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Orientador : Wanderley Dias da Silveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado Genética Mestre em Ciências Biológicas

Agradecimentos: This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (15/02395-8) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (141298/2017-0). The authors thank the Centroflora group for their assistance in the collection of passionflower leaves, as well as to Ph.D. Glyn Maria Figueira of the Agricultural, Biological and Chemical Research Center (University of Campinas) for the expertise on the biology of the plant Abstract: Plants and endophytic microorganisms have coevolved unique relationships over many generations. Plants show a specific physiological status in each developmental stage, which may determine the occurrence and dominance of specific endophytic populations with a predetermined ecological role. This study aimed to compare and determine the structure and composition of cultivable and uncultivable bacterial endophytic communities in vegetative and reproductive stages (RS) of Passiflora incarnata. To that end, the endophytic communities were assessed by plating and Illumina-based 16S rRNA gene amplicon sequencing. Two hundred and four cultivable bacterial strains were successfully isolated. From the plant’s RS, the isolated strains were identified mainly as belonging to the genera Sphingomonas, Curtobacterium, and Methylobacterium, whereas Bacillus was the dominant genus isolated from the vegetative stage (VS). From a total of 133,399 sequences obtained from Illumina-based sequencing, a subset of 25,092 was classified in operational taxonomy units (OTUs). Four hundred and sixteen OTUs were obtained from the VS and 66 from the RS. In the VS, the most abundant families were Pseudoalteromonadaceae and Alicyclobacillaceae, while in the RS, Enterobacteriaceae and Bacillaceae were the most abundant families. The exclusive abundance of specific bacterial populations for each developmental stage suggests that plants may modulate bacterial endophytic community structure in response to different physiological statuses occurring at the different plant developmental stages CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Aberto

Orientador: Wanderley Dias da Silveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Bactérias do ¿gênero¿ Shigella spp. apresentam-se como bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, imóveis, não formam esporos e pertencem à família Enterobacteriaceae. De acordo com testes de aglutinação com anti-soros específicos, estas bactérias são classificadas em quatro sorogrupos: Sorogrupo A (Shigella dysenteriae), Sorogrupo B (Shigella flexneri), Sorogrupo C (Shigella boydii) e Sorogrupo D (Shigella sonnei). Estas bactérias são responsáveis pela Shiguelose ou Disenteria Bacilar enfermidade endêmica que anualmente acomete milhões de pessoas em todo o mundo, sendo que mais de 70% de todos os casos ocorrem em crianças de 1 até 5 anos de idade, possuindo grande importância epidemiológica devido à alta morbi-mortalidade. Os principais determinantes de patogenicidade neste grupo bacteriano são: o plasmídio de alto peso molecular, que determina o fenótipo invasivo desta espécie; genes cromossômicos, que regulam a expressão dos genes de virulência no plasmídio e a produção de uma exotoxina que atua destruindo a barreira de células epiteliais. No Brasil, até então, não foram encontrados trabalhos publicados que comparem as diferentes amostras bacterianas de Shigella spp. isoladas de casos de Shiguelose, relacionando suas características biológicas e estrutura clonal. Sendo assim, neste trabalho, estudamos as características biológicas (sorotipagem, perfil de resistência a antimicrobianos, adesão e invasão, análise do perfil de DNA plasmidial) de diferentes amostras de Shigella spp. relacionando-as através de técnicas de Biologia Molecular (ERIC-PCR, REPPCR e DRE-PCR) permitindo, assim, determinar a clonalidade epidemiológica destas. As amostras de Shigella spp. foram isoladas de diferentes surtos, de diversas cidades das regiões de Campinas e de São João da Boa Vista, e pertencem à coleção do Instituto Adolfo Lutz de Campinas Abstract: Shigella spp are gram-negative, anaerobic facultative, non-motile, and non-sporulated bacilli of the Enterobacteriaceae family, responsible for ¿Shigellosis¿ or the Bacillary Dysentery (BD) disease, an important cause of worldwide morbidity and mortality. The pathogenic determinants of Shigella spp include high molecular weight plasmids responsible for the bacterial invasive capacity, as well as chromosomal genes encoding for different pathogenic, factors such as exotoxins that destroy epithelial host cells. Little is known about the antibiotic resistance profiles and the population structure of Shigella species isolated from humans in Brazil. In this work, we have studied the antibiotic resistance profiles and the clonal structure of Shigella strains isolated from humans in different cities located in the region of Campinas, a city in the state of São Paulo, Brazil. We have also related the antibiotic resistance of these strains with the bacterial clonal groups determined by the molecular techniques ERIC, REP, and DRE-PCR. Our data indicate that many strains of S. flexneri and S. sonnei are multiresistant, and our results also support the circulation of specific clones among the cities. These data indicate that the human sanitary conditions in the cities analyzed herein should be improved. Doutorado Microbiologia Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gilson Paulo Manfio, Valeria Maia de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Trinta linhagens de bactérias acidotermofílicas isoladas do processamento industrial de suco de laranja concentrado congelado (Frozen Concentrated Orange Juice, FCOJ) em diferentes regiões do estado de São Paulo foram estudadas, utilizando-se uma abordagem polifásica, a fim de se determinar a diversidade e potencial deteriogênico destas em processos de produção de FCOJ no país. A caracterização dos isolados envolveu a determinação da capacidade de crescimento e produção de odor em suco reconstituído, análises fenotípicas (padrão de utilização de carboidratos, sistema API 50 CH), quimiotaxonômicas (perfil de FAMES, sistema MIDI) e de caracterização molecular (ARDRA de região espaçadora DNAr 16S-23S com Hae III, Hha I e Msp I, e análise filogenética de DNAr 16S). Todos os isolados foram identificados como pertencentes ao gênero Alicyclobacillus pelos padrões característicos de ácidos graxos. Diferentemente de relatos de literatura, foi confirmada a presença de omega-ciclohexil-C17:0 e omega-ciclohexil-C19:0 em amostras identificadas como A. pomorum. Das 30 amostras ambientais de aliciclobacilos analisadas, 21 foram capazes de se multiplicar em suco de laranja reconstituído após 24 ou 48 h de incubação a 45 °C, mas apenas 10 produziram odor característico de biodeterioração. Seis ribotipos de ARDRA foram obtidos para os isolados, permitindo a alocação destes nas espécies A. acidocaldarius e A. acidoterrestris, e em grupos relacionados a espécies válidas designados como A. acidocaldarius-like e A. pomorum-like Abstract: Thirty strains isolated from industrial processing of frozen concentrated orange juice (FCOJ) in different regions of the state of São Paulo were studied using a polyphasic approach with the goal of determining the diversity and deteriogenic potential of isolates from FCOJ production in Brazil. Characterization of isolates involved determining their ability to grow and produce odor in reconstituted orange juice, and phenotypic (carbohydrate utilization, API 50 CH), chemotaxonomic (FAMES, MIDI system) and molecular analyses (ARDRA of 16S-23S rDNA spacer region, Hae III, Hha I and Msp I, and 16S rDNA phylogenetic analysis). All isolates were identified as Alicyclobacillus spp. according to the characteristic fatty acid patterns. Contrary to literature data, omega-cyclohexyl-C17:0 and omega-cyclohexyl-C19:0 were confirmed in samples identified as A. pomorum. From the 30 environmental alicyclobacili samples analyzed, 21 were able to grow in reconstituted orange juice after 24 or 48 hs incubation at 45 °C, but only 10 isolates yielded a characteristic biodeterioration odor. Six ARDRA patterns were obtained for the isolates analyzed, enabling them to be assigned to A. acidocaldarius and A. acidoterrestris, and to groups related to valid species named A. acidocaldarius-like and A. pomorum-like Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O vírus da Hepatite C (família Flaviviridae, gênero Hepacivirus) é causador de infecções crônicas em humanos, que podem evoluir para quadros de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. Até o momento, não há vacina disponível contra essa infecção e o tratamento disponível é caro, tem eficácia limitada e gera uma vasta gama de efeitos secundários, o que dificulta a continuidade do tratamento. Como esse vírus não replica eficientemente em cultura de células e em animais, o vírus da diarréia viral bovina é utilizado como modelo substituto para ensaios de avaliação de atividade antiviral e em ensaios de mecanismo de ação. A partir de invertebrados e micro-organismos marinhos, foram preparados extratos e frações, e algumas substâncias foram isoladas para a avaliação da sua possível atividade antiviral. Dos 422 testados, 5% foram considerados promissores e, destes, 20% mostraram-se ativos apresentando uma proteção de mais de 97% às células frente ao vírus. Os melhores resultados foram obtidos dos extratos produzidos a partir das amostras de esponjas Hyrtios sp. (BA07ES-56: PI=99%, IS=25), Aaptos sp. (BA07ES-59: PI=99%, IS=8,25) e de bactérias Bacillus sp. (555: PI=98%, IS>18; 584: PI=98%, IS=27) isoladas da esponja Petromica citrina. Os extratos e compostos promissores foram capazes de atuar em diversas etapas do ciclo replicativo viral (adsorção, penetração, etapas intracelulares do ciclo replicativo e também inativação da partícula viral), levando à sua interrupção quase completa nas condições analisadas. Desse modo, diversas substâncias presentes nesses organismos estudados são ativas e podem levar ao desenvolvimento de fármacos que garantam uma terapia alternativa para o tratamento da hepatite C Abstract: The Hepatitis C virus (family Flaviviridae, genus Hepacivirus) causes chronic infections in humans, which can develop to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. This represents a major public health problem worldwide. To this moment, there is no vaccine available against this infection and the treatment available is expensive, has limited efficacy and generates a wide range of side effects, making it difficult to continue the treatment. All this reflects the need to seek new agents with antiviral action against this virus. As this virus does not replicate efficiently in cell culture and in animals, bovine viral diarrhea virus is used as a surrogate model for screening assays of antiviral activity, and mechanism of action assays. From marine invertebrates and micro-organisms isolated from them, extracts and fractions were prepared, and substances were isolated for assessment of their possible antiviral activity. Of the 422 tested, 5% were considered promising, and of these, 20% were active presenting a protection percentage of more than 97%. The best results were obtained from the extracts produced from the samples of sponge Hyrtios sp. (BA07ES-56: IP=99%, SI=25), Aaptos sp. (BA07ES-59: IP=99%, SI=8,25) and bacteria Bacillus sp. (555: IP=98%, SI>18; 584: IP=98%, SI=27) isolated from the sponge Petromica citrina. The promising extracts and compounds acted in several stages of viral replicative cycle (adsorption, penetration, intracellular steps of the replicative cycle and also inactivation of the viral particle). Thus, various substances are active and may lead to the development of drugs which ensure an alternative therapy for the treatment of hepatitis C Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O ambiente marinho representa uma importante fonte de diversidade biológica com grande potencial para descoberta de novos metabólitos secundários biologicamente ativos. Dentro desse ambiente, pode-se destacar os actinomicetos marinhos, cujos estudos podem contribuir para a melhor compreensão de suas funções ecológicas e para seu uso como uma fonte importante de novos metabólitos. A taxonomia dos actinomicetos é bastante complexa e a metodologia de MLSA, ferramenta alternativa em estudos de sistemática microbiana, pode ser uma técnica importante na caracterização de actinomicetos. Novos metabólitos secundários tem sido isolados de actinomicetos marinhos, sendo as atividades antibacteriana e anticâncer as principais descritas,porém pouco se conhece sobre a atividade antiviral deste grupo de micro-organimos. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade de actinomicetos associados ao ambiente marinho, utilizando uma abordagem polifásica, associada à avaliação das atividades antimicrobiana e antiviral destas bactérias. No total, foram obtidos 579 isolados de bactérias oriundos de macro-organismos marinhos coletados no litoral norte do Estado de São Paulo, Brasil. Desses, 72 foram identificados por análise de sequência do gene RNA ribossomal 16S, como actinomicetos, e nove isolados foram descritos como novas espécies de actinobactérias pertencentes aos gêneros Gordonia (B204), Marmoricola (B374), Williamsia (B138, B375 e B452), Serinicoccus (B736), Kineococcus (B366), Knoellia (B175) e Janibacter (B742). A caracterização polifásica dessas novas espécies de actinobactérias foi realizada pela técnica de hibridação DNA-DNA, Multilocus Sequence Analysis (MLSA) utilizando genes conservados (rpoB, rpoA, gyrB, recA e trpB), análise de perfil de ácidos graxos e microscopia eletrônica. A caracterização dos isolados foi complementada por testes fisiológicos e quimiotaxonômicos, tais como a determinação do conteúdo de GC, lipídios polares, menaquinonas, testes de utilização de fontes de carbono, atividade enzimática, degradação de compostos e tolerância a antibióticos, pH e temperatura. Quanto ao potencial biotecnológico dos 72 isolados de actinobactérias avaliados, 16 isolados apresentaram potencial antimicrobiano e 13 potencial antiviral. Os extratos dos isolados B175 (CIM = 1 mg/mL), B375 (CIM = 2 mg/mL), B138 (CIM = 1 mg/mL) e B366 (CIM = 2 mg/mL) apresentaram atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus ATCC 6538. O extrato do isolado B374 apresentou atividade antiviral frente ao vírus Metapneumovírus aviário (aMPV), os isolados B366 e B742, frente ao herpes vírus simplex do tipo 1 (HSV-1), os isolados B138 e B452 frente ao vírus Calicivírus Felino (FCV) e o isolado B204 frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV). A partir deste trabalho, pode-se concluir que existe grande diversidade de micro-organismos marinhos a ser descoberta e explorada, como fonte de novas espécies e compostos com potencial biotecnológico Abstract: O ambiente marinho representa uma importante fonte de diversidade biológica com grande potencial para descoberta de novos metabólitos secundários biologicamente ativos. Dentro desse ambiente, pode-se destacar os actinomicetos marinhos, cujos estudos podem contribuir para a melhor compreensão de suas funções ecológicas e para seu uso como uma fonte importante de novos metabólitos. A taxonomia dos actinomicetos é bastante complexa e a metodologia de MLSA, ferramenta alternativa em estudos de sistemática microbiana, pode ser uma técnica importante na caracterização de actinomicetos. Novos metabólitos secundários tem sido isolados de actinomicetos marinhos, sendo as atividades antibacteriana e anticâncer as principais descritas,porém pouco se conhece sobre a atividade antiviral deste grupo de micro-organimos. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade de actinomicetos associados ao ambiente marinho, utilizando uma abordagem polifásica, associada à avaliação das atividades antimicrobiana e antiviral destas bactérias. No total, foram obtidos 579 isolados de bactérias oriundos de macro-organismos marinhos coletados no litoral norte do Estado de São Paulo, Brasil. Desses, 72 foram identificados por análise de sequência do gene RNA ribossomal 16S, como actinomicetos, e nove isolados foram descritos como novas espécies de actinobactérias pertencentes aos gêneros Gordonia (B204), Marmoricola (B374), Williamsia (B138, B375 e B452), Serinicoccus (B736), Kineococcus (B366), Knoellia (B175) e Janibacter (B742). A caracterização polifásica dessas novas espécies de actinobactérias foi realizada pela técnica de hibridação DNA-DNA, Multilocus Sequence Analysis (MLSA) utilizando genes conservados (rpoB, rpoA, gyrB, recA e trpB), análise de perfil de ácidos graxos e microscopia eletrônica. A caracterização dos isolados foi complementada por testes fisiológicos e quimiotaxonômicos, tais como a determinação do conteúdo de GC, lipídios polares, menaquinonas, testes de utilização de fontes de carbono, atividade enzimática, degradação de compostos e tolerância a antibióticos, pH e temperatura. Quanto ao potencial biotecnológico dos 72 isolados de actinobactérias avaliados, 16 isolados apresentaram potencial antimicrobiano e 13 potencial antiviral. Os extratos dos isolados B175 (CIM = 1 mg/mL), B375 (CIM = 2 mg/mL), B138 (CIM = 1 mg/mL) e B366 (CIM = 2 mg/mL) apresentaram atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus ATCC 6538. O extrato do isolado B374 apresentou atividade antiviral frente ao vírus Metapneumovírus aviário (aMPV), os isolados B366 e B742, frente ao herpes vírus simplex do tipo 1 (HSV-1), os isolados B138 e B452 frente ao vírus Calicivírus Felino (FCV) e o isolado B204 frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV). A partir deste trabalho, pode-se concluir que existe grande diversidade de micro-organismos marinhos a ser descoberta e explorada, como fonte de novas espécies e compostos com potencial biotecnológico Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2009/13778-4

Orientador: Wanderley Dias da Silveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A bactéria Escherichia coli coloniza o trato intestinal de aves e humanos, de maneira comensal sem causar processos infecciosos. No entanto alguns clones adquiriram fatores de virulência específicos, permitindo o desenvolvimento de diferentes doenças como infecção do trato urinário, diarréia e meningite em humanos e colibacilose em aves. As linhagens que causam doença em aves são tipicamente denominadas APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). Neste trabalho foram sequenciados e anotados os genomas de quatro linhagens APECs (SCI-07, SEPT362, S17 e O8)que, juntamente com mais nove genomas referentes a linhagens de Escherichia coli patogênicas para aves e patogênicas para humanos foram utilizados para a busca de genes sob seleção positiva. Os genes homólogos foram agrupados,e posteriormente submetidos ao alinhamento de códons e das sequencias protéicas correspondentes. Uma árvore filogenética foi gerada para cada grupo de proteínas homólogas. Testes estatísticos determinaram qual entre os modelos de seleção neutra ou seleção positiva melhor explicou os dados existentes (alinhamentos de códons e árvores filogenéticas). Essas análises detectaram duzentas e cinquenta e quatro grupos de genes homólogos com evidência de seleção positiva. Para cada grupo foi realizado um teste de recombinação para verificar se o aumento na variação das sequencias não era devido à conversão gênica, resultando em cento e dezesseis grupos de genes homólogos sob seleção positiva. A proteína correspondente a um gene de cada grupo de genes homólogos foi identificada, por meio da ferramenta Blast. Diversos fatores de virulência, já conhecidos, e proteínas regulatórias puderem ser detectados. Os genes sob seleção positiva, também foram submetidos à anotação considerando o termo GO (Gene Ontology),apenas da categoria processo biológico. Dos cento e dezesseis genes apenas cinquenta e sete puderam ser identificados por meio dessa metodologia. O resultado da classificação dos genes dentro da classe GO, considerando o terceiro nível hierárquico,mostrou que a maioria dos genes anotados (31) tinha relação com o metabolismo primário.As proteínas cuja identificação, por meio do blast, não foi possível (proteínas hipotéticas)foram submetidas à análise de predição de localização subcelular e de peptídeo sinal. Essas análises revelaram que três proteínas desconhecidas (hypothetical proteinECIAI39_1028, hypothetical proteinZ0639e hypothetical proteinEC042_3791) são potenciais alvos para estudos que visam à busca de novos fatores de virulência de Escherichia coli patogênicas Abstract: The bacterium Escherichia coli colonizesthe intestinal tract of birds and humans, in a commensal relationship without causing infection. However, some clones have acquired specific virulence factors allowing the development of various diseases such as urinary tract infection, diarrhea and meningitis in humans and colibacillosis in poultry. The strains that cause disease in birds are typically named APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). In this study we sequenced and annotated the genomes of four APECs strains (SCI-07, SEPT362, S17 and O8). These genomes and nine others avian pathogenic Escherichia coli and humans pathogenic strains genomes were used for studying genes under positive selection. The homologous genes were grouped and then subjected to codons and corresponding protein sequences alignment. A phylogenetic tree was generated for each group of homologous proteins. Statistical tests determined which among neutral or positive selection models best explains the existing data (codon alignments and phylogenetic trees). This analyzes detected two hundred fifty-four groups of homologous genes with positive selection evidence. For each group a recombination test was conducted to verify if the variation increase in the sequences was not due to gene conversion, resulting in one hundred and sixteen groups of homologous genes under positive selection. The protein corresponding to a gene of each group of homologous genes under positive selection was identified through Blast tool. Genes under positive selection were annotated considering the GO term (Gene Ontology), just for the biological process category. Only fifty-seven genes could be identified using this methodology. The gene classification within the GO classes, considering only the third hierarchical level showed that most of the annotated genes (31) were related with the primary metabolism. Proteins which blast identification was not possible (hypothetical proteins) were subjected to sub cellular localization and signal peptide prediction analyzes. These analyzes revealed that three unknown proteins (hypothetical protein ECIAI39_1028, hypothetical protein Z0639e hypothetical protein EC042_3791) are potential targets for studies, in order to search for new virulence factors of pathogenic Escherichia coli Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Marta Cristina Teixeira Duarte, Priscilla Efraim Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Durante o processamento primário, amêndoas de cacau passam por uma série de etapas de manipulação que possibilitam a contaminação por micro-organismos transmissores de doenças de origem alimentar, gerando risco à saúde dos consumidores. A irradiação gama por Cobalto-60 é uma forma eficaz de eliminar a carga bacteriana em alimentos. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da irradiação gama sobre as características microbiológicas, no que diz respeito à presença de fungos e Salmonella spp., e sobre as propriedades físico-químicas de amostras de amêndoas de cacau. Amostras de cacau (N=31) foram tratadas com três doses de irradiação gama, ou seja, 2, 3 e 5 kGy, e analisadas quanto à porcentagem de contaminação fúngica por plaqueamento direto, enquanto a presença de Salmonella spp foi determinada pelo método de PCR. Os resultados mostraram uma diminuição significativa (p

Orientadores: Fabiana Fantinatti Garboggini, Suzan Pantaroto de Vasconcellos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Bactérias e fungos têm sido largamente explorados devido às suas habilidades em produzir uma grande variedade de enzimas, entre elas, as celulases que se destacam devido ao seu potencial em degradar materiais lignocelulósicos em açúcares fermentáveis, que podem então ser convertidos, por exemplo, em biocombustíveis. O presente trabalho visou a bioprospecção de bactérias isoladas a partir do processo de compostagem realizado pela Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), quanto à produção de enzimas celulolíticas, além da caracterização taxonômica das linhagens de interesse. Para tanto, os micro-organismos oriundos do processo de compostagem da FPZSP foram isolados, preservados e caracterizados macroscopicamente. Dentre as linhagens isoladas, 168 foram testadas numa triagem qualitativa para a produção de celulases, obtendo-se 135 micro-organismos com potencial celulolítico evidenciado pela formação de halos de hidrólise em meio de cultura contendo carboximetilcelulose. Destes, 10 linhagens apresentaram halos translúcidos com diâmetros entre 1,3 cm e 1,9 cm, as quais foram avaliadas quanto a atividade celulotíca em ensaios quantitativos monitorados durante 7 dias, em duas condições de pH distintas: 4,8 e 7,4. Os melhores tempos de incubação verificados foram de sete e cinco dias para os valores de pH 4,8 e 7,4, respectivamente. Em seguida, foram selecionados linhagens para os ensaios de delineamento experimental e otimização das atividades enzimáticas. No planejamento P&B, a melhor atividade celulolítica verificada foi de 3,6392 FPU/mL obtida a partir da linhagem FPZSP 143, no pH 4,8. Esta linhagem foi então selecionada e o planejamento do tipo Delineamento Composto Central Rotacional ¿ DCCR aplicado, promovendo dessa maneira, um aumento 0,4574 FPU/mL em relação ao experimento do planejamento anterior. Posteriormente, o experimento foi validado e o resultado máximo alcançado para atividade celulolítica da linhagem FPZSP 143 foi de 4,6435 FPU/mL. Cinco linhagens selecionadas com atividade celulolítica foram identificadas por análise de sequências do gene RNA ribossomal 16S como membros do gênero Bacillus, bactérias frequentemente encontradas em ambientes da compostagem e que tem sido largamente reportada como produtoras de enzimas celulolíticas. O processo de compostagem demonstrou ser um ambiente em potencial para a produção de celulases de interesse para diversos ramos da indústria, sendo os representantes do gênero Bacillus os melhores produtores de enzimas celulolíticas. Embora as bactérias tenham sido isoladas de um ambiente com pH em torno de 7,4, há um potencial para a produção de celulases em pH mais ácidos, evidenciando sua aplicabilidade em diferentes condições. Essa característica torna-se relevante quando se leva em consideração os processos industriais, onde uma condição diferente e específica é exigida em cada processo, tornando as enzimas celulolíticas oriundas de processo de compostagem grandes aliadas no desenvolvimento e otimização de processos industriais Abstract: Bacteria and fungi have been extensively explored due to their ability to produce a variety of enzymes, including the cellulases that stand out because of their potential to degrade lignocellulosic materials to fermentable sugars, which can then be converted, for example, in biofuels. The present work aimed bioprospecting of bacteria isolated from the composting process conducted by Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), for the production of cellulolytic enzymes and the taxonomic characterization of strains of interest. For both, the microorganisms derived from the composting process of FPZSP were isolated, preserved and characterized macroscopically. Among the isolates, 168 were tested for production in a qualitative screening of cellulases, obtaining 135 cellulolytic microorganisms with potential evidenced by the formation of halos of hydrolysis in culture medium containing carboxymethylcellulose. These, 10 strains showed translucent halos with diameters between 1.3 cm and 1.9 cm, which were evaluated for activity in cellulolytic quantitative assays monitored for 7 days under two different pH conditions: 4.8 and 7.4. The best times of incubation recorded were seven and five days to pH 4.8 and 7.4, respectively. Then, strains for testing experimental design and optimization of enzymatic activities were selected. In Planning P&B, the best cellulolytic activity verified was 3.6392 FPU/mL obtained from FPZSP 143, at pH 4.8. This strain was selected and the DCCR applied, thus promoting an increase of 0.4574 FPU/mL compared to the previous experiment planning. Subsequently, the experiment was validated and the maximum score achieved for cellulolytic activity FPZSP 143 strain was 4.6435 FPU/mL. Five strains with cellulolytic activity were identified by sequence analysis of the 16S ribosomal RNA gene as members of the genus Bacillus, bacteria frequently encountered in composting environments and has been widely reported as producing cellulolytic enzymes. The composting process proved to be a potential environment for the production of cellulases of interest for various branches of industry, being the representatives of the genus Bacillus the best producers of cellulolytic enzymes. Although bacteria have been isolated from an environment with a pH around 7.4, there is a potential for the production of cellulases in more acidic pH, indicating their applicability in different conditions. This feature becomes important when one takes into account the industrial processes, where a different and specific condition is required in each case, making the cellulolytic enzymes derived from composting process a good allied in developing and industrial process optimization Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcelo Lancellotti Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia Resumo: Neisseria meningitdis, ou meningococo, é uma bactéria comensal da nasofaringe humana. Contudo, algumas linhagens meningocócicas ocasionalmente ultrapassam a mucosa respiratória e a barreira hematoencefálica e causam enfermidades como meningite e septicemia. Como a espécie humana é o único hospedeiro natural para esse patógeno, estudos in vitro com modelos celulares são uma ferramenta importante para a análise da interação entre o meningococo e seu hospedeiro. Este trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes linhagens de N. meningitidis na adesão celular, morfologia e expressão de quimiocinas inflamatórias em culturas in vitro de células humanas. Tais parâmetros também foram avaliados em um sistema in vitro de co-cultura celular entre células de origem nervosa e endotelial a fim de mimetizar a barrreira hematoencefálica humana. Os resultados obtidos indicam que a adesão de diferentes linhagens bacterianas em células humanas de sítios específicos do processo infeccioso do meningococo, como Hep-2 (laringe), NCIH460 (pulmão), Hec1b (endotelial) e NG97 (neuroglia) foi capaz de mimetizar o processo fisiopatológico deste microrganismo. Em condições in vitro, células de origem nervosa mostraram-se mais suscetíveis à infecção nos parâmetros avaliados como uma elevada expressão de TNF-?, quimiocina característica em infecções meningocócicas. A linhagem B4 destacou-se entre as linhagens meningocócicas estudadas, apresentando elevados percentuais de adesão em células humanas com valor máximo de adesão em NG97. Células HEp-2 apresentaram poucas alterações morfológicas significativas frente à infecção por N. meningitidis. Tais resultados podem estar associados ao fato do trato respiratório superior ser o habitat natural do meningococo, no qual a interação entre este patógeno e as células hospedeiras seja comensal e não-invasiva. O modelo mimético de barreira hematoencefálica, realizado em transwell, indicou comunicação entre as células que o compõem e uma maior expressão dos níveis de quimiocinas inflamatórias quando comparada à infecção desta bactéria por cada uma das células estudadas isoladamente. Tal modelo foi capaz de mimetizar a barreira hematoencefálica, fato o que torna possível sua aplicação em estudos da passagem de fármacos e outros patógenos por essa barreira. Abstract: Neisseria meningitidis,or meningococci, is a commensal bacterium of the human nasopharynx. However, occasionally some meningococcal strains can cross the respiratory mucosa and the blood-brain barrier and cause life-threatening diseases such as meningitis and septicaemia. Since the human species is the only natural host for this pathogen, in vitro studies with cellular models are an important tool for the analysis of the meningococci and its host. The aim of this present work was to value the influence of several strains of N. meningitidis in cellular adhesion, morphology and inflammatory chemokines expression in human cells cultivated in vitro. These parameters were also evaluated in a co-cultivated cellular system with glial and endothelial cells aiming mimicking the human blood brain barrier. The results indicate that the adhesion of different bacterial strains from specific sites of infectious process of meningococci as Hep-2 (larynges), NCIH460 (lung), Hec1b (endothelial) and NG97 (glial cells) was capable of mimicking, partially, the pathophysiology of this microorganism. In in vitro conditions, cells from nervous origin showed more susceptibility to infection then others in this evaluated parameters such as a high TNF-? expression, a common chemokine in meningococcals diseases. The B4 strain distinguished from the others by presenting high rates of adhesion in human cells with maximum value on NG97. HEp-2 cells showed few expressives morphologic alterations after meningococcal infection. These results may be associated with the fact that the upper human respiratory tract is the meningoccci natural habitat, in which the interaction between this pathogen and host cells are commensal and not-invasive.The mimicking blood-brain barrier model, performed in transweel, has demonstrated some communication between the cells and greater expression of inflammatory chemokines when compared to the infection in isolated cells. This model was capable of mimicing the blood-brain barrier, which makes its application possible in studies of drugs and others pathogens who might crossover though this barrier. Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fabiana Fantinatti-Garboggini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Nas últimas décadas um grande número de compostos de interesse biotecnológico, como por exemplo, citotoxinas, agentes antifúngicos, antimicrobianos, antivirais e anticancerígenos têm sido isolados de esponjas marinhas. Entretanto, estudos comprovam que, em muitos casos, os compostos ativos desses animais são oriundos de micro-organismos associados, que podem compor até 60% do volume tecidual das esponjas. A presente proposta teve por objetivo a caracterização taxonômica da diversidade de bactérias cultiváveis associadas às esponjas coletadas no litoral norte do estado de São Paulo, Brasil, e a avaliação da atividade antimicrobiana a partir de extratos orgânicos brutos dessas bactérias. Um total de 86 bactérias foi recuperado das esponjas Axinella corrugata, Dragmacidon reticulata, Chelonaplysilla erecta e Petromica citrina utilizando diferentes meios de cultivo. A diversidade das bactérias foi caracterizada utilizando dados de morfologia, ARDRA (Amplified Ribossomal Restriction Analysis) e sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S, cuja análise permitiu a identificação de membros pertencentes aos filos Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes e Firmicutes num total de 15 gêneros distintos. O gênero Pseudovibrio foi o único presente em todas as esponjas amostradas, e os gêneros Bacillus, Ruegeria, Vibrio, Staphylococcus e Erythrobacter estavam presentes em mais de uma esponja. A esponja Dragmacidon reticulata apresentou a maior diversidade bacteriana, englobando oito diferentes gêneros, dentre eles, um representate do gênero Cyclobacterium, o qual até onde se sabe, foi isolado pela primeira vez de uma esponja marinha. O gênero Bacillus esteve presente em três esponjas, mas na Petromica citrina, endêmica do Brasil, o gênero ficou representado em 74% dos isolados obtidos. Este estudo foi o primerio relato sobre a diversidade de bactérias cultiváveis da esponja Petromica critrina. Todos os isolados foram avaliados quanto à presença ou ausência dos fragmentos dos genes PKS (Polyketide Synthases) e NRPS (Non Ribossomal Peptide Synthetases), visando à investigação do potencial biotecnológico das bactérias, e mais da metade delas apresentaram pelo menos um dos genes estudados. Uma triagem da atividade antimicrobiana utilizando o método da difusão em bloco de ágar demonstrou que 21 isolados foram promissores para produção de antimicrobianos. Destes isolados foram obtidos os extratos orgâncios brutos, os quais foram testados quanto à determinação da concentração inibitória mínima contra oito micro-organismos indicadores. Um total de 13 extratos orgânicos brutos, em sua maioria respresentantes do gênero Bacillus, demonstraram ação contra o micro-organismo Bacillus subtilis ATCC 6051 e um deles demonstrou ação contra o micro-organismo Escherichia coli ATCC 11775. A numerosa inibição de estirpes de Bacillus por outros Bacillus sugere que a atividade possa ser gerada por bacteriocinas, polipeptídeos produzidos pela via ribossomal que atuam na inibição de crescimento de grupos próximos de micro-organismos. Sua possível função no meio ambiente é prover vantagem seletiva através da eliminação de um competidor relativamente próximo. Ainda, um representante do gênero Exiguobacterium apresentou atividade antimicrobiana contra B. subtilis, resultado este não descrito até o presente na literatura Abstract: In recent decades a large number of compounds of biotechnological interest, such as cytotoxins, antifungal, antimicrobial, antiviral and anticancer substances have been isolated from marine sponges, however, studies show that, in many cases, the active compounds are actually produced by associated microorganisms, which can comprise up to 60% of the volume of sponge tissue. This proposal aimed to characterize the taxonomic diversity of culturable bacteria associated with sponges collected in the northern coast of São Paulo, Brazil, and to evaluate the antimicrobial activity from crude organic extracts of these bacteria. A total of 86 bacteria were recovered from sponges the Axinella corrugata, Dragmacidon reticulata, Petromica citrina and Chelonaplysilla erecta using different culture media. The diversity of bacteria was characterized using data from morphology, ARDRA (Amplified Ribossomal Restriction Analysis) and sequencing of 16S ribosomal RNA gene, whose analysis allowed the identification of members belonging to the phyla Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes, in a total of 15 distinct genera. The genus Pseudovibrio was the only one present in all sponges sampled, and the genera Bacillus, Ruegeria, Vibrio, Staphylococcus and Erythrobacter were present in more than one sponge sampled. The sponge Dragmacidon reticulata showed the highest bacterial diversity, encompassing eight different genera, among which the genus Cyclobacterium, which, as far as is known, was first isolated from a marine sponge. The genus Bacillus was present in three sponges, but in Petromica citrina, endemic to Brazil, the genus accounted for 74% of the isolates. This study was the first report on the diversity of culturable bacteria from the sponge Petromica critrina. All isolates were evaluated for the presence or absence of NRPS (non ribossomal peptide synthetases) and PKS (polyketide synthase) genes in order to investigate the biotechnological potential of bacteria, and over half of the isolates had at least one of these genes. A screening of antimicrobial activity using the diffusion agar disk method showed that 21 isolates were promising for the production of antibiotics. Crude organic extracts from these isolates were produced and tested against eight indicator microorganisms to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). A total of 13 crude organic extracts, most of the genus Bacillus, showed inhibitory activity against the microorganism Bacillus subtilis ATCC 6051, and one of them showed activity against the microorganism Escherichia coli ATCC 11775. The large inhibition of Bacillus strains to other Bacillus strains suggests that the activity can be generated by bacteriocins produced through ribosomal polypeptides that inhibit close groups of microorganisms. Its possible role in the environment is to provide a selective advantage by eliminating a relatively close competitor. Still, a representative of the genus Exiguobacterium showed antimicrobial activity against B. subtilis, which was not described in the literature up to date Mestrado Microbiologia Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcelo Brocchi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: "Salmonella enterica" é um patógeno geralmente adquirido por meio do consumo de alimentos contaminados com essa bactéria. Pode causar gastroenterite e bacteremia em humanos, também sendo capaz de infectar diversos outros animais como répteis, aves, mamíferos e ainda sobreviverem em diversos ambientes. S. enterica é um bastonete Gram-negativo, não formador de esporo, anaeróbio facultativo, móvel e que pertence à família Enterobacteriaceae. Devido à importância de "Salmonella" spp. no escopo clínico e de saúde pública, é sempre importante aprofundar o conhecimento sobre os processos celulares e os determinantes patogênicos desta bactéria. Proteínas associadas ao nucleóide (NAPs) auxiliam na compactação do DNA e também influenciam processos celulares como replicação do DNA e transcrição de genes. Dentre as NAPs de bactérias Gram-negativas, YbaB, proteína homóloga à EbfC é uma NAP pouco caracterizada. O gene ybaB forma operon com recR, gene que codifica para uma proteína de recombinação, envolvida com o sistema de reparo de DNA. Genes ybaB/ebfC estão amplamente presentes nos genomas de bactérias e archaeas de diferentes Filos de procariotos, o que sugere que YbaB/EbfC desempenhe papel biológico importante. Assim, o objetivo principal dessa tese foi o de investigar o papel biológico de YbaB sobre o metabolismo e regulação gênica global de "Salmonella enterica" Typhimurium. Para isso, foi construída uma árvore filogenética para YbaB e outra para RecR, a fim de verificar a distribuição e a variabilidade dessas proteínas por todos os grupos de procariotos. Também foram realizadas análises de seleção natural buscando verificar a existência de seleção positiva nesses genes (Capítulo I). Como é de nosso conhecimento, bactérias desenvolveram uma série de mecanismos adaptativos que lhes permitem sobreviver e crescer na presença de diferentes fatores de estresse provenientes do ambiente. Modificações das propriedades da membrana ou mudanças no estado geral de energia, morfologia e propriedades da superfície celular, estão entre tais mecanismos adaptativos. Assim, também foram realizados ensaios fenotípicos e experimentos em modelos in vivo com mutantes para ybaB, buscando investigar principalmente o papel dessa proteína frente a estresses de envelope (Capítulo II). Ainda dentro desse objetivo, utilizando-se de técnica de sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), foram avaliados quais os genes foram diferencialmente expressos, quando há maiores níveis de YbaB (superexpressão de ybaB) (Capítulo III). Os resultados mostram que YbaB é uma proteína conservada e amplamente distribuída entre os diferentes grupos de bactérias. YbaB/EbfC e RecR estão sob seleção positiva em Firmicutes, e em Gammaproteobacteria apenas YbaB/EbfC. Também foi observado que o mutante 'delta'ybaBrbsrecR é atenuado em modelo invertebrado de larvas. Além disso, YbaB parece estar envolvido em sistemas de resposta ao estresse do envelope, choque térmico e com a motilidade em S. enterica Typhimurium. A via Psp (phage shock proteins - proteínas de choque de fago) de resposta ao estresse do envelope parece ser a principal afetada por alterações nos níveis de transcritos de ybaB. Desafios futuros incluem o esclarecimento do mecanismo pelo qual YbaB participa de respostas ao estresse do envelope e também sobre a motilidade de S. enterica Typhimurium Abstract: "Salmonella enterica" is a pathogen usually acquired through the consumption of food contaminated with this bacterium. It can cause gastroenteritis and bacteremia in humans, also being able to infect several other animals such as reptiles, birds, mammals and still survive in different environments. S. enterica is a Gram-negative rod-shaped bacterium, non-spore forming, facultative anaerobic, mobile and belonging to the Enterobacteriaceae family. Due to the importance of "Salmonella" spp. in the clinical and public health scope, it is always important to deepen the knowledge about the cellular processes and the pathogenic determinants of this bacterium. Nucleoid-associated proteins (NAPs) act on DNA compacting, influencing cellular processes such as DNA replication and gene transcription. Among the NAPs of Gram-negative bacteria, YbaB, a protein homologous to EbfC is a poorly characterized NAP. ybaB forms an operon with recR, a gene that codes for a recombination protein, involved with the DNA repair system. ybaB/ebfC genes are widely present in the genomes of bacteria and archaeae from different phyla of prokaryotes, suggesting that YbaB/EbfC plays an important biological role. Thus, the main objective of this thesis was to investigate the biological role of YbaB on the metabolism and global gene regulation of "Salmonella enterica" Typhimurium. For this purpose, a phylogenetic tree was constructed for YbaB and another for RecR, to verify the distribution and sequence variability of these proteins in all groups of prokaryotes. Analyzes of positive selection were also carried out in order to understand some aspects of the evolution of these genes (Chapter I). As we know, bacteria have developed a series of adaptive mechanisms that allow them to survive and grow in the presence of different stress factors from the environment. Modifications in the properties of the membrane or changes in the general state of energy, morphology, and properties of the cell surface, are among such adaptive mechanisms. Thus, phenotypic and in vivo assays were also carried out with mutants for ybaB, seeking to investigate mainly the role of this protein in the face of envelope stresses (Chapter II). Still within this objective, using RNA-Seq, it was evaluated which genes were differentially expressed under higher levels of YbaB expression (overexpression of ybaB) (Chapter III). The results show that YbaB is a conserved protein and widely distributed among different groups of bacteria. YbaB/EbfC and RecR are under positive selection in Firmicutes, and in Gammaproteobacteria only YbaB/EbfC. It was also observed that the mutant 'delta'ybaBrbsrecR is attenuated in an invertebrate model of larvae. In addition, YbaB appears to be involved in response to envelope stress, heat shock and motility in S. enterica Typhimurium. The Psp pathway (phage shock proteins) of envelope stress response seems to be the main one affected by changes in the levels of ybaB transcripts. Future challenges include clarifying the mechanism by which YbaB participates in responses to envelope stress and on the motility of S. enterica Typhimurium Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular CNPQ 142190/2017-9 CAPES 001

Orientador: Marcos José Salvador Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas são consideradas nichos ecológicos que possuem diferentes ambientes com diversas associações como a rizosfera (próximo às raízes), filosfera (sobre os tecidos vegetais) e endosfera (no interior da planta) e cada parte possui sua própria comunidade de microrganismos com suas diferentes funções. A endosfera funciona em associação com outros organismos onde pode ocorrer intercâmbio metabólico com benefícios mútuos. Plantas da familia Gesneriaceae Rich. & Juss. ex DC. são uma interessante fonte de metabólitos secundários com diversidade em termos químicos e com relatos de extratos e de algumas moléculas bioativas (atividade antioxidante, antimicrobiana anti-inflamatória, analgésica e antiproliferativa para linhagens de células tumorais). No entanto, poucas espécies de Sinningia Nees (Gesneriaceae) foram estudadas em termos químicos e não é conhecida a diversidade de microrganismos endofíticos a elas associada, bem como o impacto de endófitos na biossíntese de substâncias bioativas. Assim, neste trabalho buscou-se estudar, em planta in natura e cultivada in vitro, a diversidade microbiana, o potencial metabólico e a avaliação das atividades antimicrobiana e antioxidante de extratos metanólicos de bactérias e fungos endofíticos associados às lâminas foliares de Sinningia magnifica (Otto & A. Dietr.) Wiehler, Sinningia schiffneri Fritsch e Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern, grupo Fyfiana (Gesneriaceae). Para isto foram utilizados dierentes tipos de metodologias num estudo multidisciplinar, onde se buscou avaliar a diversidade microbiana no mesmo período de 3 anos, e para os endófitos cultiváveis e isolados, realizou-se análises para se determinar comunidades de bactérias e fungos endofíticos associados às lâminas foliares destas três espécies de Sinningia. Além disso, foram obtidos extratos metanólicos das plantas in natura, de plantas cultivadas in vitro e de culturas mistas sintéticas (co-culturas) entre plantas in vitro e microrganismos endofíticos isolados de cada espécie vegetal e também de co-culturas entre microrganismos endofíticos, avaliando-se o impacto no perfil cromatográfico, na biossíntese de metabólitos secundários e na bioatividade, empregando-se análises químicas por UHPLC-ESI-MS/MS, com uso de substâncias-padrão previamente isoladas de espécies de Sinningia, e análises quimiométricas multivariadas PCA e PLS-DA. Foram avaliados o potencial antioxidante (ensaio ORAC-FL) e antimicrobiano (microdiluição) dos extratos das plantas (in natura e obtida in vitro), dos microrganismos endofiticos cultiváveis isolados e das co-culturas planta in vitro-endófitos. Os resultados de diversidade microbiana indicaram que as comunidades endofíticas presentes nas espécies de Sinningia puderam ser agrupadas em bactérias pertencentes aos filos Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria, e em fungos associados aos filos Ascomycota, Basidiomycota e Chytridiomycota. Quanto aos microrganismos endofíticos cultiváveis isolados os resultados mostraram que as bactérias pertencem aos gêneros Curtobacterium, Methylobacterium, Pantoea, Stenotrophomonas e Xanthomonas, e os fungos aos gêneros Cladosporium, Curvularia, Geosmithia e Lecanicillium. Foram detectados nos extratos metanólicos analisados por UHPLC-ESI-MS a halleridona, a 8-hidroxi-dunniona, a 6-metoxi-7-hidroxi-2-metilantraquinona e o calceolariosideo B, com o teor destas substâncias variando pela interação planta-endófito. Os extratos metanólicos das plantas in natura e in vitro, dos microrganismos endofiticos cultiváveis, das co-culturas planta in vitro-endofito e das co-culturas entre microrganismos endiofiticos obtidos de cada planta, mostraram diferentes respostas em termos de bioatividade, sendo verificados extratos que apresentaram atividade antimicrobiana, antioxidante e pro-oxidante e outros que não foram ativos. Pode-se concluir que as bactérias e fungos endofíticos associados às lâminas foliares de cada uma das três espécies de Sinningia estudadas são capazes de modular o metabolismo vegetal, em termos de constituintes químicos e de bioatividade, dependendo das combinações obtidas das culturas mistas sintéticas planta-endófito, mostrando a diversidade de microrganismos endofíticos associados à lâmina foliar de S. magnifica, S. schiffneri e S. speciosa e o impacto dos endófitos na biossíntese de substâncias bioativas quando associados à endosfera vegetal Abstract: Plants are considered ecological niches that have different environments with diverse associations such as rhizosphere (near the roots), philosopher (over plant tissues) and endosphere (inside the plant) and each part has its own community of microorganisms with their different functions. The endosphere works in association with other organisms where metabolic exchange with mutual benefit may occur. Plants of the Gesneriaceae Rich family. & Juss. ex DC. They are an interesting source of chemically diverse secondary metabolites with reports of extracts and some bioactive molecules (antioxidant, anti-inflammatory antimicrobial, analgesic and antiproliferative activity for tumor cell lines). However, few species of Sinningia Nees (Gesneriaceae) have been studied in chemical terms and the diversity of endophytic microorganisms associated with them and the impact of endophytes on biosynthesis of bioactive substances are not known. Thus, this work aimed to study, in a fresh and in vitro cultivated plant, the microbial diversity, the metabolic potential and the evaluation of the antimicrobial and antioxidant activities of methanolic extracts of bacteria and endophytic fungi associated with leaf blades of Sinningia magnifica (Otto & A. Dietr.) Wiehler, Sinningia schiffneri Fritsch and Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern, Fyfiana Group (Gesneriaceae). For this we used different types of methodologies in a multidisciplinary study, which aimed to evaluate the microbial diversity in the same period of 3 different years, and for cultivable and isolated endophytes, analyzes were performed to determine communities of bacteria and endophytic fungi associated with the leaf blades of these three species of Sinningia. In addition, methanol extracts were obtained from plants in natura and from in vitro cultivated and from synthetic mixed cultures (co-cultures) between in vitro plants and isolated endophytic microorganisms from each plant species and also from co-cultures between endophytic microorganisms, evaluating impact on chromatographic profile, biosynthesis of secondary metabolites and bioactivity using chemical analyzes by UHPLC-ESI-MS/MS, using previously isolated standard substances from Sinningia species, and multivariate chemometric analyzes PCA and PLS-DA. The antioxidant potential (ORAC-FL assay) and antimicrobial (microdilution) potential of plant extracts (fresh and obtained in vitro), isolated cultivable endophytic microorganisms and in vitro endophyte plant co-cultures were evaluated. The microbial diversity results indicated that the endophytic communities present in the Sinningia species could be grouped into bacteria belonging to the phylum Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes and Proteobacteria and fungi associated with phylum Ascomycota, Basidiomycota and Chytridiomycota. As for the cultivable endophytic microorganisms isolated the results showed that the bacteria belong to the genera Curtobacterium, Methylobacterium, Pantoea, Stenotrophomonas and Xanthomonas, and the fungi to genera Cladosporium, Curvularia, Geosmithia and Lecanicillium. Were detected in the methanolic extracts analyzed by UHPLC-ESI-MSthe constituents halleridone, 8-hydroxy-dunnione, 6-methoxy-7-hydroxy-2-methylanthraquinone, and calceolarioside B, with a concentration ranging for interaction plant-endophyte. Methanolic extracts of in natura and in vitro plants, cultivable endophytic microorganisms, in vitro-endophyte plant co-cultures and co-cultures between endiophytic microorganisms obtained from each plant showed different responses, and were verified extracts with antimicrobial, antioxidant and pro-oxidant activities and others extracts that were not active. It can be concluded that the endophytic bacteria and fungi associated with leaf blades of each of the three species of Sinningia studied are able to modulate plant metabolism, in terms of chemical constituents and bioactivity, depending on the combinations of plant-endophyte synthetic mixed cultures obtained, showing the diversity of endophytic microorganisms associated with the leaf blade of S. magnifica, S. schiffneri and S. speciosa, the importance of plant-endophyte symbiotic interaction and the impact of endophytes on biosynthesis of bioactive substances when associated with the plant endosphere Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutor em Ciências CAPES 88882.435473/2019-01

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A pandemia da COVID-19 mostrou a vulnerabilidade da sociedade humana frente às doenças infecciosas. Produtos naturais representam a principal fonte de agentes terapêuticos usados como antivirais, anticâncer e antibióticos. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial biossintético e metabólico de produtos naturais de duas bactérias isoladas da Antártica. Foram sequenciados o genoma completo de duas bactérias, permitindo a análise filogenética das mesmas, concluindo-se que estas são relacionadas à Streptomyces albidoflavus e Marinobacter sp.. A análise de Genome mining identificou 24 clusters gênicos biossintéticos (BGCs) para S. albidoflavus ANT_B131 das classes ectoína, peptídeos não-ribossomais (NRP), policetídeos (PK), peptídeos sintetizados via ribossomos e modificados pós-tradução (RiPPs), sideróforos, entre outros, dos quais 50 % apresentavam baixa (

Orientador: Valeria Maia Merzel Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A contaminação por bactérias produtoras de ácido lático (LAB, do inglês Lactic Acid Bacteria) é um dos principais problemas enfrentados no processo de fermentação alcóolica em usinas de bioetanol, uma vez que reduz o rendimento do processo e traz perdas econômicas significativas. As LAB, além de competirem com as leveduras (Saccharomyces sensu stricto), responsáveis pela produção do bioetanol, também secretam metabólitos inibitórios prejudiciais às leveduras. O uso de antibióticos para o controle de LAB na fermentação alcoólica tem sido uma prática constante na indústria de bioetanol, apesar de gerar resíduos potencialmente nocivos, que resultam na disseminação de linhagens de bactérias resistentes que acarretam problemas ambientais e a saúde humana. Assim, no intuito de estabelecer processos ecologicamente mais amigáveis e sustentáveis, é indispensável a substituição dos antibióticos utilizados na indústria de bioetanol. Para tanto, é preciso substâncias eficazes que não se tornem resíduos nocivos, o que faz dos produtos naturais uma alternativa promissora para este tipo de substituição. No Brasil, a biodiversidade é considerada uma fonte de substâncias biologicamente ativas, onde muitas plantas vêm sendo amplamente reconhecidas por suas propriedades antimicrobianas ao longo dos séculos. Princípios ativos sintetizados pelo metabolismo secundário das plantas com aplicações biotecnológicas podem ser obtidos a partir de diferentes partes das plantas. Este fato motiva a investigação de produtos naturais provenientes de plantas, como óleos essenciais (OE), que possam ser utilizados no controle da contaminação por LAB no processo de fermentação alcóolica. Os OE possuem um alto potencial biotecnológico para esta substituição pois muitos apresentam atividade antimicrobiana para diversas bactérias. Em adição, são substâncias consideradas seguras, uma vez que são utilizados na indústria de alimentos e não produzem resíduos nocivos ao ambiente e à saúde humana. Desta forma, propomos neste trabalho, a triagem, caracterização e avaliação do efeito antimicrobiano de OE obtidos preferencialmente a partir de plantas da flora brasileira, que tenham atividade biológica seletiva, ou seja, inibitórios e/ou microbicidas para LAB e inertes para leveduras do gênero Saccharomyces sensu stricto, com potencial para substituir os antibióticos no controle de contaminação da fermentação de bioetanol Abstract: The use of antibiotics to control bacterial contamination in alcoholic fermentation process has been a common practice in the industry. Lactic acid bacteria (LAB), the main group of contaminating bacteria in the bioethanol fermentation process, are considered a huge problem to the process, since they are capable to thrive under the conditions found in fermentation tanks, competing with yeasts (Saccharomyces sensu stricto) for the sugar to be fermented (sugarcane juice or molasses). Furthermore, they secrete substances that may inhibit the development of yeasts in the process, compromising fermentation yield. In order to prevent LAB and limit production losses, the ethanol industry makes continuous use of the same antibiotics consumed by humans, such as, penicillin, erythromycin and virginiamycin. This practice can lead to the selection of resistant bacteria and contributes to the growing concern about the effects of the indiscriminate use of antibiotics in human health. In addition, traces of these antibiotics may be found in ethanol byproducts, such as dry yeast, which is sold as source of protein for animal feed preparation. Antibiotic traces in Brazilian dry yeast have caused frequent rejection of this product by the European Community. Hence, the replacement of antibiotics in fermentation process for bioethanol production is of paramount importance and should entail the use of substances that do not turn into harmful residues to the environment and, consequently, a hazard to human health. Essential oils (EO) are considered an important source of substances with antimicrobial activity. Thus, these oils may become a promising alternative to replace antibiotics in the control of lactic acid bacteria (LAB). In this context, the aim of this study was to screen and characterize EO obtained preferentially from Brazilian plants and showing selective activity, exhibiting inhibitory and/or biocidal activity against LAB and being inert to yeasts of the genus Saccharomyces sensu stricto, with potential to replace antibiotics in the contamination control of bioethanol fermentation Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES 001

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os oceanos cobrem cerca do 70% da superfície da Terra e estima-se que possuem uma riqueza incalculável de microflora marinha. Entre essa microflora, as bactérias são conhecidas por apresentarem uma ampla gama de compostos químicos úteis para o homem. Especificamente, as actinobactérias produzem diferentes metabolitos secundários os quais são utilizados pelo homem para o tratamento de doenças incluindo câncer e tumores. O objetivo deste trabalho foi selecionar, realizar a caracterização taxonômica e avaliar a atividade antiproliferativa de actinobactérias isoladas de organismos marinhos da região de Cabo Frio, RJ, Brasil. Uma coleção de isolados bacterianos (n = 232) foi reativada em ágar R2A suplementado com água artificial de mar (Artificial Sea Water, ASW) 2,5 % NaCl e incubados a 28°C. Após o crescimento foram selecionados os microrganismos Gram positivos pertencentes ao Filo Actinobacteria, utilizando os primers grupo específicos SCAct235S20 e SCAct878A19, e caracterizados molecularmente por análise da sequência do gene RNA ribossomal 16S. Desta primeira etapa foram obtidas 58 actinobactérias divididas em 13 gêneros identificados como Agrococcus (n=1), Curtobacterium (n=1), Dietzia (n=1), Saccharopolyspora (n=1), Haematomicrobium (n=1), Isoptericola (n=1), Kocuria (n=3), Micrococcus (n=3), Gordonia (n=5), Streptomyces (n=5), Brevibacterium (n=6), Microbacterium (n=12) e Nocardiopsis (n = 18), apresentando uma ampla variedade de espécies. Posteriormente, foi realizada uma análise bio-guiada avaliando a atividade antiproliferativa frente a três linhagens celulares tumorais U251 (Glioma), MCF7 (Câncer de mama) e NCI-H460 (câncer de pulmão). Deste processo, quatro actinobactérias apresentaram atividade antiproliferativa contra as três linhagens tumorais: Streptomyces sp 796.1 em concentração inferior a 0,25 µg/mL, seguida de Gordonia sp 892 em concentrações inferiores a 6 µg/mL, e Streptomyces sp 867 e Nocardiopsis sp 760.1 em concentrações entre 6 até 23 µg/mL. O fracionamento dos quatro extratos mostrou que as frações bioativas eram principalmente as de metanol. Análises feitas utilizando as plataformas GNPS e XCMS, e o programa MZmine2, permitiram identificar alguns compostos importantes que estão presentes nos extratos. Em conclusão, existe um grande potencial para encontrar compostos úteis para o tratamento de doenças nas fábricas de compostos naturais como são consideradas as actinobactérias. Os microrganismos pertencentes aos gêneros, Streptomyces e Nocardiopsis, corroboram os resultados já amplamente documentados como produtores de substâncias biologicamente ativas, e o gênero Gordonia, mais estudado em processos de biorremediação, agora revela a atividade promissora como fonte de compostos antiproliferativos, conforme constatado neste estudo Abstract: Oceans make up about 70% of the Earth's surface and are estimated to have an incalculably rich marine microflora. Among these microflorae, bacteria are known to present a wide range of chemical compounds useful for man. Specifically, Actinobacteria produce different secondary metabolites that are used by man to treat diseases including cancer and tumors. The purpose of this work was to select, to carry out taxonomic characterization and to evaluate the antiproliferative activity of actinobacteria isolated from marine organisms in the Cabo Frio region, RJ, Brazil. A collection of bacterial isolates (n = 232) was reactivated on R2A agar supplemented with artificial seawater (ASW) 2.5% NaCl and incubated at 28°C. After growth, Gram-positive microorganisms of the Actinobacteria Order were selected using the specific group primers SCAct235S20 and SCAct878A19 and characterized molecularly by analyzing the sequence of the 16S ribosomal RNA gene, the gene was sequenced with universal primers. 58 actinobacteria divided into 13 genera were obtained: Agrococcus (n = 1), Curtobacterium (n = 1), Dietzia (n = 1), Saccharopolyspora (n = 1), Haematomicrobium (n = 1), Isoptericola ( n = 1), Kocuria (n = 3), Micrococcus (n = 3), Gordonia (n = 5), Streptomyces (n = 5), Brevibacterium (n = 6), Microbacterium (n = 12) and Nocardiopsis (n = 18), presenting a wide variety of species. Subsequently, a bio-guided analysis was carried out assessing antiproliferative activity against three tumor cell lines U251 (Glioma), MCF7 (Breast cancer) and NCI-H460 (lung cancer). From this process, four actinobacteria showed antiproliferative activity controlling the three tumor strains: Streptomyces sp 796.1 at a concentration below 0.25 µg/mL, followed by Gordonia sp 892 at concentrations below 6 µg/mL, and Streptomyces sp 867 and Nocardiopsis sp 760.1 at concentrations between 6 to 23 µg/mL. The fractionation of the four extracts showed that the bioactive fractions were mainly those of methanol. Analyzes performed using GNPS and XCMS platforms, and the MZmine2 program, allowed us to identify some important compounds that are present in the extracts. In conclusion, there is great potential in finding compounds useful for the treatment of diseases in Actinobacteria, which are considered factories of natural compounds. Mainly in these four microorganisms of three genera, Streptomyces and Nocardiopsis, already widely documented as producing biologically active substances, and the genus Gordonia mostly studied in bioremediation processes, but now with promising activity as a source of antiproliferative compounds Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular CNPQ 141353/2017-1 CAPES 1437890

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os micro-organismos endofíticos são aqueles que habitam o interior do hospedeiro sem causar danos ou sintomas aparentes, em relações mutualísticas ou comensais. O objetivo desse trabalho foi analisar a diversidade das bactérias endofíticas presente nos tecidos foliares da planta medicinal "Passiflora incarnata". Foram isoladas 141 bactérias endofíticas afiliadas à quatro filos, 17 famílias e 23 gêneros, destacando-se os gêneros Sphingomonas, Methylobacterium e Curtobacterium, responsáveis por um total de 24 espécies diferentes. Após uma triagem fenotípica inicial, dez taxas apresentaram atividade antagonista frente aos principais fitopatógenos da cultura do maracujá, sendo eles: Bacillus sp. (1), Brevundimonas albigilva (1), Curtobacterium pusillum (2), Methylobacterium rhodesianum (1), Methylobacterium radiotolerans (3), Sphingomonas leidyi (1) e Sphingomonas yabuuchiae (1). O isolado EP58 (Bacillus sp.) foi capaz de inibir em até 66,6% o crescimento micelial de fungos e formar halos de inibição de 30 mm frente à bactéria patogênica Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, demonstrando potencial para ser utilizado como um candidato a agente de biocontrole. Os extratos orgânicos obtidos dos isolados mais promissores foram analisados por HPLC-MS/MS e foram detectados compostos de diferentes classes de produtos naturais, como alcaloides, antibióticos e biosurfactantes, confirmando o potencial desses endófitos como produtores de biomoléculas de interesse. Realizou-se também uma comparação das comunidades de bactérias endofíticas de P. incarnata por métodos dependente e independente de cultivo em função do estágio de desenvolvimento da planta (vegetativo e reprodutivo). Os resultados evidenciaram uma grande diversidade desses micro-organismos e a existência de comunidades endofíticas específicas de acordo com o estágio de desenvolvimento da planta, sugerindo uma modulação da diversidade taxonômica e funcional por parte do hospedeiro conforme suas necessidades fisiológicas. Por fim, foi investigado o potencial dos endófitos de P. incarnata para a biossíntese de flavonoides, através de testes genotípicos e fenotípicos, visto que essa planta é conhecida por ser uma grande produtora desse composto. Diferentes espécies de Sphingomonas foram positivas para a amplificação do gene flavonol synthase, e apenas a espécie Sphingomonas leidyi produziu pequenas quantidades de flavonoides Abstract: Endophytic microorganisms are those that inhabit the interior of the host without causing damage or apparent symptoms, in mutualistic or commensal relations. The objective of this work was to analyze the diversity of the endophytic bacteria present in the foliar tissues of the medicinal plant "Passiflora incarnata". A total of 141 endophytic bacteria affiliated with four phyla, 17 families and 23 genera were identified, including the genera Sphingomonas, Methylobacterium and Curtobacterium, responsible for a total of 24 different species. After an initial phenotypic screening, ten isolates showed antagonistic activity against the main phytopathogens of the passion fruit crop: Bacillus sp. (1), Brevundimonas albigilva (1), Curtobacterium pusillum (2), Methylobacterium rhodesianum (1), Methylobacterium radiotolerans (3), Sphingomonas leidyi (1) and Sphingomonas yabuuchiae (1). The isolate EP58 (Bacillus sp.) was able to inhibit in up to 66.6% the fungal mycelial growth and to form inhibition halos of 30 mm against the pathogenic bacterium Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, demonstrating the potential to be used as a candidate for biocontrol agent. The organic extracts obtained from the most promising isolates were analyzed by HPLC-MS / MS and compounds from different classes of natural products, such as alkaloids, antibiotics and biosurfactants were detected, confirming the potential of these endophytes as producers of biomolecules of interest. A comparison of the endophytic bacterial communities of P. incarnata by culture-dependent and -independent methods as a function of the developmental stage of the plant (vegetative and reproductive) was also carried out. The results showed a great diversity of these microorganisms and the existence of specific endophytic communities according to the plant developmental stage, suggesting a modulation of the taxonomic and functional diversity by the host according to its physiological needs. Finally, the potential of P. incarnata endophytes for flavonoid biosynthesis was investigated through genotypic and phenotypic tests, since this plant is known to be a significant producer of this compound. Different species of Sphingomonas were positive for the amplification of the flavonol synthase gene, only Sphingomonas leidyi was able to produce low amounts of flavonoids Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES CNPQ 141298/2017-0 FAPESP 15/02395-8

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A taxonomia microbiana evoluiu simultaneamente à Ciência, sobretudo após o surgimento da Biologia Molecular. Apesar do gene RNA ribossomal 16S permitir a obtenção de informações genotípicas acuradas, é necessário o uso de metodologias que possibilitem análises mais profundas de micro-organismos intimamente relacionados. Nesse contexto, a abordagem por Multilocus Sequence Analysis (MLSA) permite uma maior acurácia genética, uma vez que utiliza genes housekeeping para a inferência de parentesco. Assim, o presente estudo teve por objetivo classificar a um nível específico 15 linhagens do gênero Chromobacterium isoladas do Rio Negro (Manaus, Brasil) e do Rio Doce (Minas-Gerais, Brasil) e 7 linhagens Tipo descritas na literatura: C. violaceum (ATCC 12472T), C. pseudoviolaceum (LMG 3953T), C. haemolyticum (DSM 19852T), C. vaccinii (DSM 25150T), C. piscinae (LMG 3947T), C. subtsugae (PRAA4-1T) e C. amazonense (DSM 26508T), utilizando a metodologia de MLSA. Os primers para os genes estruturais atpD, rpoA e rpoB foram desenhados a partir do genoma total de C. violaceum (ATCC 12472T). A partir do sequenciamento dos genes housekeeping foi possível a construção de árvores filogenéticas parciais e árvores filogenéticas com os genes concatenados na seguinte ordem: RNA ribossomal 16S e atpD; RNA ribossomal 16S, atpD e rpoA; RNA ribossomal 16S, atpD e rpoB e RNA ribossomal 16S, atpD, rpoA e rpoB. As filogenias resultantes de diferentes metodologias (Neighboor Joining ¿Kimura 2 parâmetros, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Minimum Evolution e UPGMA) com 1000 repetições de bootstrap apresentaram topologias similares. Conforme a análise por MLSA as cepas CBMAI 301, CBMAI 302, CBMAI 303, CBMAI 304, CBMAI 306, CBMAI 307, CBMAI 308 e CBMAI 309 pertencem a espécie C. violaceum; as linhagens CBMAI 589, CBMAI 590 e CBMAI 592 representam uma provável nova espécie relativamente próxima de C. vaccinii. As linhagens CBMAI 593 e CBMAI 595 formaram um clado separado de todas as espécies descritas, e a linhagem CBMAI 594 não agrupou com nenhuma das espécies do gênero. A partir desse trabalho foi possível concluir que a abordagem por MLSA é promissora para a resolução filogenética de espécies intimamente relacionadas e que os genes conservados atpD e rpoA constituem bons marcadores moleculares para o gênero Chromobacterium Abstract: The Microbial Taxonomy evolved simultaneously to Science, especially after the appearance of Molecular Biology. Although the 16S ribosomal RNA gene allows obtaining accurate genotype information, it is necessary to use methodologies that allow deeper analyzes of closely related microorganisms. In this context, the Multilocus Sequence Analysis (MLSA) approach provides a greater genetic accuracy, since it uses housekeeping genes for inference of kinship. Thus, the present study aimed to classify at a specific level 15 strains of the genus Chromobacterium isolated from Rio Negro (Manaus, Brazil) and Rio Doce (Minas Gerais, Brazil) and 7 Type strains described in the literature: C. violaceum (ATCC 12472T), C. pseudoviolaceum (LMG 3953T), C. haemolyticum (DSM 19852T), C. vaccinii (DSM 25150T), C. piscinae (LMG 3947T), C. subtsugae (PRAA4-1T) and C. amazonense (DSM 26508T), using MLSA methodology. Primer design for the structural genes atpD, rpoA and rpoB were made from the total genome of C. violaceum (ATCC 12472T). The sequencing resulted in concatenated phylogenetic trees with the genes concatenated in this order: 16S ribosomal RNA and atpD; 16S ribosomal RNA, atpD and rpoA; 16S ribosomal RNA, atpD and rpoB and 16S ribosomal RNA, atpD, rpoA and rpoB. The phylogenies were acquired from different methodologies (Neighboor Joining -Kimura 2 parameters, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Minimum Evolution and UPGMA) with 1000 replicates of bootstrap presenting similar topologies. According to the MLSA analysis the strains CBMAI 301, CBMAI 302, CBMAI 303, CBMAI 304, CBMAI 306, CBMAI 307, CBMAI 308 and CBMAI 309 belong to the species C. violaceum; CBMAI 589, CBMAI 590 and CBMAI 592 strains represent a probable new species relatively close to C. vaccinii. The strains CBMAI 593 and CBMAI 595 form a clade separate from all described species and the line CBMAI 594 constitutes a third new species, however, further analysis are required for confirmation. There are indications that the lineage CBMAI 594 did not group with any of the species of the genus. For last, we conclude from this study that the approach by MLSA was promising for the phylogenetic resolution of closely related species and that the conserved genes atpD and rpoA were good molecular markers for the Chromobacterium genus Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Marcos José Salvador, Alba Regina Monteiro Souza Brito Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As bactérias endofíticas são microrganismos associados a plantas e apresentam a habilidade de promover crescimento, aumentar a atividade fotossintética e proteger contra o ataque de patógenos ao hospedeiro. Aliás, os endófitos também podem produzir metabolitos secundários bioativos ou modular sua síntese no hospedeiro. Este trabalho de pesquisa teve como objetivo investigar as características fenotípicas e genéticas além do potencial antimicrobiano e antioxidante da bactéria endofítica MG-1 isolada das folhas de Mikania glomerata Spreng. (Asteraceae) a partir do estudo químico/biológico do extrato bruto deste microrganismo e avaliar seu efeito na modulação de metabólitos secundários bioativos na cultura de células da planta mediante análise por UHPLC-ESI-MS. A identificação genética realizada mediante a análise do gene RNA ribossomal 16S confirmou a Methylobacterium como o gênero ao qual pertence o endófito. Os extratos em acetato de etila obtido de cultura em meio liquido ISP2 e TSB apresentaram atividade antimicrobiana in vitro frente a Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis a uma concentração de 5 mg/mL. Por outro lado, verificou-se que o extrato em acetato de etila dos calos e da suspensão celular de Mikania glomerata associados a Methylobacterium sp. apresentavam valores de ORAC mais elevados em comparação aos controles. Na associação, os valores de ORAC foram de 4484,24 ?mol TE/g de extrato do calo, e de 1384,97 ?mol TE/g de extrato da suspensão, enquanto o ORAC dos controles foram de 955,42 ?mol TE/g de extrato no calo controle e 390,55 ?mol TE/g no extrato da suspensão. Conforme as analises por UHPLC-ESI-MS, foi possível detectar um incremento na concentração de cumarina e ácido clorogênico nos extratos em acetato de etila do calo associado ao endófito em comparação ao calo controle, o que, associado ao aumento na capacidade antioxidante pelo ensaio ORAC-FL, sugere que o endófito exerce um efeito na produção de metabolitos secundários bioativos in vitro na cultura de células vegetais de M. glomerata em meio semi-sólido, nas condições avaliadas. A continuidade das investigações químicas e biológicas se faz necessária para confirmar os resultados obtidos e avaliar melhor o potencial biotecnológico deste microrganismo endofítico Abstract: Endophytic bacteria are plant-associated microorganisms that have the ability to promote growth, increase photosynthetic activity, and protect against pathogen attack on the host. In fact, endophytes can also produce bioactive secondary metabolites or modulate their synthesis in the host. This research aimed to investigate the phenotypic and genetic characteristics in addition to the antimicrobial and antioxidant potential of the MG-1 endophytic bacterium isolated from Mikania glomerata Spreng. (Asteraceae) leaves from the chemical/ biological study of this microorganism's crude extract, assessing its effect on the modulation of bioactive secondary metabolites in the plant cell culture by UHPLC-ESI-MS analysis. Genetic identification performed by the 16S rRNA gene analysis confirmed Methylobacterium as the genus to which the endophyte belongs. Ethyl acetate extracts obtained from ISP2 and TSB liquid culture showed antimicrobial activity in vitro against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis at a concentration of 5 mg / mL. On the other hand, it was found that ethyl acetate extract of calli and cell suspension of Mikania glomerata associated with Methylobacterium sp. presented higher values of ORAC compared to controls. From the association plant- bacteria, the ORAC values were 4484.24 ?mol TE / g of callus extract, and 1384.97 ?mol TE / g of cell suspension extract, while ORAC of the controls were 955.42 ?mol TE / g extract in the control callus and 390.55 ?mol TE / g in the cell suspension extract control. According to the UHPLC-ESI-MS analyzes, it was possible to detect an increase in the concentration of coumarin and chlorogenic acid in the ethyl acetate extracts of calli associated to the endophyte in comparison to control calli, which jointly to the increase in the antioxidant capacity by ORAC-FL essay suggests that the endophyte exerts an effect on the production of bioactive secondary metabolites in vitro in the plant cell culture of M. glomerata in semi-solid medium under the conditions evaluated. The continuity of chemical and biological investigations is necessary to confirm the results obtained and to better evaluate the biotechnological potential of this endophytic microorganism Mestrado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Mestra em Ciências CAPES

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os endófitos bacterianos são micro-organismos que residem nos tecidos internos das plantas sem causar nenhum sintoma aparente de doença. Nesta interação planta-micróbio, a planta oferece um nicho complexo para a vida endofítica e as bactérias endofíticas desempenham diversas funções benéficas para o hospedeiro, como a aquisição de nutrientes essenciais, modulação de fito-hormônios e síntese de compostos que protegem a planta de estresses bióticos e abióticos. Estas características estão estreitamente relacionadas à Promoção de Crescimento Vegetal (PCV). Assim, a planta pode mostrar predisposição para ser colonizada por este grupo de endófitos benéficos de acordo com suas necessidades fisiológicas, o que depende principalmente da fase de desenvolvimento do hospedeiro. Este estudo teve como objetivo determinar a composição da comunidade bacteriana endofítica cultivável na fase vegetativa de P. incarnata e avaliar seu potencial para promover o crescimento vegetal. Os 58 isolados recuperados foram proporcionados pela Divisão de Recursos Microbianos do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA-UNICAMP). A identificação dos isolados foi baseada no analise filogenética das sequencias parciais do gene RNA ribossomal 16S. Se avaliou o potencial de todos os isolados para a promoção do crescimento vegetal mediante uma abordagem fenotípica e genotípica. Com respeito a abordagem fenotípica, os isolados foram testados para a atividade de fixação de nitrogênio, solubilização de fosfatos, produção de ácido indol acético e produção de sideróforos. No caso da abordagem genotípica, se buscou a presença de genes relacionados à PCV (nifH, ipdC, asb, AcPho). A comunidade recuperada estava principalmente dominada por isolados pertencentes ao gênero Bacillus (71%), seguido por Pseudomonas (9%) e Pantoea (7%). O filotipo com maior número de representantes foi Bacillus aryabhattai (10 isolados), seguido por Bacillus megaterium (9 isolados) e Bacillus tequilensis (6 isolados). Nos testes fenotípicos o 93% dos isolados mostraram atividade para ao menos uma característica de PCV, 47% mostraram resultados positivos para três características PCV e 10 isolados mostraram ser positivos para as quatro características PCV avaliadas. Na abordagem genotípica, 31% dos isolados mostraram a presença de ao menos um dos genes relacionados à PCV. Em determinados casos a abordagem genotípica complementou os resultados dos testes fenotípicos e em outros permitiu identificar atividade de PCV que a abordagem fenotípica não conseguiu. Os gêneros Bacillus, Pseudomonas e Paenibacillus estão fortemente relacionados com as características da PCV. Estes resultados sugerem que a predominância de componentes com potencial de PCV dentro da comunidade bacteriana associada a P. incarnata pode estar relacionada a necessidades fisiológicas específicas da fase vegetativa do hospedeiro Abstract: Bacterial endophytes are microorganisms that reside in the internal tissues of plants without causing any apparent symptoms of disease. In this plant-microbe interaction, plants provide a complex niche for endophytic life and the endophytic bacteria play several beneficial roles for the host such as the acquisition of essential nutrients, modulation of phytohormones and synthesis of compounds that protect the plant from biotic and abiotic stresses. These features are closely related with the Plant Growth Promoting (PGP). Thus, the plant may be predisposed to be colonized by this group of beneficial endophytes according to their physiological needs, which depends mainly on the host development stage. This study aimed to determine the composition of the endophytic bacterial community in the vegetative phase of P. incarnata and to evaluate its potential to promote plant growth. The 58 isolates that make up this community were provided by the Division of Microbial Resources of Research Center for Chemical, Biological and Agricultural (CPQBA-UNICAMP). The identification of isolates was based on the phylogenetic analysis of the partial sequences of the 16S rRNA gene. The potential of the whole community for the promotion of plant growth was evaluated through a phenotypic and genotypic approach. Regarding the phenotypic approach, the isolates were tested for nitrogen fixation, phosphate solubilization, indol acetic acid production and siderophores production. In the case of the genotypic approach, we searched for the presence of genes related to plant growth promotion (nifH, ipdC, asb, AcPho). The community was mainly dominated by isolates belonging to the genus Bacillus (71%), followed by Pseudomonas (9%) and Pantoea (7%). The phylotype with the highest number of representatives was Bacillus aryabhattai (10 isolates), followed by Bacillus megaterium (9 isolates) and Bacillus tequilensis (6 isolates). In the phenotypic tests, 93% of the community showed activity for at least one PCV characteristic, 47% showed positive results for three PCP traits and 10 isolates showed to be positive the four PCP traits evaluated. In the genotypic approach, 31% of the community showed the presence of at least one of the genes related to PCP. In some cases, the genotypic approach complemented the results of the phenotypic tests and in others it allowed to identify the PCV activity that the phenotypic approach did not achieve. The genera Bacillus, Pseudomonas and Paenibacillus are strongly related to PCP features. These results suggest that the predominance of components with high potential PCP within the bacterial community associated with P. incarnata may be associated with specific physiological needs from vegetative stage of host Mestrado Genética de Microorganismos Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Valéria Maia Merzel, Fabiana Fantinatti-Garaboginni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O continente Antártico é considerado uma região com condições climáticas extremas, com baixas temperaturas, alta incidência de radiação UV e déficit hídrico. Possui um bioma muito singular, o que significa que grande parte do seu patrimônio biológico não pode ser encontrada em outro lugar do planeta. Nestas condições espera-se encontrar micro-organismos adaptados (extremófilos) que possam ser explorados para a identificação de arsenais metabólicos únicos e versáteis com possíveis aplicações biotecnológicas em diversas áreas. O desenvolvimento de pesquisas recentes em nosso laboratório com bactérias e fungos da Antártica permitiu o isolamento de um grande número (em torno de 1200) de micro-organismos daquela região, muitos deles possivelmente indígenas, ainda não catalogados e não estudados quanto à produção de compostos bioativos potenciais. Com base nesse repertório, este estudo visou identificar as bactérias isoladas e descobrir produtos naturais de interesse biotecnológico, com foco em antibióticos e pigmentos para aplicação na indústria farmacêutica ou cosmética. Assim, um total de 326 isolados bacterianos, distribuídos em 39 gêneros diferentes, foram identificados com base no seqüenciamento do gene RNAr 16S. A triagem para antimicrobianos revelou quinze isolados capazes de inibir o crescimento de pelo menos uma das linhagens indicadoras: Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Candida albicans. Uma bactéria psicrotolerante, Pseudomonas sp. isolado 99, apresentou amplo espectro antimicrobiano, além de atividade antiproliferativa e antiparasitária. Em relação aos pigmentos, foram selecionadas quatro bactérias que melhor resistiram à radiação UV e seus pigmentos foram extraídos e identificados. Todos os pigmentos selecionados foram identificados como carotenoides e apresentaram alta atividade antioxidante e boa estabilidade sob exposição à luz ultravioleta. Um pigmento em específico, identificado como all-trans-bacterioruberina, se mostrou seguro nos testes de fototoxicidade, abrindo perspectivas de uso na formulação de cosméticos Abstract: The Antarctic continent is considered a region with extreme climatic conditions, with low temperatures, high incidence of UV radiation and water deficit. It has a very unique biome, which means that much of its biological heritage can not be found elsewhere on the planet. Under these conditions it is expected to find adapted microorganisms (extremophiles) that can be exploited for the identification of unique and versatile metabolic arsenals with potential biotechnological applications in several areas. The development of recent research in our laboratory with bacteria and fungi in Antarctica allowed the isolation of a large number (around 1200) of microorganisms, many of them possibly indigenous, not yet cataloged or studied for the production of potential bioactive compounds. Based on this repertoire, this study aimed to identify bacterial isolates and discover natural products of biotechnological interest, focusing on antibiotics and pigments for application in the pharmaceutical or cosmetic industry. Thus, a total of 326 bacterial isolates, distributed in 39 different genera, were recovered and identified based on 16S rRNA gene sequencing. Antimicrobial screening revealed fifteen isolates capable of inhibiting the growth of at least one of the indicator strains Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Candida albicans. A psychrotolerant bacterium, Pseudomonas sp. isolate 99, showed broad antimicrobial spectrum, besides antiproliferative and antiparasitic activity. Regarding pigments, four bacteria were shown to better withstand UV radiation and their pigments were extracted and chemically identified. All selected pigments were identified as carotenoids and exhibited high antioxidant activity and good stability under ultraviolet light exposure. A specific pigment, identified as all-trans-bacterioruberina, proved to be safe in the phototoxicity tests, opening perspectives for further use in the formulation of cosmetics Doutorado Microbiologia Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/17936-1

Orientadores: Laura Maria Mariscal Ottoboni, Renato Vicentini dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A cana-de-açúcar tem grande importância econômica para o Brasil, principalmente para o Estado de São Paulo, onde se concentra a maior produção dessa cultura. No entanto, a emissão crescente de gás carbônico na atmosfera está ocasionando aumento na temperatura média e diminuição da quantidade de chuvas nas regiões produtoras de cana-de-açúcar. Na rizosfera, as bactérias do solo estão intimamente relacionadas com as plantas e podem promover o crescimento vegetal. Dessa forma, o estudo do efeito das mudanças ambientais na rizosfera de cana-de-açúcar poderá proporcionar novas informações a respeito da interação planta-microbiota e como os micro-organismos poderiam ajudar as plantas a sobreviverem em condições adversas. Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do estresse hídrico na microbiota associada a rizosfera de duas variedades (CTC9001 e RB855536) de cana-de-açúcar por sequenciamento do metatranscriptoma. Além disso, a microbiota cultivável da rizosfera da variedade CTC9001 foi isolada e avaliada quanto a capacidade de promover crescimento vegetal. O Capítulo 1 deste trabalho apresentou os resultados do metatranscriptoma da rizosfera associada a variedade de cana-de-açúcar resistente a seca (CTC9001). Os resultados indicaram que a microbiota associada a rizosfera da variedade resistente é dominada principalmente por Proteobacteria, Actinobacteria e Bacteroidetes e que o estresse hídrico provocou alterações nessas comunidades. Uma diminuição na expressão de genes relacionados ao crescimento e ao metabolismo energético ocorreu principalmente nas amostras submetidas a oito dias de estresse hídrico e foram relacionadas com os gêneros Sorangium e Rhodanobacter. Por outro lado, genes associados a funções celulares como mobilidade por flagelo, adesão celular e degradação de proteínas aumentaram sua expressão em oito dias de estresse hídrico e foram relacionadas ao gênero Aequorivita. Esse gênero também apresentou correlação positiva com os ácidos orgânicos exsudados pela planta. O mesmo experimento de estresse hídrico foi conduzido para a microbiota associada a rizosfera da variedade de cana-de-açúcar sensível a seca (RB855536). Assim sendo, o Capítulo 2 apresentou os resultados obtidos da comparação entre a microbiota da rizosfera associada às duas variedades de cana-de-açúcar (resistente x sensível). Esses resultados mostraram que a microbiota da variedade sensível de cana-de-açúcar apresentou respostas diferentes em comparação aos dados obtidos para a variedade resistente. Essa diferença na resposta da microbiota entre as duas variedades de cana-de-açúcar foi observada mesmo em tempos mais curtos de estresse hídrico (dois dias). A variedade sensível apresentou modificações na expressão de genes associados a proteínas de ligação ao DNA e ao ribossomo, ao longo de todo o período de estresse hídrico avaliado. Nessa variedade, o gênero Streptomyces e a família Polyangiaceae apresentaram os maiores valores de expressão gênica aos 12 dias de estresse hídrico, provavelmente devido a capacidade de formarem esporos ou responderem mais rápido as mudanças ambientais. Streptomyces também apresentou vários transcritos correlacionados de forma negativa com os ácidos orgânicos exsudados pela planta, os quais podem ter atuado como sinalizadores para mudanças na expressão de alguns de seus genes. Finalmente, os resultados do isolamento de bactérias da rizosfera de cana-de-açúcar CTC9001 foi apresentado no Capítulo 3. As análises revelaram uma grande abundância de bactérias do gênero Arthrobacter, Pseudomonas, Microbacterium e Bacillus. Muitos isolados apresentaram resultados positivos para a capacidade de crescimento vegetal e crescimento sob estresse hídrico (na presença de PEG), sugerindo que os isolados poderiam ser utilizados como componentes de biofertilizantes comerciais para a agricultura. Testes de crescimento vegetal em plantas de tomate revelaram que o isolado Pseudomonas sp. WS02-30 aumentou o comprimento das raízes das plantas, provavelmente devido à sua capacidade de produzir ácido indol acético (IAA) e 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase Abstract: Sugarcane is a very important crop for the Brazilian economy, especially for the State of São Paulo, where the largest production of this crop is concentrated. However, the emission of carbon dioxide in the atmosphere is promoting an increase in the average temperature and a decrease in the rainfall in the sugarcane producing regions. In the rhizosphere, soil bacteria are closely related to plants and they can promote plant growth. Thus, the study of the effect of environmental changes on sugarcane rhizosphere could provide new informations about plant-microbiota interaction and how the microorganisms could help plants to survive in adverse conditions. Therefore, the aim of the present work was to evaluate the effect of water stress on the associated-rhizosphere microbiota of two sugarcane varieties (CTC9001 and RB855536) by metatranscriptome sequencing. In addition, the cultivable rhizosphere microbiota of CTC9001 variety was isolated and evaluated for the ability to promote plant growth. Chapter 1 of this work presented the results of rhizosphere metatranscriptome of the dry-resistant sugarcane variety (CTC9001). The results indicated that Proteobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes dominated the bacterial community associated with rhizosphere of the dry-resistant sugarcane variety and that water stress caused changes in these communities. A decrease in the expression of genes related to growth and energy metabolism occurred mainly in the samples submitted to eight days of water stress and were related to the Sorangium and Rhodanobacter genera. On the other hand, genes associated with functions such as flagella mobility, cell adhesion and protein degradation increased their expression in eight days of water stress and were related to the genus Aequorivita. This genus also showed a positive correlation with the organic acids exuded by the plant. The same water stress experiment was performed for the rhizosphere-associated microbiota of the dry-sensitive sugarcane RB855536. Thus, Chapter 2 presented the results obtained from the comparison between the rhizosphere-associated microbiota to the two sugarcane varieties (resistant x sensitive). These results showed that the microbiota of dry-sensitive sugarcane variety presented different responses compared to the data obtained for the resistant one. This difference in microbial response between the two sugarcane varieties was observed even in short times of water stress (two days). The dry-sensitive variety showed changes in the expression of genes associated with DNA and ribosome binding proteins, throughout the entire period of drought stress evaluated. In this variety, the genus Streptomyces and the family Polyangiaceae showed the highest values of gene expression at 12 days of water stress, probably due to the ability to form spores or respond faster to environmental changes. Streptomyces also presented several negatively correlated transcripts with organic acids exuded by the plant, which may have acted as signals for changes in the expression of some of its genes. Finally, the results of the isolation of bacteria from CTC9001 sugarcane rhizosphere were presented in Chapter 3. The analyzes revealed a high abundance of Arthrobacter, Pseudomonas, Microbacterium and Bacillus genera. Many isolates showed positive results for plant growth capacity and growth under water stress (in the presence of PEG), suggesting that the isolates could be used as components of commercial biofertilizers for agriculture. Plant growth tests on tomato plants revealed that the isolate Pseudomonas sp. WS02-30 increased the root length of plants, probably due to its ability to produce indole acetic acid (IAA) and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/05929-0 CAPES

Orientador: Valéria Maia Merzel Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O manguezal é um dos biomas mais importantes para a manutenção da vida nos mares e o equilíbrio da biosfera. O sedimento do mangue é uma grande fonte de novos recursos genéticos para pesquisa. Estes ambientes têm sofrido impacto antropogênico por muito tempo, principalmente a poluição causada por derramamento de petróleo. Diversos estudos estão sendo conduzidos para explorar o potencial genético destas comunidades com a finalidade de desenvolver novos processos biotecnológicos para o tratamento de ambientes contaminados. Dentro deste contexto, este trabalho visou identificar e caracterizar genes que codificam dioxigenases, proteínas envolvidas na degradação de hidrocarbonetos aromáticos, a partir de clones fosmidiais de uma biblioteca metagenômica construída de sedimento de mangue impactado por petróleo do município de Bertioga-SP. A coleta e processamento das amostras ambientais, juntamente com a construção da biblioteca metagenômica fosmidial, foi realizada previamente no âmbito do projeto FAPESP "Prospecção de metagenoma microbiano de sedimentos de manguezais na busca por novos compostos bioativos" (Processo no. 2011/50809-5). O DNA metagenômico das amostras de sedimento, coletadas em triplicata, foi extraído e usado em reações de PCR para a construção de bibliotecas dos genes de dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos (ARHDs) e análise de seus padrões de distribuição biogeográfico. O DNA total da biblioteca fosmidial foi isolado e sequenciado em plataforma Illumina para prospecção in silico de genes envolvidos no metabolismo de compostos aromáticos. Ainda, os clones fosmidiais foram submetidos a uma triagem preliminar por colorimetria, baseada no uso do composto MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H-tetrazolium bromide] (Merck) e, posteriormente, ensaios de degradação de hidrocarbonetos por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) para confirmar e quantificar a atividade de degradação de hidrocarbonetos aromáticos (fenol, naftaleno, fenantreno, pireno e benzopireno) dos clones. O DNA fosmidial dos clones com melhor potencial de degradação foi sequenciado e processado para montagem de grandes fragmentos metagenômicos. Caracterização estrutural e funcional dos insertos metagenômicos foram feitos nas plataformas RAST e IMG, para elucidação de clusters gênicos envolvidos na degradação de hidrocarbonetos aromáticos. Alvos gênicos foram isolados, ligados em vetor de expressão pET28a(+) e transformados em cepas de E. coli BL21(DE3) e Rosetta. A análise da diversidade dos genes ?-ARHD revelou que Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella e Rhodococcus foram os cinco gêneros mais abundantes entre os 15 sítios analisados. A análise de distribuição biogeográfica revelou forte endemismo de algumas Operational Protein Families (OPF) de alfa-ARHD em cada região geográfica e uma considerável proximidade evolutiva entre OPFs encontradas em sítios da Antártica e da América do Sul. O sequenciamento da biblioteca fosmidial permitiu identificar um total de 71.729 sequências metagenômicas parciais na categoria SEED para metabolismo de compostos aromáticos (1% do total). Estas foram classificadas nas subcategorias Anaerobic degradation of aromatic compounds (20,34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35,40%), e Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22,56%). Além disso, foi evidenciado o predomínio das dioxigenases de Catecol, Protocatecuato e Homogentisato, envolvidas no metabolismo central, e das dioxigenases de Fenilpropionato, Lignostilbeno, Bifenil e Benzoato envolvidas nas vias periféricas de degradação de aromáticos. As análises de bioinformática dos dados de sequenciamento dos clones fosmidiais potencialmente degradadores revelaram uma interessante diversidade de genes envolvidos direta e indiretamente no metabolismo de compostos aromáticos. Os ensaios de cromatografia mostraram a eficiência de 3 clones na degradação de fenol (98%), pireno (75%) e naftaleno (71%). Os clones contendo os genes alvos para dioxigenases apresentaram sinais positivos nos testes de expressão. Os resultados deste trabalho permitiram elucidar a riqueza, distribuição e relação genética entre os genes ARHD de diferentes sítios ao redor do mundo. Além disso, a avaliação da biblioteca metagenômica pelas diferentes técnicas empregadas, revelou seu extenso potencial genético para o metabolismo de compostos aromáticos Abstract: Mangrove is one of the most important biomes for the maintenance of life in the seas and the balance of the biosphere. Mangrove sediment is a major source of new genetic resources for research. These environments have long been suffering anthropogenic impacts, especially pollution caused by oil spills. Many microbial species are able to degrade petroleum compounds, and several studies are being conducted to explore the genetic potential of these communities with the purpose of developing new biotechnological processes for the treatment of contaminated environments. In this context, this work aimed to identify and characterize genes encoding dioxygenases, proteins involved in the degradation of aromatic hydrocarbons, from fosmid clones of a metagenomic library constructed from oil-impacted mangrove sediments located in the city of Bertioga-SP. Sampling and further processing of environmental samples, together with the metagenomic fosmid library construction, were performed previously under the project "Bioprospecting microbial metagenome from mangrove sediments in the search for novel bioactive compounds" (FAPESP Process no. 2011/50809-5). Metagenomic DNA from sediment samples, collected in triplicate, was extracted and used in PCR reactions for the assembly of Aromatic Ring-Hydroxylating Dioxygenases (ARHDs) gene library and analysis of their biogeographic distribution patterns. Total fosmid DNA was isolated and sequenced on the Illumina platform for in silico prospecting of genes involved in the metabolism of aromatic compounds. Further, fosmid clones were subjected to a preliminary colorimetric screening, based on the use of the compound 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H-tetrazolium bromide (MTT, Merck) and, subsequently, to hydrocarbon degradation assays by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to confirm and quantify the aromatic hydrocarbon degradation activity (phenol, naphthalene, phenanthrene, pyrene and benzopyrene) of the clones. Fosmid DNA from clones with the best degradation potential was sequenced and processed for the assembly of large metagenomic fragments. Further structural and functional characterization of the metagenomic inserts was performed in the RAST and IMG platforms, to elucidate gene clusters involved in the aromatic hydrocarbon degradation. Gene targets were isolated, ligated into pET28a (+) expression vector and transformed into E. coli strains BL21 (DE3) and Rosetta. Diversity analysis of the ?-ARHD genes revealed that Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella and Rhodococcus were the five most abundant genera harboring dioxygenases among the 15 sites analyzed. The biogeographic distribution analysis revealed strong endemism of some Operational Protein Families (OPF) of alpha-ARHD in each geographic region and a significant evolutionary relatedness between OPFs found in sites of Antarctica and South America. Sequencing of the fosmid library allowed the identification of a total of 71,729 partial metagenomic sequences in the SEED category for the metabolism of aromatic compounds (1% of the total). These were classified in the categories of Anaerobic degradation of aromatic compounds (20.34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35.40%), and Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22.56%). In addition, we have demonstrated the predominance of Catechol, Protocatechuate and Homogentisate dioxygenases involved in central metabolism, and the dioxygenases of Phenylpropionate, Lignostilbene, Biphenyl and Benzoate involved in the peripheral pathways of aromatics degradation. Bioinformatics analyzes of sequencing data from potentially degrading fosmid clones revealed an interesting diversity of genes involved directly or indirectly in the aromatic compounds metabolism. Chromatography assays showed the efficiency of three clones in the degradation of phenol (98%), pyrene (75%) and naphthalene (71%). Clones containing the target genes for dioxygenase showed positive signals in expression tests. The results of this work allowed to elucidate the richness, distribution and genetic relationships among ARHD genes from different sites around the world. In addition, the evaluation of the metagenomic library by the different techniques employed revealed its extensive genetic potential for the aromatic compounds metabolism Doutorado Genética de Microorganismos Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/22555-4

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As lagoas das Salinas do Norte de Peru são geoformas, caracterizadas por depressões ou subsidências da costa do Oceano Pacífico. São considerados ambientes extremófilos e halofílicos devido à presença de sais na água e no solo, sendo os principais os cloretos, seguidos de sulfetos, bicarbonatos, brometos de magnésio, cálcio e potássio. O cloreto de sódio, comercialmente chamado de sal, é explorado pela população que vive nessas áreas. O presente estudo teve por objetivo isolar, caracterizar taxonomicamente bactérias presentes nas lagoas Salinas de Mórrope e Bayovar e avaliar a atividade antiproliferativa dos extratos brutos e suas frações destes micro-organismos frente a diferentes linhagens tumorais. Foram isoladas 211 bactérias, das quais 166 foram reativadas e caracterizadas morfologicamente e 50 foram identificadas por sequenciamento e análise filogenética do gene RNA ribossomal 16S. A identificação molecular agrupou as bactérias nos gêneros Streptomyces (n=39), Pseudonocardia (n=3), Staphylococcus (n=4), Pseudomonas (n=2) e Bacillus (n=2). Foram obtidos 23 extratos brutos a partir do crescimento microbiano e extração líquido-líquido com o solvente acetato de etila (AcOEt) para os testes antiproliferativos com Sulforodamina B (SRB) frente à linhagens tumorais. Os isolados M-92, B-146, B-81 e B-8 pertencem ao gênero Streptomyces e mostraram resultados promissores frente às células tumorais, U251 glioma; MCF7 mama; NCI-H460 pulmão tipo de não pequenas células. Para a amplificação da escala, fracionamento, isolamento e identificação de substâncias bioativas foram selecionados os isolados M-92, B-146, B-81 crescidos em três diferentes meios de cultura, NB, ISP2 e R2A, destes o meio R2A apresentou os melhores resultados em termos de atividade antiproliferativa, entretanto, o maior rendimento em massa foi obtido do meio ISP2. O extrato bruto e as frações do isolado B-81 foram avaliados por sua potencialidade em relação à atividade antiproliferativa frente a um painel de nove linhagens tumorais, U251 glioma; MCF7 mama; NCI-H460 pulmão tipo de células não pequenas, UACC-62 melanoma, NCI-ADR/RES ovário resistente a múltiplos fármacos, 786-O adenocarcinoma rim, OVCAR-03 ovário, HT-29 cólon e K562 leucemia, e uma não tumoral, HaCaT queratinócito, sendo a fração 3 (MeOH 100%) e a fração 4 (MeOH-AcOEt) as mais ativas. O perfil químico do extrato bruto e das frações do isolado B-81 foi investigado por UHPLC-MS e ESI-MS/MS e as moléculas detectadas por razão massa-carga (m/z) foram desreplicadas sendo possível sugerir a presença de substâncias descritas na literatura como Benastatin A, Phoslactomycin C, Actinomycin A, Asparenomycin A, Azinnomycin B, entre outras; biomoléculas já documentadas, além de novas moléculas que podem pertencer a outras classes químicas de compostos presentes nas actinobactérias do gênero Streptomyces. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o ambiente halofílico representa uma fonte promissora de microorganismos capazes de produzir novos compostos com potencial antiproliferativo Abstract: The Salinas lagoons of the North of Peru are geoforms, characterized by depressions or subsidence of the coast of the Pacific Ocean. Saline are considered as extremophilic and halophilic environments due to the presence of salts in water and soil, the main ones being chlorides, followed by sulfides, bicarbonates, bromides of magnesium, calcium and potassium. Sodium chloride, commercially called salt, is exploited by the population living in these areas. The present study aimed to isolate and taxonomically characterize bacteria present in the Salinas de Mórrope and Bayovar lagoons and to evaluate the antiproliferative activity of the crude extracts and their fractions of these microorganisms against different tumoral strains. 211 bacteria were isolated, of which 166 were reactivated and characterized morphologically and 52 were identified by sequencing and phylogenetic analysis of the 16S ribosomal RNA gene. The molecular identification grouped the bacteria in the genera Streptomyces (n = 39), Pseudonocardia (n = 3), Staphylococcus (n = 4), Pseudomonas (n = 2) and Bacillus (n = 2). Twenty-three crude extracts were obtained from the microbial growth and liquid-liquid extraction with the ethyl acetate solvent (AcOEt) for antiproliferative tests with Sulforodamine B (SRB) against tumor lines. The isolates M-92, B-146, B-81 and B-8 belong to the genus Streptomyces and showed promising results against tumor cells, U251 glioma; MCF7 breast; NCI-H460 non-small cell lung type. The isolates M-92, B-146, B-81 grown in three different culture media, NB, ISP2 and R2A were selected for the amplification of the scale, fractionation, isolation and identification of bioactive substances. Results in terms of antiproliferative activity, however higher mass yield was obtained from the ISP2 medium. The crude extract and fractions of the B-81 isolate were evaluated for their potential against antiproliferative activity against a panel of nine tumor lines, U251 glioma, MCF7 breast, NCI-H460 non-small cell lung, UACC-62 melanoma, NCI-ADR / RES multidrug resistant ovary, 786-adenocarcinoma kidney, OVCAR-03 ovary, HT-29 colon and K562 leukemia, and a non-tumor, HaCaT keratinocyte, fraction 3 (MeOH 100%) and fraction 4 (MeOH-AcOEt) the most active. The chemical profile of the crude extract and fractions of the B-81 isolate was investigated by UHPLC-MS and ESI-MS / MS and the molecules identified by m/z were de-replicated It is possible to suggest the presence of substances described in the literature such as Benastatin A, Phoslactomycin C, Actinomycin A, Asparenomycin A, Azinnomycin B, among others; biomolecules already documented, as well as new molecules that may belong to other chemical classes of compounds present in the actinobacteria of the genus Streptomyces. The results obtained in this study demonstrated that the halophilic environment represents a promising source of microorganisms capable of producing new compounds with antiproliferative potential Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CNPQ 190390/2014-0

Orientadores: Fabiana Fantinatti Garboggini, Luciana Konecny Kohn Dissertação (mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O ambiente marinho é uma preciosa fonte de diversidade biológica e genética, especialmente de micro-organismos. Embora a diversidade da comunidade microbiana nos ambientes marinhos seja muito ampla, especialmente nos ambientes extremos como o continente Antártica, pouco se conhece sobre essa diversidade. Muitos desses micro-organismos, são produtores de metabólitos secundários, podendo produzir compostos naturais com aplicações na indústria farmacêutica, entre outras aplicações de bioprospecção. Esse trabalho identificou por sequenciamento 16SrRNA, 145 isolados de sedimentos marinhos e macro-organismos como Salpa, Ascídia, Líquens e Algas oriundos da Baía do Almirantado, Ilha de Rei George, Antártica. Esses 145 isolados foram pertencentes a 4 filos; Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes e identificados em 28 gêneros distintos. Dentre esses 145 isolados observou-se a possibilidade de ter isolado possíveis espécies novas. Além disso, foram produzidos 22 extratos microbianos oriundos do genero Pseudoalteromonas ( 2 extratos), Psychrobacter (4 extratos), Planococcus (3 extratos), Bacillus ( 2 extratos), Brevibacterium ( 2 extratos), Kocuria ( 1 extrato), Arthrobacter (1 extrato), Pseudomonas (2 extratos), Saccharopolyspora (1 extrato), Salinibacterium (3 extratos) e Rhodococcus (1 extrato). Posteriormente esses extratos foram submetidos a extração líquido-líquido com a utilização do solvente acetato de etila para a obtenção da fração orgânica, essas foram submetidas a ensaios antivirais. Os ensaios avaliaram o potencial antiviral contra o Herpes vírus simplex tipo 1 (HSV-1) e contra o Bovine viral diarrhea virus (BVDV). O HSV-1 é um vírus que afeta principalmente a região orofacial dos seres humanos e BVDV é um dos principais patógenos bovinos, ambos os vírus apresentam distribuição mundial. Dos 22 extratos avaliados apenas 1, identificado como Pseudomonas sp. apresentou 99% de proteção contra o vírus HSV-1 e índice de seletividade de 8,88%. Nenhum extrato apresentou inibição igual ou superior a 97% de proteção contra o vírus BVDV. Esse trabalho evidenciou a possibilidade de revelar espécies novas de bactérias e de compostos biologicamente ativos com potencial anti-herpético oriundo do genero Pseudomonas Abstract: The marine environment is a precious source of biological and genetic diversity, especially of micro-organisms. While the diversity of the microbial community in marine environments is very wide, especially in extreme environments such as the Antarctic continent, little is known about this diversity. Many of these micro-organisms are producers of secondary metabolites and can produce natural compounds with applications in the pharmaceutical industry, among other bioprospecting applications. This work identified by 16S rRNA sequencing, 145 isolated from marine sediments and macro-organisms as Salpa, Squirt, Lichens and Algae coming from Admiralty Bay, King George Island, Antarctica. These 145 isolates were belonging to 4 phyla ; Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes and were identified in 28 distinct genera. Beteween these 145 isolates it is possible had isolated new speciesof bacterias. In addition, we produced 22 microbial extracts derived from Pseudoalteromonas (2 extracts), Psychrobacter (4 extracts), Planococcus (3 extracts), Bacillus (2 extracts), Brevibacterium (2 extracts), Kocuria (1 extract), Arthrobacter (1 extract), Pseudomonas (2 extracts), Saccharopolyspora (1 extract), Salinibacterium (3 extracts) and Rhodococcus (1 extract). Subsequently, these extracts were undergoing liquid-liquid extraction with the use of ethyl acetate solvent to obtain the organic fraction, these were subjected to antiviral assays. The assays evaluated the antiviral potential against Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and against Bovine viral diarrhea virus (BVDV). HSV-1 is a virus that mainly affects the orofacial region of human and BVDV is a major cattle pathogens, both viruses have worldwide distribution. Of this 22 extracts only one, identified as Pseudomonas sp. showed 99% protection against HSV-1 and 8.88% selectivity index. No extract showed inhibition less than 97% protection against BVDV virus. This work highlighted the possibility to reveal new species of bacteria and biologically active compounds with anti-herpetic potential derived from the genus Pseudomonas Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES 2013/05113-8 FAPESP 2013/05961-9

Orientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Burkholderia andropogonis, inicialmente descrita por Smith (1911) como Bacterium andropogonis, agente causal de doença em sorgo (Sorghum bicolor), causa sintomas como manchas e listras foliares em uma ampla gama de hospedeiros com extensa distribuição geográfica. Essa espécie bacteriana possui características únicas ausentes na maioria dos patógenos de planta, como a presença de um único flagelo polar do tipo embainhado e produção de metabólitos secundários do tipo rizobiotoxina. O objetivo desse estudo foi caracterizar a diversidade bioquímica, genética e patogênica de 42 linhagens de B. andropogonis e reavaliar a relação filogenética dessa espécie bacteriana dentro do gênero Burkholderia. Características bioquímicas e fisiológicas diferenciais não foram observadas entre as linhagens isoladas de diferentes hospedeiros e regiões geográficas, assim como não foi verificada especialização patogênica nos testes de patogenicidade em diferentes plantas hospedeiras. Na caracterização molecular, a técnica de rep-PCR mostrou-se um método sensível para medir a variação genética dentro desta espécie bacteriana, uma vez que a análise combinada utilizando REP-, ERIC- e BOX-PCR permitiu a separação das linhagens em grupos de acordo com seus hospedeiros específicos e/ou localização geográfica. Nas análises filogenéticas do gene RNA ribossomal 16S e de multilocus (MLSA) utilizando cinco genes housekeeping (gyrB, recA, lepA, atpD e gltB), B. andropogonis ficou separada das demais espécies do gênero, com baixas porcentagens de similaridade entre as sequências dos genes. O sequenciamento do genoma da linhagem Tipo de B. andropogonis também foi realizado nesse estudo e uma análise de multilocus utilizando 30 diferentes genes conservados mais uma vez mostrou que B. andropogonis permaneceu separada das demais espécies do gênero Burkholderia. Além disso, a identidade média de nucleotídeos (ANI), a frequência de tetranucleotídeos (TETRA) e o porcentual de proteínas conservadas (POCP) foram calculados e B. andropogonis apresentou valores mais baixos nas comparações aos pares com 12 diferentes espécies do gênero Burkholderia, reforçando a distância observada nas análises filogenéticas. Nossos resultados claramente colocaram B. andropogonis em um grupo distinto que pode representar um novo gênero Abstract: Burkholderia andropogonis initially described by Smith (1911) as the causal agent of leaf stripe disease on sorghum (Sorghum bicolor), affects a wide range of host plants economically important with an extensive geographical distribution. This bacterial species has unique features absent in most plant pathogens such as a single polar sheathed flagellum and rhizobitoxine production. The aim of this study was to assess the genetic, biochemical and pathogenic diversity among Burkholderia andropogonis strains and to establish the phylogenetic relationship of this bacterial species within Burkholderia genus. Differential biochemical and physiological features were not observed among strains isolated from different host and different geographical origins, as well as host specialization was not observed in the pathogenicity tests on distinct plant species. In the molecular characterization the rep-PCR technique was a sensitive method to measure the genetic variation within this bacterial species once the combined analysis using REP, ERIC and BOX-PCR allowed separation of strains into clusters according to specific hosts and/or geographical location. . The phylogenetic analysis using 16S rRNA gene and multilocus sequence analysis (MLSA) using five housekeeping genes (gyrB, recA, lepA, atpD e gltB) allowed clear separation of B. andropogonis from the other species of the genus, with low percentages of similarity among the genes sequences. After the genome sequencing of B. andropogonis type strain a multilocus analysis using 30 different conserved genes was also performed and again, B. andropogonis remained separated from the species of the Burkholderia genus. In addition, the average nucleotide identity (ANI), tetranucleotide frequency signature (TETRA), and percentage of conserved proteins (POCP) analyses were also carried out, and B. andropogonis species showed lower values when compared to the other Burkholderia species, reinforcing the distance observed in the molecular analyses. Our findings clearly indicates that B. andropogonis belongs to a distinct group and may represent a new genus Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2011/12222-2

Orientadores: Fabiana Fantinatti Garboggini, Marta Cristina Teixeira Duarte Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os micro-organismos associados ao continente Antártico apresentam populações diversas e metabolicamente ativas, porém o potencial farmacológico dos compostos obtidos pelos micro-organismos é pouco conhecido. As bactérias são importante fonte de compostos utilizados atualmente como antimicrobianos, e as principais vias de biossíntese de muitos antibióticos são catalisadas pelos genes PKS (Polyketide Synthases) e NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases). O presente estudo teve como objetivo a avaliação genética e funcional da produção de compostos antimicrobianos obtidos de bactérias isoladas na Baía do Almirantado, Antártica, a identificação taxonômica das bactérias que apresentaram tal potencial e a identificação do perfil químico dos compostos antimicrobianos. O total de 153 bactérias foi isolado do ambiente antártico, 127 isolados apresentaram pelo menos um dos genes PKSI, PKSII e NRPS. Estes foram identificados através do sequenciamento parcial do gene RNA ribossomal 16S e pertencem a 28 gêneros distintos, sendo representantes dos Filos Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes. A avaliação funcional da produção de antimicrobianos foi realizada com o total de 76 isolados dos quais 30 isolados formaram halos de inibição frente a micro-organismos testes. Os extratos brutos obtidos foram avaliados quanto à concentração inibitória mínima (MIC) frente a oito micro-organismos não virulentos, e 18 extratos brutos apresentaram atividade inibitória, onde se destaca o extrato denominado E131, obtido da bactéria do gênero Streptomyces, que apresentou atividade bacteriostática frente S. aureus e M. luteus, e atividade bactericida frente a C. albicans e B. subtilis. Frente a micro-organismos isolados de amostras clínicas, 11 extratos brutos apresentaram atividade inibitória frente a quatro cepas de Neisseria meningitides, com MIC dos extratos brutos variando de 0,0313 mg.mL-1 até 2,0 mg.mL-1. O extrato E46, obtido da bactéria Pseudoalteromonas sp., destacou-se quanto à atividade inibitória observada frente às quatro cepas avaliadas. Frente à cepa B4, destacam-se a atividade antimicrobiana dos extratos brutos obtido das bactérias Pseudoalteromonas sp. e Pseudomonas azotoformans CUG12536. Frente à cepa YUSA, destaca-se a atividade antimicrobiana observada pelo extrato bruto obtido da bactéria Marinilactibacillus sp., cuja atividade antimicrobiana foi relatada pela primeira vez neste gênero de bactéria. Os extratos brutos possuem em sua composição, compostos cuja atividade antimicrobiana é conhecida, como ácidos graxos e compostos cuja atividade antimicrobiana não está descrita na literatura. Os testes de fracionamento dos extratos frente a solventes de diferentes polaridades indicou que os extratos brutos são solúveis, em sua maioria, a solvente polar. Portanto, as bactérias isoladas da Antártica produzem compostos de interesse farmacológico e podem ser utilizadas como fonte de novos compostos. Tais resultados enfatizam a necessidade de mais estudos de bactérias associadas a ambientes extremos, como a Antártica Abstract: Microorganisms associated with the Antarctic continent have various and metabolically active populations, but the pharmacological potential of compounds obtained by micro-organisms is poorly understood. Bacterias are an important source of compounds currently used as antimicrobial, major biosynthetic pathways of many antibiotics are catalyzed by the PKS genes (Polyketide Synthases) and NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases). This study had the objective to genetic and functional evaluation of the antimicrobial activity of bacteria isolated in Admiralty Bay, Antarctica, and the taxonomic identification of bacteria that had such potential and identification of the chemical profile of antimicrobial compounds. The total of 153 bacteria was isolated from Antarctic environment, among the isolates, 127 isolates showed at least one of the genes PKSI, PKSII and NRPS. These were identified by partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene and belong to 28 different genera, with representatives of the phyla Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes. The functional evaluation of the production of antibiotic was conducted with a total of 76 isolates including 30 isolates that formed inhibition halos against test microorganisms. The crude extracts were evaluated as the minimum inhibitory concentration (MIC) against eight non-virulent microorganisms, and 18 crude extracts showed activity, highlighting the so-called E131 extract, obtained from bacteria of the genus Streptomyces, which showed bacteriostatic activity against S. aureus and M. luteus, and bactericidal activity against C. albicans and B. subtilis. Faced with microorganisms isolated from clinical samples, 11 crude extracts showed inhibitory activity against four strains of Neisseria meningitides, with MIC ranging from 0.0313 mg.mL-1 to 2.0 mg.mL-1. The E46 extract obtained from the bacterium Pseudoalteromonas sp., stood out as the inhibitory activity observed across the four evaluated strains. Faced with the strain B4, stand out the antimicrobial activity of crude extracts obtained from bacteria Pseudoalteromonas sp. and Pseudomonas azotoformans CUG12536. Against YUSA strain, Marinilactibacillus sp. crude extract showed antimicrobial activity, which was the first reported in this bacterial genus. The extracts have in their composition, antimicrobial compounds whose activity is known, such as fatty acids, and compounds whose antimicrobial activity is not described in the literature. Fractionation tests of extracts using solvents of different polarities, indicated that the crude extracts are soluble mostly the polar solvent. Therefore, the bacteria isolated from the Antarctic produce compounds of pharmacological interest and can be used as a source of novel compounds. These results highlight the need for more studies of bacteria associated with extreme environments, such as Antarctica Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A sarna da batata é uma doença de ocorrência generalizada nas regiões produtoras do Brasil, tornando-se um fator limitante no cultivo dessa cultura. Essa doença afeta a qualidade da batata por lesões na superfície do tubérculo, que diminuem seu valor comercial ou impedem a comercialização. Diferentes espécies do gênero Streptomyces são causadoras dessa doença e o levantamento das espécies patogênicas presentes em regiões produtoras do Brasil é um fator primordial para a realização de medidas de manejo. O presente trabalho teve por objetivo a caracterização de 57 linhagens de Streptomyces, consideradas possíveis novas espécies associadas à sarna da batata no Brasil, por meio de taxonomia polifásica. Foi realizada a caracterização morfológica, bioquímica, patogênica (genes nec1, tomA e txtAB e testes de patogenicidade in vitro em rabanete e batata) e molecular (primers específicos para S. acidiscabies, S. scabiei e S. turgidiscabies, PCR-RFLP do gene atpD, análises de multilocus - genes atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB e do gene 16S RNAr) das linhagens. Utilizando-se as técnicas de PCR-RFLP do gene atpD e análise de sequências dos genes atpD e rpoB as linhagens foram, inicialmente, separadas em 20 grupos genéticos (G1 a G20). Esses grupos apresentaram alta heterogeneidade com relação à morfologia da cadeia de esporos, à produção de pigmentos e ao aspecto e coloração das colônias e dos esporos, bem como na utilização de diferentes fontes de carbono. Das 57 linhagens analisadas, 24 (35,3%) apresentaram amplificação dos três genes de patogenicidade avaliados, seis (8,8%) não apresentaram nenhum dos genes e 38 (55,9%) apresentaram diferentes combinações com ausência de um ou mais genes. Todas as linhagens mostraram-se patogênicas ao rabanete causando sintomas de necrose, inchaço radial e/ou nanismo da parte aérea e raiz, no entanto, apresentaram diferenças no grau de virulência. As linhagens mais virulentas também foram avaliadas em testes de patogenicidade em fatias de batata e a agressividade das mesmas, determinada pela extensão e profundidade da necrose, foi dependente da cultivar testada, sendo que todas as variedades avaliadas foram suscetíveis. A relação filogenética das linhagens foi estabelecida junto às principais espécies de Streptomyces fitopatogênicas e a maioria dos grupos genéticos ficou alocada em ramos distintos e/ou com baixos valores de similaridade de sequências. O grupo G11 ficou filogeneticamente próximo de S. scabiei e suas genomoespécies e o G7 próximo de S. turgidiscabies/S. reticuliscabiei, porém, esses grupos não apresentaram amplificação com primers espécie-específicos e apresentaram características morfológicas diferentes. Os dados moleculares, associados às características morfológicas, bioquímicas e patogênicas das linhagens, permitiram a confirmação de que os grupos genéticos representam pelo menos 34 novas espécies de Streptomyces fitopatogênicas no Brasil. Os polimorfismos nas sequências do gene atpD permitiram o desenvolvimento de primers específicos para as espécies S. caviscabies/S. setonii (Cavis1F/Cavis4R) e S. scabiei (ScADF2/ScADR1). A especificidade desses primers foi confirmada em experimentos de amplificação utilizando-se DNAs de outras espécies de Streptomyces causadoras da sarna da batata. O nível de sensibilidade da técnica de PCR utilizando-se os primers Cavis1F/Cavis4R foi de 0,1 pg. Ainda, nas análises de AFLP, a combinação de primers E21/M16 foi selecionada como marcador molecular para estudos taxonômicos dentro do grupo de espécies de Streptomyces fitopatogênicas Abstract: Potato scab is a widespread disease in growing areas in Brazil, becoming a limiting factor in potato production. This disease affects potato quality due to injuries on the tuber surface decreasing its market value or precluding its commercialization. Several species of the genus Streptomyces causing potato scab are known and the survey of pathogenic species present in the Brazilian producing areas is the most important factor for performing management measures. This study aimed to characterize 57 strains of Streptomyces, considered possible new species associated with potato scab in Brazil, through polyphasic taxonomy. The morphological, biochemical, pathogenic (nec1, tomA and txtAB genes and in vitro pathogenicity tests on radishes and potatoes) and molecular characterization (species-specific primers for S. acidiscabies, S. scabiei and S. turgidiscabies, PCR-RFLP of atpD gene, multilocus sequence analysis of atpD, gyrB, recA, rpoB and trpB genes and 16S rRNA gene sequence analysis) of the strains were performed. Using PCR-RFLP of atpD gene technique and sequence analysis of atpD and rpoB genes, the strains were initially separated into 20 genetic groups (G1 to G20). These groups showed high heterogeneity in their spore chains morphology, pigment production and the appearance and color of the colonies and spores, as well as the utilization of different carbon sources. From a total of 57 strains evaluated, 24 (35.3%) showed presence of the three pathogenicity genes, six (8.8%) showed no amplification of the genes and 38 (55.9%) showed absence of one or more genes. All strains were pathogenic on radish causing symptoms of necrosis, radial swelling and/or stunting of shoot and roots, however, they showed differences in virulence level. The most virulent strains were evaluated in pathogenicity test on potato tubers slices and the aggressiveness of the strains, determined by the extent and depth of necrosis, was dependent on the cultivar of potato used, and all evaluated varieties were susceptible. The phylogenetic relationship of the strains has been established with respect to the main species of plant pathogenic Streptomyces and most groups were allocated in different branches and/or with low sequence similarity values. G11 group was closely related to S. scabiei and its genomospecies and G7 was allocated with S. turgidiscabies/S. reticuliscabiei, but they showed no amplification in experiments using species-specific primers and different morphological features were observed. The molecular data, associated with morphological, biochemical and pathogenic characteristics of the strains, allowed confirmation that these genetic groups represent at least 34 new species of phytopathogenic Streptomyces in Brazil. The polymorphisms in the atpD gene sequences allowed the development of species-specific primers for S. caviscabies/S. setonii (Cavis1F/Cavis4R) and S. scabiei (ScADF2/ScADR1). The specificity of these primers was confirmed by amplification experiments using DNA from other Streptomyces species causing potato scab. Sensitivity level of the PCR technique using the Cavis1F/Cavis4R primers was 0.1 pg. Further, in AFLP analyzes, E21/M16 primers set was selected as molecular marker for taxonomic studies within the group of plant pathogenic species of Streptomyces Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2011/02994-8