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The present work aimed of studying the influence of recombinant bovine somatotropin (rbST) on quantity and quality of in vivo aspirated oocytes, embryo production and gene expression of insulin-like growth factors (IGFs) types I and II in in vitro produced embryos from bovine females of Nelore breed. Five cows were treated with two administrations of 2mL of saline solution as placebo, with an interval of 14 days between them, being the first administration held 19 and the second 5 days before follicular aspirations; within 30 days after these aspirations, in a crossover design, the same protocol was used in these five animals being, in this case, the saline solution replaced by 500mg of rbST in order to perform comparisons between treatments. From retrieved oocytes, in vitro production (IVP) was performed, being all stages involving this process evaluated with subsequent achievement of polymerase chain reactions in real time (qPCRs) for gene expression of IGF-I and IGF-II in produced blastocysts. It was observed that the rbST, although having a numerical increase, did not show significant influence, on the parameters studied, on the quantity and quality of in vivo aspirated oocytes, embryo production and gene expression of IGF-I and IGF-II in in vitro produced embryos from bovine females of Nelore breed. Este estudio tuvo como objetivo estudiar la influencia de la somatotropina recombinante bovina (rbST) en la cantidad y calidad de los ovocitos aspirados in vivo, la producción embrionaria y la expresión génica de los factores de crecimiento insulínicos (IGFs) tipos I y II en embriones producidos in vitro a partir de Nelore hembras bovinas. Se trataron cinco vacas con dos administraciones de 2mL de solución salina como placebo, con un intervalo de catorce días entre ellas, siendo la primera administración diecinueve y la segunda cinco días antes de las aspiraciones foliculares; a los treinta días de estas aspiraciones, en un sistema cruzado, se utilizó el mismo protocolo en estos cinco animales, en cuyo caso se sustituyó la solución salina por 500mg de rbST, con el fin de realizar comparaciones entre tratamientos. A partir de los ovocitos recuperados se llevó a cabo la producción de embriones in vitro (PIVE), analizándose todas las etapas de este proceso y con la posterior realización de reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCRs) para IGF-I e IGF-II en los blastocistos producidos. Se observó que la rbST, aunque numéricamente influyó positivamente en los parámetros estudiados, no tuvo una influencia significativa en la cantidad y calidad de ovocitos aspirados in vivo, producción embrionaria y expresión génica de IGF-I e IGF-II en embriones producidos in vitro de hembras bovinas Nelore. Com o presente trabalho, objetivou-se estudar a influência da somatotropina recombinante bovina (rbST) sobre a quantidade e qualidade de oócitos aspirados in vivo, produção embrionária e expressão gênica dos fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs) tipos I e II em embriões produzidos in vitro de fêmeas bovinas da raça Nelore. Cinco vacas foram tratadas com duas administrações de 2mL de solução salina como placebo, com intervalo de catorze dias entre elas, sendo a primeira administração realizada dezenove e a segunda cinco dias antes das aspirações foliculares; decorridos trintas dias destas aspirações, em sistema crossover, o mesmo protocolo foi utilizado nesses cinco animais sendo, neste caso, a solução salina substituída por 500mg de rbST, com o intuito de efetuar-se comparações entre os tratamentos. A partir dos oócitos recuperados, realizou-se a produção in vitro de embriões (PIVE), sendo todas as etapas que envolvem este processo analisadas e com posterior realização de reações em cadeia da polimerase em tempo real (qPCRs) para expressões gênicas de IGF-I e IGF-II nos blastocistos produzidos. Observou-se que a rbST, ainda que numericamente tenha influenciado positivamente sobre os parâmetros estudados, não exerceu influência significativa sobre a quantidade e qualidade de oócitos aspirados in vivo, produção embrionária e expressão gênica de IGF-I e IGF-II em embriões produzidos in vitro de fêmeas bovinas da raça Nelore.

Objective: The aim of this study was to evaluate the follicle morphology, density, development and hormone production after orthotopic autransplantation of fresh or vitrified goat ovarian tissue. Methods: Fresh and vitrified ovarian cortex was orthotopically autotransplanted for six months in two and three adults bilaterally ovariectomized goats, respectively. The animals were monitored during 196 days and blood samples collected. Results: It was observed that the percentage of morphologically normal preantral follicles (MNPF) after grafting of fresh ovarian tissue was similar to control. The follicular density in the fresh graft reduced significantly when compared to fresh control. unfortunately, after transplantation of vitrified tissue it was not possible to identified any follicles after recovery. Furthermore, the proportion of developing follicles was higher (P < 0.05) in the fresh auto-grafts than in control fragments. Moreover, progesterone plasma levels increased significantly from day 179 to day 195 of transplantation. Conclusion: In conclusion, orthotopic transplantation of fresh ovarian tissue was able to keep healthy the preantral follicles, as well as the restoration of goat endocrine function.

A ocorrência de células somáticas no sêmen possibilita seu uso para a produção in vitro (PIV) de embriões pela clonagem animal por transferência nuclear de célula somática (TNCS). Visando o melhor aproveitamento desta fonte de material biológico, Nel-Themaat e colaboradores propuseram em 2008 um protocolo com o gradiente de Percoll® que possibilita o isolamento de células somáticas seminais (CSS) e espermatozoides (STPZ) de uma mesma dose de sêmen para uso na clonagem animal e na fecundação in vitro (FIV), respectivamente. Porém, ao aplicarmos tal protocolo para o sêmen bovino e ovino, observamos diferentes resultados de segregação celular, dependendo das características da amostra. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de diferentes diluentes para refrigeração e congelamento de sêmen bovino e ovino frente ao processo de segregação de CSS e SPTZ viáveis utilizando um gradiente de Percoll®. Para tanto, foi utilizado o sêmen de três carneiros cruzas Texel e de quatro touros Brangus, todos machos adultos e férteis. O ejaculado de cada macho foi dividido em oito grupos, sendo uma amostra de sêmen fresco e sete amostras diluídas em cinco diluentes comuns para ambas as espécies (Tris-Gema, TG; Citrato-Gema, CG; Tris-Gema-Glicerol, TGG; Citrato-Gema-Glicerol, CGG; e um diluente comercial), e em dois diluentes específicos para cada espécie (Leite Desnatado, LD e Leite Desnatado-Glicerolado, LDG, para ovinos; ou Lactose-Gema, LG e Lactose-Gema-Glicerol, LDG, para bovinos), para a refrigeração por 24 h (diluentes sem glicerol TG, CG, LD) ou para a congelação (diluentes com glicerol TGG, CGG, LDG, comercial). A avaliação do perfil de segregação de CSS foi realizada após a coleta do sêmen fresco (-3 h), quando o sêmen diluído atingiu o equilíbrio a 5ºC (0 h), e 24 h após o equilíbrio a 5ºC (sêmen refrigerado), ou após o descongelamento (sêmen congelado). Cada uma das oito amostras distintas de cada ejaculado, nos diferentes tempos, foi submetida à centrifugação para a segregação celular em gradiente de 20/50/90% de Percoll®. Cada amostra foi então coletada em quatro frações do gradiente, sendo a FTI a fração superficial do gradiente de 20% de Percoll®; a FTII a fração entre os gradientes de 20% e 50% de Percoll®; a FTIII a fração remanescente do gradiente de 50% de Percoll®; e a FTIV a fração contendo o pellet formado no gradiente de 90% de Percoll®. Cada fração foi analisada quanto à presença de CSS, espermatozoides e debris celulares, com os dados analisados por ANOVA e Tukey, e pelos testes de Kruskal-Wallis, X2 e correlação simples de Pearson (P

O objetivo deste estudo foi de determinar o status de capacitação espermática (CA) e de reação acrossomal (RA) durante o processamento e refrigeração do sêmen ovino sob diferentes diluentes, fatores de diluição e condições de aerobiose em função do tempo. Foram coletados ejaculados de dois carneiros adultos por vagina artificial a intervalos de 48-72 h. Após avaliações macro- e microscópicas, o sêmen foi segregado em grupos sob três diluentes (Tris-gema, citrato-gema ou leite desnatado), dois fatores de diluição (1 x 109 ou 100 x 106 células/mL) e duas condições de aerobiose (aeróbico ou semi-anaeróbico). O sêmen foi mantido refrigerado por 72 h, com avaliações a cada 24 h desde o equilíbrio a 5oC (T0). Alíquotas dos ejaculados frescos e de cada sub-grupo refrigerado de acordo com o diluente, a diluição e a aerobiose, foram coletadas nos tempos T0 e T72 para a determinação do status do acrossomo por coloração com clortetraciclina (CTC), e da integridade de membrana com azul de tripano e Giemsa. As maiores e menores quedas de motilidade e vigor espermáticos (M/V) em função do tempo foram observadas com a utilização de citrato-gema e Tris-gema, respectivamente. A proporção de espermatozoides com capacitação e/ou reação acrossomal aumentou após a diluição e armazenamento do sêmen ovino a 5oC, havendo correlação negativa com a viabilidade e M/V em função do tempo. Os fatores de variação sobre a M/V foram o diluente e o tempo de refrigeração, enquanto o status do acrossomo e a sobrevivência espermática esteve mais associada à condição de aerobiose e fator de diluição, com o diluente apresentando menor impacto no status do acrossomo em função do tempo. The aim of this study was to determine the status of sperm capacitation (CA) and acrosome reaction (AR) during processing and refrigeration of ovine semen under different extenders, dilution factors and aerobiosis conditions as a function of time. Ejaculates were collected from two adult rams by artificial vagina at 48-72 h intervals. After macro- and microscopic evaluations, semen was segregated into groups under three extenders (Tris-egg yolk, citrate-egg yolk or skimmed milk), two dilution factors (1 x 109 or 100 x 106 cells/mL) and two aerobiosis conditions (aerobic or semi-anaerobic). Diluted semen was kept refrigerated for 72 h, with evaluations every 24 h from the equilibrium at 5 oC (T0). Aliquots of fresh ejaculates and of each refrigerated diluted subgroup according to extender, dilution and aerobiosis were collected at times T0 and T72 for determination of acrosome status by staining with chlortetracycline (CTC), and membrane integrity with trypan blue and Giemsa. The largest and smallest falls in sperm motility and sperm vigor (M/V) as a function of time were observed with the use of citrate-yolk and Tris-yolk extenders, respectively. The proportion of capacitated and/or acrosome reacted sperm cells gradually increased over time after dilution and storage at 5oC, with a negative correlation observed with viability and M/V as a function of time. Variation factors on M/V were extender and refrigeration time, while acrosome status and sperm survival were more associated with aerobiosis condition and dilution factor, with the extender having less impact on the acrosome status as a function of time.

O melhor entendimento dos procedimentos de biologia molecular tem possibilitado o aprimoramento de estratégias de edição gênica, como o sistema CRISPR, possibilitando a modulação de genes em locais específicos do genoma, incluindo modificações de marcações epigenéticas, temas que foram abordados no Capítulo I. Os objetivos desta tese foram comparar diferentes estratégias utilizando o sistema CRISPR (a) para promover a reprogramação celular parcial de fibroblastos suínos utilizando o sistema de ativação com CRISPR (CRISPRa); e (b) avaliar a sobrevivência e a viabilidade de embriões bovinos após a microinjeção de zigotos com o sistema CRISPR/Cas9 e modelos de reparo de DNA para promover recombinação homóloga em safe harbor loci (SHL) em embriões bovinos produzidos por fecundação in vitro (FIV). No Capítulo II, as eficiências de duas nucleases de fusão com domínios de ativação (dCas9-VPR e dCpf1/Cas12a-VPR) foram comparadas para permitir a ativação da expressão transitória de genes alvo de reprogramação (Oct4, Myc, Klf4, Sox2 e Lin28a), e para alterar a transcrição de genes relacionados à senescência celular em células de suínos em passagens avançadas. A dCas9-VPR regulou positivamente genes únicos de forma mais eficaz do que a dCpf1-VPR, também usando menor número de gRNAs por gene, com maior nível de expressão para os genes Myc e Lin28a. Por outro lado, a dCas9-VPR não foi efetiva na regulação de múltiplos genes concomitantemente, embora tenham sido observados efeitos possivelmente relacionados aos genes-alvo, como a expressão dos genes p53 e Dkc1. O sistema CRISPRa promoveu a reprogramação in vitro parcial de células suínas em cultivo, apesar de em um nível menor do que o esperado. No Capítulo III, a sobrevivência in vitro e o desenvolvimento de embriões bovinos de FIV foram avaliados após a microinjeção citoplasmática (MI) do sistema CRISPR/Cas9 e de oligonucleotídeos de reparo de DNA em embriões no estádio de 1-célula, tendo como alvo os SHL H11 e Rosa26. Após a MIV por 20 h, CCOs bovinos foram fecundados in vitro por 8 h (grupos tratamento) ou por 18 h (grupo intacto). Grupos de zigotos foram parcialmente desnudados 8 h pós-fecundação (hpf) e, em seguida, segregados em grupos tratamento: Semi-desnudo (Semi), controle sem MI; grupo MI com CRISPR/Cas9; e grupos SHL, MI com CRISPR/Cas9, gRNA para cada SHL e uma das duas doses de oligonucleotídeos de reparo de DNA (5 ng/μL ou 20 ng/μL). Os embriões foram cultivados in vitro até o estádio de blastocisto, avaliando-se as taxas de sobrevivência pós-MI (D1), clivagem (D2) e de blastocisto (D7). A sobrevivência não foi afetada pela injeção do sistema CRISPR/Cas9, nem pelas doses ou os loci- alvo, embora a remoção parcial das células do cumulus com 8 hpf, ou a microinjeção de oligonucleotídeos de reparo de DNA com o sistema CRISPR/Cas9 reduziram o desenvolvimento a blastocisto (inferior a 20% na maioria dos grupos) em comparação com os controles (acima de 20%), independentemente da dose injetada ou do locus- alvo. A microinjeção com oligonucleotídeos de reparo de DNA com o sistema CRISPR/Cas9 se demonstrou viável para experimentos de recombinação homóloga em embriões bovinos de FIV, apesar da redução no desenvolvimento embrionário. Em conclusão, as estratégias utilizando o sistema CRISPR para auxiliar na edição gênica em cultivo de células somáticas suínas ou em embriões bovinos de FIV foram viáveis e relativamente eficientes. Por outro lado, a realização de outros experimentos será necessária para avaliar a viabilidade do uso de células de suínos reprogramadas para a clonagem, e a eficiência por análise genômica dos resultados das estratégias utilizadas para a recombinação homóloga em embriões bovinos. The better understanding of molecular biology procedures has enabled the improvement of gene editing strategies, such as the CRISPR system, making it possible to modulate genes at specific sites in the genome, including changes in epigenetic marks, subjects that were addressed in Chapter I. Therefore, the aims of this thesis were to compare different strategies using the CRISPR system (a) to promote partial cellular reprogramming in pig fibroblast cells using the CRISPR activation system (CRISPRa); and (b) to evaluate embryo survival and viability after zygote microinjection with CRISPR/Cas9 system and DNA oligonucleotide templates to promote homologous recombination into safe harbor loci (SHL) in bovine embryos produced by in vitro fertilization (IVF) procedures. In Chapter II, the efficiencies of two nucleases fused to activation domains (dCas9-VPR and dCpf1/Cas12a-VPR) were compared in enabling the transient upregulation of reprogramming target genes (Oct4, Myc, Klf4, Sox2 and Lin28a), and for the ability to alter transcription of downstream genes related to reprogramming of porcine somatic cells at advanced passages. The dCas9-VPR more effectively upregulated single genes than dCpf1-VPR, also using lower number of gRNAs per gene, with highest expression levels for Myc and Lin28a genes. On the other hand, dCas9-VPR failed to upregulate multiple genes concomitantly, although downstream effects were detected in the expression of p53 and Dkc1 genes. The CRISPRa system promoted partial reprogramming in pig somatic cells in vitro, although at lesser extent than expected. In Chapter III, the in vitro survival and developmental outcome of IVF bovine embryos were assessed after cytoplasmic microinjection (MI) of CRISPR/Cas9 system and DNA templates at the 1-cell stage embryo, targeting the SHL H11 and Rosa26. Bovine COCs were in vitro matured for 20 h and fertilized for either 8 h (treatment groups) or 18 h (Intact Group). Groups of presumptive zygotes were partially denuded 8 h post-fertilization (hpf), and then segregated into treatment groups: Semi-denuded (Semi), non-MI control; group MI with CRISPR/Cas9; and SHL groups, MI with CRISPR/Cas9, gRNA for each SHL, and one of two doses of repair oligonucleotide templates (5 ng/μL or 20 ng/μL). Embryos were in vitro cultured up to the blastocyst stage, evaluating post-MI survival (D1), cleavage (D2) and blastocyst (D7) rates. Survival was not affected by the injection of either the CRISPR/Cas9 system, the doses, or the target loci, although the partial cumulus cells removal at 8 hpf, or the microinjection of donor oligonucleotides and the CRISPR/Cas9 system reduced development to the blastocyst stage (lower than 20% in most groups) in comparison to controls (above 20%), irrespective of the injected dose or the targeted locus. The microinjection with repair templates and CRISPR/Cas9 system was feasible for homologous recombination experiments in bovine preimplantation IVF embryos, despite the reduction in embryo development. In conclusion, the strategies using CRISPR approaches to assist in gene editing pig cells in culture or early bovine IVF embryos were feasible and rather efficient. On the other hand, the performance of other experiments will be necessary to evaluate the feasibility of using reprogrammed pig cells for cloning, and the efficiency by genomic analyses of the strategies used for homologous recombination in bovine embryos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O direcionamento dos primeiros passos para a realização da transferência nuclear de célula somática (TNCS) em catetos garantirá uma ferramenta efetiva na conservação da espécie, perante sua acelerada diminuição populacional e sua atividade ecológica indispensável para o ecossistema. Para tanto, a presente tese foi dividida em duas etapas (três experimentos por etapa), sendo a primeira etapa o estudo das células doadoras de núcleo ou carioplastos e a segunda etapa, o estudo das células doadoras de citoplasma ou citoplastos. Assim, diante da importância de carioplastos de qualidade reconhecida para a TNCS, nós inicialmente estabelecemos cinco linhagens de fibroblastos de catetos, monitorando a viabilidade, atividade metabólica e estresse oxidativo, de acordo com os efeitos do número de passagens (primeira, terceira e décima) e criopreservação. Embora não haja efeito desses critérios sobre a viabilidade, células em décima passagem tiveram uma redução de seu metabolismo. Adicionalmente, células congeladas/descongeladas tiveram um aumento no número de espécies reativas de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial. Além disso, sabendo da importância de manter estas células armazenadas em um biobanco de maneira adequada, nós otimizamos a solução crioprotetora utilizada na congelação lenta de fibroblastos de catetos. Deste modo, a solução composta por 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) com 0,2 M de sacarose e 50% de soro fetal bovino (SFB) foi considerada a solução mais eficiente em manter a viabilidade, atividade proliferativa, metabolismo e níveis adequados de estresse oxidativo de células somáticas de catetos, quando comparada a soluções na ausência de sacarose e com 10% de SFB em diferentes combinações. Finalmente, um passo essencial no estabelecimento dos carioplastos para a TNCS consiste na sincronização das células em G0/G1 do ciclo celular. Deste modo, nós avaliamos diferentes métodos de sincronização do ciclo celular: (i) supressão de soro (SS) por um a quatro dias, (ii) inibição por contato (IC) por um a três dias e (iii) agentes químicos [DMSO, 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), ciclohexamida (CHX), e citocalasina B (CB)] por um a dois dias, em termos de seus efeitos sobre a sincronização em G0/G1 e viabilidade. Assim, nós observamos que a IC por três dias foi o método mais eficiente para sincronização do ciclo celular e manutenção da viabilidade de fibroblastos de catetos. Portanto, com estes três experimentos, nós estabelecemos a etapa de carioplastos da TNCS de catetos, obtendo células de qualidade e aptas a serem usadas como doadoras de núcleo. Na segunda etapa, nós, inicialmente, adequamos as condições de maturação in vitro (MIV) de oócitos de catetos, avaliando o tempo de MIV e o efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) sobre a habilidade meiótica. Assim, nós concluímos que 48 h é o período adequado para a MIV de oócitos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico. Ainda, observou-se que o EGF pode ser utilizado para otimizar o meio de MIV. Finalmente, no terceiro experimento, nós avaliamos a habilidade de desenvolvimento destes oócitos após ativação artificial, usando a ionomicina como ativador primário e comparando diferentes ativadores secundários (6-DMAP, CHX e CB). Nós verificamos que a ativação química usando ionomicina e 6-DMAP foi a mais eficiente combinação, tendo esta tese alcançado como resultado significativo, uma taxa de 27,6% de blastocistos de catetos derivados da ativação oocitária artificial. Em síntese, nós obtivemos carioplastos e citoplastos que poderão ser empregados na TNCS de catetos, deixando a ponto as etapas fundamentais para a clonagem desta espécie. Ainda, destaca-se que os conhecimentos aqui gerados poderão ser aplicados em estudos de fecundação in vitro, compreensão do desenvolvimento embrionário, produção de células induzidas à pluripotência, e ensaios de toxicidade. Portanto, este trabalho foi um grande passo para a conservação de catetos The direction of the first steps for the achievement of somatic cell nuclear transfer (SCNT) in collared peccary will guarantee an effective tool in the conservation of the species, in view of its accelerated population decrease and its essential ecological activity for the ecosystem. Therefore, the present thesis was divided into two steps (three experiments per step), being the first step the study of the donor cells of nucleus or karyoplast and the second stage, the study of the donor cells of cytoplasm or cytoplasts. Thus, in view of the importance of acknowledge quality karyoplast for SCNT, we initially established five cell lines of collared peccary fibroblasts, monitoring viability, metabolic activity and oxidative stress, according to the effects of the number of passages (first, third and tenth) and cryopreservation. Although there is no effect of these criteria on viability, cells in tenth passage had a reduction in their metabolism. Additionally, frozen/thawed cells had an increase in the number of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential. Moreover, knowing the importance of maintaining these cells stored in a biobank properly, we optimize the cryoprotectant solution used in the slow freezing of collared peccary fibroblasts. Thus, the solution composed of 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) with 0.2 M sucrose and 50% fetal bovine serum (FBS) was considered the most efficient solution in maintaining the viability, proliferative activity, metabolism and adequate levels of oxidative stress of somatic cell cells, when compared to solutions in the absence of sucrose and with 10% FBS in different combinations. Finally, an essential step in establishing the karyoplast for SCNT is the synchronization of cells in G0/G1 of the cell cycle. Thus, we evaluated different cell cycle synchronization methods: (i) serum suppression (SS) for one to four days, (ii) contact inhibition (CI) for one to three days and (iii) chemical agents [DMSO, 6-dimethylaminopurine (6-DMAP), cyclohexamide (CHX), and cytochalasin B (CB)] for one to two days, in terms of their effects on G0/G1 synchronization and viability. Thus, we observed that the IC for three days was the most efficient method for synchronizing the cell cycle and maintaining the viability of collared peccary fibroblasts. Consequently, with these three experiments, we have established karyoplast stage of SCNT in collared peccary, obtaining quality cells and able to be used as nuclear donors. In the second stage, we initially adjusted the in vitro maturation (IVM) conditions of collared peccary oocytes, evaluating the IVM time and the effect of the epidermal growth factor (EGF) on the meiotic ability. Thus, we concluded that 48 h is the appropriate period for oocyte IVM when compared to 24 h, according to meiotic potential. Still, it was observed that EGF can be used to optimize the IVM medium. Finally, in the third experiment, we evaluated the developmental ability of these oocytes after artificial activation, using ionomycin as the primary activator and comparing different secondary activators (6-DMAP, CHX and CB). We found that chemical activation using ionomycin and 6-DMAP was the most efficient combination, with this thesis achieving as a significant result, a rate of 27.6% of blastocysts of collared peccaries derived from oocyte artificial activation. In summary, we got karyoplast and cytoplasts that may be employed in the SCNT of collared peccary, leaving the point the fundamental steps for the cloning of this species. Furthermore, it is emphasized that the knowledge generated here can be applied for in vitro fertilization, studies understanding of embryonic development, production cells induced to pluripotency, and toxicity assessments. Therefore, this work was a great step for the conservation of collared peccaries

O objetivo deste estudo foi determinar a eficiência de um protocolo de indução de capacitação espermática e de reação acrossômica in vitro em sêmen criopreservado de espécies mamíferas domésticas para uso na fecundação in vitro (FIV), utilizando a espécie bovina como modelo e controle. No Experimento I, comparou-se o efeito de diferentes concentrações de heparina (5, 10 e 15 UI/mL) na indução da capacitação espermática (CE) in vitro do sêmen criopreservado das espécies bovina, bubalina, ovina, caprina e equina. Também se avaliou a resposta do sêmen bovino capacitado in vitro ao cálcio ionóforo (A23187) para a indução da reação acrossômica (RA) in vitro e, por fim, este foi utilizado para a FIV de oócitos bovinos sem zona pelúcida (ZP) para avaliar as taxas de fecundação monospérmica e polispérmica. No Experimento II, avaliou-se a resposta do sêmen equino criopreservado frente a concentrações maiores de heparina (50 e 100 UI/mL) e de cálcio ionóforo (A23187) para a indução da CE e da RA in vitro. A sobrevivência dos espermatozoides após o descongelamento, durante e após a incubação, a CE e a RA, foram avaliadas pelas colorações com azul de tripano-Giemsa, e com clortetraciclina (CTC), respectivamente. No Experimento I, a espécie bovina apresentou baixa mortalidade espermática após incubação (7 a 16%) e foi responsiva ao tratamento com heparina (59 a 84%), havendo diferença nas respostas dos touros frente à heparina (p

O objetivo deste estudo foi avaliar um protocolo de manipulação do desenvolvimento folicular ovariano em equinos, pela sincronização física da onda folicular e indução hormonal de codominância folicular, para aplicação em biotécnicas da reprodução em equinos. No Experimento 1, após a sincronização do ciclo estral e a determinação da ovulação, buscou-se caracterizar por ultrassonografia transretal a dinâmica folicular ovariana de nove éguas cíclicas após ablação folicular, realizada por ultrassonografia transvaginal entre os dias 9 e 12 pós-ovulação, com a avaliação da taxa de sincronização da onda folicular ovariana pós-ablação. No Experimento 2, repetiu-se o protocolo experimental do Experimento 1, com a determinação do efeito da administração sequencial de análogo sintético de GnRH (acetato de deslorelina) após a sincronização da onda folicular pós-ablação folicular no diestro sobre as taxas de desenvolvimento folicular e a dinâmica folicular ovariana de 16 éguas cíclicas. No Experimento 1, após análise quantitativa e qualitativa da população ovariana de folículos >5 mm e posterior ablação folicular (d0), a dinâmica folicular revelou um padrão coletivo repetível da onda de desenvolvimento folicular entre as fêmeas, com períodos previsíveis de emergência/recrutamento (d3), divergência folicular (d6-d7), dominância folicular (d9-d11) e ovulação (d11-d13), com o restabelecimento de uma nova onda folicular a partir do d12. No Experimento 2, após as ablações foliculares (d0), as éguas foram distribuídas em três grupos experimentais, sendo o grupo Controle (n=6), sem tratamento hormonal, e grupos tratamento GnRH 3-6 e GnRH 2-6, com fêmeas submetidas a duas doses diárias de 125 μg de GnRH do d3 ao d6 (GnRH 3-6, n=5) ou do d2 ao d6 (GnRH 2-6, n=4) pós-ablação (d0). Um grupo de fêmeas dos grupos Controle e GnRH 3-6 foram submetidas à OPU no d6 para a produção in vitro de embriões por partenogênese, não havendo diferenças entre os grupos quanto às taxas de recuperação e viabilidade oocitárias, e maturação in vitro e clivagem embrionária, com o desenvolvimento in vitro de um blastocisto no grupo Controle. O padrão de desenvolvimento e dinâmica folicular observado no Experimento 1 se mostrou repetível e previsível no grupo Controle do Experimento 2. Também pôde-se observar que o tratamento com GnRH após a ablação determinou um atraso no crescimento folicular nos grupos GnRH 3-6 e GnRH 2-6, com aumento na proporção de folículos de tamanhos intermediários (até 23 mm) relativos ao Controle até o d6, havendo maior atraso no crescimento diário no grupo GnRH 2-6 a partir do d4 pós-ablação. Possivelmente, o tratamento com GnRH determinou a ocorrência do fenômeno de downregulation de FSH, atrasando o recrutamento de uma nova onda folicular. Em resumo, a ablação folicular em éguas determinou uma sincronização previsível de uma nova onda folicular até a ovulação, podendo ser útil como ferramenta na aplicação em biotécnicas da reprodução em equinos. Já a utilização de doses repetidas de GnRH na fase de emergência folicular após a ablação folicular determinou um retardo na progressão da nova onda folicular. Entretanto, houve uma maior proporção de folículos com maior potencial de recuperação e competência oocitária após a OPU em fêmeas tratadas com GnRH, o que pode favorecer a eficiência da PIV de embriões em equinos. The aim of this study was to evaluate a protocol for manipulating ovarian follicular development in mares, by physical synchronization of follicular wave and hormonal induction of follicular codominance, for application in reproductive technologies in horses. In Experiment 1, after synchronization of the estrous cycle and determination of ovulation, the ovarian follicular dynamics of nine cyclic mares was characterized by transretal ultrasonography after ovarian follicular ablation, performed transvaginally by ultrasonography between days 9 and 12 after ovulation, with the evaluation of the synchronization rate of the ovarian follicular wave post-ablation. In Experiment 2, the experimental protocol of Experiment 1 was repeated, with the determination of the effect of sequential administration of a synthetic GnRH analog (deslorelin acetate) after synchronization of the ovarian follicular wave by follicular ablation, on the rates of follicular development and ovarian follicular dynamics in 16 cyclic mares. In Experiment 1, after quantitative and qualitative analysis of the >5 mm ovarian follicle population after follicular ablation (d0), the follicular dynamics revealed a repeatable pattern of follicular waves between females, with predictable periods of emergence/recruitment (d3), follicular divergence (d6-d7), follicular dominance (d9-d11) and ovulation (d11-d13), with the reestablishment of a new follicular wave after d12. In Experiment 2, after follicular ablation (d0), mares were segregated into three experimental groups: Control group (n=6), with no exogenous hormone treatment; and GnRH 3-6 and GnRH 2-6 treatment groups, with females subjected to two 125-μg daily doses of GnRH from d3 to d6 (GnRH 3-6, n=5) or from d2 to d6 (GnRH 2-6, n=4) post-ablation (d0). A group of females from Control and GnRH 3-6 groups were submitted to OPU procedures on d6 for the in vitro production of embryos by parthenogenesis, with no differences between groups regarding oocyte recovery and viability rates, and in vitro maturation and cleavage rates, with the in vitro development of a blastocyst stage embryo in the Control group. The pattern of follicular development and dynamics observed in Experiment 1 was repeatable and predictable in the Control group of the Experiment 2. In addition, the GnRH treatment after ablation determined a delay in follicular growth in both the GnRH 3-6 and GnRH 2-6 groups, with an increase in the proportion of follicles of intermediate sizes (up to 23 mm) relative to controls until d6, with a greater delay in daily growth in the GnRH 2-6 group from d4 post-ablation. Possibly, the GnRH treatment determined the occurrence of the phenomenon known as FSH downregulation, as already reported, causing a delay in the recruitment of a new follicular wave. In summary, follicular ablation in mares determined a predictable synchronization of a new follicular wave through ovulation, which can be a useful tool for the application in reproductive technologies in horses. Also, the use of repeated doses of GnRH in the follicular emergency phase after follicular ablation determined a delay in the progression of the new follicular wave. However, the higher proportion of follicles with greater potential for oocyte recovery and competence after OPU in GnRH-treated females may favor the efficiency of IVP procedures in horses.

O controle do processo oxidativo nos sistemas de produção in vitro (PIV) de embriões bovinos através do uso de aditivos pode ser uma abordagem alternativa para melhorar a criotolerância embrionária. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito do β-mercaptoetanol (βME) na criotolerância de embriões bovinos PIV. Foram realizados dois experimentos. No Experimento I, embriões de PIV foram vitrificados no Dia 7 de desenvolvimento, e após o aquecimento, foram cultivados in vitro em meio contendo 0, 50 ou 100 μM de βME por 72 h, quando as taxas de eclosão foram avaliadas. A melhor concentração de βME encontrada no Experimento I foi utilizada para o Experimento II. No Experimento II, após a MIV-FIV, os presumíveis zigotos foram cultivados in vitro na presença (tratamento CIV) ou ausência de βME, durante 7 dias. Os blastocistos de excelente e boa qualidade foram vitrificados. Após o aquecimento, os embriões foram alocados aleatoriamente em dois subgrupos e cultivados por 72 h adicionais até o estádio de blastocisto eclodido em meio SOF suplementado (tratamento CPA) ou não com βME. Os grupos experimentais foram compostos da seguinte forma: G1 (meio isento de βME durante CIV e CPA); G2 (βME apenas durante a CPA); G3 (βME apenas durante CIV); G4 (βME durante CIV e CPA). No Experimento I, verificou-se que a concentração de 100 μM de βME foi mais eficiente, produzindo maior taxa de eclosão. No Experimento II contatou-se que o uso de βME durante o CIV não afetou as taxas de clivagem (G1, 80,2% vs. G3, 81,1%), mas afetou negativamente o desenvolvimento ao estádio de blastocisto (G1, 43,8% vs. G3, 28,0%). Após a vitrificação, entretanto, a suplementação de βME durante o CIV, com ou sem adição de βME no CPA, melhorou a taxa de reexpansão (CIV 84,0% e CIV/CPA 87,5% vs. controle 71,0%) O βME no CPA melhorou as taxas de eclosão (G2, 58,1% e G4, 63,8%) em comparação com os grupos sem o aditivo (G1, 36,6% e G3, 42,0%). Além disso, a presença de βME durante o CIV ou CPA, ou mesmo durante ambos os períodos de cultivo, aumentou o número total de células em blastocistos eclodidos de embriões vitrificados. Em conclusão, a adição de βME durante o período de CIV não afetou a clivagem, mas reduziu o desenvolvimento até blastocisto. Apesar disto, a suplementação de βME durante o período de CIV aumentou a criotolerância dos blastocistos, observada pelo aumento na taxa de reexpansão, enquanto a suplementação de βME durante o período CPA também melhorou a sobrevivência dos embriões após a vitrificação, manifestada por maiores taxas de eclosão, número total de células em blastocistos eclodidos. The control of oxidative processes in the in vitro production (IVP) of bovine embryos using additives might be an alternative approach to improve embryo cryotolerance. The aim of this study was to verify the effect of β-mercaptoethanol (βME) on the cryotolerance IVP of bovine embryos, in two experiments. In Experiment I, IVP embryos were vitrified at the blastocyst stage on Day 7 of development. After warming, embryos were in vitro-cultured in medium containing 0, 50 or 100 μM βME for 72 h, when hatching rates were assessed. The best βME concentration in Experiment I was used in Experiment II. In Experiment II, following IVM-IVF, presumptive zygotes were in vitro-cultured in the presence (CIV treatment) or absence of βME, for 7 days. Excellent and good embryos quality were vitrified; after warming, embryos were randomly allocated to one of two sub-groups and cultured in fresh SOF medium supplemented (CPA treatment) or not with βME an extra 72 h until the hatching blastocyst (HBL) stage. Experimental groups were composed as following: G1 (βME-free medium during CIV and CPA); G2 (βME only during CPA); G3 (βME only during CIV); G4 (βME during CIV and CPA). In the Experiment I, a higher hatching rate was observed when using 100 μM βME concentration. In Experiment II, the use of βME during CIV did not affect cleavage rates (G1, 80.2% vs. G3, 81.1%). However, βME affected development to the blastocyst stage (G1, 28.0% vs. G3, 43.8%). Additionally, following vitrification, βME supplementation during CIV, with or without addition in the CPA, improved re-expansion rate (CIV 84.0% and CIV/CPA 87.5% vs. control 71.0%) The βME in the CPA improved hatching rates (G2, 58.1% and G4, 63.8%) compared with groups without the additive (G1, 36.6% and G3, 42.0%). Moreover, the presence of βME neither during CIV or CPA, or even during both culture periods, increased total cell number in HBL from vitrified embryos. In conclusion, the addition of βME during the CIV period did not affect cleavage, but reduced blastocyst yield. Despite that, βME supplementation during the CIV period increased the cryotolerance of the resulting blastocysts, expressed by an increasing in the reexpansion rate, whereas βME supplementation during the CPA period improved embryo survival after the vitrification process, manifesting by higher hatching rates and higher total cell numbers in HBL.

Os animais geneticamente modificados (GM) são uma importante fonte de proteína e nutrição para a maioria dos seres humanos e desempenharão papel fundamental para satisfazer a crescente demanda por alimentos em uma população mundial cada vez maior. Existem atualmente várias técnicas disponíveis para a produção animais GM, sendo que a clonagem por transferência nuclear de célula somática (TNCS), desde o nascimento da ovelha Dolly, continua sendo a técnica padrão ouro para se obter animais transgênicos. Apesar da clonagem por TNCS estar estabelecida há mais 20 anos, a eficiência continua baixa, com variações entre as diferentes espécies já clonadas. Esta baixa eficiência é multifatorial, tendo como pontos-chave a qualidade do material biológico utilizado (oócitos), o processo de ativação química partenogenética e a reprogramação celular após a fusão da célula doadora com o citoplasma receptor. Vários intentos foram realizados para avaliar a qualidade oocitária de forma menos subjetiva. A exposição dos oócitos a uma solução hipertônica é uma das opções viáveis e com resultados promissores. A ativação química dos embriões reconstruídos deve ser feita de maneira mais fisiológica possível, tentando mimetizar os processos biológicos que ocorrem na fecundação. Existem várias outras técnicas disponíveis para a produção de animais GM, incluindo a introdução de transgene em embriões, dentre estas, a microinjeção e a eletroporação de zigotos. A última década experimentou uma revolução no desenvolvimento de métodos de edição gênica que permitem a introdução de alterações específicas em genomas complexos. Esta revolução se deu início com o uso de meganucleases, Zinc Fingers, TALENS e, mais recentemente, com o descobrimento do uso das CRISPRs. Este aumento na precisão das ferramentas de edição irá melhorar características dos animais de produção com base no genoma para a produção de alimentos. A genética de precisão também aumentará o desenvolvimento de biomateriais terapêuticos e modelos de doenças humanas como recursos para o desenvolvimento de terapias avançadas para pacientes. O uso das nucleases de edição, especialmente as CRISPRs, abriu um leque de possibilidade de outras técnicas para serem empregadas na edição sítio-dirigida, como a microinjeção citoplasmática e a eletroporação de zigotos. Este trabalho teve como objetivo aumentar a eficiência na produção embriões suínos utilizando a clonagem por TNCS selecionando os oócitos de maneira menos subjetiva, aumentando a eficiência na ativação partenogenética pelo uso de quelantes de zinco, e aumentando a produção e qualidade embrionária expondo embriões a um inibidor de desacetilase de histonas (Scriptaid), assim como de desenvolver um protocolo de eletroporação de embriões suínos funcional e repetível para a edição gênica em diferentes loci utilizando CRISPRs combinada com complexos ribonucleoproteicos. Genetically modified (GM) animals are an important source of protein and nutrition for humans and will play key roles in meeting the growing demand for food in an ever-growing world population. There are currently several techniques available for the production of GM animals, but cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT), since the birth of Dolly, remains the gold standard technique for obtaining transgenic animals. Although cloning by SCNT was established more than 20 years, the efficiency in producing cloned animals remains low, with variations among the species already cloned. Such low efficiency is multifactorial, having as key points the quality of the biological material for use (oocytes), the parthenogenetic chemical activation process, and the cellular reprogramming after the fusion of the donor cell with the recipient cytoplasm. Several attempts have been made to evaluate oocyte quality in a less subjective and visual way as it is usually done. The exposure of oocytes to a hypertonic solution is one of the viable options with promising results. Also, the chemical activation of the reconstructed embryos should be done in a more physiological way, in an attempt to mimic the biological processes that occur after fertilization. Several other techniques are also available for the delivery of transgenes into embryos for the production of GM animals, among them, zygote microinjection and electroporation. The last decade has undergone a revolution in the development of methods for gene editing that allow the introduction of specific modifications into complex genomes. Such revolution began with the use of meganucleases, such as Zinc Fingers, TALENS and more recently, with the discovery and the use of CRISPRs. This increase in accuracy in the editing tools will improve animal traits for food production. Precision genetics will also enhance the development of therapeutic biomaterials and human disease models as resources for the development of advanced therapies for patients. The use of editing nucleases, especially CRISPRs, has opened up a range of possibilities for other techniques to be used in site-directed editing, such as cytoplasmic microinjection and zygote electroporation. This study aimed to increase the efficiency in the production of porcine embryos using SCNT cloning by selecting oocytes in less subjective ways, by increasing the parthenogenetic activation efficiency using zinc chelators, and by improving embryo production by exposing cloned embryos to a histone deacetylase inhibitor (Scriptaid), as well as by developing a functional and repeatable protocol for the electroporation of pig embryos for gene editing at different loci using CRISPRs combined with ribonucleoprotein complexes.

O vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais que causam importantes doenças clínicas em bovinos. A presença deste vírus em rebanhos representa um grande risco para a produtividade por perdas econômicas significativas. O uso da tecnologia de edição gênica, como o sistema CRISPR/Cas9, em animais de produção pode contribuir para o desenvolvimento de modelos de resistência a doenças, como a BVD. Mesmo que os mecanismos de infecção, entrada e liberação do BVDV não sejam totalmente compreendidos, a molécula CD46 é considerada o principal receptor celular para o BVDV em bovinos. O mapeamento do local de adesão ao BVDV demonstrou que dois peptídeos, localizados no módulo mais distal da proteína 1 de controle do complemento (CCP1), fornecem a plataforma de adesão ao BVDV. Os objetivos deste estudo foram (i) caracterizar o CD46 em linhagens celulares bovinas; (ii) modificar a plataforma de adesão do receptor por edição gênica; e (iii) investigar a permissibilidade do BVDV à infecção celular em células editadas geneticamente para o gene CD46. Para caracterizar o receptor, foi sequenciado o DNA complementar do gene CD46 em amostras de fibroblastos bovinos e em linhagens celulares de rim bovino Madin-Darby suscetíveis (MDBK) ou resistentes (CRIB) ao BVDV. Posteriormente, por edição gênica pelo sistema CRISPR/Cas9, criaram-se indels no éxon 1 do gene CD46, removendo oligopeptídeos que conformam a plataforma de adesão do receptor CD46 ao BVDV. Para realizar a edição genômica, duas sequências de RNA-guia (gRNA) foram selecionadas para a deleção do éxon 1 do CD46 em células MDBK. Posteriormente, dois plasmídeos px458, específicos para cada umas das gRNAs, e com expressão da proteína fluorescente verde (GFP), foram co-transfectados em células MDBK. O isolamento de populações de células clonais com modificações específicas das células transfectadas foi realizado por citometria de fluxo, seguido de um período de expansão para estabelecer sub-populações de células clonais. O DNA genômico foi isolado e amplificado por PCR. O produto do PCR foi ligado em plasmídeos pCR-TOPO, transformado em células TOP10 E. coli e sequenciado. Como resultados, identificou-se que as células CRIB codificam uma proteína CD46 semelhante às MDBK e aos fibroblastos, sem nenhuma mutação na região de interesse, com o receptor CD46 não apresentando aparente importância na resistência destas células à infecção por BVDV. Além disso, obtivemos três linhagens celulares MDBK com deleção em segmentos específicos na região codificante para o CCP1 referente a plataforma de adesão ao BVDV. Uma das linhagens apresentou a deleção bialélica, com a edição gênica sendo diferente em cada alelo; outra linhagem apresentou uma edição bialélica, com um dos alelos não apresentando a deleção da plataforma de adesão; e a última linhagem apresentou uma deleção bialélica homozigota. O estudo da susceptibilidade destas células mutantes à infecção pelo BVDV encontra-se em andamento. Com as três linhagens celulares bovinas modificadas geneticamente para a plataforma de adesão do receptor CD46 ao BVDV, tem-se a expectativa que estas modificações genéticas possivelmente levarão a uma diminuição na infecção pelo BVDV, o que permitirá obtermos mais informações sobre o mecanismo de entrada e infecção do vírus em células bovinas. Tal estratégia mostra-se viável para a futura geração de bovinos resistentes ao BVDV por biotécnicas avançadas da reprodução, como pela clonagem por transferência nuclear de células somáticas (TNCS). The Bovine Viral Diarrhea virus (BVDV) is one of the major viral pathogens that cause important clinical diseases in cattle. The presence of the virus in herds represents a major risk for productivity due to significant economic losses. The use of gene-editing technology, such as the CRISPR/Cas9 system, in livestock animals can contribute to the development of disease resistance models, such as BVD. Even though the mechanisms of infection, entry and release of BVDV are not yet fully understood, the CD46 molecule is considered the major cellular receptor for BVDV in cattle. The mapping of the adhesion site to the BVDV revealed that two peptides, located in the most distal domain of the complement control protein 1 (CCP1), provide the adhesion platform for the virus. The aims of this study were (i) to characterize CD46 in bovine cell lines; (ii) to modify the platform of adhesion of the CD46 receptor by gene edition; and (iii) to investigate the permissibility of BVDV to cellular infection in CD46 gene-edited cells. To characterize the receptor, the complementary DNAof the gene CD46 was sequenced on samples of fibroblast cells and in Madin-Darby bovine kidney cell lines (MDBK) or MDBK susceptible cells and on cells resistant to BVDV infection (CRIB cells). Afterwards, by gene editing using the CRISPR/Cas9 system, indels were created in the exon 1 of the CD46 gene, removing oligopeptides that form the CD46 receptor adhesion platform to BVDV. To achieve the genomic edition, two sequences of guiding RNA (gRNAs) were selected for exon 1 deletion of CD46 in MDBK cells. Subsequently, two px458 plasmids, each encoding one of the gRNAs, and expressing the green fluorescent protein (GFP), were co-transfected into MDBK cells. Isolation of clonal cell populations with specific modifications of the transfected cells was done through Fluorescence Activated Cell Sorting, followed by an expansion period to establish new clonal cell lines. Genomic DNA was isolated and amplified by PCR. The PCR amplified products were ligated into pCR-TOPO plasmid and transformed into TOP10 E. coli cells, and DNA-sequenced. Our results indicated that CRIB cells express a CD46 protein similar to MDBK and fibroblast cells, without any mutation in the region of interest, with the CD46 receptor in CRIB cells showing an apparent no importance in the resistance to BVDV infection. Furthermore, we obtained three MDBK cell lines with deletion in specific segments in the coding region for CCP1 referring to the BVDV adhesion platform. One of the lines presented a biallelic deletion of the adhesion platform, with gene edition being different in each allele; another line presented a biallelic edition, with one of the alleles not containing the adhesion platform deletion; and the last line presented a biallelic homozygous deletion. However, the study of the susceptibility of such mutant cells to BVDV infection is still ongoing. With the three genetically modified bovine cell lines to the CD46 receptor adhesion platform on BVDV, such genetic modification will possibly lead to a decrease in BVDV infection, which may allow us to obtain more pieces of information regarding mechanisms of virus entry and infection in bovine cells. Such a strategy proves to be feasible for the future generation of BVDV resistant animals by the use of advanced reproductive technologies, such as cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT).