verify direct relationship between dose and mortality; to observe the delay in the development stage of mosquitoes in the samples treated compared to control, and, to verify the reduction in % EI50 values for inclusion compounds. In the experiments realized in L1 and L4 stadia for ABA and its inclusion compound, it was verified a more fragility L1 stadium with respect to L4 and a reduction of LD50 values for the inclusion compounds in all experiments. These data demonstrate the highest larvicidal activity of inclusion compounds in relation to the free substances. In the evaluation of toxicity using the MTT assay WI26UA4 fibroblast cells it was confirmed that NOV and DIF and their inclusion compounds showed low toxicity, while the ABA and its inclusion compound showed moderate toxicity. It was also observed that the values to generate cytotoxicity in humans are much higher than those required to cause larval mortality, demonstrating the selectivity and safety of nano composition. Thus, the strategy for preparing the inclusion compound resulted in an increase in larvicidal activity in all situations tested, demonstrating that this may be a promising alternative for the control of Aedes aegypti.