Search

Abordagens para o teste genético pré-implantacional não-invasivo para aneuploidias (non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies, niPGT-A, em inglês) com o objetivo de avaliar o DNA embrionário livre são promissoras, especialmente porque estas podem reverter as menores taxas de implantação causadas por inadequada biópsia de trofectoderma (TE). Nesse contexto, nosso centro é parte do maior estudo atual que avalia as taxas de concordância entre PGT-A convencional e niPGT-A, e relatamos aqui o nascimento do primeiro bebê brasileiro após niPGT-A. Os pais do bebê foram admitidos no nosso centro em 2018. Eles não apresentavam histórico de infertilidade, e estavam interessados em utilizar os tratamentos de fertilização in vitro (FIV) e PGT-A para evitar anomalias congênitas na progênie. Um total de 11 blastocistos expandidos (3 do dia-5 e 8 do dia-6) foram submetidos a biópsia, e os meios de cultivo condicionados (cultivo do dia-4 ao dia-6) de 8 blastocistos do dia-6 foram coletados para niPGT-A. No total, resultados informativos para as amostras de TE e dos meios foram obtidos para sete embriões. Entre os embriões com resultado informativo, 5 apresentaram diagnóstico concordante entre PGT-A convencional e niPGT-A, e 2 apresentaram diagnóstico discordante (1 falso positivo e 1 falso negativo). O Blastocisto 4, diagnosticado como 46, XY por ambos niPGT-A e PGT-A convencional, foi desvitrificado e transferido, o que resultou no nascimento de um menino saudável, que pesava 3,8 kg, em fevereiro de 2020. Com base em nossos resultados e literatura contemporânea, acreditamos que a aplicação atual mais segura do niPGT-A seria como método de seleção embrionária para pacientes sem indicação ao PGT-A convencional. A confiabilidade aproximada de 80% do niPGT-A para determinação da ploidia ainda é superior àquela obtida com abordagens não invasivas, como seleção morfológica ou morfocinética. Non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies (niPGT-A) aiming to assess cell-free embryonic DNA in spent culture media is promising, especially because it might overcome the diminished rates of implantation caused by the inadequate performance of trophectoderm (TE) biopsy. Our center is part of the largest study to date assessing the concordance between conventional PGT-A and niPGT-A, and we report here the delivery of the first baby born in Brazil using niPGT-A. The parents of the baby were admitted to our center in 2018. hey did not present history of infertility, and they were interested in using in vitro fertilization (IVF) and PGT-A in order to avoid congenital anomalies in the offspring. A total of 11 (3 day-5 and 8 day-6) expanded blastocysts were biopsied, and the spent culture media (culture from day-4 to day-6) from 8 day-6 blastocysts were collected for niPGT-A. Overall, 7 embryos yielded informative results for trophectoderm (TE) and media samples. Among the embryos with informative results, 5 presented concordant diagnosis between conventional PGT-A and niPGT-A, and 2 presented discordant diagnosis (1 false-positive and one false-negative). The Blastocyst 4, diagnosed as 46, XY by both niPGT-A and conventional PGT-A, was warmed up and transferred, resulting in the birth of a healthy 3.8 kg boy in February 2020. Based on our results and the recent literature, we believe that the safest current application of niPGT-A would be as a method of embryo selection for patients without an indication for conventional PGT-A. The approximate 80% of reliability of niPGT-A in the diagnosis of ploidy is superior to predictions provided by other non-invasive approaches like morphology and morphokinetics selection.

RESUMEN La fecundación consiste en la fusión de los gametos masculino y femenino en el tercio externo de la trompa uterina para constituir el cigoto, que inicia su división celular, viaja al útero, se implanta como blastocito en el endometrio a los siete días y comienzan los procesos de embriogénesis y morfogénesis. Concepción es la acción o efecto de quedar embarazada una mujer. En el tema de los derechos establecidos al concebido, el inicio de la vida humana plantea amplia discusión entre las definiciones que plantea la ciencia frente a las de grupos de la sociedad civil. No siendo el cigoto una persona humana, de acuerdo con la Corte Interamericana de Derechos Humanos (CIDH) y otros no sería sujeto de los derechos establecidos para la persona, los cuales estarían íntimamente relacionados a los derechos de la mujer embarazada. La concepción ocurriría cuando el embrión se implanta en el útero y no aplicaría el artículo 4 de la CIDH. La doctrina, la legislación y la jurisprudencia peruana establecen amplia tutela jurídica a favor del concebido e instauran el inicio de la vida a partir de la fecundación. La Sentencia de la CIDH para el caso Artavia Murillo contra Costa Rica introduce la figura española del preembrión, al cual no se le otorga tutela jurídica hasta los 14 días, momento en que la ciencia médica establece la implantación del embrión en el endometrio materno. Para consideraciones éticas actuales, el embarazo humano empieza con la implantación del blastocisto en el endometrio y no existe sustento para aceptar el derecho del concebido desde el momento de la fecundación como si fuera una persona. Empero se señala que la vida humana posee una continuidad ininterrumpida desde su concepción hasta su fin natural, la muerte. El cigoto es vida que se inicia con dotación genética propia diferente a la de sus progenitores. El embrión preimplantatorio solo podrá originar un ser humano que se gesta y desarrolla dentro del cuerpo de otra persona, con propia dinámica vital. ABSTRACT Fertilization consists of the fusion of the male and female gametes in the outer third of the uterine tube to form the zygote, which begins its cell division, travels to the uterus, implants as a blastocyst in the endometrium after seven days and begins the processes of embryogenesis and morphogenesis. Conception is the action or effect of a woman becoming pregnant. About the rights established for the conceived, the beginning of human life raises a wide discussion between the definitions proposed by science and those of civil society groups. Not being the zygote a human person, according to the Inter-American Court of Human Rights (IACHR) and others, it would not be subject to the rights established for the person, which would be closely related to the rights of the pregnant woman. Conception would occur when the embryo implants in the uterus and Article 4 of the IACHR would not apply. Peruvian doctrine, legislation and jurisprudence establish broad legal protection in favor of the conceived and indicate the beginning of life from the moment of fertilization. The Judgment of the IACHR in the case of Artavia Murillo v. Costa Rica introduces the Spanish figure of the pre-embryo, which is not granted legal protection until 14 days, when medical science establishes the implantation of the embryo in the maternal endometrium. For current ethical considerations, human pregnancy begins with the implantation of the blastocyst in the endometrium and there is no basis for accepting the right of the conceived from the moment of fertilization as if it were a person. However, it is pointed out that human life has an uninterrupted continuity from conception to its natural end, death. The zygote is life that begins with its own genetic endowment different from that of its progenitors. The preimplantation embryo can only give rise to a human being that is gestated and develops within the body of another person, with its own vital dynamics.

[EN] The development of artificial intelligence in embryology through the application of timelapse imaging technology is making a transition to individualized culture since it provides the ability to select the most suitable embryo to be transferred. Nevertheless, one of the current doubts of the scientific community is that in vitro culture in human is carried out individually, given that most of the studies carried out indicate that the results of group culture seem to be more advantageous in terms of embryo development and quality. Most studies have been based on tests in the murine model, despite its not being the most suitable animal model for embryology and reproductive biology studies. There are models more similar to human reproduction from which results can be extrapolated, such as the rabbit, however, to our knowledge, in vitro culture has not yet been studied individually on this model. The objective of this work has been to evaluate the effect of in vitro embryo culture, individually or in groups, on in vitro development and on the capacity for implantation and birth using the rabbit model. For this, 10 nulliparous females were used as donors, obtaining 409 embryos. The embryos were placed in culture conditions, in groups (n=10) or individually (n=1), and maintained for 72 hours. After this period, development was evaluated and those that had reached the blastocyst stage (n=200) were transferred to 10 recipient females by laparoscopy. The assessment of embryonic implantation was performed by laparoscopy at day 12 of gestation. Finally, after birth, the number of animals born was determined. The individually in vitro culture presented significant differences when compared to group culture. Specifically, the blastulation rate of embryos cultured individually was higher (+12.6%) than that of group cultured (P= 0.03). Regarding in vivo development, no significant differences were observed (P= 0.881) neither in the implantation rate (33% vs 34%, for individual and in group, respectively) nor in the birth rate (20% vs 25%, for individual and in group, respectively) of both experimental groups. For all these reasons, our results indicate that the rabbit model is ideal for carrying out studies that require the use of individualized in vitro culture for early embryos, since these do not present any difference in development neither in vitro nor in vivo., [ES] Los métodos de cultivo de embriones han evolucionado notablemente en los últimos 30 años. No obstante, los estudios indican que los embriones cultivados en un sistema de cultivo en grupo (25-200 embriones en volúmenes variables entre 50-400 μl) tienen una mayor capacidad de desarrollo que los embriones cultivados individualmente o en pequeños grupos. Sin embargo, en humano el cultivo de embriones se lleva a cabo de forma individual, ya que esto permite una valoración más detallada. Por ello, para un uso adecuado de modelos animales sería necesario llevar a cabo experimentos en busca del modelo más adecuado para la extrapolación de resultados a humano. El modelo animal más empleado es el ratón, si bien, este no es el más idóneo para los estudios reproductivos. En este trabajo se pretende comparar el desarrollo de embriones tempranos de conejo en dos situaciones; (i) cultivados en grupo y (ii) cultivados de forma individualizada. Para ello, se emplearán alrededor de 10 conejas, de los que se obtendrán un mínimo 100 embriones por grupo. Para reducir el uso de animales, se empleará un tratamiento de superovulación (FSH-recombinante similar al empleado en humano). A las 72 horas se inseminarán artificialmente con machos de probada fertilidad. A las 24 horas se obtendrán los embriones en estadio de 2 células, y serán divididos de forma aleatoria en los dos grupos experimentales: (i) cultivados en grupos de 10 en un volumen de 300 μl del medio SAGE 1-STEP (Origio), y (ii) cultivados de forma individualizada en 30 μl, en condiciones estándar (38ºC, 5%CO2 en humedad saturada). A las 72 horas de cultivo se evaluará el porcentaje de embriones que alcancen el estadio de blastocisto.

El contenido de ácido desoxirribonucleico (ADN) mitocondrial (ADNmt) por célula como marcador de viabilidad embrionaria se propuso como una estrategia muy innovadora para la priorización en la selección de embriones humanos en los tratamientos reproducción asistida, siendo los embriones con menor contenido mitocondrial por célula los candidatos a ser transferidos. La hipótesis de partida se basaba en que dichos embriones presentarían un estado metabólico más apropiado y un menor estrés celular, los cuales se traducirían en una mayor probabilidad de implantación. La elevada expectación inicialmente generada alrededor de este marcador, vino acompañada de publicaciones con resultados contradictorios en cuanto a su relación con distintos parámetros de éxito clínico, lo que ha desembocado en una falta de consenso sobre la relevancia clínica de su uso. Una hipótesis posible, que explique esta falta de consenso, podría ser que el abordaje del uso del contenido de ADNmt se ha realizado sin conocimientos suficientes sobre aspectos clave como son el significado del contenido del ADNmt durante el desarrollo embrionario o la asociación entre el contenido de ADNmt y el contenido y estado de actividad mitocondrial. El presente trabajo de tesis doctoral trata de profundizar, mediante el análisis del contenido y del estado mitocondrial en el blastocisto, sobre los aspectos moleculares en los que se sustenta esta hipótesis. Este estudio se realizará para determinar si existen factores que expliquen la disparidad de resultados difundidos sobre este tema. Para ello, se establecieron tres objetivos específicos con el fin de abordar el análisis mitocondrial mediante distintas aproximaciones: Objetivo específico 1. Caracterizar el contenido y el patrón de distribución del ADN mitocondrial durante el desarrollo embrionario humano preimplantacional. Objetivo específico 2. Describir el contenido de ADN mitocondrial y el estado mitocondrial en embriones humanos bajo condiciones de estrés. Objetivo específico 3. Identificar la relación existente entre el contenido de ADN mitocondrial por célula y la masa y la actividad mitocondrial en el blastocisto humano. Gracias a la consecución de estos objetivos se ha llegado a la conclusión de que el contenido de ADNmt por célula es capaz de verse modulado en cuestión de pocas horas en situaciones de estrés respecto al cultivo in-vitro normal, y no es representativo del contenido de mitocondrias y de la actividad mitocondrial en un momento que sería cercano a la transferencia embrionaria. No obstante, se ha demostrado una importante relación entre los valores altos de contenido de ADNmt y el estrés celular. Estos hallazgos pueden explicar, en parte, la falta de consenso que existe en cuanto al uso del contenido de ADNmt por célula como marcador de competencia embrionaria, y pueden ser útiles para establecer la base molecular necesaria que respalde, en un futuro, su uso como un indicador adicional para la priorización de la transferencia embrionaria.

Objective To establish a relationship between serum progesterone values on the day of frozen blastocyst transfer in hormone-replaced cycles with the probability of pregnancy, miscarriage or delivery. Methods This was an ambispective observational study including all frozen-thawed embryo transfer cycles performed at our department following in vitro fecundation from May 2018 to June 2019. The outcomes evaluated were β human chorionic gonadotropin (β-hCG)-positive pregnancy and delivery. Groups were compared according to the level of serum progesterone on the day of embryo transfer: the 1st quartile of progesterone was compared against the other quartiles and then the 2nd and 3rd quartiles against the 4th quartile. Results A total of 140 transfers were included in the analysis: 87 with β-HCG>10 IU/L (62%), of which 50 (36%) delivered and 37 had a miscarriage (42%).Women with lower progesterone levels (< 10.7ng/mL) had a trend toward higher β-HCG-positive (72 versus 59%; p>0.05), lower delivery (26 versus 39%; p>0.05) and higher miscarriage rates (64 versus 33%; p0.05), although there was a trend toward a higher number of deliveries (43 versus 31%; p>0.05) and a lower number of miscarriages (28 versus 45%; p>0.05). These differences were not statistically significant. Conclusion There were no differences in pregnancy and delivery rates related with the progesterone level when measured in the transfer day. The miscarriage rate was higher in the 1st quartile group. Resumo Objetivo Avaliar se existe alguma relação entre os valores plasmáticos de progesterona no dia da transferência de um blastocisto desvitrificado em ciclos hormonalmente substituídos e a taxa de gravidez, aborto ou nascido vivo. Métodos Estudo observacional, ambispectivo, incluindo todos os ciclos de transferência de blastocistos congelados no nosso departamento, entre maio de 2018 e junho de 2019. Avaliou-se a taxa de gravidez e de nascidos vivos após 24 semanas de gestação. Os grupos foram comparados de acordo com os valores de progesterona plasmáticos dosados no dia da transferência do blastocisto: comparou-se o 1° quartil com os outros e depois os 2° e 3° quartis com o 4°. Resultados Avaliaram-se 140 transferências: 87 com β gonadotrofina coriônica humana (β-HCG)>10 IU/L (62%), 50 das quais terminaram em nascido vivo (36% do total), enquanto 37 tiveram um aborto (42% das gravidezes). Verificou-se uma tendência para menor número de recém-nascidos nas transferências com níveis de progesterona no 1° quartil (0.05) e ummaior número de abortos (64 versus 33%; p0.05), houve uma tendência para uma maior taxa de nascidos vivos (43 versus 31%; p>0.05) emenor número de abortos (28 versus 45%; p>0.05) abaixo do percentil 75. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas. Conclusão Não se verificaram diferenças estatisticamente significativas para taxa de gravidez e de nascido vivo. A taxa de aborto foi maior no primeiro quartil.

Non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies (niPGT-A) aiming to assess cell-free embryonic DNA in spent culturemedia is promising, especially because it might overcome the diminished rates of implantation caused by the inadequate performance of trophectoderm (TE) biopsy. Our center is part of the largest study to date assessing the concordance between conventional PGT-A and niPGT-A, and we report here the delivery of the first baby born in Brazil using niPGT-A. The parents of the baby were admitted to our center in 2018. They did not present history of infertility, and they were interested in using in vitro fertilization (IVF) and PGT-A in order to avoid congenital anomalies in the offspring. A total of 11 (3 day-5 and 8 day-6) expanded blastocysts were biopsied, and the spent culture media (culture from day-4 to day-6) from 8 day-6 blastocysts were collected for niPGT-A. Overall, 7 embryos yielded informative results for trophectoderm (TE) and media samples. Among the embryos with informative results, 5 presented concordant diagnosis between conventional PGTA and niPGT-A, and 2 presented discordant diagnosis (1 false-positive and one falsenegative). The Blastocyst 4, diagnosed as 46, XY by both niPGT-A and conventional PGTA, was warmed up and transferred, resulting in the birth of a healthy 3.8 kg boy in February 2020. Based on our results and the recent literature, we believe that the safest current application of niPGT-A would be as a method of embryo selection for patients without an indication for conventional PGT-A. The approximate 80% of reliability of niPGT-A in the diagnosis of ploidy is superior to predictions provided by other noninvasive approaches like morphology and morphokinetics selection. Resumo Abordagens para o teste genético pré-implantacional não-invasivo para aneuploidias (non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies, niPGT-A, em inglês) com o objetivo de avaliar o DNA embrionário livre são promissoras, especialmente porque estas podem reverter as menores taxas de implantação causadas por inadequada biópsia de trofectoderma (TE). Nesse contexto, nosso centro é parte do maior estudo atual que avalia as taxas de concordância entre PGT-A convencional e niPGT-A, e relatamos aqui o nascimento do primeiro bebê brasileiro após niPGT-A. Os pais do bebê foram admitidos no nosso centro em 2018. Eles não apresentavam histórico de infertilidade, e estavam interessados em utilizar os tratamentos de fertilização in vitro (FIV) e PGT-A para evitar anomalias congênitas na progênie.Umtotal de 11 blastocistos expandidos (3 do dia-5 e 8 do dia-6) foram submetidos a biópsia, e os meios de cultivo condicionados (cultivo do dia-4 ao dia-6) de 8 blastocistos do dia-6 foram coletados para niPGT-A. No total, resultados informativos para as amostras de TE e dos meios foram obtidos para sete embriões. Entre os embriões com resultado informativo, 5 apresentaram diagnóstico concordante entre PGT-A convencional e niPGT-A, e 2 apresentaram diagnóstico discordante (1 falso positivo e 1 falso negativo). O Blastocisto 4, diagnosticado como 46, XY por ambos niPGT-A e PGT-A convencional, foi desvitrificado e transferido, o que resultou no nascimento de ummenino saudável, que pesava 3,8 kg, em fevereiro de 2020. Com base em nossos resultados e literatura contemporânea, acreditamos que a aplicação atualmais segura do niPGT-A seria como método de seleção embrionária para pacientes sem indicação ao PGT-A convencional. A confiabilidade aproximada de 80% do niPGT-A para determinação da ploidia ainda é superior àquela obtida com abordagens não invasivas, como seleção morfológica ou morfocinética.

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2021. A transferência intrafolicular de ovócitos imaturos (TIFOI) é uma técnica alternativa para produção de embriões bovinos, na qual ovócitos imaturos, são injetados em um folículo dominante e são maturados, fecundados e tem o desenvolvimento inicial in vivo. Apesar de seu potencial de aplicação, a TIFOI ainda apresenta uma baixa taxa de recuperação embrionária no dia 7 (D7) após a injeção. Sendo assim, muitos aspectos do processo ainda precisam ser esclarecidos para que a sua eficiência possa ser melhorada.. O objetivo deste trabalho foi tentar identificar fatores que possam afetar os resultados da técnica. Para isso avaliou-se (1) a cinética de maturação nuclear de ovócitos submetidos à TIFOI; (2) se o tempo em que os ovócitos permanecem no folículo é suficiente para que ocorra a maturação completa; (3) o número de ovócitos mais adequado a serem injetados no folículo préovulatório no momento da TIFOI; (4) se o tempo em que os ovócitos permanecem no folículo após a injeção afeta a taxa de recuperação embrionária; (5) diferentes momentos para realizar a injeção após a remoção do implante de progesterona (P4); e, (6) se o momento da indução da ovulação e a adequação de um protocolo de sincronização das ovuladoras afeta a taxa de recuperação embrionária. Para isso, foram realizados 4 estudos: (1) ovócitos imaturos obtidos de ovários de abatedouro, foram injetados no folículo pré-ovulatório de vacas ovuladoras (TIFOI) e mantidos no folículo por 8, 12 ou 16 h, ou foram maturados in vitro (MIV) por 0, 8, 12 ou 16 h. Para a avaliação da capacidade de desenvolvimento embrionário, os ovócitos injetados no folículo préovulatório foram recuperados por OPU 12 h após a TIFOI e submetidos à fecundação in vitro (FIV) imediatamente após a OPU ou foram maturados in vitro por 4 h adicionais ou 10 h após a OPU. Os ovócitos do grupo controle foram maturados in vitro por 12, 16 e 22 h, antes de serem submetidos à FIV. (2) avaliou-se a taxa de recuperação embrionária após a injeção de 10, 25 ou 50 complexos cumulus ovócitos (CCOs) durante a TIFOI; (3) ovócitos imaturos foram injetados, 24, 36 e 52 h após a remoção do implante de progesterona e 8 dias depois realizou-se a coleta de embriões; (4) ovócitos imaturos foram injetados 30 (TIFOI 30h) ou 36 (TIFOI D9,5) h após a remoção do implante de progesterona e a indução da ovulação foi realizada 24 h após a remoção de P4 (TIFOI D30h), 40 h após a remoção de P4 ou 52 h remoção de P4, e 8 dias depois realizou-se a coleta de embriões. No estudo 1, os ovócitos maturados por TIFOI apresentaram maturação nuclear semelhantes àqueles maturados in vitro; e o tempo durante o qual os ovócitos permaneceram dentro do folículo após a TIFOI não afetou a taxa de recuperação e sua capacidade de serem fecundados e se desenvolverem em embriões; No estudo 2, o número de ovócitos injetados no folículo não afetou a taxa de recuperação embrionária; No estudo 3, o tempo em que os ovócitos permanecem no folículo após a TIFOI ser realizada em diferentes momentos afetou a taxa de recuperação embrionária. Finalmente, no estudo 4, o momento em que a indução da ovulação é realizada interfere na taxa de recuperação embrionária. Conclui-se que apesar de esclarecer alguns fatores importantes para o desenvolvimento da TIFOI, a taxa de recuperação embrionária ainda não foi melhorada. Intrafollicular transfer of immature oocytes (IFOT) is an alternative technique for the production of bovine embryos, in which immature oocytes, recovered by ovum pick-up (OPU), are injected into a dominant follicle, and they are matured, fertilized and underwent initial development in vivo. Despite its application potential, IFOT still results in a low rate of embryonic recovery on day 7 (D7) after injection. Therefore, many aspects of the process still need clarification so that its efficiency can be improved. The aim of this study was to identify factors that may affect the results of the technique, and contribute to its development. Therefore, we evaluated (1) if the nuclear maturation kinetics of oocytes submitted to IFIOT were evaluated; (2) whether the time in which the oocytes remain in the follicle would be sufficient to mature, be fertilized and develop into embryos; (3) the number of oocytes to be injected into the preovulatory follicle at the time of IFOT; (4) whether the time that the oocytes remain in the follicle after the injection would affect the embryonic recovery rate; (5) different moments to perform the injection after the removal of the progesterone implant; (6) whether the timing of ovulation induction and the adequacy of an ovulation synchronization protocol would affect embryo recovery rate. For this, 4 experiments were carried out: (1) immature oocytes, obtained from slaughterhouse ovaries, were injected into the ovulatory cows pre-ovulatory follicle (IFIOT) and kept in the follicle for 8, 12 or 16 h or were in vitro matured (IVM) for 0, 8, 12 or 16 h. In addition, for the evaluation of embryonic developmental capacity, oocytes were recovered by OPU at 12 h after IFIOT and submitted to in vitro fertilization (IVF) immediately after OPU or were in vitro matured for an additional 4 h or 10 h after OPU. Control oocytes were matured in vitro for 12, 16 or 22 h, before being submitted to IVF; (2) the embryo recovery rate after the injection of 10, 25 or 50 cumulus oophorus (COCs) complexes during IFIOT was evaluated; (3) immature oocytes were injected 24, 36 or 52 h after the removal of the progesterone implant and 8 days later, embryo collection was performed; (4) immature oocytes were injected 30 (IFIOT 30h) and 36 (IFIOT D9.5) h after removal of the progesterone implant and ovulation induction was performed 24 h after removal of P4 (IFIOT D30h), 40 h after P4 removal or 52 h P4 removal, and 8 days later, embryo collection was performed. In study 1, oocytes matured by IFIOT showed nuclear maturation similar to those matured in vitro; and the time during which the oocytes remained within the follicle after TIFOI did not affect the recovery rate and its ability to be fertilized and to develop in embryos; In study 2, the number of oocytes injected into the follicle did not affect the rate of embryonic recovery; In experiment 3, the time that the oocytes remain in the follicle after IFIOT is performed at different times affected the rate of embryonic recovery. Finally, in experiment 4, the time when ovulation induction is performed interferes with the rate of embryonic recovery. In conclusion, despite some important factors for the development of IFIOT were explained, the embryonic recovery rate was not improved.

Variability in the production of bovine blastocysts per session of ultrasound-guided follicularaspiration(OPU) is still an obstacle in commercial production.Thus, the objective of the current work was to verify factors that influence in vitro embryo production (PIVE), using data from a commercial laboratory.Data from 2014 to 2016 were analyzed, referring to 799 OPU sessions of adult bovine females of the breeds: Nelore (n=83), Girolando (n=73), Brangus (n=49), HPB (n=20), and Senepol (n=10).The influence of five variables was analyzed: breed, genetic group, frequency of aspiration, type of semen (sexed/conventional), and seasonality (spring/summer vs. autumn/winter) on the rate of viable oocytes, cleavage, and blastocyst production (bl).The protocols for the in vitroproduction of embryos (IVP) followed the routine established by the partner laboratory of the present study. The statistical analysis of the data was performed using SAS, with the Chi-square test.The Girolando and Nelore breeds had a higher (p=0.0001) number of blastocysts/OPU session, as well as the Bos indicus blood group.Blastocyst production was higher (p=0.0059) with sexed semen compared to conventional semen (6.6 x 5.2 bl/OPU session); a higher frequency of aspirations also increased (p=0.005) the number of bl/OPU session (7.7 x 5.9).We conclude that the in vitro production of bovine embryos is influenced by the analyzed factors and knowledge of these variables could guide the commercial use of OPU-PIVE. La variabilidad en la producción de blastocistos bovinos por sesión de aspiración folicular guiada por ultrasonido (OPU) sigue siendo un obstáculo en la producción comercial. Así, el objetivo fue verificar los factores que influyen en la producción de embriones in vitro (PIVE), utilizando datos de un laboratorio comercial. Se analizaron datos del año 2014 al 2016, referidos a 799 sesiones de OPU de hembras bovinas adultas de las razas: Nellore (n = 83), Girolando (n = 73), Brangus (n = 49), HPB (n = 20) y Senepol (n = 10). Se analizó la influencia de cinco variables: raza, grupo genético, frecuencia de aspiración, tipo de semen (sexado / convencional) y estacionalidad (primavera / verano vs otoño / invierno) sobre la tasa de ovocitos viables, clivaje y producción de blastocistos (licenciado en Derecho). Los protocolos para la producción de embriones in vitro (PIV) siguieron la rutina establecida por el laboratorio socio del presente estudio. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el SAS, mediante la prueba de Chi-cuadrado. Las razas Girolando y Nelore tuvieron un mayor número (p = 0,0001) de sesiones de blastocistos / OPU, así como el grupo sanguíneo Bos indicus. La producción de blastocistos fue mayor (p = 0,0059) con semen sexado en comparación con el semen convencional (6,6 x 5,2 bl / sesión de OPU); la mayor frecuencia de aspiraciones también aumentó (p = 0,005) el número de sesiones bl / OPU (7,7 x 5,9). Concluimos que la producción in vitro de embriones bovinos está influenciada por los factores analizados y conocer estas variables puede orientar el uso comercial de OPU-PIVE. A variabilidade na produção de blastocisto bovinos por sessão de aspiração folicular guiada por ultrassom (OPU) ainda é um entrave na produção comercial. Assim,objetivou-se verificar os fatores que influenciam a produção de embrião in vitro(PIVE), utilizando dados de um laboratório comercial. Foram analisados dados do ano de 2014 a 2016, referentes a 799 sessões de OPU de fêmeas bovinas adultas das raças: Nelore (n=83), Girolando (n=73), Brangus (n=49), HPB (n=20) e Senepol (n=10). Analisou-se a influência de cinco variáveis: raça, grupamento genético, frequência de aspiração, tipo de sêmen (sexado/convencional) e sazonalidade (primavera/verão vs outono/inverno) sobre a taxa de oócitos viáveis, clivagem e produção de blastocisto (bl). Os protocolos para a produção de embriões in vitro (PIV)seguiram a rotina estabelecida pelo laboratório parceiro do presente estudo. A análise estatística dos dados foi realizada utilizado o SAS, empregando-se o Teste Qui-quadrado. As raças Girolando e Nelore apresentaram maior (p=0,0001) número de blastocisto/sessão de OPU, assim como o grupamento sanguíneo Bosindicus. A produção de blastocisto foimaior (p=0,0059) com sêmen sexado em relação ao convencional (6,6 x 5,2 bl/sessão OPU); a frequência maior de aspirações também elevou (p=0,005) o número de bl/sessão OPU (7,7 x 5,9). Concluímos que a produção in vitro de embriões bovinos é influenciada pelos fatores analisados e conhecer estas variáveis pode nortear o emprego comercial da OPU-PIVE.

Ilustraciones, tablas Las hojas de Moringa oleifera tienen compuestos como vitaminas, minerales y metabolitos secundarios que le confieren propiedades antioxidantes. Sin embargo, el extracto de esta planta no ha sido estudiado como suplemento en los medios de cultivo en la producción in vitro de embriones bovinos. Por tanto, el objetivo fue evaluar si el medio de maduración in vitro con extracto de Moringa oleifera mejora la competencia del oocito y la calidad del blastocisto, a través de la tasa de maduración nuclear, tasa de blastocistos totales, niveles de especies reactivas de oxígeno (EROs), niveles de glutatión (GSH) intracelular y número de células totales. La extracción fitoquímica se realizó a partir de hojas maduras de Moringa oleifera. Los oocitos provenientes de ovarios de una planta de beneficio (1446) se maduraron en medio TCM 199 suplementado con 0 (control- , C), 50, 100 y 150 μg mL1 de extracto de Moringa oleifera y 50 μg mL-1 de ácido ascórbico (Control+ , AA). Pasadas 24 horas, se fertilizaron y cultivaron de acuerdo con el procedimiento estándar. Los datos obtenidos fueron analizados con la prueba Kruskal-Wallis. No se observaron diferencias significativas entre tratamientos (P>0,05), a excepción de los niveles de GSH y EROs, que se redujeron un 59% y 57%, respectivamente, con el uso de 150 μg mL-1 de extracto. En conclusión, el extracto de Moringa oleifera redujo las EROs, sin embargo las concentraciones de GSH intracelular también se redujeron y no hubo un efecto significativo en la maduración in vitro de oocitos bovinos ni en el desarrollo embrionario temprano. (Texto tomado de la fuente) Moringa oleifera leaves have compounds such as vitamins, minerals and secondary metabolites that give it antioxidant properties. However, the extract of this plant has not been studied as a supplement in culture media in the in vitro production of bovine embryos. Therefore, the objective was to evaluate whether the in vitro maturation medium with Moringa oleifera extract improves oocyte competence and blastocyst quality, through the nuclear maturation rate, total blastocyst rate, levels of reactive oxygen species. (ROS), intracellular glutathione (GSH) levels and total cell number. The phytochemical extraction was carried out from mature leaves of Moringa oleifera. The oocytes from ovaries of a beneficiation plant (1446) were matured in TCM 199 medium supplemented with 0 (control- , C), 50, 100 and 150 μg mL-1 of Moringa oleifera extract and 50 μg mL-1 of ascorbic acid (Control + , AA). After 24 hours, they were fertilized and cultivated according to the standard procedure. The data obtained were analyzed with the Kruskal-Wallis test. No significant differences were observed between treatments (P> 0.05), with the exception of GSH and ROS levels, which were reduced by 59% and 57%, respectively, with the use of 150 μg mL-1 of extract. In conclusion, Moringa oleifera extract reduced ROS, however intracellular GSH concentrations were also reduced and there was no significant effect on in vitro maturation of bovine oocytes or early embryonic development Maestría Magíster en Ciencias Agrarias 1. Obtención del extracto de hojas de Moringa oleifera 2. Fraccionamiento del extracto 3. Análisis fitoquímico preliminar 4. Determinación colorimétrica a microescala de compuestos fenólicos 5. Contenido total de fenoles (CTF) 6. Contenido de Flavonoides Totales (CFT) 7.Contenido total de catequinas (CTC) 8. Determinación de la actividad antioxidante (DPPH, FRAP, ABTS) 9. Recolección de ovarios 10. Aspiración folicular y obtención de oocitos 11. Maduración in vitro (MIV) 12. Fertilización in vitro (FIV) 13. Cultivo in vitro (CIV) 14. Evaluación de la maduración nuclear 15. Evaluación de los niveles de EROs y GSH intracelulares 16. Evaluación de la calidad embrionaria Producción animal tropical

Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-02T16:52:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-02T16:52:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-03T18:46:42Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-02T16:52:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-02T16:52:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-03T18:46:42Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-02T16:52:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-06T22:22:50Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-02T16:52:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-03T18:46:42Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-03T18:46:42Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-02T16:52:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-06T22:22:50Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-15T14:30:53Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-03T18:46:42Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-06T22:22:50Z (GMT) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-15T14:30:53Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-06T22:22:50Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-02T16:52:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-15T14:30:53Z (GMT) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-03T18:46:42Z (GMT) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-06T22:22:50Z (GMT) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-06T22:22:50Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-15T14:30:53Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-15T14:30:53Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-06T22:22:50Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-15T14:30:53Z (GMT) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-06T20:16:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-15T14:30:53Z (GMT) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-06T22:22:50Z (GMT) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-20T18:20:39Z No. of bitstreams: 1 ElisaPioltine_TESE_2020_repositório.pdf: 5693493 bytes, checksum: b3491f150c79b10b2811ceb4847e2c03 (MD5) Submitted by ELISA MARIANO PIOLTINE (elisapioltine@hotmail.com) on 2020-04-13T13:08:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ElisaMarianoPioltine_30_03_2020.pdf: 5536113 bytes, checksum: a12acef7c0560959d5e2ed75888374e1 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-22T21:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pioltine_em_dr_bot_par.pdf: 1996952 bytes, checksum: 903b691c4491fd62549bd35c1c325aee (MD5) Previous issue date: 2020-02-20 Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: capa Verifique nas normas do seu programa de pós se não é necessário incluir os símbolos da Universidade, da Faculdade e do seu programa de pós no alto da capa. Se sim, incluir. Se não, desconsidere essa observação. Problema 2: elementos pré-textuais -agradecimentos e epígrafe são colocados antes do resumo e abstract - o termo índice deve ser substituído por Sumário Problema 3: Financiamento CAPES No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2020-04-15T14:30:53Z (GMT) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Embora estágios iniciais de embriões de mamíferos tenham aparentemente uma grande plasticidade, eles, assim como o oócito em maturação, são bastante sensíveis a estresses exógenos. Responder a esses estresses é uma parte vital da fisiologia celular. Cada vez mais é aparente que um dos principais mecanismos, para iniciar a resposta celular a uma variedade de estressores exógenos, reside no retículo endoplasmático (RE). O RE é uma importante organela responsável pela síntese, processamento e transporte de proteínas e lipídeos. No entanto e in vitro, a perturbação do microambiente do RE pode causar alterações na estrutura das proteínas levando ao acúmulo de proteínas com o incorreto dobramento, uma condição denominada estresse do RE. Dependendo da intensidade do estresse, o RE pode desencadear a apoptose pela Unfolded Protein Response. Em várias espécies, estudos observaram uma melhoria da competência do oócito e no desenvolvimento do embrião quando foram adicionados inibidores do estresse do RE no meio de maturação e/ou meio de cultivo in vitro (CIV). Dentre os inibidores do estresse do RE, o ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) se mostrou benéfico na produção in vitro de embriões. Entretanto, pouco é conhecido sobre o seu efeito na maturação oocitária e no desenvolvimento do embrião bovino in vitro. Portanto, os objetivos gerais desta Tese foram: Capítulo 1 - investigar o efeito da adição de TUDCA durante a maturação in vitro (MIV) sobre a competência do oócito e do embrião [maturação nuclear, atividade mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), formação de pro núcleo, formação de blastocisto e abundância de transcritos em oócitos e embriões] e Capítulo 2 - investigar o efeito da adição de TUDCA durante o CIV sobre a competência embrionária e a criotolerância do embrião (cinética de eclosão e abundância de transcritos de embriões antes e após a vitrificação). A adição de TUDCA na MIV não melhorou a competência oocitária. Entretanto, a adição de 200 µM de TUDCA pareceu aliviar o estresse do RE reduzindo a produção de ERO no oócito e aumentando a abundância de transcritos relacionados positivamente com a defesa antioxidante do oócito e do embrião. Contrariamente, a adição de 1.000 µM de TUDCA na MIV pareceu ser tóxica para o oócito e diminuiu a taxa de maturação nuclear bem como a atividade mitocondrial. Além disso, houve um aumento da abundância de transcritos pró-apoptóticos no oócito. Quando o TUDCA foi suplementado no CIV não houve melhora da competência embrionária. De forma semelhante que na MIV, a adição de 1.000 µM de TUDCA no CIV pareceu ser tóxica para o embrião e diminuiu a taxas de blastocisto eclodido. De modo complementar, houve um aumento da abundância de transcritos relatados negativamente com o estresse do RE, o estresse oxidativo, o metabolismo lipídico e a sobrevivência celular. Entretanto, a adição de 200 µM de TUDCA no CIV pareceu aliviar o estresse do RE em embriões submetidos à vitrificação. Com isso, houve o aumento da taxa de embrião eclodido após o aquecimento. Além disso, nos blastocistos eclodidos pós-aquecimento foi observada uma redução da abundância de transcritos relacionados negativamente com o estresse do RE e um aumento daqueles relacionados positivamente com o mecanismo antioxidante e o desenvolvimento embrionário. Although early stages of mammalian embryos appear to retain great plasticity, they and maturing oocytes are quite sensitive to exogenous stresses. Responding to those stresses is a vital part of cellular physiology, and it is increasingly apparent that one of the main mechanisms for initiating that response is based on the endoplasmic reticulum (ER). ER is an important organelle responsible for the synthesis, processing, folding and transport of proteins and lipids. However, in vitro, the disturbance of the ER microenvironment can cause changes in the structure and folding of proteins leading to the accumulation of misfolding proteins, a condition called ER stress. Depending on the intensity of the stress, the ER can trigger apoptosis by Unfolded Protein Response. In several species, studies have reported an improvement in oocyte and embryo competence when ER stress inhibitors have been added to the in vitro maturation (IVM) medium and/or in vitro culture (IVC) medium. Among the ER stress inhibitors, tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) has been shown to be beneficial in in vitro embryo production. However, little is known about TUDCA’s effect on oocyte maturation and the development of bovine embryo in vitro. Therefore, the main objectives of this Thesis were: Chapter 1 - to investigate the effect of adding different TUDCA concentrations during IVM on the oocyte and embryo competence [nuclear maturation, mitochondrial activity, reactive oxygen species (ROS) production, pronuclei formation, blastocyst formation and transcripts abundance in oocytes and embryos]; and Chapter 2 – to investigate the effect of adding different TUDCA concentrations during IVC on embryo competence and embryo cryotolerance (hatching kinetics and transcripts abundance in embryo before and after the vitrification). The TUDCA addition to the IVM did not improve oocyte competence. However, the 200 µM of TUDCA appeared to relieve ER stress and reduced the ROS production in the oocyte. Concomitantly, there was an increasing of the transcripts abundance positively reported to the antioxidant defense in the oocyte and embryo. In contrast, the 1,000 µM of TUDCA appeared to be toxic to the oocyte by decreasing the nuclear maturation rate and mitochondrial activity in the oocyte. Moreover, there was an increasing of the pro-apoptotic transcripts’ abundance in the oocyte. When TUDCA was supplemented in IVC there was no improvement in embryo competence. As in IVM, the 1,000 µM of TUDCA appeared to be toxic to the embryo - decreasing the hatched blastocyst rate and increasing the transcripts’ abundance negatively reported in ER stress, oxidative stress, lipid metabolism and cell survival. However, the 200 µM of TUDCA addition in the CIV seemed to relieve ER stress in the embryos subjected to vitrification, increasing the hatched embryo rate post-warming. In addition, in hatched blastocysts post-warming it was observed a reduction of the transcripts’ abundance negatively reported to the ER stress and an increasing of those positively reported to the antioxidant mechanism and the embryo development. CAPES: 001

A alta pressão gasosa (HGP, do inglês high gaseous pressure) tem sido descrita como um agente estressante capaz de induzir respostas ao estresse subletal, fornecendo proteção celular e estímulos positivos a desafios subsequentes, como a criopreservação, produção in vitro de embriões (PIVE) , entre outras biotécnicas da reprodução, embora os mecanismos celulares, a modulação epigenética e as modificações no padrão de expressão gênica envolvidos ainda não estejam totalmente elucidados. Este princípio foi investigado em gametas bovinos e embriões murinos no presente trabalho. Foram realizados dois experimentos independentes. No primeiro, avaliou-se o efeito da exposição de oócitos bovinos no estádio de vesículas germinativa à HGP na eficiência e cinética de desenvolvimento da PIVE por fecundação in vitro (FIV). Os resultados revelaram que oócitos expostos a HGP em temperatura ambiente apresentaram taxa de maturação in vitro (MIV) e cinética de desenvolvimento até o estádio de blastocisto semelhantes ao controle mantido em condições ideais durante o tratamento do grupo experimental, diferentemente do observado no grupo com CCOs mantidos em temperatura ambiente durante a exposição à HGP. Em um segundo experimento, observou-se as alterações no padrão de expressão gênica de blastocistos murinos expostos previamente à alta pressão gasosa no estádio de embrião de 8-células, bem como se este desafio alterava a taxa de sobrevivência destes blastocistos após serem submetidos ao processo de criopreservação. A análise do padrão de transcrição revelou que um gene associado ao estresse oxidativo (Sod2) teve sua expressão aumentada, enquanto genes de proliferação e desenvolvimento (Igf2 e Igf2R) tiveram sua expressão reduzida, quando comparados com os embriões no estádio de 8-células, embora a relação Igf2/Igf2R não demonstrou ser afetada. O tratamento por HGP mostrou-se eficiente no aumento da taxa de sobrevivência de blastocistos após a criopreservação. Os experimentos permitiram concluir que a resposta ao estresse subletal estimulada pela HGP é eficiente na melhora da performance de gametas femininos e embriões submetidos a novas situações estressantes. High gaseous pressure (HGP) has been described as stressor, providing cell protection and positive stimuli to subsequent challenges like cryopreservation, embryo in vitro production (IVP), among other reproduction biotechnologies, although cells mechanisms, epigenetic modulation and transcriptional modifications are not totally elucidated. This principle was investigated in bovine gametes and murine embryos in this report at two independent studies. First, the effect of bovine oocyte exposure to HGP in germinal vesicle stage was evaluated to efficiency and development kinect of IVP by in vitro fertilization (IVF). Results showed that oocytes exposed to HGP at room temperature had in vitro maturation (IVM) rate and developmental kinect to reach the blastocyst stage similar to control group kept in ideal conditions during experimental group treatment, differently that what was observed in the group with COCs just kept at room temperature during HGP exposure. In the second experiment, modifications in transcriptional response were observed in murine blastocysts previously exposed to HGP when embryo 8-cells stage, as well if this challenge modified survival rate of this blastocysts after cryopreservation procedures. The analysis of the transcriptional pattern revealed that a gene associated to oxidative stress (Sod2) was upregulated, while genes of proliferation and development (Igf2 and Igf2R) were downregulated, when compared with 8-cells embryos, even though the ratio Igf2/Igf2R appeared not be affected. HGP treatment showed to be efficient to improve blastocyst survival rate to cryopreservation. The experiments enable inferring that subletal response stimulated by HGP was efficient to enhance performance of female gametes and embryos exposed to new stressor situations.

The increase of the world population generates the need to raise the production of food of vegetal and animal origin. In Brazil, livestock farming has evolved, demonstrating the important role of the country in the production of food. In this way, researchers of this productive chain have been looking for technologies related to production and reproduction, above all, to the use of reproduction biotechnologies, seeking to increase the production of different bovine breeds. Thus, the objective of this research was to investigate the efficacy of ovarian FSH super stimulation in bovine Wagyu oocyte donor females on follicular dynamics and in vitro embryo production. Twelve Wagyu animals, aged 12 to 24 months, randomly distributed in a crossover design were used in two groups: Group 1= animals not stimulated with FSH and Group 2= animals stimulated with FSH. The follicular, oocyte and embryonic variables were evaluated. It was observed that ovarian overstimulation in Wagyu oocyte donor cows with FSH improved the mean and large follicles but reduced the rate of oocyte recovery and, despite the best percentage of viable oocytes, there was no improvement in the amount of embryos produced in vitro. El aumento de la población mundial crea la necesidad de incrementar la producción de alimentos de origen vegetal y animal. En Brasil, la ganadería ha evolucionado, lo que demuestra el importante papel del país en la producción de alimentos. Así, los investigadores de esta cadena productiva han estado buscando tecnologías relacionadas con la producción y la reproducción, sobre todo, el uso de biotecnologías de reproducción, buscando incrementar la producción de diferentes razas bovinas. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue investigar la eficacia de la superestimulación de la FSH en hembras bovinas donantes de ovocitos Wagyu sobre la dinámica folicular y la producción de embriones in vitro. Se utilizaron doce animales Wagyu, de edades comprendidas entre 12 y 24 meses, distribuidos aleatoriamente en un diseño cruzado en dos grupos: Grupo 1 = animales no estimulados con FSH y Grupo 2 = animales estimulados con FSH. Se evaluaron variables foliculares, ovocitarias y embrionarias. Se observó que la superestimulación ovárica con FSH en vacas Wagyu donantes de ovocitos aumentó el número de folículos medianos y grandes, pero redujo la tasa de recuperación de ovocitos y, a pesar del mejor porcentaje de ovocitos viables, no hubo mejoría en el número de embriones producidos in vitro. O aumento da população mundial gera a necessidade de elevar a produção de alimentos de origem vegetal e animal. No Brasil, a pecuária tem evoluído, demonstrando o importante papel do país na produção de alimentos. Dessa forma, pesquisadores dessa cadeia produtiva têm buscado tecnologias relacionadas à produção e reprodução, sobretudo, ao uso de biotecnologias de reprodução, buscando aumentar a produção de diferentes raças bovinas. Assim, o objetivo desta pesquisa foi investigar a eficácia da superestimulação com FSH em fêmeas bovinas doadoras de ovócitos da raça Wagyu sobre a dinâmica folicular e a produção de embriões in vitro. Doze animais Wagyu, com idades entre 12 e 24 meses, distribuídos aleatoriamente em delineamento crossover foram utilizados em dois grupos: Grupo 1= animais não estimulados com FSH e Grupo 2= animais estimulados com FSH. Foram avaliadas as variáveis foliculares, oocitárias e embrionárias. Observou-se que a superestimulação ovariana com FSH em vacas Wagyu doadoras de oócitos aumentou o número de folículos médios e grandes, mas reduziu a taxa de recuperação de oócitos e, apesar da melhor porcentagem de oócitos viáveis, não houve melhora na quantidade de embriões produzidos in vitro.

Durante el estrés hipotérmico los espermatozoides de cuy conservan sus patrones de capacitación espermática, hiperactivación, reacción del acrosoma y fecundación in vitro El piruvato, componente del medio de cultivo San Marcos (SM), sería la fuente energética preferencial para mantener la supervivencia espermática en estrés hipotérmico prolongado, a lo mejor, regulando el metabolismo oxidativo en el espermatozoide. De la misma manera se constituiría en el sustrato ideal de la piruvato deshidrogenasa para iniciar la capacitación e hiperactivación cuando los espermatozoides son incubados a 37°C. El imidazol provoca reacción acrosómica espontánea en los espermatozoides hiperactivos y permite que estos puedan interaccionar con ovocitos maduros, fecundarlos e iniciar el desarrollo embrionario temprano hasta blastocisto. La madurez ovocitaria se consiguió cultivando Complejos Ovocito-Cumulo (COCs) en el medio North Carolina State University 23 (NCSU-23), usado por primera vez para cuy En este trabajo se demuestra que la hipotermia prolongada a 5°C en un medio químicamente definido, SM, no afecta los procesos espermáticos fundamentales para la adquisición de la capacidad fértil del espermatozoide de cuy.

El presente trabajo de tesis consistió en evaluar el efecto del zinc (Zn) durante la maduración de los ovocitos de bovino sobre la capacidad de desarrollo embrionario posterior. Para tal fin, se han establecido los siguientes objetivos: 1) estudiar el efecto de distintas concentraciones de Zn sobre la maduración del ovocito bovino; 2) evaluar el efecto de distintas concentraciones de Zn durante la maduración in vitro (MIV) sobre la capacidad de desarrollo posterior hasta el estadio de blastocisto y 3) determinar el rol de las células del cúmulus como puente metabólico entre el medio externo y el ovocito. Para ello, se utilizó como modelo experimental, la técnica de Producción in vitro (PIV) de embriones bovinos que comprende tres etapas: MIV, Fertilización in vitro y Cultivo in vitro de embriones hasta el estadio de blastocisto. La PIV se realizó con ovocitos obtenidos a partir de ovarios bovinos de frigorífico. Los resultados mostraron que: 1) la suplementación con Zn no modificó la concentración intracelular de GSH/GSSG en ovocitos y células del cúmulus excepto cuando se utilizó una concentración de 0,7 μg/ml Zn, 2) disminuye la tasa de apoptosis y el daño en el ADN en dichas células y 3) aumenta la actividad SOD en los complejos ovocito-cúmulus. Además, 4) el agregado de Zn incrementó la tasa de blastocistos y 5) mejoró la calidad de los embriones. La tasa de blastocistos aumentó independientemente de la presencia de CC durante la MIV. En consecuencia, todas las evidencias obtenidas sugerirían que el Zn actuaría como un factor importante durante la maduración del ovocito bovino favoreciendo el desarrollo embrionario temprano. Estas evidencias sugerirían además, la posible existencia de transportadores de Zn en el ovocito bovino., This study evaluated the effect of zinc (Zn) during bovine oocyte maturation on preimplantational embryo development. For this purpose, we have established the following objectives: 1) Effect of different Zn concentrations on in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes; 2) Effect of different Zn concentrations during IVM of bovine oocytes on subsequent embryo development to the blastocyst stage, and 3) Role of cumulus cells (CC) as metabolic bridge between the external medium and the oocyte. For this end, bovine in vitro embryo production (IVP) was used as experimental model. The IVP technique consists of three steps: IVM, in vitro fertilization and in vitro culture of embryos until blastocyst stage. The IVP was performed using bovine oocytes obtained from slaughterhouse ovaries. The results obtained here showed that: 1) The addition of Zn to IVM medium did not affect intracellular GSH-GSSG content in oocytes and CC with the exception of 0,7 μg/ml Zn; 2) The rates of apoptosis and DNA damage, in both oocytes and CC, were reduced when Zn was added to IVM medium; 3) SOD activity was higher in cumulus-oocyte complexes matured with the addition of Zn to IVM medium; 4) the addition of Zn in IVM medium improved the blastocyst rate and embryo quality; 5) the percentage of blastocysts was enhanced regardless of the presence of CC during IVM. Consequently, all evidences obtained suggest that Zn acts as an important factor during bovine oocyte maturation promoting early embryo development. Besides, these evidences suggest that Zn transporters might exist in the oocytes., Facultad de Ciencias Veterinarias

We evaluated the competence of bovine oocytes via morphological selection associated with follicular diameter and by brilliant cresyl blue (BCB) staining, in order to improve oocyte selection and the efficiency of in vitro embryo production. Follicles with small (2 < 4 mm), large (4–8 mm) or mixed (2–8 mm) diameters were aspirated from slaughterhouse ovaries. Next, the morphologically categorized oocytes were stained and evaluated with 26 ?M of BCB (90 min), followed by an assessment of in vitro maturation (MII) and blastocyst production. Oocytes from the large (61.1 ± 3.9%) and mixed (52.9 ± 4.6%) follicular groups showed comparable (p > 0,05) BCB+ rates, but both differed (p < 0.05) as compared to the small-diameter group (41.0 ± 4.5%). Between the BCB+ and BCB – oocytes, there was no difference (p > 0,05) in MII rate in the mixed (respectively 86.7 ± 3.4 and 75.8 ± 2.2), large (respectively 89.4 ± 2.6 and 79.7 ± 2.3) and small (respectively 76.7 ± 2.9 and 67.2 ± 2.5) diameter groups. Comparing BCB (+ and -) oocytes, we observed (p > 0,05) no change in the percentage of embryos in the large group (respectively 67.3 ± 3.3 and 53.5 ± 5.8) and in the small group (respectively 43.8 ± 5.3 and 33.9 ± 2.2), but there was a difference (p < 0.05) in the mixed group (respectively 57.8 ± 3.9 and 39.6 ± 7.5). Furthermore, when we compared between follicular groups, the BCB+/large-diameter group (61.1 ± 3.9%) had a significant higher percentage of embryos (p < 0.05) than the small-diameter BCB+ (43.8 ± 5.3) groups. To conclude, selection procedures that use follicle size and/or BCB staining may be used as an additional tool to improve the in vitro production of embryos. Avaliou-se a competência de oócitos bovinos através da seleção morfológica associada ao diâmetro folicular e pela coloração azul cresil brilhante (BCB), a fim de melhorar a seleção de oócitos e a eficiência da produção in vitro de embriões. Folículos com diâmetro pequeno (2 < 4 mm), grande (4-8 mm) ou misto (2-8 mm) foram aspirados de ovários de matadouro. Em seguida, os oócitos classificados morfologicamente foram corados e avaliados com 26 ?M de BCB (90 min), seguido de uma avaliação da maturação in vitro (MII) e produção de blastocisto. Os oócitos dos grupos folículo grande (61,1 ± 3,9%) e misto (52,9 ± 4,6%) apresentaram taxas de BCB+ comparáveis (p > 0,05), mas ambos diferiram (p < 0,05) em relação ao grupo folículo pequeno (41,0 ± 4,5%). Entre os oócitos BCB+ e BCB–, não houve diferença (p > 0,05) na taxa de MII nos grupos mistos (respectivamente 86,7 ± 3,4 e 75,8 ± 2,2), grande (respectivamente 89,4 ± 2,6 e 79,7 ± 2,3) e pequeno (respectivamente 76,7 ± 2,9 e 67,2 ± 2,5). Comparando os oócitos BCB (+ e -), não observamos alteração (p > 0,05) na porcentagem de embriões no grupo grande (respectivamente 67,3 ± 3,3 e 53,5 ± 5,8) e no grupo pequeno (respectivamente 43,8 ± 5,3 e 33,9 ± 2,2), mas há houve diferença (p < 0,05) no grupo misto (respectivamente 57,8 ± 3,9 e 39,6 ± 7,5). Além disso, quando comparamos os grupos foliculares, o grupo BCB+/grande (61,1 ± 3,9%) apresentou uma porcentagem significativamente maior de embriões (p < 0,05) do que o grupo BCB+/pequeno (43,8 ± 5,3). Para concluir, os procedimentos de seleção que usam tamanho do folículo e/ou coloração com BCB podem ser usados como uma ferramenta adicional para melhorar a produção in vitro de embriões.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Pregnancy losses occur at different stages caused by several conditions, however it occurs more frequently in the first 30 days. This decrease becomes more severe when animals are under unfavorable environmental conditions. Factors such as hyperthermia can reduce conception rates around 20-30% when compared to months where animals are under thermal comfort conditions. Therefore, heat stress (HS) is a problem found in the management of dairy cows in the tropics and subtropics, causing production and reproduction losses. The aim of the present study was to evaluate the influence of HS on development, interferon tau production (IFNT) and oxidative stress of bovine embryos produced in vitro. To evaluate the influence of HS on the in vitro production of bovine embryos, an in vitro model of HS was proposed. This model consists of altering the temperature in some specific stages of the embryo production. To induce HS, the temperature was gradually increased from 38.5°C to 40.5°C, where remained for 6 hours. Then, the temperature was gradually decreased until it returned to 38.5°C. The experimental groups were: control; oocytes submitted to HS during in vitro maturation (IVM HS); oocytes submitted to HS during in vitro fertilization (IVF HS); zygotes submitted to HS during the first day of in vitro culture (IVC HS); and embryos submitted to HS during the first three days of in vitro production (IVM + IVF + IVC HS). All groups submitted to HS had cleavage and blastocyst rates decreased, gene and protein expression of IFNT diminished and oxidative stress increased. The number of embryonic cells per blastocyst, number of trophoblastic cells and cell survival genes expression did not differ among groups. Regarding to cellular stress genes, only HSP70 had a difference among groups, showing an increase in all groups submitted to HS. Although HS is widely studied as a limiting factor in reproduction due to the decrease of hormone levels, gametes quality and embryonic viability, it was demonstrated for the first time the decrease in the production of IFNT in embryos submitted to HS in the early days of development. Perdas gestacionais acontecem nos diferentes estágios da gestação por uma variedade de causas, contudo ocorrem com maior frequência nos primeiros 30 dias. Este decréscimo se torna mais grave quando os animais estão sob condições ambientais desfavoráveis. Fatores como a hipertermia podem reduzir as taxas de concepção em torno de 20-30%, quando compararmos aos meses em que o animal se encontra em condições de conforto térmico. Portanto, o estresse térmico é um problema encontrado no manejo de vacas leiteiras nos trópicos e subtrópicos, causando reduções na produção e reprodução. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do estresse térmico no desenvolvimento embrionário, produção de interferon tau (IFNT) e estresse oxidativo em embriões produzidos in vitro (PIV). Para avaliar a influência do estresse térmico sobre a produção in vitro de embriões bovinos, foi proposto um modelo in vitro de estresse térmico. Esse modelo consiste em alterar a temperatura em fases distintas da PIV de embriões. Para induzir o estresse térmico, a temperatura foi gradualmente aumentada de 38,5ºC até chegar aos 40,5ºC, onde permaneceu por 6 horas. Após, a temperatura foi diminuída de forma gradativa, até retornar à 38,5ºC. Os grupos experimentais foram divididos em cinco: controle; oócitos submetidos ao estresse térmico durante a maturação in vitro (IVM HS); oócitos submetidos ao estresse térmico durante a fertilização in vitro (IVF HS); zigotos submetidos ao estresse térmico durante o primeiro dia de cultivo in vitro (IVC HS); e embriões submetidos ao estresse térmico durante os três primeiros dias de produção in vitro (IVM+IVF+IVC HS). Todos os grupos submetidos ao estresse térmico tiveram diminuição nas taxas de clivagem e blastocisto, diminuição da expressão gênica e proteica de IFNT e aumento do estresse oxidativo. O número de células por blastocisto, número de células do trofoblasto e expressão de genes de sobrevivência celular AKT e XIAP não tiveram diferença entre os grupos. Quanto aos genes de estresse celular, apenas a HSP70 teve diferença entre os grupos, mostrando-se aumentada em todos os grupos submetidos ao estresse térmico. Apesar do estresse térmico ser amplamente estudado como fator limitante na reprodução em função da diminuição de níveis hormonais, qualidade de gametas e viabilidade embrionária, foi demonstrado pela primeira vez a diminuição da produção de IFNT em embriões submetidos ao estresse térmico nos primeiros dias de desenvolvimento.

The study 1 was performed to describe the protein profile of sheep embryos produced in vivo during the preimplantation period. Ten ewes were subjected to hormonal superovulation treatment and laparoscopic insemination. After 5-6 days of ovulation, the ewes were slaughtered and the embryos were recovered. Embryonic proteins were identified with nano-HPLC-coupled mass spectrometry and evaluated using four search databases (PEAKS, Proteome Discoverer software (PD), SearchGUI software, PepExplorer). We identified 667 proteins from 54 embryos (morula and blastocyst). The biological process of proteins were mainly related to cellular process (30%) and regulation (25%). Most proteins were located in the nucleus (17%) and cytoplasm (14%), and molecular functions were mainly related to binding (50%) and catalytic activity (27%). Analysis of the embryonic protein database revealed 49 enriched functional clusters based on gene and database ontology (KEGG, Up_Keywords, INTERPRO, SMART). Among these 49 clusters, were found clusters with potential association with embryo physiology. By grouping this large number of proteins according to their roles and biochemical attributes, we have established a comprehensive scenario to support our understanding of the physiology of the sheep embryo. The study 2 aimed to evaluate the corpus luteum lipid changes in sheep after superovulation treatment using MALDI-TOF-MS. A total of 2558 peaks detected (71.1/sample) were used for statistical analysis. In multivariate analysis, the orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) revealed good discrimination potential between the superovulated and synchronized group. In Projecting Variable Importance (VIP) for lipid identification, PLS-DA generated a list of 13 ions (VIP>1) that represented potential altered lipids between groups. Lipids with a VIP score greater than 1.3 were identified as phosphatidylethanolamine PE (40: 6) (m/z 774.526), glycerophospholipids [PE (40:8) or PC (37:8)] (m/z 788.5125), glycerophospholipids [PE (36:8) or PC (33:8)] (m/z 732.4695), hexylheptanoate (m/z 621.2155), multiflorin A (m/z 659.174), phosphatidyl glycerophosphate PGP (i-13: 0 (19:0) (m/z 820.5), glycerophospholipid [PE (40:6) or PC (37:6)], o-glucuronide and phosphatidylcholine PC (34:5). Among these lipids, hexyl-heptanoate, multiflorin A, [PE (40:6) or PC (37:6)] and o-glucuronide were more expressed in the synchronized group, while PE (40: 6), [PE (40:8) or PC (37: 8)], [PE (36: 8) or PC (33: 8)], PGP (i-13:0 / i-19:0) and PC (34: 5) were more expressed in the superovulated group. In conclusion, the superovulatory treatments with FSH caused changes related to the lipid regulation in the ovine CL. These changes may be mainly involved with possible mitochondrial changes and increased progesterone production after superovulation treatments. O estudo 1 foi realizado para descrever o perfil proteico de embriões ovinos produzidos in vivo durante o período pré-implantacional. Dez ovelhas foram submetidas a tratamento de superovulação hormonal e a inseminações por laparoscopia. Após 5-6 dias da ovulação, as ovelhas foram abatidas e os embriões foram recuperados. As proteínas embrionárias foram identificadas com espectrometria de massa acoplada à nano HPLC e avaliadas usando quatro bancos de dados de pesquisa (PEAKS, software Proteome Discoverer (PD), software SearchGUI, PepExplorer). Foram identificadas 667 proteínas de 54 embriões (mórula e blastocisto). Os processos biológicos das proteínas foram relacionados principalmente ao processo celular (30%) e regulação (25%). A maioria das proteínas estavam localizadas no núcleo (17%) e no citoplasma (14%), e as funções moleculares estavam principalmente relacionadas à ligação (50%) e à atividade catalítica (27%). A análise do banco de dados de proteínas embrionárias revelou 49 agrupamentos funcionais enriquecidos com base em termos de ontologia de genes e bancos de dados. Entre esses 49 clusters, foram encontrados clusters com potencial associação com a fisiologia do embrião ovino. Ao agrupar esse número de proteínas de acordo com seus papéis e atributos bioquímicos, estabelecemos um cenário abrangente para apoiar o entendimento da fisiologia do embrião ovino. O estudo 2 teve como objetivo avaliar as alterações lipidômicas no corpo-lúteo (CL) de ovelhas após tratamento de superovulação usando MALDI-TOF-MS. Um total de 2558 picos foram detectados e utilizados para análise estatística. Na análise multivariada, a análise discriminante ortogonal de mínimos quadrados parciais (OPLS-DA) revelou bom potencial de discriminação entre o grupo superovulado e sincronizado. Na Importância Variável em Projeção (VIP) para a identificação lipídica, o PLS-DA gerou uma lista de 13 íons (VIP>1) que representaram potenciais lipídios alterados entre os grupos. Os lipídios com pontuação VIP igual o maior que 1,3 foram identificados como fosfatidiletanolamina PE (40:6) (m/z 774.526), glicerofosfolípidos [PE (40:8) ou PC (37:8)] (m/z 788.5125), glicerofosfolípidos [PE (36:8) ou PC (33:8)] (m/z 732.4695), hexil-heptanoato (m/z 621.2155), multiflorina A (m/z 659.174), fosfatidilglicerofosfato PGP (i-13:0/i-19:0) (m/z 820,5), glicerofosfolipideo [PE (40:6) or PC (37:6)], o- glicuronídeo e fosfatidilcoline PC (34:5). Entre esses lipídios, hexil-heptanoato, multiflorina A, [PE (40:6) or PC (37:6)] e o-glicuronídeo foram mais expressivos no grupo sincronizado, enquanto PE (40:6), [PE (40:8) ou PC (37:8)], [PE (36:8) ou PC (33:8)], PGP (i-13:0/i-19:0) e PC (34:5) foram mais expressivos no grupo superovulado. Em conclusão, os tratamentos superovulatórios com FSH causaram alterações relacionadas à regulação lipídica no CL ovino. Essas alterações podem estar envolvidas principalmente com possíveis modificações mitocondriais e o aumento da produção de progesterona após tratamentos de superovulação.

[ES] El uso de las técnicas de reproducción asistida (TRA) ha aumentado mucho en años recientes ya que permiten encontrar una solución a los muchos casos de parejas con infertilidad. No obstante, existen muchos estudios que indican que las TRA no son inocuas, y se asocian a varias alteraciones observadas en la descendencia. El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de la transferencia embrionaria sobre la paternidad de la descendencia obtenida utilizando inseminación artificial con mezcla heterospérmica y la calidad embrionaria determinada mediante la expresión de mRNA de genes pluripotentes (OCT4, Sox2 y Nanog). Para llevar a cabo el estudio se realizaron tres sesiones de inseminaciones artificiales con mezcla heterospérmica de 4 machos y se recuperaron los embriones a las 24 horas de la misma. Los embriones recuperados se transfirieron a una hembra receptora y se volvieron a recuperar 6 días después de la inseminación. Para determinar la paternidad de la descendencia se llevó a cabo una amplificación y secuenciación de 5 microsatélites que permitieron obtener el parentesco de los embriones. Para evaluar la calidad embrionaria se analizaron los niveles de expresión de los genes pluripotentes Oct4, Sox2 y Nanog mediante una amplificación a tiempo real. Los resultados del estudio no mostraron variaciones en la paternidad de la descendencia obtenida de una inseminación con mezcla heterospérmica. No obstante, sí se observó un descenso en la calidad embrionaria en términos de una disminución significativa en los niveles de expresión del gen Sox2., [EN] The use of assisted reproduction techniques (ART) has increased a lot in recent years as they allow finding a solution to the many cases of infertile couples. However, there are many studies that indicate that ART are not innocuous, and are associated with several alterations observed in offspring. The objective of this study is to evaluate the effect of embryo transfer on the paternity of offspring obtained using artificial insemination with heterospermic mixture and embryo quality determined by the expression of pluripotent gene mRNA (OCT4, Sox2 and Nanog). To carry out the study, three sessions of artificial inseminations with heterospermic mixture of 4 males were carried out and the embryos were recovered 24 hours later. The recovered embryos were transferred to a recipient female and recovered again 6 days after the insemination. To determine the paternity of the offspring, an amplification and sequencing of 5 microsatellites was carried out to obtain the kinship of the embryos. To evaluate the embryo quality, the levels of expression of the pluripotent genes Oct4, Sox2 and Nanog were analyzed by real time amplification The results of the study showed no variation in the paternity of the offspring obtained from an insemination with heterospermic mixture. However, a decrease in embryo quality was observed in terms of a significant decrease in the expression levels of the Sox2 gene.

Tesis (Maestría en Ciencias en Innovación Ganadera) El suero fetal bovino (SFB) es un suplemento universal de cultivos embrionarios; sin embargo, se han buscado alternativas para reemplazarlo. El objetivo de este estudio fue evaluar el suero de vaquillas en estro (SVQE) como suplemento del medio de cultivo, y evaluar las diferencias entre sueros utilizados individualmente de vaquillas donantes en el desarrollo de embriones ovinos cultivados in vitro. Se utilizaron 1105 ovocitos provenientes de ovarios de ovejas sacrificadas en rastro; los cuales fueron madurados (88.5%), fertilizados (67.0%) y cultivados in vitro en medio Cleavage durante 72 h hasta la etapa de 16 células (65.4%). Los embriones obtenidos (723) se asignaron aleatoriamente a uno de cinco tratamientos con medio de cultivo Blastocyst más 10% de suero de diferentes tipos: T1: SFB (testigo, n=146); T2: SVQE1 (n=144); T3: SVQ2 (n=143); T4: SVQE3 (n=143); y T5: mezcla de SVQE (n=147). Los embriones se cultivaron por 96 h hasta etapa de blastocisto. Las variables evaluadas fueron: desarrollo, tamaño y calidad de embriones. Los datos fueron analizados con los procedimientos GLM y GENMOD de SAS, según el tipo de variable. El porcentaje de embriones desarrollados hasta blastocisto fue similar entre tratamientos (41.78, 40.28, 39.86, 50.35 y 43.54% para T1, T2, T3, T4 y T5, respectivamente, p>0.05), mientras que, en tamaño de blastocistos, los T4 y T5 fueron superiores al T1 (238 vs 223 µm, p=0.007; 234 vs 223 µm, p=0.04, respectivamente). Asimismo, el T4 fue superior al T2 (238 vs 226 µm, p=0.03). La calidad de los blastocistos fue similar entre tratamientos (p>0.05). En conclusión, el suero de vaquilla en estro tiene efectos similares que el suero fetal bovino cuando se suplementa el medio de cultivo a las 72 h. Además, el uso individual de sueros puede ser mejor como suplemento que cuando se mezcla. Universidad Autónoma Chapingo, CONACyT

La congelación de espermatozoides es una técnica que supuso un importante paso para el desarrollo de la reproducción asistida. Esta es una técnica habitual y fundamental en las clínicas de reproducción que ha permitido lograr mejores resultados en las técnicas de reproducción asistida. A pesar de sus ventajas, durante la congelación, el espermatozoide sufre un gran número de alteraciones que dan lugar a la pérdida de función en el espermatozoide debido principalmente a: las bajas temperaturas a las que son sometidos, la cristalización de agua intracelular y los cambios osmóticos como consecuencia de la entrada y salida de crioprotector. Debido a los daños que se han observado, se está comenzando a desarrollar otro tipo de congelación ultrarápida llamada vitrificación, en la que los efectos que produce la entrada y salida de crioprotectores y los cambios de osmolaridad se ven disminuidos. Esta vitrificación es una técnica que consiste en el uso de crioprotectores diferentes y en un descenso de temperaturas brusco. Los primeros ensayos que se llevaron a cabo no resultaron exitosos debido a la poca tolerancia que presentan los espermatozoides a las altas tasas de crioprotector de las que se partieron. Ensayos posteriores en los que se reducía la concentración de crioprotector, se eliminaba el crioprotector permeable y la vitrificación se hacía mediante la aplicación directa de la solución espermática dentro de nitrógeno permitieron obtener mejores resultados. Es por ello que nos propusimos hacer un estudio en tres fases: una primera fase donde se realizara una valoración general de la congelación lenta y buscar un conjunto de biomarcadores útiles para la evaluación del criodaño. Posteriormente una segunda fase, en la que se realizó un estudio comparativo entre la congelación lenta y la vitrificación espermática, testando los biomarcadores elegidos en fase primera. Y, por último, en la tercera fase, un ensayo comparativo dentro de un ciclo de reproducción asistida donde la mitad del ciclo fuera fecundado con espermatozoides congelados y la otra mitad con espermatozoides vitrificados. Los resultados generales obtenidos mostraron que tras la congelación de muestras nomozoospérmicas y de baja calidad hay un conjunto de biomarcadores que dependen del estado inicial de la muestra y otros que dependen de la técnica de congelación. Que además se recomienda incluir en el estudio básico de la muestra seminal la fragmentación del ADN, el daño en el citoesqueleto y en el acrosoma, ya que son indicadores del criodaño. Que la nueva técnica de vitrificación permite criopreservar mejor las muestras seminales que la técnica de congelación lenta. Y que es seguro aplicar la técnica de vitrificación dentro de los ciclos de TRA, ya que se obtienen fecundaciones, desarrollos y niños nacidos normales. Cátedra Human Fertility, Ivf Spain Foundation

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Objetivou-se avaliar diferentes concentrações de Kisspeptina (Kp) e o seu efeito na fertilização in vitro de embriões bovinos quanto à qualidade e taxas de desenvolvimento embrionário inicial. No Experimento 1 foi determinada a concentração mínima de Kp a ser utilizada no meio FIV, a partir dos tratamentos: controle (n=240); Kp 10-5 M (n=223); Kp 10-6 M (n=225) e Kp 10-7 M (n=245). No Experimento 2, os ovócitos, foram distribuídos em quatro tratamentos: controle (n=362); Kp 10-1 M (n=425), Kp 10-7 M (n=304), e antagonista P234 4x10-6 M (n=424). Os espermatozoides foram capacitados por gradiente descontínuo de Percoll®, e co-incubados com os ovócitos por 16 a 18h em estufa de cultura a 38,5°C com 5% de CO2. Após esse período, os zigotos foram incubados em Fluido Sintético de Oviduto (SOF) durante sete dias nas mesmas condições. A taxa de clivagem foi avaliada 48h após a fertilização e a taxa de blastocistos e estágio de desenvolvimento/qualidade no sétimo dia. Foi adotado um escore numérico de 1 a 4 para avaliação do estágio de desenvolvimento, onde 1 corresponde a blastocisto inicial, 2 blastocisto, 3 blastocisto expandido e 4 blastocisto eclodido. A qualidade foi avaliada por microscopia confocal 3D, e os dados analisados pelo PROC GLIMMIX/SAS e teste de Kruskal-Wallis. No Experimento 1, não houve diferença entre os tratamentos para taxas de clivagem e blastocistos respectivamente: controle (82,0%/34,2%); Kp 10-5 M (81,6%/26,9%); Kp 10-6 M (80,8%/29,3%) e Kp 10-7 M (80,8%/29,4%) (P > 0,05). No Experimento 2, as médias das taxas de clivagem e blastocisto foram semelhantes entre os tratamentos: controle (85,1%/38,1%), Kp 10-1 M (82,6%/33,6%), Kp 10-7 M (83,6%/34,9%) e P234 (81,4%/31,6%) (P > 0,05). Foram produzidos 514 embriões, com as seguintes médias de escore de desenvolvimento: controle 2,89; Kp 10-1 M 3,04; Kp 10-7 M 2,79 e P234 2,63, sem diferença estatística entre os mesmos (P > 0,05). Quanto à qualidade, foram avaliados 360 embriões, n=30/tratamento/corante. Os parâmetros observados foram produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), necrose, apoptose e potencial mitocondrial. Cada embrião forneceu de 3 a 8 imagens (n=1.492) com intensidade de fluorescência em pixels. O grupo controle apresentou maior porcentagem de ROS: controle 3,76%; Kp 10-1 M 0,25%; Kp 10-7 M 2,95% e P234 0,91% (P < 0,05). A porcentagem de degeneração celular foi semelhante entre os tratamentos: controle 1,51%; Kp 10-1 M 1,73%; Kp 10-7 M 4,71% e P234 1,98% (P > 0,05). A média de apoptose, foi semelhante entre os tratamentos: controle 2,79%; Kp 10-7 M 1,67% e P234 6,11% (P > 0,05). O potencial mitocondrial teve maior porcentagem no grupo P234: controle 0,51%; Kp 10-1 M 0,26%; Kp 10-7 M 0,22% e P234 1,43% (P < 0,05). A adição de kp-10 no meio de fertilização não interferiu nas taxas de clivagem e blastocisto, bem como no estágio de desenvolvimento embrionário. A Kp não teve efeito na apoptose, necrose, nem tampouco no potencial mitocondrial. Por outro lado, a Kp diminuiu os níveis intracelulares de ROS, sugerindo o seu envolvimento no controle antioxidante. The aim was to evaluate the different concentrations of Kisspeptin (Kp) and its effect in the process of in vitro fertilization of bovine embryos about the quality and production rates. In Experiment 1 the minimum concentration of Kp was determined to be used at medium FIV, starting from the treatments: control (n=240); Kp 10-5 M (n=223); Kp 10-6 M (n=225) and Kp 10-7 M (n=245). In Experiment 2, the oocytes were distributed in four treatments: control (n=362); Kp 10-1 M (n=425), Kp 10-7 M (n=304), and antagonist P234 4x10-6 M (n=424). The sperms were enabled by Percoll® discontinuous gradient, and coincubated with the oocytes from 16 to 18 hours in stove culture at 38.5°C with 5% of CO2. After this period, the zygotes were incubated in Synthetic Oviduct Fluid (SOF) during 7 days in the same conditions. The rate of cleavage was evaluated 48 hours after fertilization and the rate of blastocysts and development stage/quality on the seventh day. A numerical score was adopted from 1 to 4 for evaluation of the development stage, as 1 corresponds to initial blastocyst, 2 blastocyst, 3 expanded blastocyst and 4 hatched blastocyst. The quality was evaluated by 3D confocal microscopy, and the analyzed data by PROC GLIMMIX/SAS and Kruskal-Wallis test. In Experiment 1, there wasn’t difference between the treatments rates of cleavage and blastocysts respectively: control (82,0%/34,2%); Kp 10-5 M (81,6%/26,9%); Kp 10-6 M (80,8%/29,3%) and Kp 10-7 M (80,8%/29,4%) (P > 0,05). In Experiment 2, the averages from the rates of cleavage and blastocysts were similar between the treatments: control (85,1%/38,1%), Kp 10-1 M (82,6%/33,6%), Kp 10-7 M (83,6%/34,9%) and P234 (81,4%/31,6%) (P > 0,05). A total of 514 embryos were produced, with the following averages of development score: control 2,89; Kp 10-1 M 3,04; Kp 10-7 M 2,79 and P234 2,63, without statistical difference among them (P > 0,05). About the quality, 360 embryos were evaluated, n=30/treatment/coloring. The parameters observed were production of reactive oxygen species (ROS), necrosis, apoptosis and mitochondrial potential. Each embryo supplied from 3 to 8 images (n=1.492) with fluorescence intensity in pixels. The control group presented bigger percentage of ROS: control 3,76%; Kp 10-1 M 0,25%; Kp 10-7 M 2,95% and P234 0,91% (P < 0,05). The percentage of cellular degeneration was similar between the treatments: control 1,51%; Kp 10-1 M 1,73%; Kp 10-7 M 4,71% and P234 1,98% (P > 0,05). The average of apoptosis was similar between the treatments: control 2,79%; Kp 10-7 M 1,67% and P234 6,11% (P > 0,05). The mitochondrial potential had bigger percentage in the group P234: control 0,51%; Kp 10-1 M 0,26%; Kp 10-7 M 0,22% and P234 1,43% (P < 0,05). The addition of kp-10 amid fertilization didn’t interfere in the rates of cleavage and blastocyst, as well as in the embryonic development stage. The Kp didn’t have effect in the apoptosis, necrosis, nor even in the mitochondrial potential. On the other hand, the Kp decreased the intracellular levels of ROS, suggesting its involvement in the antioxidant control. Dissertação (Mestrado)

Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2020-06-05T12:16:58Z No. of bitstreams: 1 Bárbara Gomes Rodrigues Nogueira.pdf: 849260 bytes, checksum: 2dc165bceaec5a4bfe3fda6a0597e50c (MD5) Made available in DSpace on 2020-06-05T12:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bárbara Gomes Rodrigues Nogueira.pdf: 849260 bytes, checksum: 2dc165bceaec5a4bfe3fda6a0597e50c (MD5) Previous issue date: 2018-05-24 Brazil accounts for almost 70% of the worldwide production of in vitro embryos. The OPU-IVP (ovum pick-up/in vitro production) technique has advantages over other breeding programs, since it provides an accelerated advance of the genetic improvement of the national herd, generating superior animals due to the selection pressure, besides allowing the use of females of different ages, at any stage of the estrous cycle, including those with acquired reproductive problems. Combined with the use of sexed semen, it has benefits, especially for dairy farmers, since they can have a higher proportion of females in the herd, making the use of IVP viable on a large scale. However, the technique presents variability in the production of blastocysts and in the pregnancy rate. Thus, to verify and demonstrate the factors that influence the results obtained by a commercial laboratory is necessary, since these companies include different variables such as: breeds, localities, management, seasonality and thus portray the reality of the field. Thus, the present study aimed to verify the factors that influence in vitro embryo production (IVP) and the pregnancy rate using data from a commercial laboratory. For analysis of IVP, data from the year 2014 to 2016, referring to the 776 ultrasound guided follicular aspiration (OPU) sessions of oocyte donor adult females for commercial purposes of the Nelore (n=83), Girolando (n=73), Brangus (n = 49), Holstein (n=10) and Senepol (n=10) from different localities were evaluated. The influence of five variables: donor breed, donor aspiration frequency, semen type (sexado vs conventional), seasonality (spring/summer vs. autumn/winter) and donor genetic group (Bos taurus taurus, Bos taurus indicus and crossover) on the rates of: viable oocytes, cleavage and blastocyst production. In vitro embryo production followed the protocols already established by the Laboratory. As for the analysis of the pregnancy rate, data from 20,297 innovations carried out between November 2009 and April 2016 were evaluated. The influence of five variables: seasonality (spring/summer vs. autumn/winter), type of semen (sexed vs conventional), embryonic stage, donor and recipient breed on pregnancy rate were analyzed. The in vitro production of the embryos was performed by only one laboratory technician and the innovations by two equally trained technicians. Statistical analysis of the data was performed using the Statistical Analysis System for Windows (SAS Inst., Inc., Cary, NC) software using the chi-square test at a 5% level of significance (p

Submitted by ELENA CAROLINA SERRANO RECALDE (caritos1000@hotmail.com) on 2018-06-14T11:10:40Z No. of bitstreams: 1 13-06-18 impresso e CD TESE ELENA CAROLINA SERRANO RECALDE.pdf: 2861326 bytes, checksum: 744a24760860a9d4cfec4de9112e2ba1 (MD5) Rejected by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br), reason: Prezada Remover números de linhas que estão em seu trabalho, Isso é uma das exigências da pós-graduação consideradas como OBRIGATÓRIA. A seguir insira o novo arquivo novamente no Repositório No aguardo on 2018-06-14T15:49:48Z (GMT) Submitted by ELENA CAROLINA SERRANO RECALDE (caritos1000@hotmail.com) on 2018-06-19T01:48:01Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado ELENA CAROLINA SERRANO RECALDE versão FINAL - Biblioteca.pdf: 2104858 bytes, checksum: e9886691abb6faa6877c0c73085019fc (MD5) Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2018-06-19T11:56:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 recalde_ecs_dr_botfca_par.pdf: 914996 bytes, checksum: 6bb3228adfc8fe4441da41f5bc07a428 (MD5) Made available in DSpace on 2018-06-19T11:56:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 recalde_ecs_dr_botfca_par.pdf: 914996 bytes, checksum: 6bb3228adfc8fe4441da41f5bc07a428 (MD5) Previous issue date: 2018-05-18 O objetivo do presente estudo foi avaliar o benefício da substituição do soro fetal bovino (SFB) pelo fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-1) durante a maturação in vitro (MIV) ou cultivo in vitro (CIV), sobre qualidade embrionária e expressão de genes em embriões pré- e pós-compactação. Delineamento experimental foi fatorial 3 x 3 (três suplementos de MIV e três de CIV), com 9 grupos experimentais. Foram realizadas 20 réplicas (oócitos ≈ 400/grupo). Complexos cúmulus-oócito (COCs) graus I e II foram maturados in vitro com a adição de 10% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL polivinil-álcool (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) a 38,5 ºC em 5% de CO2 em ar por 22 a 24 horas. Foram fertilizados e incubados durante 18 horas. Os zigotos foram cultivados com a adição de: 2,5% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL de PVA (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) por sete dias a 38,5ºC em 5% de CO2 em ar. As taxas de clivagem e blastocisto foram avaliadas após 48 e 168 horas de cultivo, respectivamente. A técnica simplificada de coloração diferencial de células da massa celular interna (MCI) e trofoectoderma (TE) foi utilizada para avaliar a distribuição celular de blastocistos (n = 155) e a técnica de TUNEL para avaliação do índice de apoptose (n = 207). Concentrações de glicose e lactato obtidas do meio MIV utilizaram-se para analisar o metabolismo de glicose. mRNA foi extraído de embriões de 6 – 8 células colhidos após 66 horas post-inseminação (4 pools de 15 embriões por grupo) e de blastocistos expandidos de 7 dias (4 pools de 5 embriões por grupo). A expressão gênica foi realizada no sistema BioMark HD® de microfluídica, pelo arranjo 96.96 Dynamic Array. Os dados foram analisados ANOVA do PROC GLIMMIX do SAS. Foi utilizado o teste Tukey para comparação de médias. Valores de p ≤ 0.05 foram considerados significativos. A clivagem foi maior (p < 0,05) nos grupos maturados em SFB. MIV e CIV com SFB presentou maior (p < 0.05) taxa de produção de blastocisto e maior quantidade de blastocistos expandidos que PVA e IGF. MIV com IGF-I aumentou o consumo de glicose e síntese de lactato dos COCs e levou à produção de blastocistos com maior (p < 0.05) número total de células. Embriões cultivados em IGF-I tiveram maior (p < 0.05) quantidade de células na MCI e embriões cultivados em PVA tiveram maior (p < 0.05) apoptose do que SFB. Os genes NANOG, OTX2, POU5F1 e IFNT2 foram mais expressos em blastocistos cultivados em PVA e IGF do que em SFB. O IGF-I regula TP53, BAX, CASP3, CASP9, HSPA1A e IGF1R para prevenir apoptose. IGF-I durante a MIV em meio semi-definido estimula o metabolismo de glicose de COCs, melhora a qualidade embrionária, aumentando o número total de células de blastocistos. IGF-I durante a CIV aumenta o numero de células na MCI, melhora a expressão de biomarcadores importantes de qualidade embrionária com a possibilidade de melhorar o desenvolvimento embrionário. The aim of the present study was to analyze the benefits of fetal bovine serum (FBS) replacement by insulin-like growth factor I (IGF-I) during in vitro maturation (IVM) and in vitro culture (IVC), on embryo quality and temporal gene expression in embryos pre- and post-compaction. A 3 x 3 factorial design was performed (three supplements for IVM and three for IVC), with a total of 9 experimental groups. A total of 20 replicates (oocytes ≈ 400/group) were performed. Grade I and II cumulus-oocyte complexes (COCs) matured in vitro with the addition of 10% of FBS (FBS), or 3 mg/mL of polyvinyl-alcohol (PVA), or PVA + 100 ng/mL IGF-1 (IGF) at 38.5 ºC in an atmosphere of 5% CO2 for 22 to 24 hours. After IVM, oocytes were fertilized and incubated for 18 hours. Possible zygotes were cultured with the respective addition of: 2.5% of FBS (FBS), or 3 mg/mL of PVA (PVA), or PVA + 100 ng/mL of IGF-1 (IGF) for seven days at 38.5 ºC in an atmosphere of 5% CO2. Cleavage and blastocyst rates were analyzed at 48 and 168 hours of culture respectively. Simplified technique for differential staining of inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) cells was performed to analyze cell allocation of blastocysts (n = 155) and TUNEL assay for apoptosis rate analysis (n = 207). Glucose and lactate concentrations were measured in IVM spent media to analyze glucose metabolism. mRNA was extracted from 6 – 8 cells embryos collected after 66 hours post insemination (4 pools of 15 embryos per group) and 7 day expanded blastocysts (4 pools of 5 embryos per group). Gene expression analysis was performed with BioMark HD® system with microfluidic chip 96.96 Dynamic Array. Data were analyzed by ANOVA from PROC GLIMMIX model from SAS. Tuckey test was used to compare means. P value ≤ 0.05 was considered to be significant. Cleavage rate was higher (p < 0.05) for groups matured in FBS. IVM and IVC in FBS presented higher (p < 0.05) total blastocyst yield and greater quantity of expanded blastocysts than PVA and IGF. IVM with IGF-I increased glucose uptake and lactate synthesis of COCs and produced blastocysts with increased (p < 0.05) total cell number. Embryos cultured in IGF-I had greater (p < 0.05) amount of cells in the ICM and embryos cultured in PVA had higher (p < 0.05) apoptosis rate than FBS. NANOG, OTX2, POU5F1 and IFNT2 genes were more expressed in blastocysts cultured in PVA and IGF than in FBS. IGF-I regulates TP53, BAX, CASP3, CASP9, HSPA1A and IGF1R genes to prevent apoptosis. The addition of IGF-I during IVM in chemically semi-defined media stimulates glucose metabolism of COCs and improves embryo quality, increasing total cell number of blastocysts. The addition of IGF-I during IVC increases the amount of cells of the ICM, improves expression of important embryo quality biomarkers with the possibility to enhance embryo development.

Embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) apresentam diferenças quando comparados aos produzidos in vivo. Esta particularidade reduz as taxas de viabilidade in vitro e in vivo após a criopreservação, limitando o emprego comercial da preservação dos embriões PIV. Várias estratégias vêm sendo propostas para aumentar a viabilidade e desenvolvimento desses embriões criopreservados. Alguns estudos utilizam a exposição dos embriões a um estresse subletal, como a alta pressão hidrostática (HHP), previamente a procedimentos que reduzem a viabilidade embrionária, o que aumenta a tolerância desses indivíduos à criopreservação. Os objetivos deste experimento foram determinar as taxas de viabilidade de blastocistos bovinos PIV previamente expostos à alta pressão gasosa (HGP) de 27,5 MPa por 120 min e após submetidos à congelação ou vitrificação. A avaliação da viabilidade foi mediante determinação das taxas de re-expansão e eclosão após criopreservação.Oócitos morfologicamente viáveis obtidos a partir de ovários de frigorífico foram maturados in vitro durante 24 h a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2 com umidade relativa do ar saturada e fecundados (dia 0) com sêmen criopreservado capacitado in vitro Após 20 h, os presuntivos zigotos foram submetidos a cultivo in vitro em meio SOF condicionado a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2, com umidade relativa do ar saturada. Os blastocistos (dia 7) foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: expostos à HGP e congelados, PC; controle congelação, CC; expostos à HGP e vitrificados, PV; controle vitrificação, CV. Os embriões foram expostos ou não à HGP de 27,5 MPa por 120 min e em seguida colocados em cultivo por 120 min. Após esse período os blastocistos foram submetidos à congelação ou à vitrificação. A taxa de re-expansão dos blastocistos avaliada em 24 h do grupo CV (59,6%) foi maior que a dos embriões dos grupos CC (45,2%) e PC (46,3%) (P