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Orientador: Luís Felipe de Toledo Ramos Pereira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os anfíbios são os animais mais ameaçados do planeta, tendo como fatores mais impactantes a perda de habitat e a quitridiomicose. Esta doença em anuros é causada pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que já foi registrado em todos os continentes e no Brasil estende-se por toda a Mata Atlântica, e já foi encontrado no Cerrado e na Amazônia. Existem diversos fatores que podem influenciar a dinâmica de infecção na natureza, e como fatores intrínsecos ao Bd podemos citar a variação genotípica, morfológica, variação na virulência e taxas de crescimento. Com isso, o presente estudo teve como objetivos realizar a caracterização genotípica e fenotípica de cepas de Bd provenientes de um gradiente de elevação na Mata Atlântica, e verificar se existem associações entre o tamanho dos zoósporos e zoosporângios das cepas isoladas com dados de prevalência e intensidade de infecção e taxa de crescimento do Bd. Adicionalmente, foi analisado se as taxas de infecção aumentam conforme o aumento da elevação. Para tanto, foram isoladas e genotipadas cinco cepas de Bd. Foi realizado o diagnóstico e quantificação da doença, assim como a confecção de suas curvas de crescimento. Com base nos resultados foram desenvolvidos dois índices relacionados à variação em tamanho e dados de prevalência e intensidade de infecção. Todas as cepas isoladas pertencem à linhagem Bd-GPL2. Foi detectada variação fenotípica entre as cepas e associações entre tamanho das cepas com prevalência e intensidade de infecção, e não houve associação com as taxas de crescimento. A prevalência e intensidade de infecção não aumentaram com a altitude. Os índices de tamanho e infecção também foram associados. Com isso, a variação fenotípica pode ser considerada preditora da dinâmica de infecção do Bd na natureza. Isto poderá ser utilizado como eficiente ferramenta de baixo custo para estudos que busquem reconhecer áreas nas quais o fungo pode ser mais prevalente e apresentar maior intensidade de infecção. Estes fatores podem ser cruciais para determinar populações de anfíbios ameaçadas Abstract: Amphibians are the most threatened animals of the world. Habitat loss and chytridiomicosys are considered the main causes for their declines. Chytridiomycosis is a disease caused in anurans by the fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), detected worldwide. In Brazil it was registered all over the Atlantic rainforest and in some localities of the Cerrado and Amazonia. Several factors influence this disease dynamics, such as intrinsic factors related to Bd: different lineages, morphology, virulence, and growth rate. Given these factors, the present study aimed to genotype and analyze Bd strain¿s size from an elevational range, and verify if these factors were correlated to Bd size, prevalence, infection load, growth rate, and elevation. We isolated and genotyped five strains, and quantified growth rates. We developed two indexes related to Bd size, prevalence, and infection load. The five strains were Bd-GPL2. We found size variation and correlations between Bd size, prevalence, and infection load, but not with growth rate. Prevalence and infection load did not increase with elevation. The size and infection indexes were correlated. The phenotypic variation can be considered as a predictor to disease dynamics on environment. It can be used in other studies as a tool to efficiently (cheap and fast) identify areas where the fungus can develop faster and be more deleterious to amphibian populations Mestrado Biodiversidade Animal Mestra em Biologia Animal

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Amphibians have suffered a widespread population decline across the globe. About 40% of existing amphibian species are threatened with extinction. Solar ultraviolet (UV) radiation (280-400 nm) has the capacity to form cytotoxic and mutagenic lesions in the amphibian genome, which may compromise the performance and fitness of these animals. Factors such as the decrease of stratospheric ozone, climate changes, deforestation and decrease of organic matter in water bodies have increased the incidence of solar UV radiation upon amphibian breeding sites. In contrast, in order to minimize the harmful effects of UV-induced lesions on their genome, amphibians have mechanisms capable of repairing them, such as photorepair (or photoreactivation), which involves the absorption of light (350-700 nm) by means of enzymes called photolyases and the transfer of electrons to the lesions, thus removing them. However, photorepair capacity varies among species, and the inefficiency of this mechanism is a possible determinant factor for population decline of UV-sensitive species. Taking this into account, the general objective of this work was to evaluate the importance of DNA photorepair in amphibians. First, the biological responses of amphibians to UV-induced DNA damage, which include photorepair capability, have been discussed through a broad review of existing literature on this topic. The results show that only three out the 21 studies found directly evaluated the UV-induced DNA lesions in vivo. As a consequence, DNA repair mechanisms are very few studied and understood. Thus, the importance of DNA photorepair for the maintenance of the feeding performance of forest specialist tadpoles previously exposed to a low environmental dose of UVB radiation (280-315 nm) was evaluated through a controlled experimental study with a species of treefrog threatened with extinction [Boana curupi (Garcia, Faivovich and Haddad, 2007); Anura; Hylidae]. The results demonstrate that UVB radiation negatively impacted tadpole weight due to reduced food consumption, which in turn was a consequence of the genotoxic impact of UVB. An additional treatment with visible light (post-UVB) suggested a low efficiency of DNA photorepair in this species, since body weight and food consumption activity remained affected. In addition, in silico analyzes were conducted with the objective of understanding the molecular basis of amphibian photolyases. Homology analyzes were performed with sequences of amphibian photolyases. Only annotated and accurate sequences were obtained from GenBank, BLASTp and tBLASTn (NCBI). The results demonstrate interspecific variations in the occurrence of these enzymes and the possible bad annotation of some sequences. From these results, future perspectives are discussed. The present dissertation demonstrates that there is still a lack of understanding of amphibian photolyases, and that possible new avenues on this subject must be traced in order to better elucidate the role of photorepair in amphibians. Therefore, the contribution of solar UV radiation to the decline of amphibians, and the importance of DNA photorepair to avoid the UV-induced genotoxic effects on amphibian species may become more evident in the near future. Os anfíbios têm sofrido um declínio populacional generalizado em todo o globo. Em torno de 40% das espécies de anfíbios existentes estão ameaçadas de extinção. A radiação ultravioleta (UV) solar (280-400 nm) possui a capacidade de formar lesões citotóxicas e mutagênicas no genoma de anfíbios, as quais podem comprometer o desempenho e aptidão destes animais. Fatores como o decréscimo do ozônio estratosférico, mudanças climáticas, desmatamento e diminuição de matéria orgânica em cor-pos de água, têm aumentado a incidência de radiação UV solar em sítios reprodutivos de anfíbios. Em contrapartida, a fim de minimizar os efeitos prejudiciais das lesões induzidas pela UV em seu genoma, anfíbios possuem mecanismos capazes de repará-las, tais como o fotorreparo (ou fotorreativação), o qual envolve a absorção de luz (350-700 nm) por meio de enzimas chamadas fotoliases e a transferên-cia de elétrons às lesões, assim removendo-as. No entanto, a capacidade de fotorreparo varia entre espécies, sendo a ineficiência deste mecanismo um possível fator determinante para o declínio popula-cional de espécies sensíveis à radiação solar. Levando isto em consideração, o objetivo geral deste trabalho consistiu em avaliar a importância do fotorreparo de DNA em anfíbios. Primeiramente, as respostas biológicas de anfíbios aos danos de DNA induzidos pela UV, as quais incluem a capacidade de fotorreparo, foram discutidas através de uma revisão ampla da literatura existente sobre este tópico. Os resultados demonstram que apenas três trabalhos dos 21 encontrados avaliaram diretamente as lesões de DNA induzidas pela UV in vivo. Como consequência, os mecanismos de reparo de DNA são pouquíssimos estudados e compreendidos. Desta forma, a importância do fotorreparo de DNA para a manutenção do desempenho alimentar de girinos especialistas florestais previamente expostos a uma baixa dose ambiental de radiação UVB (280-315 nm) foi avaliada através de um estudo experimental controlado com girinos de uma espécie de perereca ameaçada de extinção [Boana curupi (Garcia, Fai-vovich e Haddad, 2007); Anura; Hylidae]. Os resultados demonstram que a radiação UVB impactou negativamente no peso dos girinos devido a uma redução do consumo de alimento, que por sua vez foi consequência do impacto genotóxico da UVB. O tratamento adicional com luz visível (pós UVB) su-geriu uma baixa eficiência do fotorreparo de DNA nesta espécie, uma vez que o peso corporal e a ati-vidade de consumo de alimento permaneceram afetados. Adicionalmente, análises in silico foram con-duzidas com o objetivo de compreender as bases moleculares das fotoliases de anfíbios. Análises de homologia foram realizadas com sequências de fotoliases de anfíbios. Apenas sequências anotadas e acuradas foram obtidas a partir do GenBank, BLASTp e tBLASTn (NCBI). Os resultados demonstram variações interespecíficas na ocorrência destas enzimas e a possível má anotação de algumas sequên-cias. A partir destes resultados, perspectivas futuras são discutidas. A presente dissertação demonstra que há ainda uma falta de compreensão do fotorreparo em anfíbios, e que possíveis novas avenidas sobre este tema devem ser traçadas, a fim de melhor elucidar o papel do fotorreparo em anfíbios. Por-tanto, a contribuição da radiação UV solar para o declínio de anfíbios e a importância do fotorreparo de DNA para evitar os efeitos genotóxicos induzidos pela radiação UV em espécies de anfíbios pode se tornar mais evidente em um futuro próximo.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul On the last decades, amphibian populations have been suffering a global decline, and different factors can be related to this process. Parallel observations between the decrease of stratospheric ozone concentration in the late 1970s and amphibian decline in early 1980s aroused interest to study the possible association among increased incidence of ultraviolet radiation (UV) and amphibian decline. The UV radiation has important biological impact on living organisms due to their ability to induce lesions in the DNA molecule, which may result in the induction of mutations or cell death. Photoreactivation is an important DNA repair mechanism that promotes the reversal of UV-induced DNA damage by photolyase enzymes after the absorption of UVA and visible light photons. In this study, we evaluated the biolocial effects of UVB and UVA through morphological, histological, locomotor and survival of Hypsiboas pulchellus (Anura: Hylidae) tadpoles. Tadpoles kept in the laboratory were submitted to acute and chronic treatments, composed of different doses of UVB and UVA exposures. The results of survival curves indicate that the H. pulchellus is very sensitive to UVB radiation comparative to UVA. However, despite the high tadpole survival after UVA, they showed serious malformations after metamorphosis. Tadpoles body weight also suffered influence of different UV radiation doses, however the body length was bit affected. The locomotor capacity (horizontal and vertical speed) of UVB-exposed tadpoles has been significantly changed. In addition, UVB radiation had severe impact on the skin (stratum corneum) and mouth (rows of teeth and jaw sheaths) keratin structures of tadpoles, indicating that these should be important impacts of solar UV radiation in reducing the performance of these organisms. In parallel, it was also possible to observe the extreme importance of activation of photolyases for the repair of DNA damage after treatment with UVB but not UVA. Therefore, in this study, we present a wide characterization of the biological effects of solar UVB and UVA on the performance of H. pulchellus tadpoles. Durante as últimas décadas, as populações de anfíbios vêm sofrendo um declínio generalizado e diferentes fatores são sugeridos como responsáveis por esse efeito. Observações paralelas entre o rápido decréscimo da concentração do ozônio estratosférico no final da década de 1970, com o declínio de anfíbios no início da década de 1980, despertaram grande interesse para se estudar as possíveis associações entre o aumento da incidência de radiação ultravioleta (UV) na superfície e a redução do número de espécies de anfíbios. Sabe-se que a radiação UV solar tem importante impacto biológico na vida dos organismos devido a sua grande capacidade de induzir lesões na molécula de DNA, que podem levar a indução de mutações ou morte celular. Um dos principais mecanismos de reparo de DNA é a fotorreativação que ocorre por meio das enzimas fotoliases, as quais promovem reversão dessas lesões ao absorver fótons de luz UVA e luz visível. Neste projeto, avaliou-se a ação biológica da radiação UVB e UVA a partir de dados morfológicos, histológicos, locomotores e de sobrevivência de girinos da espécie Hypsiboas pulchellus (Anura: Hylidae). Girinos coletados e mantidos no laboratório foram submetidos a tratamentos agudos e crônicos, compostos por exposições a diferentes doses de luz UVB e UVA. Os resultados de sobrevivência indicam que os girinos de H. pulchellus são muito sensíveis à radiação UVB em relação à UVA. Entretanto, apesar da alta sobrevivência dos indivíduos submetidos à radiação UVA, estes apresentaram sérias malformações em longo prazo. A massa corporal dos girinos também sofreu influência das diferentes doses de radiação UV aplicadas, entretanto o comprimento total foi pouco influenciado. A capacidade locomotora (vertical e horizontal) dos organismos expostos à luz UV foi bastante alterada, onde se destaca a grave redução da atividade locomotora dos indivíduos tratados com radiação UVB. Adicionalmente, a radiação UVB teve impacto severo nas estruturas de queratina da pele (estrato córneo) e da boca (queratodontes e mandíbula) dos girinos, indicando que esses devem ser impactos principais da radiação UV solar na redução da performance desses organismos. Em paralelo, também foi possível observar a extrema importância da ativação das enzimas fotoliases para a reparação dos danos de DNA, assim como os seus efeitos após os tratamentos com radiação UVB, mas não com UVA. Portanto, no presente trabalho, foi possível apresentar uma ampla caracterização dos efeitos biológicos da radiação UVB e UVA solar na performance de girinos de H. pulchellus.

Orientador: Luís Felipe de Toledo Ramos Pereira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os anfíbios são o grupo de vertebrados mais ameaçados em todo o mundo. As principais ameaças ao grupo são a perda de habitat e a quitridiomicose, uma doença infecciosa emergente causada pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). O fungo se distribui por todos os continentes do mundo levando populações de anfíbios ao declínio ou extinção, e no Brasil sua distribuição é pouco compreendida. Muitos declínios foram registrados no sudeste do Brasil, principalmente nas décadas de 1970 e 1980, e as causas para esses declínios permanecem pouco esclarecidas. Em nosso trabalho analisamos aparatos bucais de mais de 30 mil girinos de todo o Brasil preservados em museus. Com isso, fomos capazes de identificar a distribuição do Bd em todo o território nacional e correlacionar positivamente o aumento da prevalência da quitridiomicose com os declínios registrados na Mata Atlântica Abstract: Amphibians are the most threatened group of vertebrates in the world. The main threats to the group are habitat loss and chytridiomycosis, an emerging infectious disease caused by the fungus Batrachochytrium (Bd). The fungus is spread over all continents of the world leading amphibian populations to decline or extinction, and in Brazil its distribution is poorly understood. Many declines were recorded in southeastern Brazil, mainly in the 70's and 80's, and the causes for these declines remain unclear. In our work we analyze buccal apparatus of more than 30 thousand tadpoles from all over Brazil preserved in museums. Thus, we were able to identify the distribution of Bd throughout the country and positively correlate the increased prevalence of chytrid with the declines recorded in the Atlantic Forest Mestrado Ecologia Mestra em Ecologia CAPES FAPESP 2014/23388-7